Acta Biolgica Colombiana, Vol. 8 No.

1, 2003 11

SEPARACIN HIDRODINMICA DE MACROMOLCULAS,

PARTCULAS Y CLULAS
Hydrodynamic Separation of Macromolecules, Particles and Cells

MAURICIO HOYOS
Laboratoire de Physique et Mcanique des Milieux Htrognes
UMR7636 CNRS
Ecole Suprieure de Physique et Chimie Industrielles
10 rue Vauquelin, 75231 Paris Cedex 05, Francia
Revisin invitada, junio 2003

RESUMEN
La separacin de especies qumicas de gran tamao como las protenas, el ADN, los
polisacridos, las clulas, est tomando una importancia indiscutible tanto en el campo
de las aplicaciones industriales, como en el campo de la investigacin fundamental. La
fuerza de la biotecnologa y de las ciencias biomdicas est centrada en su capacidad
de innovacin, en la cual, las tcnicas de anlisis, de separacin y de purificacin juegan
un papel capital. A pesar del enorme progreso de la cromatografa de alto rendimiento
y de sus diferentes subtcnicas en materia de separacin de pequeas y medianas molculas, dichas tcnicas resultan inadecuadas para la separacin y el anlisis de grandes
especies qumicas, justamente por el tamao de estas ltimas. Presentamos aqu los
fenmenos ms importante inherentes al anlisis y a la separacin de macromolculas,
partculas y clulas. Dichos fenmenos deben ser estudiados principalmente desde el
punto de vista de la mecnica de fluidos, de la fisicoqumica y de la qumica analtica.
Hacemos particular nfasis en la separacin de objetos ms grandes que una micrmetro, a travs de la presentacin de dos tcnicas poco conocidas, pero de gran potencial:
el Fraccionamiento Campo-Flujo, FFF, y el Split-Flow Thin Cell Fractionation, SPLITT.
Palabras clave: hidrodinmica, separacin, FFF, SPLITT, macromolculas.
ABSTRACT
Separation of big chemical species, like proteins, DNA, polysaccarides, biological cells,
is ubiquitous in industrial applications and fundamental research. Progress in biotechnology and biomedical engineering need to make appeal to separation sciences for
developing new products. Although big progress have been made by the chromatography
and its related techniques concerning the separation of small and intermediate molecules, those techniques are nevertheless inadequate for fraction-ating and analyzing big
species. In this paper we present the main phenomena implied in the separation process
of macromolecules, particles and biological cells. Those phenomena have to be investigated by means of the fluid mechanics, the physical-chemistry end the analytical chemistry. We emphasize on separation of species bigger than one micrometer, by consider-

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ing two not still very well known techniques, but with high developing potential: the
Field_Flow Fractionation, FFF, end the Split-flow Thin cell fractionation, SPLITT.
Kew words: hydrodinamics, sepration, FFF, SPLITT, macromolecules.
INTRODUCCIN
La separacin y la caracterizacin de especies qumicas es fundamental en procesos
de produccin tecnolgica tan variados como la industria farmacutica, agroalimenticia, biotecnolgica y biomdica. Las ciencias de la separacin engloban un gran
nmero de procesos que han sido desarrollados principalmente dentro del marco de
la qumica analtica. As, la cromatografa, la eletroforesis y otros procesos de separacin y de caracterizacin de especies qumicas, han tenido un desarrollo impresionante en los ltimos cincuenta aos. Actualmente ninguna industria qumica puede eludir
el anlisis cromatogrfico. Cada producto que existe debe ser analizado. Adems, una
multitud de anlisis son necesarios cotidianamente, ya sea en el estudio del dopaje de
deportistas, en el control in situ de productos suceptibles de pasar por los aeropuertos
como explosivos, drogas, etc. La cromatografa es una tcnica capaz de separar y analizar especies qumicas de pequea masa molecular. Esto es debido a que la separacin
se lleva a cabo en una columna llena de pequeas partculas de silicio compactadas,
llamada fase estacionaria, que dejan muy poco espacio para que grandes molculas,
transportadas por un solvente llamado fase mvil, puedan atravesarla. En este medio
poroso, o ms exactamente, de doble porosidad ya que las partculas son, ellas mismas,
porosas, las molculas sufren esfuerzos elongacionales que las rompen cuando son muy
grandes. Entonces, la caracterizacin de polmeros, de grandes protenas, de partculas coloidales, de clulas, en fin, de grandes especies qumicas, no puede beneficiarse de
la cromatografa, llamada ahora, de alto rendimiento (HPLC, high performance liquid
chromatography). La electroforesis, la cromatografa de exclusin estrica o size exclusion
chromatography, SEC, la cromatografa sobre gel o gel permeation chromatography, GPC,
permiten ir ms lejos en masa molecular que la cromatografa en fase lquida tradicional. Sin embargo, ms all de masas moleculares del orden de un milln de daltons,
cualquier fase estacionaria, por ejemplo, un gel de la GPC u otros tipos de fases en electroforesis, puede romper las macromolculas o no deja pasar las partculas. Entramos
entonces en otro dominio de las ciencias de la separacin donde la fisicoqumica de la
materia coloidal y la hidrodinmica juegan un papel fundamental. Es en este dominio
de tallas de objetos nos situaremos, es decir, trataremos de mostrar los elementos que
forman la base de la separacin de macromolculas, coloides y partculas de talla
microscpica, haremos ms nfasis en los objetos cuyo tamao es mayor que un micrmetro. En esta categora se sitan las partculas rgidas como las de silicio, ltex, almidn, polen, metlicas; partculas deformables como gotas de una emulsin no coloidal
y clulas de todo tipo. La necesidad es separar, caracterizar y preparar suspensiones y
emulsiones lo ms monodispersas posible, es decir, de una sola talla. Por ejemplo, es
indiscutible y los mtodos de separacin eficientes, poco costosos y fciles de utilizar
son an muy escasos. Actualmente un gran reto en el rea de la biomedicina es poder
diagnosticar en forma precoz el cncer y el de separar clulas cancerosas de una muestra

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de sangre que tiene muy pocas de estas clulas malignas; otro ejemplo es el de poder
separar fcilmente in situ los dos tipos principales de la bacteria Escherichia coli. Hay
muchos ejemplos de la necesidad de separar bacterias, ADNs, clulas infectadas con
parsitos, que justifican una investigacin profunda y una inversin econmica y humana en este campo.
La separacin de grandes especies qumicas es adems, un vasto campo multidisciplinario por excelencia. As, la qumica, la fsica, la mecnica, la hidrodinmica y la biologa se encuetran estrechamente relacionadas. Por esta razn el desarrollo es an
lento pues no es fcil encontrar los laboratorios adaptados ni suficientes especialistas
para desarrollar este difcil pero fascinante campo de la investigacin. Esta revisin
pretende dar pistas que permitan apreciar la intervencin de uno de los campos que
necesitan ser desarrollados en materia de separacin: la mecnica de fluidos. El objetivo principal de esta revisin es mostrar el rol de la mecnica de fluidos en los procesos
de separacin, es decir lo enfocaremos desde el punto de vista de la fsica buscando
sensibilizar al mismo tiempo a los bilogos. Trataremos por un lado los aspectos de la
separacin analtica, o sea la separacin con fines de anlisis de muestras, y por otro
lado, los aspectos ligados a la separacin en continuo de tipo preparativo o sea aquella
utilzada para preparar productos derivados de la biotecnologa. Entre los mtodos ms
usados en materia de aislamiento y separacin de especies biolgicas podemos mencionar (ciertos mtodos estn desarrollados en Garca et al., 1999, y Recktenwald y
Radbruch, 1998): la centrifugacin, la elutriacin, la citometra de flujo, la filtracin
con membranas y otras variantes de las primeras que tienen que ver con la filtracin
tangencial, gradientes de Percoll. Para completar la lista podemos mencionar las separaciones que utilizan campos elctricos como la electroforesis que separa protenas y
ADNs y la dielectroforesis para las clulas; campos magnticos como la magnetoforesis
empleada en la separacin de clulas sanguneas; campos acsticos o acustoforesis que
comienza a dar resultados en separacin celular, tambin acoplamientos diversos pueden establecerse entre todos los mtodos mencionados y de hecho, las tcnicas de separacin se desarrollan enormemente alrededor de dichos acoplamientos entre campos y flujos. El objetivo de esta revisin no es el de exponer las diferentes tcnicas sino
el de presentar los principales conceptos de base de la separacin de grandes especies
qumicas a travs de la introduccin de dos tcnicas de separacin poco conocidas
pero con enorme potencial: el Fraccionamiento Campo-Flujo (FFF) y la tcnica de
Split-flow fractionation, SPLITT. Tambin pasaremos en revista los efectos hidrodinmicos ligados a la separacin analtica y preparativa de grandes especies qumicas.
FENMENOS LIGADOS A LA SEPARACIN DE GRANDES ESPECIES QUMICAS
Llamamos grandes especies qumicas a las macromolculas de masa molecular superior
a 50.000 daltons, y los objetos rgidos o deformables cuya talla comienza a nivel del nanmetro (10-7 cm). La figura 1, que muestra un tablero de tallas de diferentes compuestos biolgicos nos da una idea de donde nos podemos situar desde el punto de
vista del tamao de grandes especies qumicas. Dentro de la categora de las macromolculas, encontramos los polmeros como de poliestireno o de policloruro de vinilo,
el ADN, las protenas, los polisacridos. Las partculas coloidales son en general ms

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pequeas que un micrmetro (10-4 cm). Dentro de esta categora podemos citar las partculas de ltex de poliestireno, de silicio coloidal, las partculas magnticas que componen los ferrofluidos, las microemulsiones, las llamadas micropartculas que son expulsadas por algunas clulas sanguneas como signo de ciertas patologas, etc. Estas dos
categoras de objetos supermoleculares tienen en comn que estn animadas del movimiento Browniano que caracteriza el fenmeno llamado difusin. Los objetos de talla
superior al micrmetro como las clulas, las vesculas o las gotas de ciertas emulsiones,
forman parte de la especies qumicas de grn inters en materia de separacin.
100
Clulas

Talla (m)

10
1
0,1

Levaduras, hongos
Bacterias
Virus

0,01
Biopolmeros
0,001
0,0001

Enzimas
Azcares
Iones
Antibiticos
Agua

Componente biolgico
Figura 1. Tamao de algunos componentes biolgicos de inters.

Fenmeno de difusin browniana y separacin. El movimiento Browniano es aquel

que es transmitido por un lquido en reposo macroscpico, pero cuyas molculas estn en permanente agitacin trmica, a partculas o macromolculas que estn suspendidas en l. Los choques aleatorios de las molculas del lquido sobre la superficie
de las partculas provocan en ellas, de igual forma, movimientos aleatorios. El desplazamiento neto de las partculas en suspensin est gobernado por una ley que establece que la distancia, l, llamada longitud de difusin; recorrida por la partcula es
proporcional a la raz cuadrada del tiempo, t. Esta relacin caracteriza todo proceso
difusivo. As, se define el coeficiente de difusin, D, a partir de la constante de proporcionalidad de la ecuacin:
l = (2Dt)1/2

(1)

El coeficiente de difusin D, est directamente relacionado con el tamao de las

macromolculas y de las partculas por medio de la relacin de Stokes-Einstein:
D = kT/3d

(2)

Donde k es la constante de Boltzmann, T la temperatura en grados Kelvin, es la viscosidad del lquido y d el dimetro de las partculas. En el caso de partculas slidas

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y el factor 3 es de carcter geomtrico el cual cambia segn la forma o la deformabilidad del objeto. En el caso de las macromolculas dicho factor tiene otra forma que
considera la masa molecular y el dimetro de giro propio a cada macromolcula en un
solvente preciso. La difusin as presentada, llamada autodifusin, es vlida para una
partcula suspendida en un lquido en reposo. Pero la difusin puede tambin ser considerada en el caso de una suspensin de partculas de una solucin de macromolculas.
En ese caso, las partculas en difusin interactan por medio de choques o simplemente
por interaccin hidrodinmica o sea por medio de perturbaciones a travs del fluido.
La difusin como fenmeno colectivo tiende a homogeneizar una suspensin. As,
cuando en una suspensin existen zonas ms concentradas que otras, las partculas
tienden a migrar de las zonas ms densas hacia la menos densas hasta homogeneizar
la suspensin. Cuando el fenmeno es colectivo, la difusin se llama difusin de Fick.
La ley de Fick nos describle este fenmeno bajo la forma de la ecuacin de difusin:
J = D grad C

(3)

Donde J, es el flujo o sea el volumen de partculas que pasan por unidad de tiempo a
travs de una superficie y grad C, el gradiente de concentracin, estas son cantidades
vectoriales. El coeficiente de difusin en este caso es el mismo que le precede solo en el
caso de suspensiones diluidas, o sea, C<<1% en fraccin volumtrica. En el caso de
suspensiones concentradas, el coeficiente de difusin es una funcin ms o menos complicada de la concentracin. La ecuacin (2) nos dice tambin que D depende de la
viscosidad del lquido y del tamao de las partculas, esto hace que el coeficiente de
difusin pueda considerarse como un parmetro fisicoqumico que caracteriza las especies qumicas y pueda ser por consiguiente utilizado como parmetro selectivo de
separacin en el caso de especies brownianas. Esto quiere decir que un mtodo de separacin de coloides (que asociaremos aqu a las especies brownianas) debe poder
diferenciar especies que tengan diferente coeficiente de difusin.
Cundo entra en juego la mecnica de fluidos? Veamos ms de cerca lo que significa
la difusin en los lquidos a partir de la ecuacin (2). El numerador es la energa de agitacin trmica de las molculas del lquido suspendente. Con esta energa la partcula
debe abrirse paso en el fluido el cual ejerce una resistencia. El fenmeno disipativo provocado por esta resistencia est ligado a la viscosidad del lquido, por eso encontramos
en el denominador la viscosidad, cuyas unidades en el sistema cgs son: [g cm-1 s-1]. Adems, mientras ms grande sea la partcula ms fluido debe desplazar en su movimiento
y la resistencia aumenta, vemos entonces que d se encuentra tambin en el denominador. Es til recordar la fuerza de friccin Ff que ejerce un lquido al movimiento de
una partcula desplazada por una fuerza F:
Ff = 3dU _ dU/M

(3)

Donde U es la velocidad constante a la cual se desplaza la partcula. M es la mobilidad de la partcula. Esta ecuacin demostrada por G. Stokes, fsico ingls de fines del
siglo XIX, es vlida para todo tipo de partculas brownianas o no. Cuando una par-

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tcula se desplaza en un lquido en reposo o en movimiento y dicho lquido ejerce presiones y esfuerzos sobre la superficie de la partcula, la hidrodinmica entra en accin.
As, la separacin de dos tipos de partcula es posible cuando dichos esfuerzos son
diferentes para cada una. Un ejemplo conocido es la centrifugacin. La velocidad de
sedimentacin Us de una partcula en un lquido viscoso est dada por la ecuacin:
Us = Gd 2/18

(4)

Donde es la diferencia entre la densidad de la partcula o de una clula sangunea,

por ejemplo, y el lquido que la suspende. G es la aceleracin del campo gravitacional,
centrfugo, magntico, etc. Esta ecuacin se obtiene considerando los esfuerzos sobre la
partcula y el resultado muestra una funcin del cuadrado del dimetro de la misma.
Dos partculas de tamao diferente sedimentan a velocidad diferente y podrn ser
separadas. En una suspensin bidispersa, es decir, compuesta de partculas de diferente
dimetro o densidad, la separacin se puede hacer por simple sedimentacin o centrifugacin. Este mtodo es muy utilizado en biologa; varios parmetros pueden ser modificados, por ejemplo, la densidad del medio creando gradientes de Percoll para separar
en funcin de la densidad. El Percoll es una suspensin browniana concentrada en la
cual un perfil de concentracin creado por la competencia entre la conveccin (la sedimentacin) y la difusin, crea gradientes de densidad en una columna. Las clulas en
sedimentacin en dicha suspensin coloidal se acumulan en los niveles donde su densidad coincide con la densidad local del Percoll, punto isopcnico. Este ejemplo muestra
un acoplamiento entre la fisicoqumica, la difusin, y la mecnica de fluidos, la sedimentacin con fines separativos. Veremos a continuacin cmo separar especies acoplando un campo de fuerza.
HIDRODINMICA Y SEPARACIN
Tenemos que aclarar que cuando se trata de mtodos analticos, el concepto de separacin parece bien claro ya que el mtodo de elucin empleado por la cromatografa
muestra bien una mezcla inyectada en una columna y una serie de picos de absorcin
que salen o eluyen de la columna en tiempos diferentes. En general un detector ultravioleta o un refractmetro se usan en lnea a la salida de la columna cromatogrfica.
Los picos son la manifestacin de los componentes individuales bien separados que pasan por la ventana del detector y el tiempo de residencia o de elucin; y est ligado a la
naturaleza del componente. La solucin molecular es considerada como monodispersa,
es decir, que las pequeas molculas tienen la misma masa molecular y esto hace que
los picos sean bastante angostos permitiendo definir as un tiempo preciso de elucin
para cada componente. Con la ayuda de tablas de calibracin de las columnas cromatogrficas se puede determinar el componente cuando solo se conoce el tiempo de elucin. Aqu comenzamos nuestro anlisis que diferencia la separacin de pequeas molculas de la de grandes especies qumicas. En realidad un pico de elucin cromatogrfico no es infinitamente fino sino que tiene un cierto ancho. El ensachamiento del pico
obedece a un fenmeno llamado dispersin hidrodinmica. En canales de separacin
sin fase estacionaria donde un lquido vector transporta las especies que se pretenden
separar, se presenta un fenmeno similar de dispersin hidrodinmica, pero a ste se le

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suma un efecto de colisiones entre las partculas y un efecto de interaccin hidrodinmica. Todo esto complica la tarea de separar, por ejemplo, clulas sanguneas en continuo.
Dispersin hidrodinmica (Dispersin de Taylor). Ya hemos hablado del proceso de
difusin browniana en el cual macromolculas o partculas suspendidas en un lquido
poseen un movimiento errtico inducido nicamente por los innumerables choques de
las molculas del solvente en permenente agitacin trmica. Se trata en este caso de la
suspensin en reposo en un recipiente. Qu pasar entonces, si la supensin fluye en
un canal, es decir, adems del movimiento browniano las partculas en suspensin se
encuentran en un campo de velocidades? La pregunta ms concreta es: cmo es el acoplamiento difusin-conveccin? El campo de velocidades de un fluido en movimiento
bajo un gradiente de presin en un conducto de seccin circular o rectangular es de tipo
parablico o perfil de Poiseuille. La caracterstica es que la velocidad del lquido en las
paredes del conducto es nula y dicha velocidad aumenta en forma parablica hasta
alcanzar la velocidad mxima en el centro del canal. La velocidad media en un canal de
seccin circular es la mitad de la velocidad mxima, mientras que la misma velocidad
en un canal de seccin rectangular es dos tercios de la velocidad mxima. Si en un separador inyectamos un pulso de suspensin (un pequeo volumen, por ejemplo, 25 l en
un canal de volumen 500 l, pero de un espesor muy fino de 100 m), las partculas
tienden a seguir las lneas de corriente del flujo y as adoptar la forma del perfil de velocidades. Es evidente que este campo de velocidades crea inhomogeneidades tranversales
de concentracin que van a generar un proceso de difusin cuya tendencia es de homogeneizar la zona, es decir, hacer que la concentracin sea la misma en el espesor. La zona
inicial que era muy angosta se ensancha y la distribucin tender, al cabo de un tiempo,
a adoptar una forma Gausiana como lo indica la figura 2. El pico sufrir entonces dos
procesos, uno de difusn transversal al flujo, y un proceso de ensanchamiento axial producido por el perfil de velocidades. Este proceso conjunto es llamado dispersin de
Taylor, descrito por primera vez por Charles Taylor, fsico ingls, en los aos 30. Este
proceso es fundamental en separacin, pues en funcin del ensanchamiento de la banda para diferentes especies, se podrn separar dos componentes de una mezcla.

Figura 2. Dispersin de Taylor. Una nube de partculas ocupan un espacio angosto a la entrada del
canal. El perfil de velocidades es parablico. La nube de partculas se ensancha tendiendo a una
concentracin Gaussiana.

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Acoplamiento con un campo de fuerzas, tcnica FFF. Si las partculas o las macromolculas tienen un coeficiente de difusin muy grande, es decir, que toda inhomogeneidad en concentracin creada por el flujo parablico es compensada rpidamente
por la difusin, o en todo caso, rpidamene comparado con el tiempo caracterstico
del flujo, o si las especies estn uniformemente distribuidas en el canal a la entrada,
su velocidad va a coincidir con la velocidad media del flujo. En estas condiciones
ninguna separacin en funcin del coeficiente de difusin podr hacerse puesto que
todas las molculas o partculas viajarn con la misma velocidad en el canal. La separacin puede lograrse cuando un campo de fuerza transversal al flujo es aplicado. Se
considera que la separacin se realizar en un canal de tipo Hele Shaw es decir, una
celda de seccin transversal rectangular mucho ms ancha y larga que gruesa. Las dimensiones tpicas de canales existentes estn comprendidas entre 1 y 4 cm de ancho,
5 y 100 cm de largo y 50 y 300 m de espeso. Aqu el tercer elemento de acoplamiento
aparece y es el efecto convectivo del campo de fuerzas el cual puede ser centrfugo, elctrico, magntico, etc., y que va a dirigir las especies hacia una de las paredes del canal
llamada pared de acumulacin, creando una inhomogeneidad transversal de concentracin suplementaria. En este caso, ser esa inhomogeneidad creada por el campo
quien permitir la separacin. Cuando la fuerza termodinmica de difusin se equilibra con la fuerza convectiva del campo, un perfil de concentracin de equilibrio, perfil
de Boltzmann, se crea; es un perfil que decrece en froma exponencial a partir de la pared de acumulacin. Una vez el equilibrio de sedimentacin es alcanzado, la nube de
partculas puede desplazarse a lo largo del canal a velocidad constante. La velocidad
es funcin de la posicin en el espesor del centro de gravedad de la nube. Aqu encontramos el acoplamiento con el perfil de velocidad: especies de tamao diferente tienen coeficiente de difusin y velocidad de sedimentacin diferente, por lo tanto, la distancia media a la pared de acumulacin y la velocidad axial media van a ser diferentes,
como lo indica la figura 3.
Campo de fuerza

la

lb

a
b
Figura 3. Esquema de la separacin de especies brownianas en un canal de FFF. Las partculas a tiene
un coeficiente de difusin menor que las especies b. El centro de gravedad de la nube b est ms
alejado de la pared de acumulacin y debido al perfil de velocidad transitan ms rpido en el canal
que las partculas a.

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La separacin axial aparece entonces y las especies saldrn del canal en tiempos diferentes. El tiempo de residencia est ligado al coeficiente de difusin por medio de ciertas
relaciones matemticas simples que no sern enunciadas aqu. Esta tcnica de separacin es llamada Field-Flow Fractionation, FFF, que traduciremos como Fraccionamiento
Campo-Flujo. La FFF es una familia de mtodos analticos de separacin inventados por
J. Calvin Giddings, Profesor de la Universidad de Utah, en los aos 60 (Giddings, 1966).
Los campos ms utilizados son el gravitacional centrfugo o multigravitacional, el campo
creado por un gradiente de temperatura que permite la determinacin del coeficiente
de difusin trmica y un campo hidrulico creado por un flujo transversal. Este mtodo
de separacin es analtico ya que permite la identificacin de especies como la cromatografa tradicional, inyectando una pequea cantidad de soluto y observando a travs
de detectores ultravioleta los picos de retencin. Vemos que este mtodo no utiliza sino
un canal sin fase estacionaria o sea que las especies, por grandes que sean, evidentemente dentro de los lmites geomtricos fijados por el separador, pasan sin ser degradadas. Dentro de la aplicaciones de la FFF podemos citar el anlisis de contaminantes del
agua, caracterizando las partculas coloidales que transportan microorganismos en los
ros (Contado et al., 1997); el anlisis de polmeros de masa molecular muy elevada
(Martin et al., 2002); el anlisis de protenas (Levin et al., 1989); el anlisis de macromolculas del vino (Godoy, 2002).
Caso del flujo de partculas no-brownianas. La clulas estn consideradas entre las especies no-brownianas a las cuales hacemos referencia aqu. Recordemos que los objetos
no-brownianos son aquellos cuyo coeficiente de difusin es despreciable. Qu entendemos por despreciable en este contexto? Miremos algunas magnitudes carctersticas:
una molcula pequea, por ejemplo la rea, (no es muy claro si se puede considerar a
la molcula de rea como una molcula browniana, no podemos entrar en detalles por
el momento), tiene un coeficiente de difusin alrededor de D~10-5 cm2/s, esto quiere
decir que en un segundo, la molcula se desplaza de acuerdo con la ecuacin (1) de una
distancia l~45 m; para una protena con un D~10-8 cm2/s, l~1.5 m; para una partcula
de ltex de 0.24 m, D~2 10-8 cm2/s, l~2 m; finalmente, si caculamos D con la ecuacin
(2) para un glbulo rojo tomando como dimetro medio 5 m, obtenemos D~5 10-10,
l~0.3 m o sea de 1/15 de su propio dimetro. Esto quiere decir que, para ver desplazada una clula, gracias nicamente a su movimiento browniano, una distancia caracterstica del dimetro de una pequea arteria de 200 m, se necesitan al rededor de 9
das. Esto implica un desplazamiento imperceptible a la escala de cualquier tiempo caracterstico de separacin. Las clulas no son por lo tanto consideradas como brownianas. Por consiguiente, la separacin por medio de la tcnica FFF no utiliza el mecanismo
de difusin para separar dichas especies sino que utiliza otro principio hidrodinmico
llamado mecanismo de focalizacin. Tenemos que sealar que este tipo de separaciones
se realizan en flujos a bajo nmero de Reynolds. Este nmero sin dimensiones carcteriza
los fluidos viscosos donde no existen flujos turbulentos. Los flujos viscosos son llamados laminares. El nmero de Reynolds est definido como: Re=UL/, donde es
la densidad del lquido, U la velocidad carcterstica del lquido o de la partcula y L una
dimensin caracterstica del canal o de la partcula. El flujo es considerado como laminar
cuando Re<1. A la base de este mecanismo de focalizacin hidrodinmica se encuentra

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un tipo muy particular de fuerza de origen hidrodinmico llamada fuerza de sustentacin, ms conocida como lift force. La fuerza de sustentacin hidrodinmica a la
que hacemos referencia es de origen inercial y es de naturaleza muy diferente de la fuerza
de sustentacin que hace volar los aviones. Ella acta sobre partculas que se desplazan
paralelamente en la vecindad de una pared. As, una clula arrastrada por el flujo sanguneo en una arteria, experimenta una fuerza que la repele de la pared; la clula seguir
una trayectoria que la conduce a una posicin de equilibrio que se sita en un punto
intermedio entre el centro del eje de la arteria y la pared. Este fenmeno es conocido en
hemodinmica como efecto Fhareous-Linqvist. El mecanismo de sustentacin explica
el por qu la sangre, siendo una suspensin concentrada, fluye tan fcilmente. Todos
estos problemas que tienen que ver con el flujo sanguneo son tratados por la rama de
la mecnica de medios con-tinuos llamada bioreologa. La fuerza de sustentacin F s, es
funcin del tamao de la clula, de su distancia a la pared y de la velocidad media del
flujo. La relacin terica, que necesita desarrollos matemticos bastante elaborados
(Ho y Leal, 1974, Vasseur y Cox, 1976), es la siguiente: F s =d 4<v> 2 F ()/w 2. F() es una
funcin decreciente complicada de la distancia , a la pared. La figura 3 muestra la
trayectoria de una partcula de 5 m en un canal de FFF. La posicin de equilibrio se
ve claramente. En la figura se considera la partcula sin peso aparente. Cmo se efecta
la separacin? Pensemos en clulas que sedimentan en el canal y al mismo tiempo son
llevadas por el flujo. La fuerza de sustentacin se opone a la sedimentacin y la partcula
se equilibra en una posicin en el espesor que depende de su tamao como lo indica la
ecuacin (4), la sedimentacin depende del tamao al cuadrado. De esta forma, como
la posicin de equilibrio es diferente en el espesor para partculas diferentes, acoplada
con el perfil de velocidad, la velocidad axial de cada especie es diferente y podrn ser
separadas a lo largo del canal. La teora de la fuerza de sustentacin est bien establecida para una partcula rgida y esfrica en un lquido viscoso, pero cuando se trata
de un clula que no es esfrica y adems es deformable, no existe ninguna teora que
permita predecir la trayectoria anloga a la de la figura 4. Igualmente no existe teora
alguna que tenga en cuenta las fuerzas cuando se trata de una suspensin de partculas
o de clulas en interaccin. Los efectos hidrodinmicos colectivos los trataremos en la
seccin siguiente, consagrada a la separacin en continuo de clulas y partculas.
0.15

x/w

0.1
0.05
0
0

10

12

L(cm)
Figura 4. Trayectorias calculadas tericamente de partculas que parten de diferentes posiciones en
el espesor normalizado x/w, de un canal de FFF, provocadas por las fuerzas de sustentacin. L es la
longitud del canal. La partcula esta a la escala de una partcula de 10m en un canal de 100m.

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SEPARACIN HODRODINMICA EN CONTINUO DE SUPERMOLCULAS, TCNICA SPLITT

Acabamos de ver en forma muy resumida la tcnica de separacin analtica FFF. Inspirados en dicha tcnica, cmo podramos realizar en forma similar separaciones en continuo con el fin de preparar productos? Calvin Giddings siguiendo su misma visin de la
separacin de grandes especies qumicas, propuso en los aos 80 un mtodo de separacin en continuo que llam Split-flow Lateral Transport Thin Cell Fractionation, SPLITT
(Giddings, 1985). El separador es del mismo tipo que el de la FFF, es decir, un canal fino
donde un flujo transporta axialmente una muestra. Igualmente, un campo de fuerza
transversal acta sobre las especies que componen la muestra. Pero con el fin de obtener un dispositivo que pueda trabajar en continuo, la celda posee dos entradas y dos
salidas que permiten, gracias a un divisor de flujo tanto a la entrada como a la salida,
inyectar de manera independiente y simultnea, el lquido vector y la muestra. En la figura 3 podemos observar un esquema del funcionamiento de este mtodo de separacin. Las suspensin de partculas o la solucin de macromolculas es inyectada por la
entrada a y el lquido vector por la entrada b. La diferencia de los dos flujos lleva a una
configuracin tal que las partculas son obligadas a comenzar su migracin axial en la
vecindad de la pared del lado de la inyeccin. Una vez en el canal, la partculas comienzan a sedimentar en el espesor de la celda. Las partculas cuya velocidad de sedimentacin es mayor, alcanzarn ms fcilmente la salida marcada b, opuesta al punto de
inyeccin. Con el fin de seleccionar adecuadamente la especie que deseamos evacuar
por cada salida, debemos manipular en forma muy precisa los flujos. As, si aspiramos
lquido por la salida a con un caudal ms grande que aquel con el que inyectamos la
muestra en a, crearemos, como lo indica la figura, una zona virtual llamada zona de
transporte, en la que las partculas que logren atravesar dicha zona antes de alcanzar el
divisor de flujo de la salida, podrn ser evacuadas por la salida b. Este mtodo de separacin es de tipo binario ya que se tienen solo dos salidas. As, si tenemos, por ejemplo,
una muestra de clulas de tamao diferente y deseamos eliminar las ms grandes a
partir de un cierto tamao, se utiliza la relacin matemtica:
d c = {(Qa-Qa)/gLB18}1/2

(5)

Donde dc es el dimetro hidrodinmico crtico a partir del cual las clulas sern colectadas por la salida b. B y L son respectivameente el ancho y el largo del canal. Por la
evacuacin a, saldr la fraccin compuesta de las clulas ms pequeas que el dimetro
crtico. La tcnica de SPLITT tiene una gran ventaja con respecto a las existentes ya que
no utiliza membranas de filtracin o de dilisis para efectuar la separacin. La zona de
transporte gobernada por los flujos juega el papel de una membrana y el espesor de la
zona es anloga a la porosidad de una membrana virtual. Este mtodo es eficientemente usado sobre todo en estudios relacionados con la contaminacin (Contado et al.,
1997), mientras que en lo relacionado con separaciones de clulas, solo un dispositivo
de tipo SPLITT que utiliza un campo magntico existe (Zborowski et al., 1997, Hoyos et
al., 2002), aun cuando ciertas separaciones fueron logradas en un sistema de SPLITT
gravitacional (Zhang et al., 1994). El dispositivo de SPLITT magntico no es por el momento completamente operacional ya que las aplicaciones conllevan problemas hidrodinmicos suplementarios comparados con las aplicaciones al medio ambiente.

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Revisin - Separacin hidrodinmica de macromolculas, partculas y clulas. Hoyos.

Campo de fuerza
Zona de transporte
Inyeccin
de la
muestra

Divisor
del flujo

Inyeccin del
lquido vector

Fracciones
colectadas

Superficie de
incidencia del
lquido vector

Flujo

b
Superficie
de aspiracin

Figura 5. Esquema (escala no considerada) de la celda de SPLITT.

Tomando como ejemplo las separaciones magnticas, podemos analizar la hidrodinmica que est implicada en el proceso de separacin en continuo. La separacin de
clulas madres hematopoyticas por medio de la tcnica de SPLITT magntica, se realiza en un canal axi-simtrico compuesto por dos cilindros coaxiales. El campo magntico es aplicado de tal forma que las clulas magnetizadas son desviadas radialmente.
nicamente las clulas hematopoyticas de la suspensin son marcadas con partculas
superparamagnticas gracias a una interaccin especfica antgeno-anticuerpo. En el separador, las clulas magnetizadas son desviadas hacia la salida opuesta a la inyeccin,
mientras que las no marcadas no deben en principio ser desviadas. Las clulas hematopoyticas pueden as ser aisladas y seleccionadas para ser utilizadas con fines teraputicos o de diagnstico. Este tipo de separacin es llamada inmunomagntica. Dos efectos hidrodinmicos estn implicados en este tipo de separacin: la difusin inducida
por el esfuerzo de corte y al arrastre o la traccin hidrodinmica. Los dos efectos son
colectivos. Entendemos por colectivos, los efectos que implican muchas partculas en
interaccin. La difusin hidrodinmica inducida por el corte (Leighton y Acrivos, 1986
y 1987) est ligada al flujo de un grupo de partculas en un campo de velocidades. Las
clulas cuando entran al canal son dirigidas por el lquido vector hacia una regin
vecina a una de las paredes donde las variaciones o gradientes de velocidad son importantes. Las partculas que se encuentran ms lejos de la pared tendrn una velocidad
ms grande que las que son transportadas ms cerca de la pared. Esta situacin engendra choques o interacciones hidrodinmicas entre partculas generando desplazamientos perpendiculares a la direccin del flujo. Este transporte transversal es puramente hidrodinmico y es independiente del campo de fuerza aplicado. La consecuencia
de esta migracin no especfica es que las especies que no estn afectadas por el campo,
pueden contaminar las fracciones que nos interesan. La migracin es difusiva pero completamente diferente de una difusin browniana, y est caracterizada por un coeficiente
especfico a este tipo de difusin. Este efecto, ya conocido en mecnica de suspensiones,
aplicado a la separacin, es un tema de investigacin actual (Hoyos et al., 2004). El ltimo efecto al cual haremos referencia es el de arrastre o traccin hidrodinmica. Este
efecto est ligado al concepto que ya hemos mencionado: la interaccin hidrodinmi-

Acta Biolgica Colombiana, Vol. 8 No. 1, 2003 23

ca. Una partcula que se desplaza en un lquido crea una perturbacin cuya magnitud
decrece con la distancia. La atenuacin de la perturbacin es lenta y cuando otra partcula se encuentra al alcance de dicha perturbacin, la velocidad de las dos es modificada. Esta interaccin vehiculada por el lquido est bien determinada por las leyes de la
hidrodinmica. Un ejemplo lo observamos fcilmente cuando vemos que dos partculas
vecinas sedimentan en un lquido a una velocidad que es mayor que la de una partcula
aislada. Volviendo a nuestro caso de separacin inmunomagntica, las interacciones
hidrodinmicas de arrastre hacen que la separacin se dificulte ya que cuando las clulas magnetizadas son desviadas por el campo magntico, arrastran las no magnetizadas. El arrastre no es completo y por eso la manipulacin de flujos tiene que hacerse en
forma muy sutil. Los dos efectos son difciles de controlar; otros dispositivos estn siendo estudiados con ese fin y un dispositivo de focalizacin hidrodinmica est siendo
desarrollado (Hoyos et al., 2004). Debemos sealar para terminar, que en el caso de la
separacin y flitracin de clulas sanguneas, la sangre total es un medio complejo
donde protenas y clulas de varias clases cohabitan. El gran desafo consiste en poder
extraer la clase de protena o de clula de una muestra, sin necesidad de tratamiento
previo, sin flitros y sin modificar las concentraciones toleradas.
CONCLUSIONES
Los conceptos tratados en esta revisin, son bastante conocidos por los fsicos y fisicoqumicos dedicados a la mecnica de fluidos. Lo nuevo es el uso de dichos conceptos
por parte de la comunidad de ciencias separativas. La multiplicacin de tcnicas de
separacin y de caracterizacin de especies qumicas hace que esta rama no sea ms
la exclusividad de la qumica analtica. Una rama multidisciplinaria aparece donde la
colaboracin de qumicos, bilogos, fisicos e ingenieros debe hacerse en forma til
y eficaz. Se hizo incapi en el papel que juega la mecnica de fluidos cuando se trata
de la separacin de grandes especies qumicas y en particular de clulas. Las necesidades son inmensas en materia de fraccionamiento y purifiacin. Las tcnicas presentadas, la FFF et la SPLITT, son particularmente adaptadas para la separacin de dichas
especies. Hay que mencionar los avances de la micro y nano tecnologas en materia de
separacin gracias al desarrollo de la microfludica y los MEMS (Micro ElectroMecanical
Systems), tema que abordaremos en una publicacin futura.
AGRADECIMIENTOS
A Ecole Suprieure de Physique et Chimie Industrielles y a la DIB, Universidad Nacional
de Colombia por el apoyo como Profesor Visitante a Mauricio Hoyos, julio de 2003.
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