LABORATORIO DE EQUILIBRIO

Y CINTICA QUMICA
FUNDAMENTOS DE
ESPECTROFOTOMETRA

CONTENIDO
1.

Introduccin
Mtodos Instrumentales de Anlisis:

Mtodos pticos. Clasificacin

Radiacin electromagntica

Espectro electromagntico

2.

Absorcin de radiacin electromagntica

3.

Fundamentos de la espectrofotometra de absorcin UV-Vis

4.

Teora de la absorcin de radiacin UV-Vis

Espectro de absorcin
Especies absorbentes. Tipos de transiciones electrnicas
Bases del color

Leyes de la absorcin de la radiacin: Ley de Lambert Beer

Limitaciones y Desviaciones de la Ley de Beer

5.

Instrumentacin

6.

Aplicaciones analticas

Caractersticas analticas del mtodo

Anlisis cuantitativo. Detalles del procedimiento experimental
Aplicaciones al anlisis de alimentos
2

1. Introduccin

Mtodos Instrumentales de Anlisis

Estn basados en la medida de propiedades qumicas y fsicas de
los analitos con fines cualitativos y cuantitativos.
La medida se realiza en un instrumento apropiado.
Propiedad medida

Mtodo Instrumental

Mtodo
Instrumental

Absorcin de radiacin

Espectrofotometra de
absorcin

ptico

Emisin de radiacin

Espectroscopa de emisin

ptico

Potencial elctrico

Potenciometra

Electroanaltico

Corriente elctrica

Voltamperometra

Electroanaltico

Resistencia elctrica

Conductimetra

Electroanaltico
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1. Introduccin

Mtodos pticos de anlisis

Mtodos que miden alguna propiedad de la radiacin electromagntica

emitida por la materia o que interacciona con ella

Clasificacin

Mtodos espectroscpicos: Existe intercambio de energa entre la

radiacin electromagntica y la materia
Mtodos de absorcin: Miden la disminucin de la potencia de la
radiacin electromagntica debida a la absorcin que se produce en su
interaccin con el analito
Mtodos de emisin: Miden la radiacin electromagntica emitida
cuando el analito es excitado por energa trmica, elctrica o radiante
Mtodos no espectroscpicos: Se producen cambios en la direccin o en
las propiedades fsicas de la radiacin electromagntica:
Dispersin
Refraccin
Difraccin
Rotacin ptica
4

1. Introduccin

La radiacin electromagntica
La radiacin electromagntica es una forma de energa que
se transmite por el espacio a gran velocidad sin soporte de
materia.
La radiacin electromagntica puede describirse segn:

la teora ondulatoria: formada por ondas sinusoidales

la teora corpuscular: flujo de partculas o corpsculos de
energa llamados fotones

1. Introduccin

Teora ondulatoria . Parmetros ondulatorios

La radiacin electromagntica (REM) se representa como ondas

consistentes en campos elctricos y magnticos que estn en fase y que
oscilan sinusoidalmente de manera perpendicular entre s y respecto a la
direccin de propagacin
Parmetros ondulatorios
Campo elctrico y

Longitud de onda
Amplitud A

Campo magntico z

Direccin x

La potencia P: es la energa del haz que llega

a un rea dada por segundo
6

1. Introduccin

Teora corpuscular. Propiedades corpusculares de la radiacin electromagntica

La radiacin electromagntica es considerada como paquetes discretos de
energa llamados fotones o cuantos.
Dualidad onda-partcula:
Un fotn es una partcula de radiacin electromagntica con masa cero y energa
E proporcional a la frecuencia de la radiacin
La energa de un fotn: E = h
E = energa del cuanto de radiacin: Cal mol-1
= frecuencia de la radiacin : hertzio (Hz) = ciclos s-1
h = constante de Planck = 6,624 10-27 erg s
Velocidad de la luz : v =
Velocidad de la luz en el vaco: c = 3,00 1010 cm s-1
Energa de un fotn :E = h = h c /

m = 10-6 m
nm = 10-9 m
= 10-10 m

Cuando aumenta, disminuye la energa y frecuencia del fotn

7

1. Introduccin

Espectro electromagntico

Abarca un intervalo muy amplio de

longitudes de onda o energas.
Segn su recibe diferentes
nombres.
La luz visible, que es la nica
perceptible por el ojo humano,
representa solamente una
pequea parte del espectro, desde
350-380 a 750-780 nm.

2. Absorcin de radiacin electromagntica

Absorcin: proceso por el cual una especie, en un medio

transparente, capta selectivamente ciertas frecuencias de la
radiacin electromagntica.
El fotn absorbido hace pasar a la especie de su estado
fundamental a un estado excitado de energa M*:
M + h M*
Tras un corto perodo de tiempo, aproximadamente 10-8 a 10-9 s,
se pierde la energa de excitacin, generalmente en forma de
calor, y la especie M vuelve a su estado fundamental:
M* M + calor
Los mtodos de absorcin tienen la ventaja de producir poca o
ninguna alteracin en el sistema estudiado.
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2. Absorcin de radiacin electromagntica

Requisitos

Para que la radiacin electromagntica sea absorbida por la materia

deben cumplirse dos condiciones generales:
1) debe haber una interaccin entre el campo elctrico de la
radiacin y alguna carga elctrica de la sustancia
2) La energa de la radiacin incidente debe ser exactamente igual
a la energa cuantizada que requiere la sustancia.

Ecuacin de Bohr

E = Ef Ei = h

h : energa del fotn absorbido

Ei: energa total de la materia en el estado fundamental
Ef: energa total de un estado permitido de energa superior o estado
excitado.
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3. Fundamento de la Espectrofotometra de Absorcin UV-visible

Mtodo instrumental ptico basado en la medida directa de la

absorcin de radiacin electromagntica UV-Visible, por las
molculas del analito contenido en la muestra.
La regin ultravioleta comprende entre 10 y 400 nm y la
regin visible comprende entre 350 y 750 nm.
Las radiaciones UV y visible tienen en comn el hecho de
que la absorcin de ambas regiones por molculas, provoca
la excitacin de e- de enlace a niveles de E superiores.

Los picos de absorcin pueden correlacionarse con los tipos

de enlaces de la especie absorbente, base de su aplicacin
cualitativa
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3. Fundamento de la Espectrofotometra de Absorcin UV-visible

Un analito molecular tiene la capacidad de absorber ciertas

longitudes de onda caractersticas de la radiacin
electromagntica UV-Visible.
En este proceso, la radiacin es transferida temporalmente a la
molcula y, como consecuencia, disminuye la intensidad de la
radiacin.
Dicha disminucin, debida a la absorcin experimentada por el
analito, puede ser cuantificada utilizando diversas magnitudes,
siendo la Absorbancia, A, la ms comnmente utilizada en la
espectrofotometra de UV-Vis.
La aplicacin cuantitativa de la espectroscopa de absorcin
UV-Vis se basa en la medida, a una fija, de la A de una
disolucin del analito contenida en una cubeta transparente de
camino ptico b cm.
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3. Fundamento de la Espectrofotometra de Absorcin UV-visible

Atenuacin de un haz de radiacin por

una especie absorbente contenida en la
cubeta

Radiacin
incidente

Transiciones energticas en la
molcula del analito
E2

Disolucin de analito de
concentracin c

E2 = E2-E1=h2= hc/2

Radiacin
transmitida

P0

E1

E1 = E1-E0=h1 = hc/1

Cubeta

E0
Espectro de absorcin

Transmitancia = T = P/P0
Absorbancia = A = - log T = log P0 /P

Absorbancia A

, nm

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3. Fundamento de la Espectrofotometra de Absorcin UV-visible

Transmitancia y absorbancia

Transmitancia (T): fraccin de radiacin que una sustancia deja pasar

cuando la REM atraviesa la muestra.

Transmitancia = T = P/P0
T puede valer desde 0 hasta 1. %T puede valer desde 0 hasta 100 %

Absorbencia (A): es la atenuacin de la intensidad de la radiacin cuando

sta incide sobre una muestra. Es la cantidad de energa que la sustancia toma
para pasar a un estado ms excitado.
A aumenta a medida que aumenta la atenuacin de la radiacin.
Cuando no hay absorcin de radiacin Po= P y entonces A = 0,, mientras que si
se absorbe el 99% de la radiacin, solo se transmite el 1%, la A = 2

Absorbencia = - log T = log P0 /P

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3. Fundamento de la Espectrofotometra de Absorcin UV-visible

Espectros de absorcin
representacin
grfica
de
la
absorbancia de un analito (o de otra
magnitud equivalente) en funcin de la
longitud de onda de la radiacin (o de
otro parmetro relacionado con la
energa de la radiacin utilizada).
El mximo de absorbancia obtenido
en el espectro de absorcin de un
analito, nos dar la longitud de onda
que proporciona la mayor sensibilidad
posible, y por tanto ser la que se
utilizar
en
el
anlisis
espectrofotomtrico de dicho analito.

Absorbancia A

Un espectro de absorcin es una

max

nm

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3. Fundamento de la Espectrofotometra de Absorcin UV-visible

Teora del color

La sensacin de color se produce cuando disminuye

apreciablemente una o ms zonas de la regin visible.
Si el ojo recibe luz de todas las de la regin visible el efecto es
luz blanca.
El color aparente siempre es el color complementario del que ha
sido eliminado.
Los colores complementarios son tiles para predecir la de
absorcin de los compuestos coloreados: una disolucin
amarilla, absorber luz azul 450-480 nm, para analizarla debemos
usar luz con esta seleccionada con el monocromador o bien
usar un filtro azul, que transmite esta luz azul
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3. Fundamento de la Espectrofotometra de Absorcin UV-visible

(nm)
380-420
420 - 440
440 - 470
470 - 500
500 - 520
520 - 550
550 - 580
580 - 620
620 - 680
680 - 780

Color absorbido
violeta
azul-violeta
azul
verde-azul
verde
amarillo-verde
amarillo
anaranjado
rojo
prpura

complementario
(nm)
Color observado
520 - 550
amarillo-verde
550 - 580
amarillo
580 - 620
anaranjado
620 - 680
rojo
680 - 780
prpura
380 - 420
violeta
azul-violeta
420 - 440
440 - 470
azul
470 - 500
verde-azul
500 - 520
verde

Una disolucin se observa de color azul cuando se ilumina con luz policromtica, porque absorbe
580-620 nm (anaranjado) y transmite o deja pasar 440-470 nm (azul)
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4. Leyes de la absorcin de la radiacin

Ley de Lambert-Beer
Al interaccionar la radiacin electromagntica con la materia, tiene lugar la
absorcin si la de la radiacin coincide con la energa necesaria para que el
sistema pase a un nivel de energa superior y permitido
h = E2 - E1
Las dos leyes fundamentales que rigen el comportamiento de la fraccin de
la radiacin incidente absorbida al pasar a travs de una muestra dada son:
Ley de Lambert: predice el efecto que produce el espesor del medio-muestra
sobre la fraccin de radiacin que se absorbe.
Ley de Beer: establece el efecto de la concentracin del medio-muestra
sobre la fraccin de radiacin que se absorbe.

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4. Leyes de la absorcin de la radiacin

Ley de Lambert-Beer: muestra cmo la absorbancia es directamente

proporcional a la longitud b de la trayectoria a travs de la solucin y a la
concentracin c del analito o especie absorbente.

A abc

A bc

a: cte de proporcionalidad llamada absortividad. (unidades L/cmg, si

c=g/L)
b: longitud del camino que recorre la radiacin a travs del medio
absorbente.
c: concentracin expresada en g/L (mg/L, ...).
Si la concentracin c viene expresada en mol/L, la cte de proporcionalidad se
denomina absortividad molar y se representa por (unidades L/cmmol).
La absortividad molar, , es caracterstica de cada especie a una determinada19

4. Leyes de la absorcin de la radiacin

Potencia del haz

antes de
atravesar la
muestra

Ley de Lambert- Beer

Absorbencia
total medida
a la longitud
de onda l

Absortividad
molar

P0
AT,l = log
=bc
P

P
= Transmitancia (T)
P0
A = -logT

Concentracin molar
de las especies
absorbentes

camino ptico
(celda)
Potencia del haz
despus de
atravesar la
muestra

A=bc
Ley de Lambert- Beer

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4. Leyes de la absorcin de la radiacin

Comprobacin de la Ley de Beer. Curva de calibrado

La Ley de Beer debe comprobarse siempre antes de utilizarla para un anlisis
cuantitativo exacto.
Para ello se preparan una serie de disoluciones estndar del analito en el
intervalo en el que se supone que se encuentra la muestra.
Se registra el espectro de absorcin utilizando una de ellas.
Se mide la absorbencia de dada una de las disoluciones a la del mximo de
absorcin del analito con una longitud de celda dada, generalmente 1 cm.
Se representan las absorbancias en funcin de las concentraciones.
Si la ley de Beer se cumple en todo el intervalo de c estudiado: A = bc se
obtiene una lnea recta en todo el intervalo, que pasa por el origen.
La recta obtenida se llama Curva de calibrado.
Pueden aparecer desviaciones positivas o negativas a partir de una
determinada concentracin debido a Limitaciones de la ley de Beer y/ a
posibles errores experimentales cometidos
21

4. Leyes de la absorcin de la radiacin

Desviaciones de la Ley de Beer

La proporcionalidad directa entre absorbancia y concentracin cuando b es constante, slo
se cumple en un intervalo de concentraciones del analito.
Fuera de dicho intervalo se observan en las curvas de calibrado desviaciones positivas o
negativas de la linealidad debido a las limitaciones de la Ley de Beer:
A
A= bc
respuesta del blanco,
interferencias o escasa
sensibilidad

Intervalo
lineal

respuesta debida
a la autoabsorcin
o a la luz escasa que
atraviesa la cubeta

concentracin

Para la aplicacin cuantitativa, las medidas de A de la muestra deben estar incluidas

en el intervalo lineal

22

5. Instrumentacin

Espectrofotmetros

23

5. Instrumentacin

Componentes bsicos de los espectrofotmetros

Fuente de
energa
radiante

Cubeta
muestra

Selector
de

Detector

Dispositivo de
lectura

Muestra

Fuente de
radiacin

Monocromador

Luz
compuesta

Detector

Luz
monocromtica

I0

I
b

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5. Instrumentacin

Fuente de energa radiante

Caractersticas

intensidad lumnica

Continua. Estable. Intensa

Lmpara de
Deuterio

300
Para en el
Ultravioleta

500

Lmpara de
Tungsteno o Wolframio

700

900

Para en
el Visible

1100

longitud de onda (nm)

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5. Instrumentacin

Selector de
Caractersticas

longitud de onda de mxima transmisin

ancho de banda efectivo

Filtros de corte

Filtros de absorcin

Monocromadores de prisma
Monocromadores de red

Filtros de interferencia

Fotmetros

Espectrofotmetros
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5. Instrumentacin

Celdas
Caractersticas
Absorcin mnima a la longitud de onda de trabajo
Colocar con caras transparentes perpendiculares a la direccin del haz incidente

Slice

Ultravioleta

Vidrio o plstico

Visible

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5. Instrumentacin

Detectores
Su funcin es convertir la respuesta del instrumento en una seal medible.
Caractersticas

deben responder a un amplio rango de longitudes de onda

deben dar respuesta rpida
deben ser sensibles a bajos niveles de radiacin
deben producir seal elctrica fcilmente amplificable
la seal debe ser proporcional a la potencia radiante

Fototubos

Fotomultiplicadores

Fotodiodoarray
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6. Aplicaciones analticas

La espectrofotometra de absorcin molecular se puede aplicar tanto al anlisis

cualititativo como cuantitativo.
Anlisis cualitativo: los espectros de la muestra se comparan con los de los
correspondientes estndares, con el fin de identificar las bandas de absorcin
coincidentes. Este tipo de anlisis es ms frecuente en UV e IR para identificar
compuestos orgnicos y ms rara vez se utiliza en Vis.
Anlisis cuantitativo: est basado en la ley de Lambert-Beer en el intervalo de
concentraciones de cumplimiento de la ley.
Se establece la curva de calibrado usando estndares y la absorbancia de la
muestra de concentracin desconocida se remite a la curva (a veces basta con un
solo estndar).
En espectrofotometra Vis, el analito se suele incorporar a una especie compleja
que presente bandas de absorcin intensas.
Siempre que sea posible se debe medir la absorbancia a max
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6. Aplicaciones analticas

Caractersticas de los mtodos espectrofotomtricos

Amplia aplicabilidad: Anlisis orgnico e inorgnico

Elevada sensibilidad: los lmites deteccin de 10-4 a 10-5 M.

Selectividad de moderada a alta.
Buena exactitud: errores de concentracin 1-5% o incluso menores.
Facilidad y comodidad en las medidas espectrofotomtricas.
Se prestan a una fcil automatizacin.

Campo de aplicacin
Especies absorbentes: compuestos orgnicos que contengan grupos
cromforos y especies inorgnicas como son los metales de transicin.
Especies no absorbentes: los analitos reaccionan con un reactivo para
producir un compuesto absorbente.
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6. Aplicaciones analticas

A (l = 508 nm)

Calibracin con patrones de concentracin conocida

A
muestra
Analito en la
muestra

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