Facultad de Ciencias Biolgicas

REPORTE FINAL DE
Licenciatura en Biotecnologa
LABORATORIO DE
INGENIERA GENTICA
ITZEL ANAYANSI SOLIS GARCIA
DIANAYELI MORALES HERNNDEZ
MIGUEL NGEL JIMNEZ BURTON
IVN ALEXANDER SANTOS CABRERA

Introduccin
La transformacin gentica se usa como base en muchas reas de la biotecnologa y es
una de las herramientas ms sobresalientes de la biologa molecular. A ste fenmeno
conocido cmo transformacin bacteriana o gentica, se le conoce como el proceso
mediante el cual las clulas tienen la capacidad de adquirir y mantener DNA exgeno en
su interior con el fin de incorporarlo a su genoma y expresarlo en una situacin, para
que esto ocurra, la clula debe estar en un estado de competencia y se presentan
diferentes condiciones fisiolgicas [1].
En bacterias el proceso de transformacin natural tiene una eficiencia muy variable
dependiendo de la especie con que se trabaje, por ello existen metodologas que
aumentan la probabilidad de transformacin [1] [2]. La primera parte de un proceso de
transformacin a nivel laboratorio consta de cuatro etapas: (I) el desarrollo de un estado
de competencia en la clula, (II) la unin de la molcula de DNA a la superficie de
celular, (III) su entrada y procesamiento y (IV) la expresin fenotpica del nuevo
genotipo. Adems, en esta parte ocurre la preparacin del DNA exgeno o vector que se
quiere introducir, dnde se engloban tcnicas in silico e in vitro como prediccin del corte
de las enzimas, bsqueda de secuencias, PCR, electroforesis, anlisis del gel, etc. [3]
Todo lo anterior con el fin de obtener microorganismos que tengan la capacidad de
heredar una nueva caracterstica adquirida a la progenie. Y en la segunda etapa se trata
de preservar este nuevo fondo gentico aislndolo e almacenndolo para tenerlo en
existencia.
A la cantidad de clulas transformadas por g de DNA es llamada eficiencia de la
transformacin. Durante la prctica se utilizan de 5 a 10 ng de DNA, ya que el exceso
puede inhibir la trasformacin. Los vectores son instrumentos muy tiles para ste
proceso y la posibilidad de realizarle modificaciones antes de ser introducidos tambin
[4].
Un ejemplo y el usado en ste trabajo es el introducir la resistencia a un antibitico en
una cepa que antes no la tena, lo que le otorga una ventaja competitiva en el medio o
en contacto con otras especies y permite a nivel laboratorio la seleccin de las mutantes
[5].
El fin de ste escrito es tener un registro de lo realizado en el laboratorio de Ingeniera
gentica a lo largo del curso, haciendo una recopilacin y anlisis de los resultados
obtenidos al realizar y concluir un proceso de transformacin de Escherichia coli, dnde
se introdujo el plsmido recombinante pUC19 que contena el gen de resistencia a
ampicilina y se le introdujo el gen aacC1, que le permite la resistencia a gentamicina y
proviene de pBSL-141 [5].

Metodologa
Para la extraccin de ADN plasmdico se emplearon dos cultivos de Escherichia coli,
cada uno portador de los plsmidos pGEM-TEasy-XY-Km y pUC19 que contenan un
gen de resistencia a ampicilina, se saba que estas cepas ya haban sido cultivadas y
seleccionadas de acuerdo a ese antibitico. Posteriormente se siguieron 2 mtodos para
la extraccin de los plsmidos, el pGEM-TEasy-XY-Km se extrajo por lisis alcalina
seguida de una purificacin con slica, el cual fue resuspendido en 20 L de RNAsa

diluida; y el pUC19 por el mtodo calor-perclorato de sodio, el cual se resuspendi en 30

L de RNAsa diluida. Por medio de una electroforesis en gel de agarosa al 1%, en buffer
TAE 1X, se visualizaron las extracciones con un transiluminador.

Teniendo ya aislados los vectores se prosigui con la digestin del vector pUC19, de
2686 pb, y la restriccin del vector pBSL141, vector que contiene el inserto de inters
tratndose del gen que codifica para la enzima gentamicina 3-acetiltransferasa, aacC1,
con la enzima de restriccin EcoR1, y el anlisis de los productos de la digestin se
realiz mediante una electroforesis en gel de agarosa. Tambin se realiz la restriccin
del vector pGEM-TEasy, el cual tiene el gen aacC1 que proviene del vector pBSL141
con EcoR1.
Para la purificacin del cassette de aacC1, se corri una muestra en un gel de agarosa
teido con Red Gel, se visualiz en un fotodocumentador y se cort la banda
correspondiente, despus esta fue purificada por slica.
Ya purificados el vector (pUC19) y el inserto (aacC1) se sigui con la reaccin de
clonacin, es decir su ligacin, por medio de la enzima T4 ligasa, para ello se utiliz una
relacin molar de 1:3 (vector: inserto,1:3), se utilizaron 30 ng de DNA vector y 10.38 ng
del DNA inserto.
Para continuar con el proceso de clonacin se transformaron clulas competentes
qumicas de E. coli Top 21 por choque trmico con el producto de la ligacin (pUC19+
aacC1), por 2 minutos a 42C; para el control positivo el vector pGLO fue transformado
de igual manera en clulas competentes. Despus de un tiempo de recuperacin de las
clulas transformadas en un medio liquido de LB, se tom una alcuota de 300 L, se
sembraron y esparcieron con perlas de cristal estriles en 2 placas con medio de cultivo
LB, con 100 g/mL de ampicilina y 10 g/ml de gentamicina para su seleccin. Las que
crecieron en este medio fueron las elegidas.
Para finalizar se analiz por PCR en colonia a las clonas transformadas, antes de este
paso se prepar a las clulas transformantes en un tubo eppendorf, posteriormente se
continuo con la PCR donde se utilizaron oligonucletidos especficos al gen que codifica
para la enzima gentamicina 3-acetiltransferasa, el termociclador se program de
acuerdo a su temperatura de alineamiento. Para verificar los resultados la muestra se
corri en un gel de agarosa al 1%, el tamao de banda esperado fue de
aproximadamente 1000pb.

Resultados y discusin

: marcador de peso molecular, 1: pGEM-TEasy, lisis alcalina y purificado con slica, 2: pUC19 mediante perclorato de sodio, 3: pUC19

Con el fin de observar la integridad y calidad de las extracciones se realiz una

electroforesis en gel de agarosa para comparar los resultados (Ilustracin 1). Se puede
observar la banda obtenida del plsmido pGEM-TEasy (3015 pb) en el pozo 1, las
bandas 2 (extrada mediante mtodo de perclorato de sodio) y 3 corresponden al pUC19
(2686 pb).
Cuando se lleva a cabo una extraccin de DNA plasmdico se pueden llegar a encontrar
tres conformaciones de ste como son la superenrrollada, relajada y lineal, por lo que al
correr un gel se pueden encontrar hasta tres tipos de bandas, las cuales corresponden a
la misma molcula y las mismas pb, sin embargo, difieren en la forma que tienen,
afectando su velocidad de migracin; en esta ocasin se logra observar 2 bandas en el
pozo 3, puede ser el plsmido en una configuracin de superenrrollamiento (superior) y
relajada (inferior).
Las restricciones de los plsmidos pUC19 y pBSL141 (inserto aacC1), fueron realizadas
por la enzima Ecor1, la cual realiza cortes cohesivos y reconoce las secuencias
5GAATTC-3CTTAG. Los fragmentos de la digestin fueron observados en una
electroforesis mediante un gel de agarosa, la digestin de pUC19 muestra nicamente
una banda de 2686 pb (Ilustracin 2.A), esto se debe a que este plsmido solo tiene un
sitio de corte para esta enzima, el resultado se compar mediante la herramienta
NEBCutter para observar la digestin in silico (Ilustracin 2.B) el cual coincide con los
resultados mostrados en los pozos 1-6 con un fragmento de 2686 pb. La digestin de
pBSL141 (3886 pb) tiene dos sitios de corte con EcoR1, uno a las 701 pb y otro a 1626
pb, dando como resultado un fragmento de 2961 pb y uno de 925 pb, en este ltimo se
encuentra el inserto de inters, aacC1, gen que codifica para la enzima gentamicina 3acetiltransferasa, el cual confiere resistencia a este antibitico, de igual manera se
realiz su digestin in silico como se observa en la Ilustracin 2.C.
1 2 3

4 5 6 7

8 9 10 11 12 M

Gm-R

Ilustracin 2: Resultado de restricciones A) Resultado electrofortico en gel de agarosa: M: marcador de peso

molecular (3Kb),1-6: pUC19-EcoRI, 7-12 pGemTeasy-XY-Km-EcoRI B): Digestin in silico mediante NEBcutter
pUC19-EcoRI, fragmento de 2686 pb C): Digestin in silico mediante NEBcutter de pBSL141-EcoRI, 2
fragmentos uno de 2961 pb y otro de 925 pb (cassette de aacC1).

706
2997
925

2997

925
706

135
roforesis de las restricciones. M: marcador de peso molcular 1kb, 1:135
Digestin de pUC19 con EcoRI (2686pb), 2: Cassette de Gm-R (925 pb).

EM-TEasy, que tiene clonado un fragmento de 1747 pb, con EcoR1, dando como resultado 4 bandas de 2997 pb, 925 pb, 706 pb y 135 pb.

En la Ilustracin 2.A, apartir del pozo 7-12, se observa el patrn de restriccin del vector
pGEM-TEasy clonado con un fragmento de 1747 pb, en ese regin tambin se
encuentra el gen aacC1 de aproximadamente 534 pb, con la enzima EcoR1, para
analizar la presencia de esas 4 bandas se busc la secuencia del plsmido pBSL141,
dentro se localiz el cassette de resistencia aacC1 y se tomaron los 1747 nucletidos
que abarcaran los sitios de restriccin XhoI y EcoRI que son muy similares y estn casi
en el mismo lugar, solamente se selecciona esa zona. Posteriormente se buscaron los
sitios de restriccin del pGEM-TEasy con EcoRI y se quitaron los nucletidos del 52-71
reemplazndolos con el cassette de aacC1, para despus correrlos en el programa
Snapgene, dando como resultado un vector de 4750 pb, en la Ilustracin 3 se observa el
posible vector y los fragmentos que se tendran al digerirlo con la enzima EcoR1, los
cuales coinciden con los patrones de restriccin, Ilustracin 2.A del pozo 7-12,
realizados en la practica.
Mediante un gel de agarosa se observ la calidad de los fragmentos digeridos (pUC19 y
el cassette de aacC1) para realizar la clonacin (Ilustracin 4), en el carril uno se tiene
una banda de 2686 pb, correspondientes a pUC19, y en el carril 2, el cassette aacC1 de
aproximadamente 925 pb, para obtener solo este fragmento de DNA se cree que cuando
se realiz la restriccin tambin se hizo una PCR para obtener solo el inserto, ya que
EcoR1 genera 2 fragmentos de DNA los cuales no se observan en la Ilustracin 4; todo
esto fue de utilidad para la purificacin de banda por el mtodo de slica.
Despus de tener la ligacin, pUC19+ aacC1, se continu con la transformacin
gentica por choque trmico de clulas competentes qumicas de la cepa de E. coli
Top21, cuyo fondo gentico es F-hsdR, -Amp y -Gm-R, se sembraron en un medio LB
que contenan dos antibiticos, ampicilina y gentamicina como marcadores de seleccin,

por lo que nicamente creceran las clonas con el vector pUC19+ aacC1 que le
conferira resistencia a ambos antibiticos, lo que resultara una clonacin exitosa. Si se
hubiera sembrado primero con ampicilina se concluira que las clonas obtenidas
tendran el plsmido pUC19 y para confirmar que tienen el inserto, se resembraran en
un medio LB con gentamicina donde las que crecieran llevaran el plsmido pUC19+
aacC1. En s los resultados mostraron formacin de 6 colonias con un indice de
crecimiento de 3 UFC/ng. De acuerdo a estos resultados, a pesar de que crecieron
pocas colonias, al hacer la PCR utilizando oligos especificos, se obtendra un amplicon
correspondiente al gen de resistencia a gentamicina, de aproximadamente 1000 pb
porque esas clonas fueron capaces de crecer en un medio con ambos antibiticos, lo
que indica que tienen los dos genes que les dan esa resistencia. Con respecto a las
clulas tranformadas con pGLO, control, tienen un gen de resitencia a ampicilina por lo
cual pueden crecer en un medio con este antibiotico pero no en gentamicina.
Se finaliz con la PCR por colonia, para corroborar la presencia del gen que codifica
M

sa del amplicn Gm-R. M: marcador de peso molecular (3kb), 2-10: se observa una banda de aproximadamen

para la enzima gentamicina-3-acetiltransferasa en el plsmido pUC19, se visualiz en un

gel de agarosa un amplicn de aproximadamente 1000 pb (Ilustracin 5), sin embargo,
en el pozo 1 no hay ninguna banda (de este equipo), lo cual no coincide con los
resultados obtenidos de la tranformacin, ya que si hubo crecimiento de 6 colonias, por
ello se podra concluir que al analizar las clonas no se tomo correctamente la azada de
las colonias o fue muy poco, durante el procedimiento fueron afectadas las clulas, o
tambin hubo algun error en la metodologa para hacer PCR, dnde no se tom
correctamente la muestra, falt aadir algun reactivo, como los oligonucletidos, o la
manipulacin fue incorrecta.

Conclusin.
La tcnica de transformacin bacteriana requiere el entendimiento de bsico de
Ingenieria gentica adems de paciencia y cuidado, especialmente en las etapas de
seleccin de nuestro DNA de inters que queremos clonar. El producto de la ligacin es
introducido en una cepa bacteriana por transformacin, y se seleccionan los clones
recombinantes por la resistencia al antibitico portada por el plsmido.

En nuestro trabajo realizamos una transformacin bsica para que la bacteria pudiera
desarrollarse en un medio con gentamicina, los resultados fueron favorables debido a la
presencia de colonias transformadas, sin embargo este resultado no coincide con la
reaccin de PCR para el cartucho insertado, por ello concluimos que el procedimiento
de la reaccin hubo errores que afectaron el ultimo resultado. La clonacin de un
fragmento de DNA en un plsmido; por ejemplo de un gen de inters, es de gran inters
biotecnolgico y ayuda a disminuir procesos de produccin.

Referencias
[1]

S. Sinha, J. Mell, R. J. Redfield, and B. Columbia, Bacterial Transformation, vol. 1.

Elsevier Inc., 2013.

[2]

G. Wilharm, D. Lepka, F. Faber, J. Hofmann, T. Kerrinnes, and E. Skiebe, A

simple and rapid method of bacterial transformation, J. Microbiol. Methods, vol.
80, no. 2, pp. 215216, 2010.

[3]

Y. Serrano-rivero and A. H. R. Fando-calzada, Comparacin de dos mtodos para

la preparacin de clulas competentes en Escherichia coli, Rev. CENIC. Ciencias
Biolgicas, 2013.

[4]

J. Manuel, B. Luis, K. Marrero, J. M. Snchez, E. Suzarte, J. Campos, B. L.

Rodrguez, Y. Silva, T. Ledn, and E. Martnez, Obtencin y caracterizacin de
mutantes de V ibrio cholerae auxtrofos a la metionina, 2005.

[5]

A. R. Poteete, C. Rosadini, and C. S. Pierre, Benchmarks Gentamicin and other

cassettes for chromosomal gene replacement in Escherichia coli, vol. 41, no. 3,
pp. 261263, 2006.