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METODOS PARA LA DETERMINACIN DE CARBOHIDRATOS.

INTRODUCCIN.
Qu son los carbohidratos, Algunos ejemplos y algunos mtodos.
Mtodos
Se denominan carbohidratos a aquellos que responden a la frmula
emprica Cn(H2O)n. Entre los muchos elementos de nuestra
alimentacin los carbohidratos (conocidos tambin como hidratos de
carbono, sacridos o glcidos) son una de las sustancias principales
requeridas por nuestro organismo debido a su alto aporte energtico,
stos se encuentran en azcares, almidones y fibra. En todos los
seres vivos se encuentran presentes los carbohidratos en el material
gentico a causa de la desoxirribosa y la ribosa presentes en l.
Mtodos Qumicos
-Mtodo de cido Fenol Sulfrico: se basa en los productos de reaccin y
degradacin del cido y del azcar, en donde el azcar se torna
fundamentalmente hidroximetilfurfural (HMF) o furfural (F), leyendo una
absorbancia a 490nm generando colores amarillos y anaranjados.
-Mtodo de cido Sulfrico: sus fundamentos son los mismos del mtodo de
cido Fenol Sulfrico, se diferencia en que los colores que se observan son
azules y verdes leyendo una absorbancia de 620nm.
*Estos mtodos si bien son fciles, rpidos, no interfieren con las protenas y
los resultados son confiables y reproducibles, si los carbohidratos no
proporcionan HMF o F en la descomposicin cida, la muestra arrojar una
amplia gama de colores.
MTODOS PARA LA DETERMINACIN DE AZCARES REDUCTORES:
Mtodo Volumtrico o Propuesta de Lane-Eynon (1923)
Este mtodo se basa en la determinacin del volumen de una disolucin de la
muestra, que se requiere para reducir completamente un volumen conocido del
reactivo alcalino de cobre. El punto final se determina por el uso de un
indicador interno, azul de metileno, el cual es reducido a blanco de metileno
por un exceso de azcar reductor.

Este mtodo se puede aplicar en productos como leche evaporada y


condensada, productos lcteos, jarabes, mieles, mermeladas, nctares y jugos,
dulces y moles.
-Reactantes, procedimiento.
Mtodo Fehling-Soxhlet

Este es el mtodo qumico ms aconsejable para utilizar. El fundamento de


ste es que precipita el xido cuproso (Cu 2O) en presencia de una sustancia
reductora.
Para este mtodo se utilizan dos soluciones:
-Solucin a: sulfato de cobre cristalino.
-Solucin b: tartrato de sodio y potasio (o citrato de sodio) + hidrxido de sodio
(o hidrxido de potasio o carbonato de sodio).
1. El citrato o tartrato evita la precipitacin del hidrxido cprico el lkali
enoliza a los azcares provoca su rompimiento en fragmentos reactivos
que pueden oxidarse inmediatamente: Cu++ (cprico) es reducido a Cu+
(el in cuproso).
2. A medida que los iones Cu++ se reducen por los fragmentos de azcar,
los iones Cu+ se combinan con los iones hidroxilo para formar hidrxido
de cobre (de color amarillo, Cu+).
3. El CuOH reducido pierde H2O en presencia de calor para dar como
resultado xido cuproso insoluble (Cu2O).
4. La determinacin del cobre reducido se puede llevar a cabo por
gravimetra, volumetra, o por mtodos electrolticos. El peso del Cu 2O
slo es aplicable a muestras relativamente puras.
Si bien este mtodo es uno de los mtodos qumicos ms utilizados, presenta
una serie de desventajas, entre ellas est que la reduccin del cobre y la
oxidacin de los azcares no es estequiomtrica. Otra es que la produccin de
xido cuproso vara, dependiendo del reactivo lkali, la velocidad y tiempo de

calentamiento y la concentracin de azcares en la muestra, adems, los


azcares difieren en su habilidad para reducir la solucin cprica, por tanto, la
titulacin (o peso o absorbancia) deben ser convertidos en (miligramos de
cobre) y posteriormente se debe recurrir a tablas para determinar la
concentracin de azcar presente en la muestra.

Mtodo Gavimtrico o La Propuesta de Munson-Walker


Este mtodo corresponde a la cantidad de cobre reducido en presencia de
azcares reductores, en donde el peso de los miligramos de Cu 2O corresponde
a los miligramos de azcares analizados (por medio de las tablas de Munson y
Walker que aparecen en el AOAC).
*Para el resultado de la concentracin final hay que considerar las diluciones.
NaOH + Cu++ + AZCAR REDUCTOR CU+ + AZCAR
(Cu 2O) OXIDADO
La determinacin del Cu2O puede ser gravimtrica, pero es generalmente
mejor titular el xido cuproso. Esto se puede realizar mediante uno de los
siguientes mtodos (se llevan mucho tiempo):
TITULACIN DEL PERMANGANATO DE POTASIO
EL Cu 2O REACCIONA CON EL IN FRRICO (Cu+++) EL CUAL ES REDUCIDO AL
IN FERROSO (Cu++). POSTERIORMENTE EL IN FERROSO ES TITULADO (+2
+3) CON PERMANGANATO (+3, ROSA +2, INCOLORO)
1) Cu 2O + Fe 2(SO 4 )3 2FeSO 4 + CuSO 4 + CuO
2) 10 FeSO 4 + 2KMnO 4 + 8H 2SO 4 5Fe 2(SO 4 )3 + K 2SO4 + 2MnSO 4 +
8H 2 O
TITULACIN DEL TIOSULFATO DE SODIO
SE OXIDA EL Cu + A Cu++ CON CIDO NTRICO. POSTERIORMENTE SE HIERVE
LA MUESTRA PARA ELIMINAR EL EXCESO DE HNO 3
HNO 3
Cu 2

Cu(NO 3 ) 2

SE AADE UNA CANTIDAD CONOCIDA DE SOLUCIN DE KI


2I - + 2Cu++ 2Cu + + I 2

SE TITULA EL I 2 LIBERADO CON UNA SOLUCIN ESTNDAR DE TIOSULFATO DE


SODIO (Na2S2O3)
S2O3-2

I2 + I

I3

S4O6

-2

+ 3I

(TRIIODURO)

SE USA ALMIDN COMO INDICADOR: AZL INCOLORO


Desventajas del mtodo:
-NO SE PUEDE DISTINGUIR ENTRE LOS DIFERENTES AZCARES REDUCTORES.
-SE REQUIEREN MUESTRAS RELATIVAMENTE GRANDES (100 A 200mg DE
GLUCOSA POR DETERMINACIN.
Mtodo Benedict
Mtodo Somogy I-Nelson
Azcar reductor + Cu++ Cu+ + AZCAR REDUCTOR
Procedimiento:

Reactivos para el mtodo de Somogy I - Nelson


Reactivo de Somogy I
NaCO 3 - Carbonato de sodio
NaHCO 3 Bicarbonato de Sodio
KaNaC H O Tartrato de Sodio Potasio 4 H 4 O 6 Tartrato de Sodio Potasio

Reactivo de Nelson
(NH 4)6Mo 7 O24 - Molibdato de amonio
Na 2HAsO 7H 2O Arsenato de Sodio H 2SO 4 cido Sulfrico
CuSO 45H 2O Sulfato de Cobre

Mtodo Fluorimtrico
Este mtodo es posible realizarlo cuando los compuestos de la muestra
absorben la radiacin a una longitud de onda corta y luego emiten radiacin a
una longitud de onda ms larga.
Determinacin de glucosa por medio de este mtodo:
Extraccin con iso-butil metil cetona.
Reaccin con hidracida de cido phidroxibenzoico.
Adicin de reactivo y lectura a una emisin de 470nm.
Excitacin a 454nm.
Mtodo Enzimtico
En este mtodo se requiere de un extracto neutro o cido libre de alcoholes y
metales pesados (ya que no se pueden usar sales de plomo para clarificar los
extractos).
Este mtodo se puede aplicar a una gran variedad de carbohidratos o
compuestos relacionados como monosacridos, disacridos, polisacridos,
cidos, alocholes y polioles.
Reacciones
GLUCOSA OXIDASA

H2O + O2 + GLUCOSA LACTONA DE CIDO DGLUCNICO + H2O


CATALASA

H2O2 H2O + O2
O2 + CROMGENO INCOLORO, REDUCIDO CROMGENO AZL OXIDADO
DETERMINACIN ENZIMTICA DE SACAROSA/GLUCOSA

-LA CONCENTRACIN DE GLUCOSA ES DETERMINADA ANTES Y DESPUS DE LA


HIDRLISIS ENZIMTICA
DETERMINACIN DE LA GLUCOSA ANTES DE LA INVERSIN
-A UN pH DE 7.6 LA ENZIMA HEXOQUINASA (HK) CATALIZA LA FOSFORILACIN
DE GLUCOSA MEDIANTE EL ADENOSIN TRIFOSFATO. EN PRESENCIA DE
GLUCOSA 6 -FOSFATO DESHIDROGENASA (G6P-DH) LA GLUCOSAFOSFATO
PRODUCIDA ES ESPECFICAMENTE OXIDADA POR EL NADP A
GLUCONATOFOSFATO CON LA FORMACIN DE NADP REDUCIDO.

Reacciones:
HK

GLUCOSA + ATP G6P + ADP


G6P-DH

G6P + NADP+ GLUCONATO-FOSFATO + NADPH + H+


EL NADPH FORMADO EN ESTA REACCIN ES ESTEQUIOMTRICO CON LA
CANTIDAD DE GLUCOSA Y SE MIDE MEDIANTE EL AUMJENTO EN
ABOSROBANCIA A 334, 340 365nm.
INVERSIN ENZIMTICA
-A pH DE 4.6 LA SACAROSA ES HIDROLIZADA POR LA ENZIMA -FRUCTOSIDASA
(INVERTASA) A GLUCOSA Y FRUCTOSA:
-FRUCTOSIDASA
SACAROSA + H 2O GLUCOSA + FRUCTOSA
EL CONTENIDO DE GLUCOSA ES CALCULADO DE LA DIFERENCIA DE
CONCENTRACIONES DE GLUCOSA ANTES Y DESPUS DE LA INVERSIN
ENZIMTICA

Mtodo Haderdorn-Hansen
Mtodo del cido 3.5 Dinitrosaliclico (DNS)

Los azcares presentes en una muestra de azcar comercial o de algn


producto azucarado se determinan cuantitativamente por mtodos fsico
(pticos/preferentemente) o por mtodos qumicos.
Se basan en lo mismo: Una de las tcnicas analticas ms potentes consiste en
determinar la cantidad de una sustancia disuelta midiendo la cantidad de
radiacin absorbida por la misma. Esta tcnica se llama Espectrofotometra. Se
puede utilizar el espectrofotmetro para determinar la longitud de onda de
radiacin necesaria para las determinaciones de la cantidad de azucar en las
muestras bajo estudio, comparndola despus con la radiacin absorbida por
un blanco. La regla especfica que relaciona la cantidad de radiacin absorbida
por una sustancia con la concentracion de esa misma sustancia, se llama ley
de Beer.
Fehling, benedict, somogy, hagerdorn-hansen MTODO FLUORIMTRICO
MTODOS ENZIMTICOS CROMATOGRAFA DE GASES CROMATOGRAFA
LQUIDA MTODOS FSICOS

Mtodos Fsicos
Densimetra
Este mtodo proporciona una aproximacin a la cantidad de azcar presente
en soluciones de azcar relativamente pura, ya que la presencia de otros
materiales solubles afecta a la gravedad especfica de una solucin.
*Gravedad especfica: la gravedad especfica de una solucin de azcar es una
funcin de la concentracin de soluto a una temperatura definida.
Determinacin de Carbohidratos por Densimetra:
Para este proceso se utiliza un instrumento de medicin llamado Higrmetro
(tambin utilizado para la medicin de slidos solubles totales), para este
mtodo se ha diseado un higrmetro especial que lee el % de azcar
directamente a 20C.
NDICE DE REFRACCIN FUNDAMENTO
EL NDICE DE REFRACCIN DE UNA SOLUCIN DE AZCAR ES UNA MEDIDA
DE SU CONCENTRACIN.
LAS SOLUCIONES DE DIFERENTES AZCARES DE IGUAL CONCENTRACIN
TIENEN APROXIMADAMENTE EL MISMO NDICE DE REFRACCIN.

POLARIMETRA
Fundamento:
-SI SE PUEDE HACER QUE TODOS LOS RAYOS TENGAN ORIENTADOS SUS
COMPONENTES ELCTRICOS Y MAGNTICOS EN LA MISMA DIRECCIN, LA
RADIACIN SER POLARIZADA EN PLANO. ESTO SE PUEDE LOGRAR MEDIANTE
EL USO DE UN FILTRO POLARIZADOR.
CUANDO LA LUZ POLARIZADA BRILLA EN UNA MOLCULA ASIMTRICA (UN
COMPUESTO QUE NO PUEDE PRODUCIR UNA IMAGEN AL ESPEJO). LA LUZ ES
ROTADA. ESTO ES LLAMADO COMPUESTO PTICAMENTE ACTIVO (e.g.
GLUCOSA).
SI UN COMPUESTO TIENE SIMETRA LA LUZ POLARIZADA NO SER AFECTADA.
EL SEGUNDO FILTRO ES ROTADO MANUALMENTE PARA COMPAGINAR
VISUALMENTE LAS SOMBRAS DE UN COLOR. ESTO ROTA AL RAYO DE LUZ
POLARIZADA DE REGRESO A SU POSICIN ORIGINAL.
SE MIDE EL GRADO DE ROTACIN REQUERIDO.
MAGNITUD DE LA ROTACIN DEPENDIENTE DE:
LA LONGITUD DE ONDA DE LA LUZ UTILIZADA.
LONGITUD DE LA CELDA
NATURALEZA DE LA SUBSTANCIA ACTIVA Y SU CONCENTRACIN
TEMPERATURA

POLARMETROS vs SACARMETROS
POLARMETRO: USA LUZ MONOCROMTICA Y LEE EN GRADOS ANGULARES
(SE DEBE RELACIONAR CON LA CONCENTRACIN DE AZCAR).
SACARMETRO: USA LUZ BLANCA Y LEE LA CONCENTRACIN DE AZCAR
DIRECTA.

Determinacin de carbohidratos totales por Espectrofometra

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