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APNDICE D

1.
1.1.

Apndice D
Material y equipo de laboratorio
Gasas.
Cubreobjetos.
Portaobjetos.
Microscopio.
Balanza.
Mortero con pistilo.
Centrfuga.
Tubos de ensayo de 10 a 15ml.
Caja negra con lmpara de luz blanca.
Espectrofotmetro.

1.2.

Reactivos
25ml de solucin de NaCl al 0.9 %.
Solucin de 2.6 diclorofenolindofenol (DCPIP) (0.012g de DCPIP y aforar a 100ml).

1.3.

Material biolgico
Elodea canadensis
Hielo

1.4.

Desarrollo experimental

Pesar 10 gramos de hoja Elodea canadensis y colocarlos en un mortero cuya temperatura sea de 4 C
con polvo cristal previamente triturado para romper la pared de la clula y as obtener los cloroplastos con
mayor facilidad. Preparar 25ml de solucin de NaCl a 0.9 % y llevarla a 4 C con uso de hielo.
Posteriormente aadir esta solucin al mortero junto con el polvo cristal y las hojas de Elodea y macerar
la mezcla. Una vez maceradas las hojas, filtrar el producto con gasas sobrepuestas (para retirar el detrito de
las hojas) en vasos de precipitado previamente enfriados a 4 C, verter el filtrado en tubos de centrfuga y
centrifugar a 1500 Revoluciones por Minuto (RPM) durante 5 minutos a 4 C con la finalidad de separar el
detrito celular de los cloroplastos.
Al trmino de la centrifugacin para separar completamente el sobrenadante del botn, decantar los
cloroplastos y la solucin salina en vasos de precipitado a 4 C. Una vez ms, verter el sobrenadante en
tubos de centrfuga y esta vez centrifugar a 2500 RPM durante 10 minutos para as formar un botn de
cloroplastos.
Al trmino de la segunda centrifugacin, decantar con cautela el sobrenadante en un vaso de precipitado
para mantener intacto al botn de cloroplastos al cual o a los cules aadir 10ml de solucin de NaCl al
0.9 % a 4 C para resuspender el botn, obteniendo as una solucin abundante en cloroplastos.
Cubrir el tubo de ensayo con la solucin de cloroplastos con papel aluminio para inactivar a los cloroplastos
y se mantener a 4 C.
Para llevar cabo la medicin deben usarse los tubos de ensayo que contenan cada uno solucin de NaCl
al 0.9 %, solucin de cloroplastos y/o 2ml de solucin DCPIP. Estas sern las muestras que se usarn para
medir la absorbancia.