Licenciatura en biologa por competencias

GENETICA MOLECULAR
PRACTICA DE LABORATORIO: comparacin de PCR
en la deteccin de parsitos de Leishmania (Viannia)
spp. en Lutzomyia (Diptera: Psychodidea)

INTRODUCCION
La leishmaniosis o leishmaniasis es una enfermedad causada por un parsito
llamado Leishmania el cual se transmite por medio de la picadura de un mosquito
del gnero Phlebotomus. La leishmaniosis en perros puede ser muy grave y hasta
mortal si no se detecta y trata a tiempo. Es una enfermedad incurable y crnica y
el perro no la transmite a los humanos ni a otros animales (Espinosa, 2015).
La reaccin en cadena de la polimerasa (PCR: polymerase chain reaction) es una
tcnica de amplificacin de secuencias de DNA in vitro
El diagnstico de la enfermedad en el laboratorio se realiza usando mtodos
microscpicos y cultivos in vitro e in vivo a partir de biopsias de la lesin,
demostrando la presencia del parsito. Estos mtodos son lentos, trabajosos y de
limitada sensibilidad, adems, requieren personal calificado.
En las ltimas dos dcadas, la PCR se ha constituido en una tcnica alternativa,
altamente sensible y especfica, que ha permitido identificar diferentes especies de
Leishmania a partir de muestras de pacientes, reservorios y vectores. Teniendo en
cuenta que en el control de las leishmaniasis es de vital importancia conocer la
especie o especies de Lutzomyia involucradas en la transmisin en cada foco
especfico, para disear programas de control basados en la biologa y el
comportamiento de estas especies el objetivo general del presente estudio fue
valorar el uso de la PCR basada en los iniciadores B1 y B2, para la deteccin de
parsitos de Leishmania en grupos de insectos del gnero Lutzomyia sin disecar.

OBJETIVOS
Evaluar la aplicabilidad de la reaccin en cadena de la polimerasa (PCR), basada
en los iniciadores B1 y B2, en la deteccin e identificacin de parsitos de
Leishmania (Viannia) en insectos vectores enteros sin disecar.

METODOLOGIA
Materias y mtodos
Antes de realizar todos los procesos es necesario dar una explicacin del material
requerido
Los principios de BIOSEGURIDAD se pueden resumir en:
A) Universalidad: Todo el personal debe seguir las precauciones estandarizadas
de manera rutinaria para prevenir la exposicin de la piel y de las membranas
mucosas, en todas las situaciones que puedan dar origen a accidentes. Estas
precauciones, deben ser aplicadas por y para TODAS las personas.
B) Uso de barreras: Comprende el concepto de evitar la exposicin directa a
agentes biolgicos infecciosos o sustancias potencialmente contaminantes,
mediante la utilizacin de materiales adecuados que se interpongan para evitar el
contacto con estos agentes y sustancias. La utilizacin de barreras (ej. bata de
laboratorio, guantes, lentes de proteccin, mascarillas, etc.) no evitan los
accidentes de exposicin a estos fluidos, pero disminuyen las consecuencias de
dicho accidente.
C) Medios de eliminacin de material contaminado: Comprende el conjunto de
dispositivos y procedimientos adecuados a travs de los cuales los materiales
biolgicos y qumicos utilizados en los laboratorios son depositados para su
almacenamiento y posterior eliminacin sin que se presente ningn riesgo.
Cuantificacin de ADN
Para que la cuantificacin de cidos nucleicos sea adecuada se requiere la
habilidad de medir de manera exacta y reproducible. El transferir volmenes
pequeos de lquidos es crtico para obtener resultados confiables es por ello que

en los laboratorios de biologa molecular para medir volmenes pequeos, se

utiliza un dispositivo conocido como micropipeta (Fig 1). Las micropipetas tienes
diferentes capacidades de medida, 0.1-1 L, 0.5-10 L, 10-100L, 20-200 L, 1001000 L, 1000-5000 L. OBJETIVOS Objetivo General Llevar a cabo la
cuantificacin de ADN por mtodos espectrofotomtricos Objetivos especficos
Conocer las partes y el funcionamiento de las micropipetas, Adquirir destreza en
la utilizacin de pipetas para la medicin de volmenes pequeos.

MATERIALES

1 juego de micropipetas P1000, P200 y

P10 por equipo
Agua desionizada
Balanza analtica con lmite de 0,0001 g
Tapas de
cajas de Petri de plstico
Puntas de diferentes capacidades (10, 200
y 1000 L
Muestra de ADN en solucin de
concentracin desconocida

MANEJO DE LA MICROPIPETA
Importante: Para el uso adecuado de la micropipeta asegrese que est
usando la micropipeta correcta para el volumen que necesita medir. Tambin,
asegrese que la micropipeta est realmente lista para el volumen que
necesita revisando la ventana de volumen. Si es necesario, cambiar el
volumen mediante el dispositivo del control o mando del volumen hasta que la
micropipeta corrija el volumen (la micropipeta no lee su mente varias personas
usarn las pipetas, no siempre se encontrar como usted la necesita).
NO trate de colocar la micropipeta para volmenes mayores que el mximo, o
para volmenes menores del cero, esto descalibrar y daar la micropipeta.
1) Partes de la micropipeta
a) Identificar las partes de la micropipeta ayudndose de la imagen en la Figura
1.
b) Observar las diferencias entre la micropipeta a usar y la mostrada en la
Figura

2) Llenado de la pipeta
a) Colocar una punta segn corresponda.
b) Colocar el pulgar sobre el mando o mbolo de pipeteado.
c) Oprimir el mbolo hasta el primer un punto de resistencia alto o "tope". Si
contina presionando encontrar un punto donde el mbolo ya no se mueve
hacia abajo, este corresponde al segundo punto de resistencia alto o "tope".
d) Oprimir el mbolo hasta el primer tope y colocar la punta dentro del lquido
hasta una profundidad menor a 1 mm. De una manera lenta y controlada,
disminuya la presin del mbolo para permitir que se desplace hacia arriba. No
suelte el mbolo abruptamente, al permitirlo causar que el lquido pueda
salpicar dentro de la punta produciendo volmenes inexactos y generando
contaminacin de la pipeta. Una vez el mbolo se haya desplazado hasta
arriba mantenga la micropipeta en el lquido durante un segundo, esto evita
que se aspire aire en la parte final.
3) Expulsin de la muestra
a) Llevar la micropipeta al tubo de polipropileno de 1.5 mL.
b) Se apoya la punta en la pared inferior del tubo.
c) Oprimir el mbolo hasta el primer tope y luego hasta el segundo tope. Haga
este procedimiento a una velocidad moderada, hacerlo muy rpido har que
queden gotas de muestra en la punta. Si observa cuidadosamente, entonces
notar que al oprimir hasta el segundo alto se expele todo el lquido de la punta.
d) Lo anterior es cierto para la mayora de soluciones acuosas, excepto para las
soluciones de alta viscosidad como el Glicerol. Si es usada inadecuadamente, la
micropipeta transferir volmenes inexactos.
4) Calibracin de Micropipeta
La micropipeta puede perder su calibracin. Comprobar la calibracin de la pipeta
es un procedimiento simple que puede ahorrar tiempo considerable, energa, y
reactivos. En esta prctica aprender a usar la micropipeta de tamaos diversos
medir su exactitud, precisin y calibracin.
Para cada micropipeta revisar el porcentaje de exactitud (E%) y el coeficiente de
variacin (CV%) en todo el rango usando al menos dos volmenes diferentes por
ejemplo: Para la micropipeta P1000 revisar los volmenes de 300 L y 1000 L.
Para P200 revisar los volmenes de 60 y 200 L. Para P10 revisar 3 y 10 L.

a) Seleccionar la micropipeta y las puntas adecuadas.

b) Colocar la tapa de la caja de Petri en la balanza y tarar a cero.
c) Tomar el volumen de agua destilada con la micropipeta y dispnselo en la tapa
de la caja de Petri. Registre el peso del agua aadido. La densidad del agua es 1
g/mL a 25C, por lo tanto un volumen de 1 mL corresponde aproximadamente a
una masa de 1 g, 300 L a 0.3 g, 200 L a 0.2 g, 60 L a 0.06 g, 10 L a 0.01 g y 3
L a 0.003 g.
d) Repita el procedimiento cinco veces para cada volumen.
e) Repetir todo el procedimiento para glicerol. La densidad del glicerol es de
1,2656 g/mL a 25 C.
f) Calcular la masa esperada para cada volumen
5) Clculo de la exactitud (E%) y del coeficiente de variacin (CV%)
Extraccin de ADN
Hay diferentes tcnicas que permiten obtener cidos nucleicos con alto grado de
pureza. Las ms utilizadas suelen incluir una etapa de ultracentrifugacin en
gradientes de CsCl una cromatografa de intercambio inico. Sin embargo,
muchas aplicaciones de laboratorio no necesitan un grado de pureza tal que
justifique incluir estas tcnicas (laboriosas y/ caras) en los protocolos de
purificacin.
MATERIALES
Reactivos y Materiales
Acetato de Sodio (3 M)
Etanol absoluto
Etanol 70%
Fenol
Cloroformo
Agua desionizada
TE (pH 8.0)
1 juego de micropipetas P1000, P200 y P10 por equipo

 Gradillas
Medio LB lquido
Termobloques
Tubos de polipropileno 1.5 mL
Centrifuga
Vortex
En este caso se aplicara la toma de muestras en E. coli y las muestras que
necesitamos en esta prctica ya fueron extradas y donadas por un instituto
Muestras biolgicas
Una alcuota de 3 mL de un cultivo lquido de E. coli incubado por 14-16 h a 37C
con agitacin constante de >200 rpm.
Una muestra de suelo.
METODOLOGA EXPERIMENTAL
IMPORTANTE:
Adems de los aspectos bsicos de bioseguridad (bata obligatoria, zapatos
cerrados) se Deber usar en todo momento guantes de ltex o vinilo.
Primera Sesin. Extraccin de DNA
Extraccin de ADN de E. coli
1. Propagar un cultivo de E. coli en medio LB (3 mL) durante toda la noche (14-16
h) a 37C con agitacin constante de >200 rpm.
2. Colocar 1 mL del cultivo en un tubo de polipropileno de 1.5 mL.
3. Centrifugar el tubo a 7000 g durante 2 min.
4. Decantar el sobrenadante.
5. Agregar 250 L de agua desionizada estril al paquete celular.
6. Agitar vigorosamente utilizando un vortex hasta lograr la resuspensin de las
clulas (aproximadamente 30 s).
7. Agregar 250 L de fenol (equilibrado con Tris 1M pH 8.0).

8. Agitar vigorosamente durante 30 s utilizando un vortex.

9. Agregar 250 L de cloroformo.
10. Agitar vigorosamente utilizando un vortex durante 30 s.
11. Centrifugar a 19000 g durante 5 min.
12. Recuperar la fase acuosa (fase superior, aprox. 225 L) y colocarla en otro
tubo de 1.5 mL. En muchas ocasiones en la interfase se presenta un precipitado
blanco, este precipitado no debe de ser recuperado, ya que son protenas que
pueden contaminar la muestra e inhibir reacciones posteriores.
13. Agregar 225 L de cloroformo.
14. Agitar vigorosamente durante 30 s utilizando un vortex.
15. Centrifugar a 19000 g durante 5 min.
16. Recuperar la fase acuosa (fase superior, aprox. 200 L) y colocarla en otro
tubo de 1.5 mL, teniendo las mismas precauciones que en el paso 12.
17. Agregar 20 L de Acetato de Sodio (3M) a la fase acuosa.
18. Agitar en vortex 20 s.
19. Agregar 440 L de etanol Absoluto fro a la fase acuosa.
20. Centrifugar a 19000 g durante 30 min. Es importante colocar los tubos un la
misma orientacin siempre, para saber en qu lado del tubo est el ADN
precipitado. Mientras se est llevando a cabo la centrifugacin, se debe hacer el
gel de agarosa.
21. Decantar el sobrenadante a un tubo nuevo y mantenerlo en hielo durante el
resto del experimento.
22. Agregar 500 L de etanol al 70% al tubo que ha sido vaciado, evitando
resuspender la pastilla.
23. Centrifugar a 19000 g durante 5 min.
24. Decantar el sobrenadante a un tubo nuevo y mantenerlo en hielo durante el
resto del experimento.
25. Colocar el tubo que ha sido vaciado encima de una servilleta de papel y boca
abajo, hasta que todo el etanol haya sido evaporado.

26. Resuspender el ADN en 50 L de TE pH 7.8 o agua desionizada. Guardar a

-20C.
Nota: en este caso no es necesario a extraccin de una muestra del suelo
Cuantificacin de ADN en gel de agarosa
Una vez que se ha realizado la extraccin de ADN es necesario revisar la
integridad y la cantidad del mismo, esto se efecta mediante la separacin por
electroforesis en geles de agarosa o de poliacrilamida. La agarosa es ms
comnmente utilizada puesto que no es txica. A los valores de pH en los cuales
usualmente se trabaja con cidos nucleicos, los grupos fosfato confieren carga
neta negativa a estas molculas. En la electroforesis en geles de agarosa, las
molculas de ADN lineales migran segn su tamao y se pueden visualizar
mediante tincin. Los geles son teidos con diferentes colorantes para visualizar el
ADN. Los ms comunes son: el bromuro de etidio, el nitrato de plata, y
recientemente el SYBER SAFE, Gel Red, Syber Green, Syber Gold, etc.
Los geles de agarosa se preparan fundiendo agarosa en presencia del buffer
adecuado hasta que se logre una solucin transparente. La solucin fundida es
puesta en un molde donde gelifica. El gel forma una matriz cuya densidad est
determinada por la concentracin de agarosa. Cuando se aplica un campo
elctrico a travs del gel, el ADN migra hacia el nodo. La velocidad de migracin
est determinada por varios parmetros, algunos de los cuales son detallados a
continuacin.
MATERIALES
Materiales y Reactivos
Solucin de Agarosa 0.5% w/v
Solucin para teir ADN
Regulador para electroforesis TBE 1X
Regulador de carga 6x
1 juego de micropipetas P1000, P200 y P10 por equipo
Agua desionizada
Puntas de diferentes capacidades (10, 200 y 1000 L)
Muestras de ADN

 Cmara de Electroforesis
Fuente de Poder
Marcador de Peso Molecular (100pb)
METODOLOGA EXPERIMENTAL
1. Colocar 20 mL de TBE en un vaso de precipitado de 100 mL (para un volumen
de gel de 20 mL, si es mayor hacer los clculos conservando la proporcin de la
concentracin del gel)
2. Agregar 100 mg de agarosa
3. Calentar en parrilla de calentamiento hasta fundir completamente
4. Adicionar 0.5L de reactivo para teir ADN (Rojo Texas, Syber green, etc.)
5. Mezclar
6. Verter la solucin en una canastilla para electroforesis
7. Colocar el formador de pozos (peine) en la canastilla
8. Dejar gelificar (cubrir el gel con papel aluminio)
9. Colocar la canastilla adentro de la cmara de electroforesis 10. Agregar buffer
de corrimiento (TBE)
11. Preparar las muestras a analizar (con buffer de carga, no ms de 10 L en
total)
12. Colocar las muestras adentro de los pozos
13. Llevar a cabo la electroforesis a 100 V durante 30 a 45 min
14. Visualizar el gel en el transiluminador y cuantificar segn instrucciones
COMPOSICIN DE SOLUCIONES
6x Amortiguador de carga
Azul de bomofenol 0.25% (w/v)
Glicerina en agua 30% (v/v)
TBE
Prepare una solucin madre 5x en 1 litro de H2O

Tris base 54 g, cido Brico 27.5 g , EDTA 0.5 M (pH 8.0) 20 mL

Insercin de material gentico en un plsmido bacteriano.
La ligacin de fragmentes de inters en plsmidos ha sido una metodologa
presente en casi todos los estudios que tienen que ver con tcnicas de Biologa
Molecular. Se han utilizado diferente sistemas que utilizan diferente vectores, entre
los que se encuentran el pUC 19, pBR322, pBlueScript KS II, pTOPO, etc. Para la
insercin de un gen o de un fragmento del gen en un vector, generalmente se
lineariza el vector con enzimas de restriccin y al mismo tiempo se digiere el gen
con las misma enzimas de restriccin. Despus de la linearizacin del vector y de
la restriccin del gen, ambos fragmentos se incuban con una ligasa en presencia
de ATP para que la enzima catalize la reaccin de ligacin.
MATERIALES
Plsmido (cuales
Enzimas de restriccin
Material gentico de inters.
T4 ADN Ligasa
Buffer de restriccin.
Buffer de Ligacin.
Termo-Bloque
MTODOLOGA
Sesin 1. Reaccin de restriccin
1. En un tubo estril, adicionar 2 l de buffer de restriccin.
2. Adicionar 200-500 ng de plsmido.
3. Adiciona 1 U de la enzima de restriccin.
4. Adicionar suficiente cantidad de agua para alcanzar un volumen final de 20 L
5. Incubar a la temperatura indicada para la enzima durante 30 min en el
termobloque.
Sesin 2. Reaccin de ligacin
6. Colocar 2 L de buffer de ligacin en un tubo estril.

7. Adicionar 1 L de T4 ADN ligasa.

8. Aadir (100-300 ng) de plsmido previamente tratado con enzima de restriccin.
9. Agregar (500-900 ng) del fragmento a insertar deseado.
10. Adicionar suficiente cantidad de agua para alcanzar un volumen final de 20 L
11. Incubar a 22C durante 2 horas en el termobloque.
12. Almacenar a -20C hasta el momento de su uso.
Reaccin en cadena de la Polimerasa (PCR).
La Reaccin en Cadena de la polimerasa (PCR) permite obtener ms de 10
millones de copias de una cadena de ADN de inters a partir de pocas molculas
de sta. La sensibilidad de sta tcnica requiere de cuidados para que la muestra
no est contaminada previamente con otras cadenas de ADN que pudieran
generar amplificados. Existen numerosas tcnicas que emplean la PCR (RAPD,
RFLP, RTPCR) con diferentes aplicaciones en campos de diagnstico,
criminologa, e investigacin.
MATERIALES
Termociclador.
ADN molde
Tubos de polipropileno de 200 L.
Oligonucletidos iniciadores (primers): sentido y anti sentido
Taq DNA polimerasa
Micro pipetas de diferentes capacidades (1000-100, 200-20 y 10-0.5 L
10X PCR buffer
MgCl2
dNTPs: 1 mM dATP, 1 mM dGTP, 1 mM dCTP, 0.65 mM dTTP.
MTODOLOGA EXPERIMENTAL
1. En condiciones de esterilidad colocar dos tubos de polipropileno de 200L de
capacidad en hielo.
2. Adicionar los reactivos que se indican en la tabla 1

3. Mezclar perfectamente la reaccin por y centrifugar unos segundos en caso de

ser necesario.
4. Colocar en el termociclador con
el siguiente programa:
a) 95C 2 min
b) 95C 30s (desnaturalizacin),
c) 55C 30 s (alineamiento),
d) 72C 1 min (elongacin)
e) Repetir los pasos b a d 30 veces
f) 72C 4 min.
g) 4C (refrigerar hasta el momento de uso)
5. Separar el fragmento amplificado por electroforesis en un gel de agarosa.
6. Verificar que el tamao amplificado por PCR sea el esperado.

Practica realizada
Parsitos
Para los ensayos de sensibilidad y como controles positivos y de especificidad se
trabaj con formas promastigotes de las siguientes cepas de referencia del
Laboratorio de Parasitologa del Instituto Nacional de Salud de Colombia:
Leishmania (Viannia) panamensis (MHOM/CO/87/CL412), L. (V.) braziliensis
(MHOM/CO/86/CL250),
L.
(Leishmania)
mexicana
amazonensis
(MHOM/ME/94/CL856) y L. (L.) chagasi (MHOM/CO/84/CL044B). As mismo, se
utilizaron formas epimastigotas de cepas de referencia de Trypanosoma cruzi
(MHOM/CO/92/FCh) y T. rangeli (MHOM/CO/99/99/5048). Los parsitos se
cultivaron en masa segn lo descrito por Duque et al. a una concentracin
promedio de 1 x 106 parsitos por ml.
Vectores
Se trabaj con grupos de hembras de L. ovallesi, L. serrana y L. longipalpis,
provenientes de colonias del Laboratorio de Entomologa del INS, establecidas y
mantenidas segn la metodologa de Modi y Tesh y Ferro et al.

Extraccin del ADN

El ADN de los insectos se obtuvo de acuerdo con el protocolo estandarizado por
Cabrera et al., el cual consiste en la maceracin de los insectos individuales o en
grupos almacenados en alcohol al 70%, seguido de centrifugacin a 10.000 rpm
por 3 minutos, eliminacin del sobrenadante, adicin de 100 ml de Chelex 100
(Bio Rad) al 5%, incubacin a 56C por 30 min, agitacin en vrtex por 10
segundos, incubacin a temperatura de ebullicin por 8 minutos, agitacin en
vrtex por 10 segundos y centrifugacin a 10.000 rpm por 3 minutos. El
sobrenadante as obtenido fue recuperado y almacenado a 20 C hasta ser usado
como plantilla para la PCR.
Para la extraccin del ADN de los parsitos, los cultivos se lavaron en solucin
salina posteriormente, los parsitos se recolectaron por centrifugacin, se elimin
el sobrenadante, se adicionaron 100 ml de Chelex 100 y se siguieron los dems
pasos descritos para la obtencin del ADN de insectos.
Amplificacin del ADN
Se eligieron los iniciadores B1 (5'GGG GTT GGT GTA ATA TAG TGG3') y B2
(5'CTAATT GTG CAC GGG GAG G3'), diseados a partir de la regin conservada
de los minicrculos de ADN del cinetoplasto de parsitos de Leishmania y
reportados como especficos en la deteccin de las especies del subgnero
Viannia produciendo una banda de aproximadamente 750 pb . Dos microlitros (2
l) del ADN extrado en cada ensayo se amplificaron en una mezcla de reaccin
que contena 1,5 mM de MgCl, 100 pmol de cada iniciador, 0,2 mM de cada dNTP,
1X de tampn A (KCl 50 mM, 10 mM TrisHCl) y 2,5 unidades de Taq polimerasa
(Promega) en un volumen final de 50 l. Como control positivo de la reaccin se
utiliz ADN desnudo de L. panamensis como control negativo de la reaccin se
utiliz solucin salina en reemplazo del ADN, y como control de especificidad se
utiliz ADN de T. cruzi. As mismo, las muestras negativas se evaluaron para la
presencia de inhibidores de la reaccin de PCR mediante la adicin de ADN de L.
(V.) panamensis, seguido de la prueba de PCR.
La amplificacin se hizo en un termociclador PerkinElmer 2400 con la siguiente
rutina trmica: predesnaturacin a 94C por 2 minutos, 35 ciclos con el siguiente
perfil: denaturacin a 93C por 30 segundos, anillaje a 67, 5C por 1 minuto y
extensin a 72C por 1 minuto, seguidos de una extensin final a 72C durante 7
minutos. Los productos de amplificacin obtenidos se mantuvieron a 4C hasta su
anlisis.
Anlisis de los productos de amplificacin
Seis microlitros (6 l) de las muestras de ADN amplificadas se analizaron
mediante electroforesis horizontal en geles de agarosa (NuSieve: SeaKem, 3:1) al

2%, utilizando TBE 1X ( 89 mM Tris HCl, 90 mM de cido brico y 20 mM de

EDTA, pH 8,3) como tampn de corrido. Los geles se tieron con 0,1 ug/ml de
bromuro de etidio (Sigma). Como control del corrido electrofortico se utiliz el
marcador de peso molecular ADN 100 pb (Promega). Los productos se
visualizaron en un transiluminador de luz ultravioleta.
Determinacin de la sensibilidad de la PCR
Para determinar la concentracin mnima de ADN de parsito que puede detectar
la PCR basada en los iniciadores B1 y B2, se utilizaron cultivos de promastigotes
de L. (V.) panamensis. Despus de recolectar los parsitos por centrifugacin, se
lavaron tres veces en solucin salina, se determin su concentracin en cmara
de Newbauer y se realizaron siete diluciones seriadas en base 10 conteniendo un
estimado de 106, 105, 104, 103 102, 10 y 1 parsitos, en un volumen final de 100
l de solucin salina. Estas diluciones se sometieron a los procesos de extraccin
de ADN, amplificacin y anlisis descritos previamente.
Determinacin de la especificidad de la PCR
La especificidad de los iniciadores B1 y B2 se determin aplicando el mismo
protocolo al ADN desnudo de L. (V.) panamensis y L. (V.) braziliensis y al ADN de
especies de Leishmania del subgnero Leishmania como L. (L.) mexicana
amazonensis y L. (L.) chagasi y de otras dos especies de la familia
Trypanosomatidae: T. cruzi y T. rangeli.
Validacin de la PCR en flebtomos infectados experimentalmente con
Leishmania
El primer objetivo en la validacin de la PCR en flebtomos infectados
experimentalmente con Leishmania fue probar que la PCR basada en los
iniciadores B1 y B2 permita detectar parsitos de Leishmania en hembras de
Lutzomyia enteras sin disecar. Para ello, se infectaron experimentalmente con L.
(V.) panamensis un grupo de hembras de 2 a 4 das de edad de la especie L.
serrana, la cual es susceptible a la infeccin con L. (V.) panamensis . Para la
infeccin, estos insectos fueron expuestos al hocico de un hmster anestesiado e
inoculado 2 meses antes con promastigotes de L. (V.) panamensis. Entre 6 y 8
das despus de la alimentacin sobre el hmster infectado, las hembras se
preservaron individualmente en alcohol al 70% y se almacenaron a temperatura
ambiente. Posteriormente, se realiz la extraccin del ADN, seguida de la reaccin
de PCR y la visualizacin de los productos de amplificacin, tal como se describe
previamente.
El segundo objetivo fue comparar el mtodo tradicional frente a la PCR en la
deteccin de infeccin por Leishmania en grupos de flebtomos infectados de
manera experimental. Para esto, se infect con L. (V.) panamensis un grupo de

100 hembras, aproximadamente, de 2 a 4 das de edad de L. longipalpis, la cual

es susceptible a la infeccin con L. (V.) panamensis .
La infeccin se realiz siguiendo el mtodo descrito por Tesh y Modi , el cual
consisti en exponer los insectos a un recipiente con membrana que contena una
mezcla de cultivo de promastigotes de Leishmania a una concentracin de 1,19 x
107 parsitos/ml y eritrocitos humanos lavados en una proporcin de 2:1. Las
hembras alimentadas se mantuvieron a 24C, 80% de humedad relativa y a una
dieta de agua y solucin azucarada. Entre 7 y 8 das despus de la comida
infectiva, las hembras que sobrevivieron se dividieron aleatoriamente en dos
grupos de 30 hembras cada uno. En el primer grupo, el porcentaje de infeccin se
estableci por el mtodo tradicional, para lo cual se realiz la diseccin del
intestino de cada hembra en una gota de solucin salina y la presencia de
promastigotes se detect bajo el microscopio a 40X. En el segundo grupo, las
hembras se almacenaron individualmente, sin disecar, en alcohol al 70% y se
procesaron por PCR de acuerdo con el protocolo descrito, determinando as el
porcentaje de infeccin experimental en este grupo.
Determinacin del nmero de ejemplares de Lutzomyia que pueden ser
procesados a la vez sin disminuir la sensibilidad
Para determinar el nmero mximo de hembras de Lutzomyia que podan ser
procesadas sin disminuir la sensibilidad de la PCR, se realizaron extracciones del
ADN de grupos de 1, 2, 3, 4 y 5 hembras de L. ovallesi. El ADN de cada grupo se
amplific en presencia del ADN extrado de cada una de las diluciones de L. (V.)
panamensis, que contenan tericamente desde 106 hasta 1 parsito. Como
control negativo se us ADN extrado de 1 hembra de L. ovallesi sin adicin de
ADN de parsitos. Los productos de amplificacin de cada grupo de flebtomos se
visualizaron y se compararon entre s.
RESULTADOS
En cuanto a la sensibilidad de la PCR basada en los iniciadores B1 y B2, en el
rango de concentraciones ensayadas, el productode amplificacin caracterstico
de 750 pb para el subgnero Leishmania (Viannia) se observ en todas las
diluciones, incluso, en la que contena un estimado de 1 parsito

En la comparacin de los dos mtodos de deteccin de la infeccin por

Leishmania en grupos de hembras experimentalmente infectadas de L. longipalpis,
se observ que con la diseccin de cada hembra y la visualizacin de los
flagelados al microscopio, se detect la infeccin por Leishmania en 9 de 30
hembras, lo cual corresponde a un porcentaje de infeccin de 30% y empleando la
PCR, basada en los iniciadores B1 y B2, se obtuvo la banda de amplificacin
esperada en 10 de 30 hembras procesadas, lo cual corresponde a un porcentaje
de infeccin de 33,3% .
CONCLUSIN
La PCR basada en los iniciadores B1 y B2 se ha utilizado con xito en la deteccin
de parsitos de Leishmania (Viannia) endiferentes estudios epidemiolgicos,
especialmente, para el diagnstico de leishmaniasis en pacientes. En el presente
estudio se valor el potencial de esta tcnica en la deteccin de infeccin por
Leishmania (Viannia) en flebtomos, con el fin de aplicar esta PCR en futuros
estudios de infeccin natural en poblaciones silvestres de estos insectos.
En cuanto a la sensibilidad de la PCR empleando extraccin con Chelex 100 y
los iniciadores B1 y B2, tericamente y segn lo reportado por De Bruijn y Barker,
el protocolo puede detectar hasta menos de un parsito e, incluso, lo
correspondiente a 1.000 minicrculos del cinetoplasto de un parsito sera
suficiente como plantilla para la amplificacin. En este trabajo, el ADN extrado de
una dilucin con un estimado de un parsito de L. (V.) panamensis fue suficiente
para obtener el producto de amplificacin esperado, lo que confirma que la tcnica
es altamente sensible. En cuanto a la especificidad, los iniciadores B1 y B2
resultaron especficos para las especies del subgnero Viannia y no se observ

ningn producto de amplificacin en especies del subgnero Leishmania ni en

otros cinetoplstidos como T. cruzi o T. rangeli.
Por otra parte, se valor la eficiencia de la PCR en la determinacin de
porcentajes de infeccin experimental en flebtomos, comparada con la tcnica
tradicional. En este experimento, se observ que los porcentajes de infeccin
obtenidos por diseccin y examen al microscopio comparado con la PCR son muy
cercanos. El nico reporte de un experimento similar lo presenta Michalsky et al.
Estos investigadores realizaron infecciones experimentales con tres
combinaciones LutzomyiaLeishmania: L. longipalpis con L. chagasi, L. migonei
con L. amazonensis y L. migonei con L. braziliensis. El porcentaje de infeccin
obtenido por diseccin y examen al microscopio para cada combinacin fue de
70%, 40% y 50%, respectivamente, y el porcentaje de infeccin obtenido
aplicando la PCR fue de 87%, 33% y 40%, respectivamente.
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