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Efeitos da Alta Concentrao de Oxignio (Hiperxia) por Tempo
Prolongado no Tecido Pulmonar de Ratos Wistar
Effect of High Concentration of Oxygen (Hyperoxic) by Long Time in the Lung
Tissue of Wistar Rats
PEREIRA, Daniel Martins 1
SILVA, Iandara Schettert 2
SILVA, Baldomero Antonio Kato da 3
AYDOS, Ricardo Dutra 4
CARVALHO, Paulo de Tarso Camillo de 5
ODASHIRO, Alexandre Nakao 6
OLIVEIRA, Luis Vicente Franco de 7
1 Mestre em Sade e Desenvolvimento na Regio Centro-Oeste UFMS
2 Docente da ps-graduao em Sade e Desenvolvimento na Regio Centro-Oeste UFMS
3 Docente do curso de Fisioterapia UNIDERP
4 Coordenador da ps-graduao em Sade e Desenvolvimento na Regio Centro-Oeste UFMS
5 Docente do Curso de Fisioterapia UNIDERP
6 Docente do Curso de Medicina UNIDERP
7 Docente Ps-Graduao em Cincias da Reabilitao da UNINOVE
Autor para correspondncia: ftdaniel80@yahoo.com.br
Recebido em 2 de outubro de 2008; aceito em 27 de janeiro de 2009
RESUMO
Objetivo: Avaliar os efeitos da concentrao de oxignio a 100% em tempo de exposio de 72
horas no tecido pulmonar de ratos wistar. Mtodo: Foram estudados 12 ratos machos com peso
mdio de 21015,9 g, com idade entre 60 e 90 dias, distribudos de forma aleatria em dois
grupos com 6 animais cada, permanecendo o grupo CONTROLE nas condies da fase de
adaptao e o grupo HIPERXIA, submetidos inalao de oxignio umidificado na concentrao
de 100% administrado de forma contnua em um total de 12 L/min por 72 horas. Resultados: A
anlise histolgica revelou para o grupo CONTROLE mdia de espessura dos septos alveolares de
0,380,1 m e para o grupo HIPERXIA de 0,620,2 m (p<0,0001). Em relao contagem das
regies organizadoras nucleolares (pontos NORs) por clula, o grupo CONTROLE apresentou
1,00,4 dots e o grupo HIPERXIA 1,80,4 dots (p=0,0064). Achados como inflamao aguda,
inflamao crnica, edema alveolar, hemorragia alveolar, desnudamento de reas do epitlio
alveolar e atelectasia no foram observados. Concluso: A exposio concentrao de 100% de
oxignio por tempo de 72 horas provocou alteraes histolgicas compatveis com incio do
processo inflamatrio no tecido pulmonar e aumento da atividade celular desse tecido, indicadas
pelo aumento significativo da espessura dos septos alveolares e aumentos dos pontos NORs por
clula para os animais expostos.
PALAVRAS-CHAVE Oxignio, hiperxia, radicais livres, estresse oxidativo, doena pulmonar.
ABSTARCT
Objective: Evaluate the 100% oxygen concentration effects in Wistar rats lung tissue after 72
hours of exposition. Methods: Twelve male rats with mean weight 21015,9g, 60 to 90 days of age
was studied, at random distributed in two groups with 6 animals. CONTROL group remained in
adaption phase conditions, and HYPEROXIC group was submitted to inhalation of 100% humidified
oxygen concentration with 12 L/min continuous administration during 72 hours. Results:
Histological analysis revealed alveolar septa thickness mean of 0,380,1 m in CONTROL group,
and 0,620,2 m in HYPEROXIC group (p<0,0001). On counting of nucleolar organizer regions
(NOR dots) by cell, CONTROL group presented 1,00,4 dots, and HYPEROXIC group 1,80,4 dots
(p=0,0064). Finding as acute inflammation, chronic inflammation, alveolar edema, alveolar
hemorrhage, alveolar epithelium denuded areas and atelectasis werent observed. Conclusion:
Exposure to 100% oxygen concentration for 72 hour caused histological alterations compatible
with inflammatory process beginning and cellular activity increase in this tissue, evidenced by
significant increase of alveolar septa thickness and NORs dots by cell increase in exposed animals.
KEY WORDS: Oxygen, hyperoxic, free radicals, oxidative stress, pulmonary disease
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I. INTRODUO
O oxignio pode causar leses pulmonares e sistmicas quando administrado em altas
concentraes ou por um perodo prolongado de tempo. Dessa maneira, os pacientes com doenas
respiratrias crnicas que dependem de oxigenioterapia por longo prazo e aqueles que necessitam de
ventilao mecnica prolongada podem estar mais expostos a esses riscos. Considerando-se que o tratamento
adequado da hipoxemia depende primeiramente de uma compreenso fisiopatolgica satisfatria de todos os
mecanismos envolvidos, concentraes desnecessrias de oxignio podem ser utilizadas em determinadas
situaes sem que a real causa da hipoxemia seja efetivamente corrigida (KLEEN; MESSMER, 1999).
A exposio a altas concentraes de oxignio produz alteraes do trato respiratrio em seres
humanos e outros animais, que ocorrem no epitlio pulmonar, na rede arterial pulmonar, nos septos
alveolares e tambm no espao pleural. Os achados experimentais mostram disfunes como atelectasias,
edema alveolar intersticial, derrame pleural e modificaes na funo e estrutura celular. As alteraes
morfolgicas decorrentes da inalao de concentraes elevadas de oxignio foram descritas inicialmente em
1897-1899 por J. Lorraine Smith, que caracterizou os achados histolgicos agudos incluindo, atelectasia,
inflamao, congesto vascular e edema alveolar relacionadas toxicidade do OXIGNIO (CRAPO, 1986).
Clinicamente o uso suplementar de oxignio frequente, principalmente para o tratamento das
condies de disfunes respiratrias. No entanto a falta de monitoramento adequado pode produzir
situaes de hiperxia, que por tempo prolongado poder cursar com danos difusos em capilares
pulmonares, endotlio e epitlio gerando extensiva inflamao com infiltrados celular e intersticial e edema
intra-alveolar. Essas situaes patolgicas pulmonares esto relacionadas gerao de espcies reativas de
oxignio secundrias hiperxia (CLAYTON et al., 2001)
Os mecanismos de leso tecidual provocados por espcies reativas de oxignio despertam
considervel interesse cientfico, gerando estudos fisiopatolgicos em relao ao envelhecimento, cncer,
aterosclerose e inflamao (AL-MEHDI; ZHAO; FISHER, 1998).
As espcies reativas de oxignio so molculas que apresentam eltrons no pareados em sua rbita
externa, sendo capazes de modificarem outras molculas, como protenas, carboidratos, lipdeos e o cido
desoxirribonuclico (DNA). So encontradas em todos os sistemas biolgicos. Essas espcies reativas se
desenvolvem a partir do metabolismo aerbio do oxignio que pelo processo de sua reduo acaba por
formar espcies reativas (ANDRADE JNIOR et al., 2005; FERREIRA; MATSUBARA, 1997; MARTINEZ; MEDEIROS;
DI MARCIO, 2000).
O pulmo protegido contra as espcies reativas de oxignio por enzimas endgenas antioxidantes
tal como a superxido dismutase (SOD) e a catalase. Mitocndrias pulmonares so particularmente suscetveis
aos danos oxidativos e a isoforma mitocondrial da SOD (manganese SOD [Mn SOD]), a maior antagonista da
injria oxidativa pulmonar (BOWLER et al., 2002; CLAYTON et al., 2001).
Mais especificamente relacionados ao ambiente de cuidados intensivos e ao procedimento de
suporte ventilatrio artificial, o II Consenso Brasileiro de Ventilao Mecnica (2000), descreve que o uso de
concentraes de fraes inspiradas de oxignio acima de 60% pode produzir efeitos secundrios, como
alterao da formao de surfactante, efeitos citotxicos e traqueobronquites, a sndrome da angstia
respiratria aguda e displasia broncopulmonar, dentre outras.
O estudo dos ambientes que favorecem a produo de espcies reativas de oxignio pela hiperxia
e seus efeitos deletrios motivam o esclarecimento e a difuso de informaes, uma vez que no ambiente
hospitalar, frequentemente so observadas situaes clnicas de pacientes que apresentam estados clnicos
de hipxia e hiperxia.
O objetivo deste estudo foi avaliar os efeitos da concentrao de 100% de oxignio em tempo de
exposio de 72 horas no tecido pulmonar de ratos wistar e caracterizar morfometricamente os achados
pulmonares e alteraes celulares decorrentes desta situao.
II. MTODOS
A pesquisa foi realizada aps aprovao pela Comisso de tica em Pesquisa com Animais/CEUA da
Universidade Federal de Mato Grosso do Sul (UFMS), conforme certificado n 127/2006.
O estudo experimental foi realizado no setor de Tcnica Cirrgica II do Hospital Veterinrio da
Universidade para o Desenvolvimento do Estado e da Regio do Pantanal (UNIDERP), em Campo Grande - MS
no ms de junho de 2007.
Foram estudados 12 ratos machos adultos norvegicus albinus (Rattus norvegicus albinus) da
linhagem Wistar, procedentes do Biotrio da UNIDERP, com peso corporal mdio de 21015,9 gramas, com
idade entre 60 e 90 dias.
Os animais foram mantidos em condies controladas de luminosidade (ciclo dia e noite) e
temperatura (24,11,2 C; 40 a 60% de umidade relativa), com alimentao padro e gua ad libitum. Essas
condies foram utilizadas como base para adaptao inicial.
Procedeu-se a distribuio dos animais de forma aleatria em dois grupos com 6 animais cada,
permanecendo o grupo CONTROLE nas mesmas condies da fase de adaptao e o grupo HIPERXIA,
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colocados em caixa de vidro desenvolvida para o estudo nas dimenses 33x40x30 cm, com fechamento
hermtico, proporcionado pela adeso tampa/caixa com adesivo de silicone e suplemento de oxignio.
O oxignio umidificado foi administrado de forma contnua em um total de 12 L/min por 72 horas
seguidas. Esse fluxo contnuo foi utilizado para prevenir o acmulo de dixido de carbono e manter uma
concentrao constante de 100% de OXIGNIO.
A eutansia foi realizada com dose letal via injeo intraperitoneal de pentobarbital sdico (65
mg/Kg) (Cristlia Produtos Qumicos e Farmacuticos Ltda Campinas, SP). Os pulmes foram removidos do
trax com os animais posicionados e fixados em decbito dorsal, por inciso mediana partindo da regio
cervical anterior e estendendo-se at aproximadamente um centmetro abaixo do apndice xifide. O acesso
cavidade torcica foi feito por inciso sub-xifidea e osteotomia costal paraesternal. Procedeu-se a
pleurotomia e, aps cuidadosa resseco, os pulmes foram retirados e, separadamente, submersos em
soluo de formol tamponado a 10%.
As peas foram processadas e includas em blocos de parafina com cortes de 4 m para confeco
das lminas. Foram coradas por Hematoxilina e Eosina (HE) e pela deteco das regies organizadoras
argiroflicas (AgNOR).
Os cortes foram analisados em microscopia ptica de luz (Olympus BX 41 Trinocular Microscope
Olympus Optical do Brasil Ltda) com captura de imagem por cmera analgica prpria acoplada ao
microscpio. Para cada lmina foram fotografados 10 campos diferentes obtidos de forma aleatria em
objetiva de aumento final de 400x para HE e objetiva de imerso em 1000x para AgNOR. Os campos foram
analisados por profissional patologista com anlise quanti-qualitativa para ambos os preparos.
A hiptese de edema pulmonar foi avaliada, observando-se duas variveis: congesto de vasos e
capilares e espessura dos septos alveolares. Foi realizada a contagem em cruzes (+) do nvel de congesto de
vasos e capilares no tecido pulmonar, aceitando-se como parmetro a relao do nmero de vasos e capilares
congestos em anlise comparativa lmina a lmina entre as amostras.
Para determinao da espessura do septo alveolar de cada lmina foram obtidos 10 campos
fotogrficos de forma aleatria. Em cada campo fotogrfico foi realizada mensurao de trs septos, com
escolha do maior valor para cada campo, a partir do qual se calculou a mdia do valor da espessura dos
septos por animal, posteriormente clculo da mdia por grupo e ao final, realizao de comparao entre os
grupos. Outros possveis achados tambm foram investigados para descrio.
As lminas para observao das regies organizadoras nucleolares foram submetidas anlise
quantitativa com escolha aleatria de clulas pulmonares por campo fotogrfico com obteno do nmero de
pontos NORs em cada clula, obtendo-se ao final um valor mdio e o desvio padro para cada grupo.
Para a observao quanto distribuio dos valores foi utilizado o teste de Shapiro-Wilk aplicado para
a avaliao da espessura dos septos alveolares, congesto de vasos e capilares pulmonares e contagem de
pontos NORs por clula. A varivel espessura do septo alveolar e pontos NORs por clula apresentaram
distribuio normal dos valores. A varivel congesto de vasos e capilares apresentou distribuio no normal
dos dados (p<0,05).
Para as variveis com distribuio normal foi utilizado o teste t de Student para amostras no
pareadas. Para as variveis com distribuio no normal foi utilizado o teste de Mann-Whitney. O nvel de
deciso foi estabelecido em p<0,05.
III. RESULTADOS
O tecido pulmonar de todos os animais foi avaliado quanto presena de achados decorrentes de
alteraes provocadas pela exposio a altas concentraes de OXIGNIO por tempo prolongado (tabela 1).
Trs dos 6 animais do grupo HIPERXIA evoluram para bito antes de completadas s 24 horas aps
o perodo de exposio e foram imediatamente submetidos coleta de material para processamento e
colorao. Observou-se, abertura da caixa torcica para retirada dos pulmes, extenso contedo lquido
transudativo na cavidade pleural. Os trs animais restantes sofreram eutansia 24 horas aps a exposio
(tabela 1).
Tabela 1 Sequncia de eventos durante e aps o perodo de exposio concentrao de oxignio a 100%
por 72 horas.
Perodo de
24 horas aps a
Grupo Hiperxia
exposio
72 horas de exposio
exposio
Hiperxia
1 bito
Presena de disfuno
2 bitos
Eutansia dos 3
6 animais
Entre 60 72
respiratria em todos
Imediatamente
animais restantes
hora
os animais restantes
aps as 72 horas
O achado mais expressivo nas seces preparadas em HE foi o aumento da espessura dos septos
alveolares (figura 1), indicando presena de espessamento das paredes alveolares (p<0,0001). No foi
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observada diferena estatisticamente significante na avaliao da varivel congesto capilar (p=0,1998; teste
de Mann-Whitney) (tabela 2).
Tabela 2 Espessura dos septos alveolares, congesto de vasos e capilares e pontos NORs por clula dos
grupos Controle e Hiperxia. Avaliao histolgica das coloraes HE e AgNOR.
Variveis
Grupo CONTROLE
Grupo HIPERXIA
Valor de p
0,380,1
0,620,2
*<0,0001
Congesto (+)
1,750,5
2,170,8
0,1998
1,00,4
1,80,4
*0,0064
Inflamao aguda, inflamao crnica, edema alveolar, hemorragia alveolar, desnudamento de reas
do epitlio alveolar e atelectasia no foram observados.
Em relao comparao dos valores de pontos NORs por clulas, o grupo HIPERXIA apresentou valor
de pontos maior que o grupo CONTROLE (p=0,0064) conforme comparao apresentada na figura 2.
Figura 1.
1 Espessura dos septos alveolares em fotomicrografias das seces pulmonares (HE, 400X). (A) Grupo
CONTROLE (0,380,1 m), (B) Grupo HIPERXIA (0,620,2 m). (C). Valores significativamente maiores da
espessura dos septos alveolares para o grupo HIPERXIA (teste t de Student).
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Figura 2.
2 Nmero de pontos NORs por clula em fotomicrografias das seces pulmonares (AgNOR, 1000X).
(A) Grupo CONTROLE (1,00,4 dots), (B) Grupo HIPERXIA (1,80,4 dots). (C) Valores significativamente maiores de
pontos NORs por clulas no grupo HIPERXIA (teste t de Student).
IV. DISCUSSO
Os resultados desse estudo mostraram que os animais do grupo HIPERXIA, expostos condio
ambiente de concentrao de 100% de oxignio por tempo de 72 horas apresentaram sinais relacionados
toxicidade do oxignio. Tal fato pode explicar a causa de bito em alguns animais do grupo antes mesmo de
completado o perodo total da exposio ou imediatamente ao final dela. Essa evidncia vai ao encontro de
outros modelos experimentais com a investigao de dose resposta a diferentes concentraes de oxignio,
que identificaram para a concentrao de 100% de oxignio por perodo de 72 horas situao semelhante,
com bito e leso pulmonar difusa e menor formao de edema pulmonar quando utilizadas baixas
concentraes de oxignio (SILVEIRA et al., 2004; FERREIRA et al., 2007). Estudo clssico da literatura cientfica
tambm enumera que as altas concentraes de oxignio por determinados perodos de exposio podem
culminar em bito e levar a quadros pulmonares compatveis com leso difusa (CRAPO, 1986).
Ao trmino do perodo de exposio todos os animais apresentaram sinais de disfuno respiratria,
com a observao de tiragem torcica, cianose de mucosas e extremidades e estado de hipocinesia, sendo
que dois dos animais culminaram em bito imediatamente aps a exposio. Durante a abertura da caixa
torcica para retirada dos pulmes foi observada grande quantidade de lquido translcido na cavidade pleural
destes animais. O aumento do processo de estresse oxidativo pode induzir o aumento da permeabilidade
vascular, o que resulta no aumento do lquido pleural e de forma associada ao edema pulmonar. O uso de
substncias atenuantes das agresses por espcies reativas de oxignio mostrou-se eficaz na diminuio
destes efeitos, com reduo de at 50% da quantidade de volume pleural em comparao aos grupos que
no receberam substncia antioxidante (SINHA et al., 2005).
Clayton et al. (2001) observaram em relao ao lquido pleural e edema pulmonar que o volume de
lquido pleural aumentou significativamente nos ratos expostos ao oxignio e ao oxignio adicionado de
monxido de carbono. Tais efeitos aconteceram em decorrncia da hiperxia, porque no grupo com inalao
isolada com monxido de carbono por trs dias no houve acmulo de lquido pleural.
O achado mais expressivo no grupo HIPERXIA foi o aumento da espessura do septo alveolar,
sugerindo o incio de processo inflamatrio. Tal evidncia tambm foi observada em pesquisa com estudo das
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