Kromatografi Cair Kinerja Tinggi (KCKT) atau yang biasa disebut

dengan HPLC (High Pressure Liquid Chromatography) merupakan teknik

pemisahan yang diterima secara luas untuk analisis dan pemurnian senyawa
tertentu dalam suatu sampel pada sejumlah bidang antara lain: farmasi,
bioteknologi,
lingkungan,
polimer,
dan
industri-industri
makanan.
Popularitasnya disebabkan oleh kekuatan pemisahannya yang tinggi,
selektifitasnya yang sangat baik, dan banyaknya solut yang dapat
dipisahkan dengan metode ini (Gandjar,2007).
1
Kegunaan KCKT
Kegunaan KCKT secara umum digunakan untuk memisahkan sejumlah
senyawa organik, anorganik, maupun senyawa biologis, analisis
ketidakmurnian (impurities), analisis senyawa-senyawa tidak mudah
menguap (non-volatil), penentuan molekul-molekul netral, ionik, maupun
zwitter ion, isolasi dan pemurnian senyawa, pemisahan senyawa-senyawa
yang strukturnya hampir sama, pemisahan senyawa-senyawa dalam jumlah
sekelumit (trace elements), dalam jumlah banyak, dan dalam skala proses
industri. Selain itu, dapat pula digunakan untuk menetapkan kadar senyawasenyawa tertentu seperti asam-asam amino, asam-asam nukleat dan
protein-protein dalam cairan fisiologis, menentukan kadar senyawa-senyawa
aktif obat, produk hasil samping proses sintesis, atau produk-produk
degradasi dalam sediaan farmasi, memonitor sampel-sampel yang berasal
dari lingkungan, memurnikan senyawa dalam suatu campuran, memisahkan
polimer dan distribusi berat molekulnya dalam suatu campuran, kontrol
kualitas, dan mengikuti jalannya reaksi sintesis (Rohman, 2007).
2
Prinsip Kerja KCKT
Pemisahan dengan KCKT dapat dilakukan baik pada fase normal atau
fase terbalik mengunakan fase diam silika atau silika fase terikat yang
terdapat dalam suatu kolom, sedangkan untuk fase gerak itu sendiri
digunakan zat cair, akan tetapi pengunaan zat cair pada fase gerak
mendapatkan kesukaran untuk mengalir didalam kolom, sehingga
membutuhkan pompa bertekanan tinggi untuk dapat melalui kolom yang
selanjutnya masuk ke detektor. Sampel dimasukan ke dalam aliran fase
gerak dengan cara penyuntikan. Di dalam kolom terjadi pemisahan
komponen-komponen campuran. Karena perbedaan kekuatan interaksi
antara solut-solut terhadap fase diam. Solut-solut yang kurang kuat
interaksinya dengan fase diam akan keluar dari kolom lebih dahulu.
Sebaliknya, solut-solut yang kuat berinteraksi dengan fase diam maka solut
tersebut akan keluar dari kolom lebih lama. Setiap komponen campuran
yang keluar kolom dideteksi oleh detektor kemudian direkam dalam bentuk
kromatogram. Dalam kromatogram ini terdapat jumlah puncak (peak) yang
menyatakan konsentrasi komponen dalam campuran (Hendayana, 2006).
3

Instrumentasi KCKT

Pada dasarnya instrumen KCKT terdiri atas : yaitu wadah fase gerak,
sistem penghantaran fase gerak, alat untuk memasukan sampel, pompa,
kolom, detektor, dan rekorder (Gandjar, 2007).
a.

Wadah Fase Gerak

Wadah fase gerak harus bersih dan lembam (inert). Wadah pelarut kosong
ataupun botol-botol eluen yang dapat digunakan sebagai wadah fase gerak.
Wadah ini biasanya dapat menampung fase gerak antara 1 sampai 2 liter
pelarut.
Fase
gerak
sebelum
digunakan
harus
dilakukan degassing(penghilang gas) yang ada pada fase gerak, sebab
adanya gas akan berkumpul dengan komponen lain terutama di pompa dan
detektor sehingga akan mengacaukan analisis. Pada saat membuat pelarut
untuk fase gerak, maka sangat dianjurkan untuk menggunakan pelarut,
bufer, dan pereaksi dengan kemurnian yang sangat tinggi, dan lebih terpilih
lagi jika pelarut yang akan digunakan untuk KCKT berderajat KCKT
(HPLC grade). Adanya pengotor dalam pereaksi dapat menyebabkan
gangguan pada sistem kromatografi. Adanya partikel yang kecil dapat
berkumpul dalam kolom atau tabung yang sempit, sehingga dapat
mengakibatkan suatu kekosongan pada kolom atau tabung tersebut
(Rohman, 2007).
b.
Injektor
Pemasukan atau injeksi sampel untuk analisis dengan metode KCKT
merupakan tindakan yang penting. Walaupun kolom telah memadai, hasil
kromatogram yang ditampilkan akan tidak memadai kalau injeksi sampel
dilakukan tidak tepat. Ada tiga macam sistem injektor pada KCKT yaitu,
injektor dengan memakai diafragma (septum), injektor tanpa septum, dan
injektor dengan pipa dosis. Sistem dengan pipa dosis saat ini merupakan
pilihan yang sangat tepat pada KCKT khususnya untuk analisis kuantitatif
(Mulya,1995).
c.
Pompa
Pompa dalam KCKT dapat diartikan sebagai jantung pada manusia yang
berfungsi untuk mengalirkan fase gerak cair melalui kolom. Terdapat dua tipe
pompa yang digunakan, yaitu kinerja konstan (constant pressure) dan
pemindahan konstan (constant displacement). Pemindahan konstan dapat
dibagi menjadi dua, yaitu pompa reciprocating dan pompa syringe. Pada
pompareciprocating menghasilkan suatu aliran yang berdenyut teratur. Oleh
karena itu membutuhkan peredam pulsa atau peredam elektronik untuk
menghasilkan garis dasar (base line) detektor yang stabil, bila detektor
sensitif terhadap aliran. Keuntungan utamanya ialah ukuran reservoir tidak
terbatas. Sedangkan pada pompa syringe memberikan aliran yang tidak
berdenyut, tetapi reservoirnya terbatas (Putra, 2004).
Setiap pompa KCKT yang baik harus dapat melaksanakan sistem elusi dari
isokratik yang sederhana sampai sistem elusi dari isokratik yang sederhana
sampai sistem elusi dengan pemompaan otomatis yang sempurna.

1.

2.

1.
2.
3.
4.
5.
d.

1.

2.

Sistem pompa kromatografi KCKT sudah diprogram untuk dapat

melakukan elusi dengan satu atau lebih macam pelarut. Dikenal dengan dua
sistem pompa pada KCKT, yaitu :
Sistem elusi isokratik
Pada sistem ini elusi dilakukan dengan satu macam larutan pengembang
atau lebih dari satu atau lebih larutan pengembang, dengan perbandingan
tetap misalnya Metanol : air = 50 : 50 v/v
Sistem elusi gradien
Pada sistem ini dilakukan dengan pelarut pengembang campur yang
perbandingannya berubah dalam waktu tertentu misalnya Metanol : air =
40 : 60 v/v, dengan kenaikan kadar metanol 8% tiap menit (Mulja, 1995).
Pompa yang digunakan dalam KCKT harus dapat memenuhi persyaratan
sebagai berikut :
Menghasilkan tekanan sampai 6000 psi
Bebas pengotor
Kecepatan alir berkisar antara 0,1 10 mL/menit
Bahan tahan korosi sehingga seal yang digunakan terbuat dari bahan
baja atau teflon
Alirannya terkontrol dengan reproduksibilitas 0,5%
(Hendayana, 2006)
Kolom (column)
Kolom merupakan jantung dari KCKT sebab kunci keberhasilan analisis
sangat bergantung kepada efisiensi kolom sebagai alat untuk memisahkan
senyawa dalam campuran yang kompleks (Mulya,1995).
Kolom dibagi menjadi dua bagian :
Kolom Analitik
Garis tengah dalam 2-6 cm, panjang begantung kepada jenis kemasan
partikel biasanya panjang kolom 50-100 cm. Untuk kemasan mikropartikel
berpori biasanya 10-30 cm.
Kolom Preparatif
Umumnya bergaris tengah 6 mm atau lebih besar dan panjang 25-100
cm, kolom terbuat dari baja nirkarat. Kolomnya dapat berupa gelas atau baja
yang tidak berkarat. Kolom gelas dapat menahan tekanan sampai 600 psi.
Panjang kolom bervariasi 15-150 cm. Pengisi kolom biasanya adalah silika
gel, alumina, dan elit. Pengisi kolom seperti partikel pelikular, yaitu butiran
gelas yang dilapisi dengan materi berpori seperti silika gel, alumina atau
penukar ion, juga sering digunakan (Pescok,1976).
Kolom pada kromatografi cair kinerja tinggi merupakan bagian yang
sangat penting, sebab separasi komponen-komponen sampel akan terjadi di
dalam kolom. Oleh sebab itu harus diperhatikan dengan seksama tiga hal
yaitu pemilihan kolom yang sesuai, pemeliharaan kolom, uji spesifikasi kolom
(walaupun kolom tersebut merupakan kolom yang siap pakai). Kolom akan
menjadi kunci penentu keberhasilan pemisahan komponen-komponen
sampel serta hasil akhir analisis dengan kromatografi cair kinerja tinggi.
Kolom pada kromatografi cair kinerja tinggi dibuat lurus (tidak dibuat

melingkar sebagaimana kolom pada kromatografi gas ataupun bentuk U).

Hal ini dimaksudkan untuk efisiensi suatu kolom (Mulya,1995).
Kolom dibuat dengan ukuran diameter sangat kecil (kolom mikro), dibuat
dengan tujuan untuk memperoleh kepekaan menjadi lebih teliti, menghemat
larutan pengembang, memperluas kemampuan detektor, sampel yang akan
dianalisis sedikit. Sedangkan kolom yang dibuat pendek supaya
menghasilkan resolusi yang baik, memperkecil harga diameter rata-rata
partikel fase diam, waktu retensi (tR) atau mengurangi pengaruh bagian
instrumentasi kromatografi cair kinerja tinggi terhadap hasil pemisahan
(Mulya,1995).
Perbedaan jenis kolom pada KCKT adalah :
Kromatografi Fase Normal
Kromatografi dengan kolom konvensional yang fase diamnya normal
bersifat polar, misalnya silika gel, sedangkan fase geraknya bersifat polar.
2.
Kromatografi Fase Terbalik
Kromatografi dengan kolom yang fase diamnya bersifat non polar,
sedangkan fase geraknya bersifat polar, kebalikan dari fase normal. Untuk
mendapatkan fase yang non polar silika gel direaksikan dengan klorosilan ClSi-(R)n. Fase diam yang non polar yang banyak dipakai adalah jenis C 18, C8,
dan C2 (Mulya,1995).
Keuntungan kromatografi fase terbalik adalah senyawa yang polar akan
lebih baik pemisahanya pada kromatografi fase terbalik, senyawa yang
mudah terionkan (ionik) yang tidak dapat terpisahkan pada kromatografi cair
kinerja tinggi normal akan dapat terpisahkan pada kromatografi fase
terbalik, dengan kromatografi fase terbalik air dapat digunakan sebagai
salah satu komponen pada pelarut pengembang campur (Mulya,1995).
e.
Detektor
Suatu detektor dibutuhkan untuk mendeteksi adanya komponen sampel
di dalam kolom (analisis kualitatif) dan menghitung kadarnya (analisis
kuantitatif) (Putra, 2004).
Ada beberapa persyaratan dari detektor ini, yaitu:
1. Mempunyai respon terhadap solut yang cepat dan reprodusibel
2. Mempunyai sensitifitas yang tinggi, yaitu mampu mendeteksi solut pada
kadar yang sangat kecil
3. Tidak merusak sampel
4. Tidak dipengaruhi perubahan temperatur dan kecepatan pelarut
pengembang
5. Stabil dalam pengoperasiannya
6. Dapat bekerja dari temperatur kamar hingga 400oC
7. Mudah di dapat dan mudah pemakaiannya oleh operator
8. Signal yang dihasilkan berbanding lurus dengan konsentrasi solut pada
kisaran yang luas (Gandjar, 2007).
Ada beberapa detektor yang digunakan pada KCKT, misalnya detektor
spektrofotometri UV-Vis. Detektor ini paling banyak digunakan dan sangat
berguna untuk analisis di bidang farmasi karena kebanyakan senyawa obat
1.

mempunyai struktur yang dapat menyerap sinar UV-Vis. Detektor ini

didasarkan pada adanya penyerapan radiasi ultraviolet (UV) dan sinar
tampak. Selain detektor UV-Vis adapula detektor-detektor lain yang
digunakan pada metode KCKT ini, misalnya detektor Fluorometer, detektor
Ionisasi Nyala, detektor Elektrokimia, detektor Spektrofotometer Massa,
detektor Refraksi Indeks, detektor Reaksi Kimia, dan detektor PhotodiodeArray (PDA) (Putra, 2004).
f. Rekorder
Hasil pembacaan dari detektor kemudian diolah oleh suatu prosesor dan
dikirim ke perekam lalu perekam akan membuat suatu tampilan. Dalam
kromatografi tampilan ini disebut kromatogram (Rohman, 2007).
Keuntungan utama metode KCKT adalah memiliki daya pisah tinggi,
kecepatan tinggi, sensitifitas tinggi, dapat dijalankan secara otomatis, dan
berbagai pemakaian tidak dapat disamai oleh cara lain. Sedangkan
kelemahan utama KCKT adalah harga perlengkapan yang mahal, dan
diperlukan pengalaman untuk memperoleh hasil yang baik (Edward,1991)
g.
Waktu Retensi (tR)
Waktu tambat atau waktu retensi (retention time) adalah selang waktu
yang diperlukan oleh senyawa pada saat diinjeksikan sampai keluar dari
kolom dan sinyalnya ditangkap oleh detektor. Waktu retensi dinyatakan
dalam satuan waktu (menit) dan memberikan arti yang sangat penting
dalam analisis kualitatif dengan KCKT (Mulya, 1995).