La reaccin antgeno anticuerpo y las tcnicas inmunolgicas

moleculares
Ac est HER 2 que es una protena que tiene anticuerpos. Se ha podido
mapear su estructura y se conoce el lugar en donde los anticuerpos se unen.
Se pueden conocer los aminocidos de una det. Protena que son reconocidos
por los anticuerpos. A veces hay distintos tipos de eptopes: eptopes lineales,
en donde hay aminocidos muy contiguos, y otros que pueden ser
conformacionales , los cuales se pliegan en el espacio y son reconocidos por el
anticuerpos, porque si fuesen lineales estaran muy lejos.
Cuando a una protena se le une el anticuerpo se producen cambios
conformacionales de la molcula, en donde los aminocidos tambin han sido
mapeados y se pueden ver cmo se mueven dentro la estructura.
Se tiene una molcula pequea aromtica que es antignica, pero no
inmunognica, lo que significa que el anticuerpo puede reconocerla y formar
un complejo antgeno anticuerpo, pero si la molcula se la inyecto a un animal
este no va a producir los anticuerpos. Esto se debe al tamao, ya que es
demasiado pequea para producir por s misma la produccin de anticuerpos,
pero si posee las estructuras que son reconocidas por el anticuerpo. Si se le
llega a mejorar el peso molecular, unindola a una protena va a tener
suficiente masa, y al ser inyectada a un animal este producir anticuerpos.
Estas molculas pequeas se llaman haptenos.
Ac estn todas las interacciones que
pueden ocurrir entre la interaccin de
un antgeno con un anticuerpo. Por
ejemplo, electroesttica con molculas
con cierto grado de polaridad. Tambin
molculas muy apolares tendrn reas
en donde se produzca la interaccin,
fuerzas de Van der Waals, dipolos, todas
estas interacciones dbiles estn
presentes en esta interaccin, salvo
unin covalente.
Concepto de afinidad y avidez : Cuando
una protena tiene unin con un
anticuerpo con slo un determinante antignico, las fuerzas de unin son
dbiles, pero si se tiene un sistema en donde hay dos anticuerpos, pero contra
distintos determinantes antignicos, la fuerza de unin ser mucho ms
potente y ms difcil de separar.
Fenmeno de prozona (le encanta preguntarlo)

Uno de los elementos que se va a aplicar en la rx.antgeno- anticuerpos es la

inmunoprecipitacin . Cuando un antgeno interacciona con un anticuerpo uno
de los eventos que ocurre es la precipitacin, la que se observa con tcnicas
inmunolgicas. Generalmente se ve, pero otras veces no, ya que depende de la
relacin que ocurra, como se ve en los paneles A, B y C

Hay un momento en que se tienen muchos

anticuerpos en comparacin con el antgeno, y
no se forma un enrejado molecular. Tambin
cuando hay demasiado antgeno no se forma el
enrejado molecular. Hay una relacin de
concentraciones que se llama zona de
equivalencia y se forma el enrejado molecular;
se tiene que formar el enrejado para que ocurra
la precipitacin. Con haptenos no se pueden
formar enrejados porque son muy pequeos. La
zona de equivalencia ocurre cuando hay precipitacin y el fenmeno en
general se llama prozona.
La Ouctherlony: inmunodifusin doble, es una tcnica muy vieja en donde se
observa la precipitacin. Ac se produce una difusin del antgeno y el
anticuerpo en una matriz de agar con pocillos. En un pocillo se coloca el
antgeno y en el otro se coloca el anticuerpo, y migran hasta que se
encuentran. Precipitan cuando estn en la zona de equivalencia con las
concentraciones apropiadas. Sirve para ver la pureza de algunos anticuerpos
ya que al interaccionar en concentraciones adecuadas con el antgenos se
producira la precipitacin, lo que indicara la pureza; si se tienen mezclas de
anticuerpos y de antgenos, las diferencias particulares hacan de que una
parte iba a precipitar y la otra no y se forme un espoln.
Si eran totalmente distinto, o sea si se tena slo x y ac z y anticuerpos contra
ambos en otro pocillo las lneas iban a quedar totalmente cruzadas, porque
tenan otras
propiedades
fisicoqumicas,
de modo que
la
zona de
equivalencia
se
iba a producir
a
otro nivel.
La
inmunodifusin doble se llama as porque tanto como el antgeno como el

anticuerpo migran hasta que se encuentran en la zona de equivalencia y

precipitan.
Despus viene la inmunidifusin radial, que en este caso un solo el antgeno
migra como un crculo. Cuando el agar est lquido se le agrega el anticuerpo,
se hace un pocillo cuando se solidifica en donde se siembra la muestra que
contiene al antgeno, el antgeno empieza a difundir. Primero habr exceso de
antgeno, por lo tanto no hay precipitacin hasta que llegue a la zona de
equivalencia y precipita. Mientras ms concentrado est el antgeno, ms lejos
se producir la zona de equivalencia y se producen dimetros que son
proporcionales a la concentracin de antgenos y se hace una curva de
calibrado con estos datos. Con esta tcnica se puede medir: cantidad de Ig,
complemento, fibringeno, apoprotenas de las lipoprotenas las que se asocian
con riesgo CV.
Otra opcin es ir complementando esto con tcnicas electroforticas, por lo
tanto sobre el agar se puede aplicar un campo elctrico para darle ms fineza
y estimula a que se forme la lnea de precipitacin. Esto se llama
inmunoelectroforsis con contracorriente y se tiene que adecuar el pH para
que el antgeno migre con ms facilidad al polo positivo y esta es la debilidad
porque la protena que se usa (antgeno) tiene una carga muy negativa.
Est la tcnica de inmunoelectroforesis, que an se usa. Se parece a la
anterior, pero la diferencia est en que se hace una electroforesis solo con el
antgeno. Se separa el antgeno que puede provenir de una muestra de plasma
o de suero. La ventaja de hacerlo con suero es que se elimina la interferencia
del fibringeno. Despus de la electroforesis se hace una zanja al agar y
posteriormente se coloca el anticuerpo, que puede ser de distinta naturaleza y
va a formar el arco con el antgeno
Ac se hizo la prueba para
varios anticuerpos y en un
paciente normal deberan
aparecer todas las cadenas. Se
hacen tantas electroforesis
como a anticuerpos que se
quiere ver.
Si una persona tiene un
cncer, se podra ver por
ejemplo que la cadena
desaparece y todo es . En estos cnceres se produce slo un clon de clulas B
de clula plasmtica, y si hay un solo clon hay puras cadenas u otra faltante.
Esta tcnica es muy utilizada en laboratorio, sobre todo para la gammapata
monoclonal.

Esta ltima tcnica no se usa mucho es la electroforesis de cohete. Lo que se

hace es parecido a la inmunodifusin radial, pero con electricidad. Se tiene el
agar con distintas concentraciones de antgeno, que aumentad de derecha a
izquierda. Mientras ms antgeno haba, ms se va a desplazar y ms alto ser
el cohete y se arma una curva de calibracin. Se mejora la sensibilidad del
mtodo. Esto puede servir para diferenciar con un anticuerpo mediante una
electroforesis C3 de C3c lo que permite saber si un paciente tuvo un encuentro
con un antgeno y hay inflamacin, un paciente sano va a tener C3c bajo y
permite tambin ver si hay autoinmunidad.
En el western blot tambin se ocupa. Se hace un lisado celular que se corre en
una electroforesis, se aplica un anticuerpo especfico contra la protena que se
quiere estudiar y luego un segundo anticuerpo con una marca que va a
permitir observar.
En la separacin magntica se tiene una poblacin de clulas que podran ser
inmunolgicas y se quiere separar las NK. Se toma un anticuerpo con una
partcula magntica, se incuba y luego se tiene un soporte con un magneto.
Por lo tanto, las clulas que no tengan el anticuerpo pasan de largo por la
columna y las que lo tienen pegado con el antgeno de inters, se quedan
retenidas. Se descarta lo que no sirve, y se diluyen las clulas de inters. Con
un poco de NaCl se despega el anticuerpo y se tienen a las clulas. Se podra
probar la citotoxicidad de CD8 o de NK. Esto sirve para trabajar a pequea
escala por el tamao de las columnas, no como en el caso del Sorter.
Anticuerpo monoclonal
Todos los medicamentos son de naturaleza monoclonal al igual que los
reactivos de clnica.
La respuesta inmunolgica y fisiolgica es policlonal, muchos clones se activan
y cada uno va a producir una clula plasmtica que es un clon. No se puede
cultivar una clula plasmtica para luego aislar un anticuerpo especfico, as
que para hacerlo se tiene un animal inmunizado y se le sacan sus clulas B, las
que se diferencian en clulas plasmticas para producir anticuerpos y luego se
pegan con clulas tumorales llamadas plasmocitomas, es decir, clulas
cancerosas que producen anticuerpos. Al pegarlas usando polietinelglicol se
fusionas se obtiene un hibridroma, el cual mantiene la inmortalidad de la clula
tumoral y la especificidad del linfocito B, teniendo clulas productoras. Se tiene
una poblacin de clulas produciendo anticuerpos y para separarlas se usan las
diluciones lmites, se hacen muchas diluciones hasta que se tiene una clula
por pocillo o media, es decir, que hay pocillos que tienen una clula y otros que
tienen ninguna. Luego se prueba el anticuerpo buscado. En el sobrenadante
del hibridoma est el anticuerpo. La gracia del anticuerpo monoclonal es que

est dirigido a un eptope muy particular con poca reaccin cruzada, y puede
ser utilizado en inmunoensayos.
Ejercicios:
Las clulas efectoras
son las CD8 y el target
la tumoral. Ac se mira
la liberacin del cromo,
por lo tanto la curva de
ms abajo es la que
tiene la menor
actividad citotxica.

Un cientfico japons sostiene que el cncer se produce por una inmunodepresin.

Describa un ensayo que le permita detectar una respuesta inmune deprimida
ante tumores.
Un ensayo podra hacer tener muestras de sangre de un paciente y una de
control. Hacer un ensayo de inmunodifusin radial con anticuerpos
antitumorales y luego comparar los dimetros. Tambin se puede hacer un
estudio de proliferacin

Usted ha sido contratado para ser el jefe del laboratorio de seguimiento de pacientes
HIV positivos. Debe implementar una tcnica para analizar las subpoblaciones
linfocitarias.
Describa la tcnica escogida, haciendo un anlisis crtico (ventajas y desventajas)

No hacer estudio de proliferacin porque eso es funcional, ac se ve si existe o

no la subpoblacin linfocitaria. Hay que hacer una citometra de flujo y se
puede ver CD4 y CD8.

Deteccin de reaccin antgeno anticuerpo no precipitante:

El hecho de estar en la zona de equivalencia era un problema y hay tcnicas en
donde la reaccin antgeno-anticuerpo no genera un precipitado y aparece la
nefelometra. En vez de precipitado hay turbidez la que puede desviar un haz
de luz. Esto es lo que hoy se usa para medir reacciones antgeno-anticuerpo.
Un nefelmetro mide los niveles de Ig mediante la desviacin. Tambin se
puede usar polietenilglicol para dar ms peso molecular y aumentar la
sensibilidad. Se parece al citmetro, pera ac no hay clulas, sino que el
complejo antgeno anticuerpo.
Se puede hacer por tubidemetra