Manual de Practicas de Laboratorio Experiencia Educativa de Virus y Bacterias. Licenciatura en Biologia. Practica 1. Tipos de asa y su uso. Las asas se utilizan para inoculacién o transferencia de cultivos, pueden ser un alambre de platino, recto en forma de asa, un extremo de ese alambre se interna en un mando cilindrico que permite su manejo. Actualmerse se utilizan mayoritariamente las asas de siembra de plastico que ademas de estar calibradas pueden tener una aguja incorporada cuando se quiere hacer siemras en profundidad, y que son desechables. Las asas de pléstico tienen una ventaja frente a las de metal, flameadas después de cada uso, con las cual se evita que se produzcan aerosoles que provocan contaminacién, ‘A continuacién se indican algunos modelos de asas que se usan en el trabajo microbiolégico. ‘A. Asa en argolla o anillo, no calibrada. Generalmente son de alambre de nicromo, Sirve para siembra por estrias e inoculaciones en general OF ——— B. Asa rectao en hilo. Sirve para trasladar una sola colonia o medios de identificacién o subcultivo. : —— —————— CC. Asa de platino amarillo. Calibrada para tomar 0.001 ml de uso frecuente para urocultivos. D. Asa espatulada. Para manipular colonias duras. SS —S—S—E—E—— ‘Asa de alambre grueso en L. Sirve para purificar colonias de hongos y procedimientos especiales. -eo_O—O SeManual de Prdcticas de Laboratorio Experiencia Educativa de Virus y Bacterias. Licenciatura en Biologia. F. Aguja de diseccién con punta aguda. Sirve para purificar colonias te : de hongos en fresco. lias pequefias y distribuir las preparacionesManual de Practicas de Laboratorio Experiencia Educativa de Virus y Bacterias. Licenciatura en Biologia Practica 2, Elaboracién y observaci6n de una preparacién fresca. La preparacién fresca es una técnica itil en los estudios de bacterias para observar aspectos de las células bacterianas como movilidad y forma. A continuacién se indican dos procedimientos para su elaboraci Procedimiento. ‘A) Método de la gota pendiente. a) A partir de un cultivo bacteriano de 24 a 48 h prepare una dilucién en agua destilada estéril b) Coloque una gota de muestra en el centro de un cubreobjetos limpio. Use condiciones asépticas, ©) Invierta el cubreobjetos cuidadosamente y coléquelo sobre la depresién de un portaobjeto excavado (ldmina excavada), de manera que no deslice la gota por el cubreobjeto. La gota no debe tocar el fondo de la depresién. ) Aplique unas gotas de agua destiiada estéril a los bordes del cubreobjetos para sellarlo y ‘mantenerlo en su lugar. €) Observe con el lente seco de mayor aumento, este puede ser el de 40x. 3) A partir de un cultivo bacteriano de 24 a 48 h prepare una dilucin en agua destilada estéril. b) Coloque una gota de fa muestra usando técnica aséptica (con asa 0 con pipeta estéril) sobre un portaobjetos limpio y coloque un cubreobjetos sobre esta. Para prevenir las corrientes de conveccién y el secado de la preparacién, sellar los bordes del cubreobjetos con petrolato, sellador oesmalte de urs incoloro, ©) Observe con el lente seco de mayor aumento. ‘Nota: La visién es mucho mejor si se dispone de un microscopio de contraste de fases.Manual de Practicas de Laboratorio Experiencia Educativa de Virus y Bacterias. Licenciatura en Biologia. Practica 3. Preparacién fija (frotis) de una muestra microbiana. El propésito de la fijacién es matar los microorganismos, coagular el protoplasma de Ja célula y adherir la preparacién al portaobjetos. Sin el proceso previo de fijaci6n se lavaria la capa de células durante el proceso de tincién. . . El agente fijador ideal preserva las estructuras de la célula con su forma y posicién sin que aparezcan estructuras que no existian en la eélula original El calor es el método de fijacién utilizado para la observacién de ta morfologia de células microbianas. Procedimiento. ) Si la muestra a analizar se encuentra en suspensién, colocar una gota sobre un portaobjetos limpio ccon un asa 0 pipeta estéril. Si la muestra proviene de un cultivo en medio s6lido, colocar primero una gota de agua destilada estéril sobre el portaobjetos, tomar la muestra con el asa, tocar la gota, ‘quemar el asa y luego de haberse enfriado, mezclar bien con el agua ) Secar ai aire para fijar las células. Puede acelerar el secado, pasando el portaobjetos tres veces por la llama del mechero a 15 cm o més de distancia. El calor hace que las células se deformen y se tian defectuosamente, por lo que es conveniente sostener ef portaobjetos con la mano la cual funcionard como sensor de que no se esté aplicando calor excesivo. ©) Una vez fijada una preparacién, sobre el frotis seco pueden emplearse colorantes bésicos para tefir las células, varias de las cuales estén referidas en la Préctica 4.Manual de Précticas de Laboratorio Experiencia Educativa de Virus y Bacterias. Licenciatura en Biologia. Practica 4. Métodos de tincién para el estudio de bacterias. Una vez que se fija una preparacién, éstas pueden emplearse para ter las células bacterianas La tineién simple se basa en que las céulas bacterianas difieren desde el punto de vista quimico de su medio externo y por eso se tifen, contrastando con él. Para la tinci6n simple de las células puede emplearse los siguientes colorantes bésicos: azul de metileno, cristal violeta 0 fucsina fenica. Estos presentan diferente afinidad por las células bacterianas y por ello, los tiempos de aplicacién necesariamente serdn distintos Los microorganismas también difieren fisica y quimicamente entre si y por eso reaccionan de una manera diferente frente a un determinado proceso de tincién. Esto constituye el fundamento de las tinciones diferenciales. Procedimiento. A. Tincién simple a) Preparar un frotis segdn la técnica antes descrita b) Colocar el portaobjetos sobre un soporte para tinciones. ©) ,Cubrir la preparacién con 2 0 3 gotas de solucién de azul de metileno y dejar 1 min (0 de cristal violeta 0 fucsina fénica y dejar 30s). 4) Lavar con agua. ©) Secar con papel de filtro o encima del mechero, f)Observar al microscopio con lente de inmersién y determinar forma, disposicién y relacién de tamafios de las distintas bacterias. Preparacién de reactivos para la tincién simple A. Cristal violeta (Férmula de Hucker) Cristal vioteta 20g Etanol 95% (viv) 20.0 mL. Oxalato de amonio 1% (v/v). 80.0 mL. Disolver el cristal violeta en etanol. Agregar el oxalato de amonio y dejar 48 horas antes de usar. B. Azul de metileno (Férmula de Loeffler) Cloruro de azul de metileno . 16g Etanol 95% (VIV) sowunsenennnn 100.0 mL Hidréxido de potasio 0.01% (w/v) 100.0 mL Preparar una solucién alcohélica saturada de azul de metileno agregando el colorante al alcohol Agregar 30 mL de esta solucién a la de KOH,Manual de Practicas de Laboratorio Experiencia Educativa de Virus y Bacterias. Licenciatura en Biologia. B. Tincién Gram. La tincién de Gram, la mas empleada en bacteriologia, es una tincién diferencial. Por este método se clasifican las bacterias en dos grupos: Gram positivos (Gram +) y Gram negativos (Gram -), en funcién de su reacci6n frente a la coloracién, Seguin este procedimiento, las células previamente fijadas, se tien con solucién de cristal violeta, se lavan y se tratan con Tugol. El iodo forma un complejo con el cristal violeta, que sirve para fijar éste a la célula Luego se agrega un agente decolorante (alcohol, acetona 0 mezclas de ambos) en el cual el complejo iodo- cristal violeta €s soluble y por eso algunos microorganismos son decolorados (Gram -) mientras que otr0s no (Gram 4). Lego de la decoloracién se aplica un colorante de contraste, generalmente safranina, que hace visibles los tmicroorganismos decolorados (Gram -). Cuando se observa una preparacién teftida mediante este procedimiento, se ven células azul violeta (Gram +) y rosadas (Gram -). En los Gram - el complejo es extraido por el alcohol mientras que en los Gram + no. Las bacterias Gram + pposeen paredes gruesas de peptidoglicano, se deshidratan por el alcohol. Esto provoca que se cierren los poros de Ia pared, impidiendo que el complejo iodo-cristal violeta se escape. En las bacterias Gram -, la fina capa de peptidoglicano no evita el pase del solvente y el escape del complejo yodo-cristal violeta de la célula, + Las levaduras, que poseen una pared celular gruesa pero de una composicién quimica totalmente diferente, s¢ tien como Gram +. No son los constituyentes quimicos, sino la estructura fisica de la pared lo que le ‘confiere la Gram positividad. Procedimiento (Tincién de Gram, Técnica de Hucker) a) Preparar un frotis segin la técnica antes descrita. b)Colocar el portaobjetos sobre un soporte para tinciones. ©) Cubrir con sotucién de cristal violeta y dejar actuar | min. 4) Lavar suavemente con agua de Ia llave o con una pizeta ©) Cubrir con lugol y dejar actuar 1 min. 4) Lavar suavemente con agua de la llave o con una pizeta. 8) Cubrir con etanol 95% y dejar 30 s moviendo suavemente el portaobjetos. Repetir el lavado con etanol hasta que éste no arrastre mas colorante. hy) _Lavar con agua. i) Cubrir con solucién de safranina y dejar 1 min i) Lavary secar. k)_Observar al microscopio por inmersién, Las bacterias Gram + se verdn de color azul-violeta y las Gram - rosadas. La tincién de Gram es frecuentmente usada para determinar forma, disposici6n y tama relativo y reaccién al Gram de las distntas bacterias presente. Medicién de tamaho La medicién del tamafo (longitud y didmetro) de las bacterias, no se puede realizar con la precisin ¥ exactitod deseables debido a dificultades t€enicas inevitables. Los microorganismos enManual de Practicas de Laboratorio Experiencia Educativa de Virus y Bacterias. Licenciatura en Biologia preparaciones fijadas y coloreadas sufren deformaciones que hacen que las medidas scan solo aproximadas. Ademas los preparados secos, fijados (atin con formal) y coloreados no revelan la pared celular. No se debe medir el tamafio con coloracién negativa en caso de organismos encapsulados; ademés, dedido a que tanto la bacteria como el colorante tienen carga negativa, este se seca a una pequefia pero significativa distancia de la bacteria, lo que hace que esta aparezca més grande, aiin cuando no tenga cépsula. Preparacidn de reactivos para la tincién de Gram (técnica de Hucker) ‘A. Cristal violeta (formula de Hucker) De acuerdo a ta formulacién indicada en la tincidn simple. B. Lugot Yodo 10g Yoduro de potasio 208 ¢ Agua destilada 300.0 mL Disolver el yodo y el KI en el agua. Dejar de un dia para el otto si es necesario, para disolver ‘completamente. Almacenar en frasco oscuro. C. Safranina Safanina25%6(wh)enakeshel 95%. 100 mb ‘Agua destilada 100.0 mL C. Coloracién de estructuras. Tincién de Esporas Ciertas especies bacterianas, en particular de los géneros Bacillus y Clostridium, producen elementos de resistencia denominados esporas 0 endoesporas debido a que se forman dentro de la célula, a razén de una por célula A diferencia de la célula vegetativa que la produce, la espora es muy resistente a condiciones adversas tales ‘como alta temperatura, baja humedad, radiaciones y agentes quimicos. Es una forma de vida latente que puede permanecer largos periodos como tal y cuando desaparesen, las condiciones adversas pueden germinar. También puede inducirse esa germinacién mediante, .por ejemplo, un shock térmico por calentamiento a 80°C. Las esporas son altamente impermeables a los colorantes, de manera que con las técnicas de coloracién comunes aparecerin como regiones sin tefir dentro de las células coloreadas, Por lo tanto, para tefir las4 Manual de Précticas de Laboratorio Experiencia Educativa de Virus y Bacterias. Licenciatura en Biologia. ‘esporas especificamente, deben usarse métodos de coloracién especiales; por otra parte, una vez coloreada, la espora resiste fuertemente la decoloracién y el contrast. Procedimiento ®) b) <) 4) e) f) 8) Preparar un frotis pasando 10 veces por la flama para fijar. Colocar la lamina sobre un soporte para tinciones. CCubrir con pequetos trozos de papel de filtro © impregnarlos con solucién de verde de malaquita y calentar durante 5 min con el mechero. Mantener el papel de filtro siempre saturado con verde de malaquita, no dejar que se seque. Quitar el pape! de filtro y lavar suave, pero abundantemente, con agua Dar contraste con solucién de safranina durante 30s. Lavar con agua y secar. Observar al microscopio por inmersién. Se verdn las esporas verdes y los cuerpos celulares rosados. Si se dispone de un microscopio con contraste de fases, se puede observar la endospora sin teflir como una estructura densa, blanca dentro de la célula Observe y registre los datos siguientes: = presencia 0 ausencia de esporas = deformacién 0 no del cuerpo celular posicién de la espora dentro del cuerpo celular segiin lo siguiente: ‘© terminales (espora en el extremo del cuerpo celular) (© centrales (espora en el centro del cuerpo celular) (© centrales a terminales o subterminales (posicién intermedi Preparacidn de reactivos para la tincién de esporas A. Verde de malaquita Verde de malaquita 05g ‘Agua destilada plas 100.0 mL B. Safranina Safranina 2.5% (w/v) en alcohol 95%... 10.0 mL ‘Agua destilada se 100.0 mL Tincidn de Capsul Ciertas bacterias segregan en su superficie materiales gomosos compuestos por polisacdridos, polipéptidos o complejos glucoproteicos. Cuando este material se dispone de una manera compacta alrededor de la superficie celular se denomina cépsulaManual de Prdcticas de Laboratorio Experiencia Educativa de Virus y Bacterias. Licenciatura en Biologia. La mejor forma de observarla es con tincién negativa (Procedimiento 1) aunque también existen técnicas especiales para la coloracién especifica de la cApsula (Procedimiento 2). Procediniiento 1 a) Colocar una gota de tinta china en un portaobjetos limpio y mezclarla con una muestra de crecimiento colonial. b) Cubrircon un cubreobjetos. ©) Observar al microscopio por inmersién. Las cépsulas aparecen como zonas claras alrededor del organismo refractil sobre fondo oscuro. Procedimiento 2 1a) _Enun portaobjetos limpio hacer un frotis de la solucién bacteriana. b) Secary fijar al aire. ). Cubrir Ia lamina con fuccina fénica fuerte y calentar ligeramente durante 1 minuto. 4) Lavar rapidamente con etanol y posteriormente con agua. ) ;Cubrir con la solucién mordente de Muir durante 30 segundos. f)Lavar con agua y posteriormente con etanol durante 30 segundos o bien, hasta que el frotis tome un color rojo palido. 8) Lavar con agua. h) Tetir con azul de metileno de Loeffler dejando actuar por 30 segundos. i) Lavar con agua y dejar secar. i) Observar al microscopio con el objetivo 40x o el de inmersién. Las bacterias se tiften de rojo y las cépsulas de azul Preparacién de reactivos para la tincién de cépsula, A. Euccina fenica fuerte Fuccina bésica 100g Etanol (95%) 100.0 mL Mezclar y disolver en un frasco tapado y mantener a 37°C durante toda la noche. idn de Flagelos ‘Muchas bacterias son méviles y su capacidad para moverse en forma independiente se debe generalmente a la presencia de estructuras especiales, los flagelos. Son apéndices largos, delgados, de forma helicoids, libres en un extremo y unidos a la célula por otro. Son tan delgados que solo se pueden ver al microscopio comiin luego de una coloracién especial que haceManual de Practicas de Laboratorio Experiencia Educativa de Virus y Bacterias. Licenciatura en Biologia uuso de un mordiente. Este promueve la fijacién de las moléculas de eolorante al flagelo dando lugar a la formacién de un precipitado a lo largo del flagelo, haciéndolo visible. Procedimiento ) Colocar una gota de agua esterilizada en el extremo de un portaobjetos b) Con el asa bacteriolégica tome crecimiento bacteriano desarrollado en el medio y depositelo en la gota de agua para que se forme na suspensién. También puede partir del crecimiento bacteriano en medio liquido. ©) Inclinar el portaobjetos de tal manera que la gota se deslice suavemente alo largo del portaobjetos. 4) Secar al aire €) Cubrir durante 5 minutos con el mordiente. f) Escurrir y enjuagar con agua de la lave evitando que el agua caiga de golpe sobre la preparaci6n, 2) Adicionar solucién de cristal violeta y dejar actuar por 2 minutos. hh) Escurrir y enjuagar con agua de la llave, i) Dejar secar. j) Observar al microscopio con el objeto de inmersién. Observar y registrar fa Mlagelacién caracteristica de la célula bacteriana, la cual puede tener uno 0 més flagelos dispuestos en distinta manera y en base a eso se clasifican en = Polar now un flageloen un extreme del cuerpo celular - Anftrica...flagelos en ambos extremos = Lofétrica.... penacho de flagelos en un extremo = Peritrica.. flagelos alrededor de toda la célula sin distribucién = Célula sin lagelos En las fotos se observan flagelos tehidos con dcido ténico (mordiente) y fucsina bésica, en disposicién peritrica Preparacién de reactivos para la tincidn de flagelos. A. Solucién Mordiente : ey Acido ténico 200 g° C10, Sol. Acuosa al 2.5% 15.0 mL, ‘Agua caliente 80.0 mLManual de Prdcticas de Laboratorio Experiencia Educativa de Virus y Bacterias. Licenciatura en Biologia. El Acido tinico se disuelve en 80m! de agua caliente, y se agrega ta solucién de CrOs,se rmezclan y se guardan en el refrigerador durante 4 dias en un recipiente oscuro. Para emplear, el mordiente se debe fitrar previamente, Tincién de Grinulos metacromiticos, Procedimiento + Enun portaotjetos limpio hacer un frotis det cultivo bacteriano. Fijar al aire. Tefiir con el colorante de Albert durante 3 -5 minutos. LLavar con agua y secar con papel secante. Tefir con solucién de Lugol durante 1 minuto. LLavar con agua, escurrir y secar, Observar al microscopio con el objetivo de inmersién. Elcitoplasma aparece verde claro y los grénulos azul obscuro. Preparacién de reactivos para tincin de grénulos metacromiticos. ¢ A. Solucién Colorante de Albert. Verde de malaquita 028 Azul de toluidina O1Sg Etanol 95% 20 mL Acido acético glacial 1.0 mL Agua destilada 100.0 mL El colorante se disuelve en etanol y el acido se mezcla con agua y se agrega a la solucién del colorante. La mezcla se deja reposar por 24 h y se filtra. ‘incién de Inclusiones de poli Procedimiento ‘+ En un portaobjetos limpio hacer un frotis del cultivo bacteriano de 12-24 horas de edad, sembrado en medio de agar nutritivo o medio mineral ‘© Dejar secar al are y fijar al calor. Cubrir la preparacién con la solucién de sudén negro (Schad, p. 72) dejéndola actuar durante 15 minutos. Decantar la solucién y secar. : ° Lavar la preparacién con Xilol y dejar secar al aire. ‘Adicionar solucién acuosa de safranina al 0.5% y mantenerla durante 10 minutos. Lavar con agua y dejar secar. Observar el microscopio con el objetivo de inmersién.Manual de Practicas de Laboratorio Experiencia Educativa de Virus y Bacterias. Licenciatura en Biologia. Si la bacteria acumula 0 no intracelularmente el Poli B-hidroxibutirato, propio del grupo de bacterias Pseudomonas no fluotescentes. incign de bacter do resistent La tincién de Scido-resistentes es una tincién diferencial que demuestra la resistencia de la célula a ser decolorada por los. Alcalis, acidos y alcohol. En algunos microorganismos de los géneros Mycobacterium y Actinomyces la propiedad écido resistente esté relacionada con su alto contenido en lipidos. La tincién de estas bacterias debe hacerse con colorantes que tengan alta afinidad por tales células y en caliente. El método general consiste en tenir el frotis en caliente, decolorar con alcohol Acido (no se decoloran los dcido resistentes) y luego tefir con un colorante de contraste. De esta forma quedan las bacterias dcido resistentes con el color inicial y las demas con el color de contraste Procedimiento (Téenica de Ziehl-Neelsen) a) Colocar —el_—portaobjetos. ~—sobre_-~=—=un—soporte_—para_—_tinciones. Cubrir con solucién de fuesina bésica y calentar, por debajo, con el mechero hasta que se 30g, 03.8 NHH:PO, 10 g- Ole KCI 028 002g MgSO..7H;0 028 0028 ‘Agar Noble 10g Ol g ‘Agua destilada LoL 100.0 mt tiaManual de Practicas de Laboratorio Experiencia Educativa de Virus y Bacterias. Licenciatura en Biologia. 2 3 4 Disolver los components, vaciar a tubos de ensayo y esterilizar a 121°C durante 1S min. Dejar eenfiar. Inocular cultivo bacteriano por puncién y sellar la superficie del tubo, adicionando 1 ml de solucién de agar noble 3% o aceite mineral ester Incubar a 27° C durante 5 dias. Observar... Positivo: Si se observa crecimiento bacteriano. ‘Método 2. (recomendado por Schead e¢ al. para Enterobacterias) as Preparar el medio: Caldo Nitrato, con... iL 100.0 ml KNO; 3.0 8 03g Bacto peptona 5.08 05 g Extracto de levadura 5.08 05 g ‘Agua destlada LOL 100.0 mi Calentar el agua y disolver los componentes, ajustar el pH & 7.1 + 0.1, vaciar 4 ml a tubos de ensayo € introducir, de manera invertida, un tubo Durham lleno de medio. Esterilizar a 121°C durante 15 min, Dejar enfrier. ‘tras opciones de medio son: ub 100.0 m KNO, 30g 03 8 Peptona 5.08 058 Extracto de levadura 5.0.8 05 8 ‘Agar fon Oxoid No.2 Log alg ‘Agua destilada 1OL 100.0 mi Calentar el agua y disolver los componentes, ajustar el pH a 7.1 + 0.1, vaciar 4 ml a tubos de ensayo. Esterilizar a 121°C durante 15 min. Dejar enftiar. Inocular 4 tubos con cultivo bacteriano, por puncién en el segundo caso. Incubar 2 tubos a 28°C + 2 durante 24 h y 2 tubos durante 5 dias. Coloque a incubacién 2 tubos sin inéculo, Una vez concluido cada periodo de incubacién (24 h y 5 dias). Tomar el tubo inoculado y ef control, 4 los cuales se agrega I mi de solucién A y 1 ml de solucién B (Sol. A y B, para reduccién de nitratos). Sol A... (0.6% viv de N,N-dimetil-1 naftilamina 0 0.5% de alfa naftilamina). Precaucién por ser carcinogénicos. Sol. B...... (0.8% viv de Acido Sulfanilico).Manual de Practicas de Laboratorio Experiencia Educativa de Virus y Bacterias. Licenciatura en Biologia. Nota: Ambas soluciones se preparan en Acido Acético 5 N (1 parte de Acido Acético Glacial por cada 2.5 partes de agua) S. Observar. Positivo: Si se presenta una goioracién rosa a raja debido a la presencia de nitritos en un periodo hasta de 1 h. Sino aparece el color rosa. adicionar polvo de zinc al tubo, el cual reaccionard con los nitratos brpliclonco_u_color rasa, confirmando asi que la prueba es negativa. Sin embargo, si el color 1 indi a denitri completa y la lucha se consders postive Los tubos control verificarén cada paso de la prueba para evitar un error debido a la absorcién del acido nitroso del aire, Rodriguez (1994) p. 67.107, 113 y 114; Schaad, et al. (2001) p.46. Fermentacién de Lactosa. La realizaci6n de esta prueba permite observar si la bacteria tiene capacidad de fermentar lactosa, caracteristica propia de organismos facultativamente anaerobios. Método 1. Produecién de écido a partir de carbohidratos (medio C de Dye). 1, Ira la prueba Produccién de dcido a partir de carbohidratos (medio C de Dye) de este Manual. 2. Los organismos que utilizan lactosa, cambiarén el color del medio a amarillo como resultado de la presencia de Acido. ‘Método 2. Cultivo en Levine EMB Agar (Difco) 1. Preparar medio Levine EMB Agar (Difco: 37gtltro)ajustando el pH 7.1 + 0.2 a 25° C; estriizar a 121-124° C/15 minJ/15 psi; y vaciaren placas. Estriarcultivo bacteriano Inecubar por 24 a 48 h/ 28 -30°C. : -. Observar y registrar: Las colonias fermentadoras de Lactosa se apreciardn de color verde metilico, azul obscuro a caféManual de Précticas de Laboratorio Experiencia Educativa de Virus y Bacterias. Licenciatura en Biologia. Las colonias no fermentadoras se apreciardn incoloras a ligeramente pirpuras wranslucidas. Método 3. Cultivo en medio, TSI (Medio triple azicar hierro) (Bioxon) La realizacién de este método permite observar si la bacteria tiene capacidad de fermentar glucoss, lactosa 0 sacarosa y, producir acido sulfhidrico. 1. Preparar medio TS! (Bioxon) inclinado en tubos grandes, procurando que la inclinaci6n inicle & partir de la parte media de! tubo. 2, Seleccionar colonias que se encuentren bien aisladas y tocar el centro microbiol6 3. Inocular por estria en la superfici Incubar por 24 a 48 h / 28-30° C. 5. Observar y registrar: Evento Resta) de la colonia con el asa Je inclinada y por puncién hacia el fondo del tubo con TSI. Vire del indicador a amarillo positivoa fermentacién dela 4 enel fondo del tubo alucosa. Siena superficie del medio se observa —-_—_egativo para fermentaciGn de la te color rojo mds intenso que el medio iactosa ni de la sacar original Presencia de coloracién negra positive para produccién de dcido ‘alo largo de la puncién. sulfhirico Nota: tiene el inconveniente de que no se puede distinguir la fermentacién de la lactosa de la iglucosa. Es adecuado para diferenciar bacterias entéricas de importancia en salud humana utiizando la tabla anexa. MdManual de Précticas de Laboratorio Experiencia Educativa de Virus y Bacterias. Licenciatura en Biologia Descarboxilacién de la Licina (empleando medio LIA). La realizacién de esta prueba permite observar si la bacteria tiene capacidad de descarboxilar Ia Lisina. Método. 1. Preparar medio LIA en tubos preferentemente grandes y esterilizar por autoclave. 2. Inclinar los tubos, procurando que la inclinacién inicie a partir de la parte media del tubo. 3. Seleccionar colonias que se encuentren bien aisladas y tocar el centro de !a colonia con el asa microbiolégica. 4, Inocular por estria en la superficie inclinada y por puncién hacia el fondo del tubo con TSI. 5. Incubar por 24 a 28-35°C. 6. Observar y registrar: vento Siel medio intensifica el color plirpura er todo el tubo la Hisina Siel fondo del agar se torna Negative a la descarboxilacién dela § wn color claramente amarillo lisina. Presencia de coloracién negra ivoa de acid a lo largo de la puncién. sulthidrico. Produccién de enzimas Ureasas Procedimiento 1. Con una asa estéril tomar crecimiento del cultivo, Inocular tubos de caldo urea, Utilizar un control de medio para comparacién. Incubar 24 +2 h a 35°C o bien 2 ha 37 #0,5°C en baho de agua. Observar el viré piirpura de las reacciones positivas contra el control.vy Manual de Précticas de Laboratorio Experiencia Educativa de Virus y Bacterias. Licenciatura en Biologia Utilizacién de Fuentes de Carbono (Para Enterobacterias y Pseudomonas...) Método. _-1._-Preparar Medio de sales minerales de Ayers ef al 1b NHH:PO, 10g KCl 028 MgSO,.7H,0 02g Azul de bromotimol Om! (1.6% wiv en etanol de 50 2 95%) o bien, 30m (1.0% wiv en etanol de 50%) Agar 120g ‘Agua destlada LoL Ajustar el pHa 7.240. y eserlizar. NOTAS: Esterilizar por autoclaveado y posteriormente adicionar por filtracién la fuente de carbono a una concentracién final de 0.1% (wv). O bien, adicionar la solucién de la fuente de carbono al medio y esterilizar el medio a 116-118° C durante 10 min. Preparar medio sin fuente de carbono para utilizarlo como control negativo. Vaciar a cajas petri y dejar solidificar. Tomar con un asa, una muestra del cultivo bacteriano y estrarlo sobre el medio. Incubar a 27° C y observar crecimiento durante 3, 7 y 14 dias. Comparar el crecimiento con las cajas control y registrar resultados. Produccidn de Acido a partir de carbohidratos (Para Enterobacterias...) Método. 1. Preparar Medio C de Dye. re Lk NHdH;POs 058 K;HPO, OSB MgSO,.7H,0 028Manual de Prdcticas de Laboratorio Experiencia Educativa de Virus y Bacterias. Licenciatura en Biologia. Nac 5.08 Extracto de levadura 10g Piirpura de bromocresol 0.7 ml (1.5% wiv en etanol 95%) Agar 120g ‘Agua destilada 10L, Ajustar el pH a 6.8 y esterilizar. NOTAS: Esterilizar por autoclaveado y posteriormente adicionar por filtracién la fuente de carbono a una cconcentracién final de 0.5% (w/v). bien, adicionar la solucién del carbohidrato al medio y esterilizar a 116-118° C durante 10 min. Para las sustancias dificiles de disolver, como la salicina, disolverla en un volumen mayor: de agua y adicionarla al Medio C, y esterilizar tres dias sucesivos. Preparar medio sin carbohidrato para utilizarlo como control negative. 2. Vaciar a cajas petri o tubos de ensayo y dejar solidificar de manera inclinada. 3. Tomar con un asa, una muestra del cultivo bacteriano y estriarlo sobre el medio. 4, Incubar a 27°C +2, y observar vire del indicador a color amarillo, durante 2, 4, 6, 21 y 28 dias. 5. Comparar el vire del indicador con el de las cajas 0 tubos control y registrar resultados. Produccién de scido a partir de fuentes de carbono (Para Agrobacterium...) Método. 1. Preparar Medio de sales minerales de Ayers et al. + YS iL NHHPO, 10g KCI 028 MgSO.7H,0 028 Extracto de levadura 108 ‘Azul de bromotimol 1.0 mi (1.6% wiv en etanol de 50 2 95%) obien . 30m (1.0% w/v en etanol de 50%) . Agar 120g ‘Agua destilada 10L Ajustar el pHa 7.1 + 0.1 antes de adicionar el Agar.Manual de Prdcticas de Laboratorio Experiencia Educativa de Virus y Bacterias. Licenciatura en Biologia. NOT, Esterilizar por autoclaveado y posteriormente adicionar por filtracin la solucién 10% (w/v) de Ia fuente de carbono (eritritol, melezitosa o sacarosa) en una proporcién de 1: 9 (fuente de carbono = medio basal). Obien, adicionar la solucién de la fuerte de carbono al medio y este min, a 116-118° C durante 10 Vaciar a tubos de ensayo, inclinarlos y dejar solidificar. ‘Tomar con el asa, una muestra del cultivo bacteriano y estriarlo sobre el medio. Incubar a 27° C+ 1 y observar vire del indicador a color amarillo, durante 2, 4, 6,21 y 28 dias 5. Comparar el vire con tubos control y registrar los resultados. og 2~ Manual de Prdcticas de Laboratorio Experiencia Educativa de Virus y Bacterias. Licenciatura en Biologia. Practica 8. Prueba de se Procedimiento. iscos para determinar la sensibi jad a antibidticos. 1. Preparacién de Sensi-discos con antibidtico. Se dard como ejemplo la preparacién de sensidiscos con eritromicina en relacién de 15 ug/disco ‘A. Preparacién de I ml de solucién de eritromicina. B. Preparacién de los sensi-discos de eritromi b. & Si la eritromicina ests en presentacién de tabletas medicinales, primero estimar la relacién de eritromicina por peso de la tableta (una tableta con 500 mg de eritromicina pesa alrededor de 1g, por lo tanto por cada 2 mg de tableta tenemos | mg de eritromicina). Pesar la cantidad de tableta que contenga 3 mg de eritromicina. Adicionar la eritomicina en 0.5 ml de etanol en un recipiente previamente esterilizado. Agitar hasta disolver el polvo. Adicionar 0.5 ml de agua destilada estéril, ina (15 pe/disco). Cortar discos de papel filtro de 7 mm de didmetro, Marcar con lapiz un lado del disco. Envolver en papel aluminio y esterilizar en autoclave. Adicionar en flujo laminar, 5 il de la solucién de eritromicina (3 mg/ml) por disco. Depositados en el lado no marcado del disco. Nota: Esterilizar discos sin eritromicina para control 2. Preparacién del cultivo. Preparacién de Agar. El Agar Muller Hinton es ef més usado para este fin aunque también puede realizarse en Agar Nutrtivo (AN), Esterilizar por autoclave y mantenerlo en bafto de agua a 45-50° C. Preparar una suspensién acuosa densa de células bacterianas a partir de cultivos jovenes (24- 48 h), Se recomienda que el cultivo se realice en el mismo medio de cultivo en que se probaré la sensibilidad al antibistico. Vaciar 6 mi de medio a cajas Petri y dejar solidificar. Mantener el resto a 45-50° C Adicionar 100 yi de ta suspensin acuosa de bacterias Adicionar 10-12 ml de Agar Nutritivo y agitar a favor y en contra de las manecillas del rel. Después de que el medio haya solidificado, colocar 2 0 3 discos impregnados con ceitromicina sobre el medio y ademas un disco control (sin antibiético) Incubar entre 23-27°C durante 48 h, ‘Observar una zona de inhibiciOn circundante al disco con antibiético