Universidad de Guanajuato

Facultad de Medicina de Len

Manual de Microbiologa Clnica

Dr. Alejandro E. Macas Hernndez

Dr. Juan Manuel Muoz Barrett
QFB. Humberto Medina Valdovinos
Dr. Jess Martnez Canseco

2003

CONTENIDO
Prlogo
Parte 1. Procedimientos comunes en microbiologa clnica
Generalidades
1.1. Medios de cultivo y tcnicas de siembra
1.2. Coloraciones y microscopia
1.3. Obtencin y transporte de muestras
1.4. Incubacin

Parte 2. La flora normal

Parte 3. Identificacin bacteriana
Generalidades
3.1. Identificacin de cocos grampositivos
3.2. Identificacin de bacilos gramnegativos
3.3. Identificacin de bacilos grampositivos

Parte 4. El proceso de la muestra

Generalidades
4.1. Secreciones purulentas
4.2. Lquido cefalorraqudeo y otros lquidos corporales
4.3. Sangre y mdula sea
4.4. Orina
4.5. Expectoracin y aspirado bronquial
4.6. Exudado de la faringe, nasofaringe y odo
4.7. Heces. Cultivo y parasitoscpico
4.8. Exudado vaginal y uretral
4.9. Secreciones oculares
4.10. Cultivo de sondas y catteres

Parte 5. El laboratorio en infecciones por hongos

Parte 6. El laboratorio en infecciones por micobacterias
Parte 7. Estudios para anaerobios en laboratorios generales
Parte 8. Sensibilidad a antibiticos
Parte 9. El laboratorio en las infecciones nosocomiales
Parte 10. Inmunodiagnstico y serologa
Parte 11. Biologa molecular aplicada a la microbiologa clnica
Anexo 1. Seguridad en el laboratorio
Anexo 2. Espectro antimicrobiano. Lo que todos debemos saber
Anexo 3. Anotaciones para acompaar algunos resultados del laboratorio de
microbiologa

Prlogo
Este manual est elaborado pensando en el personal mdico y de laboratorio
interesado en las enfermedades infecciosas y su diagnstico por el laboratorio.
Si se encuentra usted involucrado en la atencin de pacientes, se beneficiar al
encadenar sus conocimientos clnicos con los del laboratorio, sin importar la
especialidad a la que se dedique. Si trabaja en un laboratorio encontrar,
adems de consejos tcnicos, informacin mdica y epidemiolgica para dar
sentido a los procedimientos. Si requiere procesar estudios de microbiologa sin
ser un experto en este campo, este manual podr serle de gran ayuda. Conviene
aclarar que no pretende sustituir a ninguno de los excelentes manuales de
microbiologa a disposicin en el mercado, que contienen una amplia informacin
y agotan los temas ms all de los alcances de este manual. Sin embargo,
precisamente por su extensin, los textos de que se dispone pueden abrumar de
informacin a quien requiere adems conocer tcnicas de hematologa, clnica
qumica e inmunologa. Lo que pretendemos es ofrecer una gua prctica para
proceder de manera expedita ante situaciones comunes en laboratorios no
especializados en microbiologa, con una orientacin de utilidad clnica. Siendo
as, los aspectos de microbiologa ambiental quedarn fuera del alcance de esta
obra.
En la primera parte se describirn fundamentos, tcnicas y procedimientos
comunes en el laboratorio. Es una seccin breve y debe leerse cuando no se
dispone de experiencia en procesar muestras. Las subsecuentes son
consideraciones particulares para cada muestra o situacin clnica y puede
consultarse en cada caso. Hemos incluido una descripcin del laboratorio y su
utilidad para el control de las infecciones nosocomiales, as como una breve
descripcin de tcnicas moleculares.
Por ltimo, conviene mencionar que este manual tiende a recomendar
tcnicas y procedimientos de bajo costo, lo que es sin duda una ventaja para
muchos laboratorios clnicos, que requieren dar informacin til pero que no
cuentan con elementos para efectuar una microbiologa de alta especializacin.

Parte 1. PROCEDIMIENTOS COMUNES EN

MICROBIOLOGA CLINICA
Generalidades
El mundo microbiano se constituye por una enorme variedad de seres en constante
relacin. Afortunadamente, la lista de los patgenos para el ser humano es
relativamente breve, lo que hace que la microbiologa clnica sea diferente que la
microbiologa general. As, el laboratorio casi siempre se ocupa de buscar agentes
causales de infeccin, generalmente con su cultivo e identificacin. Tambin son
muy solicitadas las pruebas que detectan antgenos especficos del agente, o
fracciones de su componente gentico a travs de pruebas de biologa molecular, o
bien, la respuesta serolgica del paciente con la produccin de anticuerpos. Este
manual se orienta principalmente a los procedimientos de diagnstico por cultivo,
aunque se abordarn brevemente el resto.
Las enfermedades infecciosas constituyen la causa ms comn de consulta en
pacientes ambulatorios y las complicaciones ms graves de los hospitalizados. Los
estudios de laboratorio deben utilizarse con buen juicio, siempre en espera de una
informacin necesaria para tomar una decisin clnica. El diagnstico clnico es a
menudo suficiente para orientar la etiologa e instaurar un tratamiento, si el mdico
conoce las causas de las enfermedades ms comunes. Otras veces se requieren
mtodos diagnsticos para confirmar una sospecha, sobre todo en pacientes
hospitalizados o ambulatorios con enfermedades de causa poco predecible. Sin
embargo, la funcin del laboratorio es compleja pues los patgenos pueden ser
virus, bacterias, hongos o parsitos. Adems, las muestras pueden ser lquidos,
tejidos o secreciones. El cultivo ha sido el mtodo clsico para el diagnstico; sin
embargo, el hecho de aislar un germen no siempre representa enfermedad, pues
en ocasiones aparece como colonizador normal o como contaminante en el
laboratorio. Por ello, el laboratorio de microbiologa clnica se asemeja al de
histopatologa en la necesidad de vincularse ntimamente con el mdico. Por
ejemplo, si se toma una biopsia ante un caso de diagnstico dudoso, la buena
prctica obliga a informar al patlogo las caractersticas del paciente y algunos
datos clnicos para su orientacin. Desgraciadamente, esta prctica no se ha
extendido an a la microbiologa: es comn que las muestras que llegan sean
inadecuadas, con apenas una solicitud con el nombre del paciente, pero sin otros
datos que orienten para profundizar la pesquisa en el laboratorio.
Un ejemplo puede remarcar mejor la importancia de la comunicacin: si el
hemocultivo de un enfermo desarrolla estafilococo coagulasa negativo, el
laboratorio puede verse imposibilitado para brindar un informe pues este germen
puede ser un contaminante o un patgeno, segn el caso. Si el clnico informa que
el paciente porta una vlvula cardiaca artificial y tiene datos de endocarditis
bacteriana, el diagnstico ser evidente. Por el contrario, si el enfermo no tiene
antecedentes de importancia y acudi por fiebre aguda, casi seguramente se trata
de un contaminante. Por ello es importante insistir que el mdico debe acudir al
laboratorio ante cualquier duda. De la misma manera, el personal de laboratorio
tiene que procurar la comunicacin constante e, incluso, salir del laboratorio en
busca de la informacin clnica adicional. El clnico es pues, finalmente, el elemento

fundamental en el control de calidad externo, pues aunque el laboratorio cuente con

el ms estricto control de calidad interno, es el clnico quien observa si los
resultados son congruentes con el caso de estudio. La mencionada relacin deja
siempre un aprendizaje para el mdico y el laboratorista: el primero aprende
elementos tcnicos y el segundo, clnicos. As el personal del laboratorio encuentra
mayor motivacin en su trabajo, pues hace conciencia de su importancia. Todo esto
redunda en una mejor calidad y en un beneficio mximo para el enfermo.
Conviene agregar algunos conceptos acerca de la flora normal, ya que la piel y las
mucosas hospedan siempre una gran diversidad de microorganismos. Estos se
conocen como la flora residente, que puede ser slo comensal, como en la piel, o
simbitica, como en algunas regiones del intestino. Cuando se altera la flora
residente, como al utilizar antibiticos de amplio espectro, se crea un vaco
ecolgico que es ocupado por flora transitoria, que puede incluso proliferar y
producir enfermedad. En el laboratorio, la flora normal y la flora transitoria suelen
producir dificultades para interpretar los resultados; por ejemplo, si el cultivo de una
paciente con flujo vaginal informa la presencia de Candida albicans, no puede
asegurarse que sea causa de problema, dado que esta levadura puede ser parte de
la flora normal o transitoria, sin causar enfermedad. Es por ello que debe tenerse
conciencia, siempre que se interprete el cultivo de una regin normalmente
colonizada, que no todo lo que crece en cultivo es un patgeno. Tambin es cierto
que no todos los patgenos crecen en cultivo, como es el caso de la diarrea por
rotavirus, cuyos coprocultivos son, obviamente, negativos. Si se informa el cultivo
de enterobacterias normales, un clnico sin buena informacin puede desorientarse
e indicar tratamientos antimicrobianos innecesarios y hasta perjudiciales.
Desgraciadamente, en muchos laboratorios de pases en desarrollo eso es prctica
comn, dada la carencia de normas y regulaciones al respecto. Los laboratorios
han aprendido que al clnico le molesta que una prueba no encuentre germen
alguno y prefieren informar incluso la flora normal, generalmente por presiones de
orden econmico ms que por ignorancia. En pases desarrollados, eso se evita
con la publicacin de normas a las que deben ceirse los reportes de resultados.
Cuando esas normas no existen, un clnico mal informado tendr dificultades para
interpretar los estudios y con frecuencia indicar tratamientos innecesarios o,
incluso, dainos. Estas situaciones son muy comunes y se hacen presentes cuando
el laboratorio informa flora normal en pacientes con uretritis, vaginitis, conjuntivitis,
faringitis, amigdalitis o, incluso, neumona (recuerde que el esputo habitualmente se
contamina con grmenes de la boca).
1.2. Medios de cultivo y tcnicas de siembra
1.2.1. Generalidades de los medios de cultivo
Los cultivos de bacterias son fundamentales en la microbiologa clnica. Muchas de
las tcnicas con que contamos son heredadas del siglo pasado, con modificaciones
mnimas. En general, puede decirse que los cultivos bacterianos se siembran en
medios slidos o medios lquidos, que pueden ser a su vez selectivos o no
selectivos. Conviene describir algunos ejemplos para aclarar estos conceptos.

Los medios slidos se conocen tambin como agares, pues es esta sustancia
gelatinosa la que les brinda su consistencia. Si usted siembra con una asa de
alambre una muestra en medio slido en caja de Petri, podr observar, despus de
un perodo de incubacin, las colonias bacterianas. Cada colonia proviene de una
sola bacteria, por lo que stas se conocen tambin como unidades formadoras de
colonias (UFC). Es as como el nmero de colonias permite cuantificar el nmero
de bacterias que haba en la muestra. Esta propiedad de los medios slidos genera
cultivos cuantitativos, como el caso de los cultivos de la orina, en que se define
como positivo slo cuando excede una cuenta predeterminada. Adems, las
caractersticas de la colonia pueden auxiliarnos con mucho en la identificacin,
pues cada gnero bacteriano desarrolla colonias de fenotipos caractersticos.
Bajo estas consideraciones de la bondad de los medios slidos pudiera pensarse
que es intil contar con medios lquidos. Un ejemplo puede ilustrar lo contrario.
Como sabe, un paciente con bacteriemia (presencia de bacterias en la sangre)
puede estar gravemente enfermo a pesar de que en su sangre existan slo una o
dos bacterias por cada 10 mL. Existe entonces una franca diferencia con las
infecciones urinarias, pues en stas se encuentran generalmente ms de 100,000
bacterias, o UFC, por mL. Entonces, para un cultivo de orina con una gota basta y
sobra; por el contrario, para el cultivo de sangre, una gota casi nunca dar un
resultado positivo, por lo que se requiere la siembra de un gran volumen,
habitualmente de hasta 10 mL. Suponga que quiere sembrar 10 mL en una caja de
Petri y podr deducir la importancia de los medios lquidos. Por desgracia, en los
medios lquidos no podremos observar bien las colonias, sino la turbidez resultante
del crecimiento; la identificacin se logra pasando una gota del medio lquido a un
medio slido, despus de un perodo de incubacin.
Entre otros objetivos, los medios lquidos se siembran como un respaldo, como en
las meningitis pues, aunque el cultivo primario en agares generalmente resulta
positivo, no es raro que la cantidad de bacterias (o inculo) sea muy baja y no se
revele al tomar una asada, sino slo al sembrar volmenes mayores en caldo. En
conclusin, puede decirse que los medios lquidos tienen la ventaja de permitir
sembrar volmenes mayores. Sin embargo, tienen la desventaja de hacer difcil
discriminar entre contaminacin e infeccin. Suponga que tiene problemas en la
toma de un hemocultivo y la aguja se contamina con un solo estafilococo de la piel:
tarde o temprano el caldo se enturbiar y el resultado ser positivo, sin
posibilidades de cuantificar el nmero inicial. Entonces se requiere de criterios en la
interpretacin, y de contacto con el clnico para calificar el resultado.
Analicemos ahora la necesidad de contar con medios no selectivos y selectivos.
Suponga que le solicitan el coprocultivo de un enfermo con diarrea aguda y
suponga tambin que la causa es el Vibrio cholerae. Dado que el excremento
alberga a una gran cantidad de bacterias colonizadoras, encontrar el vibrio en un
medio no selectivo se puede convertir en algo as como sacar una aguja de un
pajar. Sin embargo, si se siembra un medio de TCBS observar en l con facilidad
el desarrollo pues otros grmenes estarn inhibidos. Obviamente, los medios que
se requieren son diferentes para cada muestra y no tendr caso sembrar el medio
TCBS en el cultivo del lquido cefalorraqudeo. Al tratar el proceso de cada muestra

en la segunda parte de este manual, se sugerirn medios selectivos y no selectivos

para cada caso. En la Tabla 1 se muestran los medios ms comunes, y algunas de
sus propiedades.
1.2.2. Tcnicas para la siembra o inoculacin
La inoculacin apropiada de los agares y los caldos es importante para la
interpretacin posterior de los resultados. Afortunadamente, estos procedimientos
son uniformes y sencillos.
Para la siembra de las placas de agar, se toma la muestra con hisopo o con la
propia asa de alambre y se distribuye en el primer cuadrante de la caja.
Posteriormente, se efectan tres estras adicionales que crearn un efecto de
dilucin de la muestra, con la consiguiente separacin de las colonias en la
superficie de agar, que permita observar sus caractersticas sin que se
superpongan unas con otras. Para lograr este efecto, es importante considerar que
la segunda estra debe introducirse dos veces sobre la anterior, y la tercera y la
cuarta, una sola vez, pues de lo contrario no se observar el efecto de dilucin (Fig.
1). En cultivos con inculos que se esperan altos (como coprocultivos), el asa debe
quemarse entre una estriacin y la siguiente, esperando un tiempo prudente para
su enfriamiento.

Figura 1 Inoculacin y estriacin de la placa

AGAR

COMENTARIO

SANGRE

Es el medio ms utilizado. Est adicionado con sangre (generalmente de

carnero) para permitir el desarrollo de casi todos los grmenes habituales
(excepto neisserias y Hemophilus)

CHOCOLATE

Adems de los componentes del agar sangre, contiene factores nutricios que
permiten el desarrollo de neisserias y Hemophilus. La sangre se adiciona
cuando el medio est caliente, lo que la hemoliza y proporciona su color
caracterstico.

MacCONKEY

Es el medio selectivo ms comn. Contiene cristal violeta y bilis, que impiden el

desarrollo de grampositivos. Adems, contiene lactosa y un indicador que
permite reconocer las bacterias lo utilizan, pues stas se tornan rojizas, mientras
que las que no la utilizan permanecen incoloras.

EMB

Semejante al MacConkey. Se utiliza menos

MULLERHINTON

Medio no selectivo, pero no enriquecido. Se utiliza generalmente para probar la

sensibilidad a antibiticos

SS

Es muy semejante al MacConkey, pero contiene aditivos para la seleccin e

identificacin de Salmonella y Shigella. Contiene sales de hierro que forman un
precipitado negro con cepas de Salmonella productoras de sulfuro de
hidrgeno.

SAL Y
MANITOL

Tiene un alto contenido de sal, lo que selecciona los estafilococos de muestras

contaminadas. Contiene adems manitol y un indicador, que permite distinguir
S. aureus (vira el medio al amarillo) de las cepas coagulasa-negativas (el medio
permanece rosado).

THAYERMARTIN

Es un agar chocolate adicionado con nistatina, vancomicina y colimicina. Estos

evitan el crecimiento de hongos, cocos grampositivos y bacilos gramnegativos,
permitiendo asilar neisserias de muestras contaminadas

TCBS

Contiene tiosulfato, citrato, sucrosa y sales biliares, lo que permite aislar Vibrios
de heces fecales. El medio es azul-verdoso por la presencia del indicador azul
de bromotimol. Las colonias de V. cholerae son amarillas, pues utilizan la
sucrosa y acidifican el medio.

XLD

Es un medio de xilosa, lisina, desoxicolato y sales de hierro, que se utiliza para

seleccionar Salmonella y Shigella de muestras fecales. El indicador es rojo
fenol, que le da su color. Las colonias de enterobacterias no patgenas son
amarillas pues acidifican el medio. Las colonias de Salmonella y Shigella
permanecen rojizas. Se forma un precipitado negro con cepas de Salmonella
productoras de sulfuro de hidrgeno.

SABOURAUD

Es un medio general enriquecido para el desarrollo de todo tipo de hongos. No

es adecuado para siembra de muestras contaminadas con flora normal.

MYCOSEL

Es un medios selectivo para el desarrollo de hongos patgenos pues contiene

cicloheximida, lo que no permite el desarrollo de saprofitos como Aspergillus.
Est adicionado con cloramfenicol para inhibir la flora bacteriana. Es muy til
para el cultivo de lesiones de piel.

El cultivo de la orina es cuantitativo, por lo que habr de sembrarse de manera

diferente (Figura 2). En este caso, debe usarse un asa calibrada de 1 ul y vaciarla
en una lnea vertical sobre el agar, sobre la que se efectuar una sola estra corrida
perpendicularmente, sin quemar el asa.

Figura 2 Inoculacin de un cultivo cuantitativo de orina

Para la inoculacin del exudado farngeo debe recordarse que generalmente se
busca slo el desarrollo de estreptococos betahemolticos. La hemlisis de stos se
observa mucho mejor en condiciones pobres de oxgeno. Por ello, se efectan
varios piquetes con el asa en el medio ya estriado, para que los grmenes
desarrollen en su interior, facilitando la betahemlisis alrededor del piquete (Fig. 3).
La inoculacin del hemocultivo se tratar en su captulo, as como la siembra de
catteres y sondas.
Figura 3 Mtodo ptimo para
inocular la placa de un exudado
farngeo.

10

1.3.1 Microscopia
Uno de los utensilios ms tiles en el diagnstico de laboratorio es el microscopio
ptico, ya que forma parte esencial de muchas de las pruebas. Es importante
conocer su funcionamiento. El microscopio que se utiliza generalmente en el
laboratorio es conocido como microscopio fotnico o de luz, debido a que su fuente
luminosa es un foco de emisin de luz comn. El microscopio est compuesto por
cuatro sistemas: Soporte, ptico, mecnico y luminoso.
Soporte Es el encargado de formar la estructura rgida del aparato dndole
sostn a los dems sistemas y se encuentra formado por el brazo, el pie y la
platina.
Optico Se encuentra formado por los oculares y los objetivos, los cuales nos
permiten visualizar la muestra a estudiar hasta con un ndice de resolucin de
0.2 micras, dependiendo de cul de ellos utilicemos.
Mecnico Consiste en todo el sistema que permite la movilizacin, tanto de los
lentes, como de la muestra en estudio. Se encuentra compuesto por los tornillos
macro y micromtrico, as como por el sistema de movimiento para la muestra
que se encuentra sobre la platina. Algunos autores tambin consideran al
revlver (en el que se encuentran los objetivos) como parte de este sistema.
Luminoso Formado por la fuente de luz, el condensador y el diafragma, los
cuales permiten controlar la intensidad de la luz par lograr una imagen ms
ntida.
Utilizacin Antes de utilizar un microscopio hay que tener una serie de
conocimientos bsicos, ya que de ello depende la calidad de la imagen a obtener y,
por ende, la del diagnstico. Para comenzar, el microscopio se debe de transportar
exclusivamente del brazo llevndolo en posicin vertical hasta el sitio en el cual se
va a utilizar, procurando que sea sobre una plataforma plana e inmvil. Una vez
colocada la muestra en estudio en la platina, se proceder a enfocarla comenzando
con el objetivo de 10X (seco dbil). Cuando el microscopio est fuera de foco, no
intente obtenerlo iniciando en el objetivo de inmersin pues puede daar el lente y
la preparacin. Es importante mencionar que en el caso de los microscopios
binoculares se deben de utilizar ambos ojos para observar correctamente, lo cual
se logra colocando los ojos a 1 2 cm de distancia de los oculares y abriendo o
cerrando el ngulo entre los mismos segn sea necesario. Una vez logrado esto se
enfoca el campo deseado. La luz con la que se observe debe de ser blanca.
Cuando la fuente de luz es amarillenta, debe utilizarse un filtro azul. La nitidez de la
imagen depende con mucho del angulo con el que la luz incide sobre la
preparacin. Para observar preparaciones teidas prefiera utilizar el condensador
arriba, asi las membranas celulares se mostrarn con menor refringencia. En
preparaciones en fresco descienda el condensador y apreciar mejor los
elementos celulares.
Para pasar de un objetivo a otro basta con girar el revlver cuidando no daar la
preparacin. Aqu es necesario comentar que, al utilizar los objetivos de seco dbil
y seco fuerte (10X y 40X respectivamente), la luz a utilizar debe de ser ms difusa,
por lo cual, el condensador generalmente debe de colocarse abajo (lejos de la
platina). En el momento de utilizar el objetivo de 100X o de inmersin, la luz debe
11

de incidir en un solo punto, por lo cual se sube el condensador y se coloca una gota
de aceite de cedro entre el objetivo y la muestra.
Preparaciones Existen dos tipos de preparaciones para su observacin al
microscopio de luz, las frescas y las fijas. Las preparaciones frescas se obtienen de
muestras clnicas recientes en las cuales se quiere observar, sin mucho detalle, el
tipo de clulas que presenta, as como la presencia de agentes tales como
bacterias, hongos, parsitos, etc. La realizacin de una preparacin fresca es
sumamente sencilla, basta tomar una pequea porcin de la muestra o de su
centrifugado sobre un portaobjetos, diluirla con una gota de agua o solucin salina,
retirarle los detritus celulares macroscpicos tales como fibras, colocarle un
cubreobjetos y proceder a su observacin. El tiempo de observacin de una
muestra fresca debe de ser el suficiente para que no se deshidrate y no se
cristalice; asimismo, la observacin se debe de realizar con los objetivos de 10X y
40X, utilizndose la inmersin slo en casos excepcionales y por personas
experimentadas. Un procedimiento comn para la observacin de toda muestra
independientemente del objetivo que estemos utilizando es recorrerla de la esquina
superior a la inferior formando grecas, para as estar seguros de que se ha
recorrido toda. Este tipo de preparaciones son de gran utilidad sobre todo en
muestras donde se quiere ver la movilidad de algunos microorganismos,
generalmente parsitos. Algunas veces, las muestras necesitan ser aclaradas para
observarse mejor, como en el caso de las obtenidas de lesiones producidas por
algunos hongos (dermatfitos), la tcnica es la
siguiente:
1.
2.
3.
4.

Tome una muestra de la lesin mediante raspado sobre un portaobjetos.

Cubra con hidrxido de potasio al 10 al 20%.
Caliente levemente la laminilla
Coloque el cubreobjetos y observe al microscopio.

Las preparaciones fijas sirven para observar con mayor detalle las caractersticas
de la muestra ya que se valen de la preservacin de la misma mediante su fijacin
al portaobjetos y su coloracin posterior. Otra ventaja importante es que pueden ser
estudiadas por uno o ms observadores en momentos diferentes, lo cual puede
ayudar en el diagnstico en el caso en el que el observador inicial tuviera duda o
careciera de la experiencia suficiente. Este tipo de preparaciones por lo general se
observa tambin a seco fuerte e inmersin.
1.3.2. Coloraciones
Histricamente, las primeras observaciones efectuadas al microscopio se
efectuaron sin colorantes. Estas observaciones, conocidas tambin como
observaciones en fresco, siguen siendo importantes para el diagnstico (como el
anlisis del sedimento urinario, la bsqueda de algunos parsitos en excremento o
la bsqueda de formas micticas en la piel). Sin embargo, el uso de los colorantes
represent un hito en la historia de la microbiologa pues permiti observar y
clasificar las bacterias de mayor importancia clnica. De hecho, las dos tcnicas de
coloracin ms importantes (Gram, Ziehl-Neelsen) se disearon hace ms de cien
12

aos, y siguen efectundose casi sin modificaciones. Quienquiera que tenga que
atender pacientes, o que trabaje en un laboratorio clnico, debe saber elaborar e
interpretar estas coloraciones. De ellas trataremos en esta seccin.
La coloracin de Gram es muy sencilla. Se prepara el extendido del material de
estudio y se deja secar al aire. Se fija al calor del mechero, pasndolo rpidamente
en tres ocasiones (no sobrecaliente!). Se tie as:
1.
Cubra el extendido con cristal violeta por un minuto y enjuague con agua,
2.
Cubra con lugol para Gram por un minuto y enjuague,
3.
Decolore con alcohol acetona hasta que slo las partes ms gruesas del extendido
tengan color, y enjuague,
4.
Cubra con safranina por 30 segundos y enjuague. Seque al aire o sin tallar, con papel
secante y observe. Los grampositivos retienen la violeta (azules), lo que no hacen los
negativos (rosados).

El orden violeta, lugol, alcohol y safranina se recuerda fcilmente con la

nemotecnia vlas. La preparacin se observa primero en seco dbil para evaluar la
calidad de la muestra, informndose la cantidad y proporcin de leucocitos,
eritrocitos y clulas epiteliales. Al pasar a inmersin, se observan e informan los
distintos morfotipos bacterianos:
Cocos grampositivos en racimos (estafilococos)
Cocos grampositivos en cadenas y diplococos no lanceolados (estreptococos)
Diplococos en forma de punta de lanza (sugieren neumococos)
Cocobacilos grampositivos (sugieren corynebacterias o actinomicetos)
Bacilos grampositivos (sugieren clostridios o Bacillus sp.)
Levaduras (sugieren Candida, Criptococcus, Coccidioides, Histoplasma)
Bacilos gramnegativos gruesos, algunos con tincin bipolar (sugieren
enterobacterias)
Bacilos gramnegativos pequeos (sugieren Pseudomonas, Bacteroides,
Hemophilus)
Cocos gramnegativos (Neisseria, Moraxella, Prevotella, Acinetobacter)

Figura 4. Cocos grampositivos en racimos

Figura 5. Cocos grampositivos en cadenas

13

Figura 6 . Levaduras. Observe la morfologa de las pseudohifas de Candida sp.

Figura 7. Cocos grampositivos lanceolados

La importancia de la coloracin de Gram es enorme, y en muchas ocasiones es
mayor que la de un cultivo. Unos ejemplos bastan para convencerse de ello.
1. Frecuentemente permite contar con datos mucho ms tempranamente que el
cultivo, lo que puede resultar vital para el paciente, ya que la informacin es ms
til mientras sea ms oportuna. El caso ms claro puede ser el de los pacientes con
bacterias en lquidos normalmente estriles, ya que el manejo ideal depende del
diagnstico bacteriolgico.
2. Coadyuva para evaluar la calidad de la muestra. Un ejemplo es el cultivo de
expectoracin: Si en la coloracin de Gram se observan abundantes clulas
epiteliales de la boca, y escasos leucocitos, se colige que la muestra es de calidad
insuficiente para el cultivo y que, de hecho, no debe cultivarse.
3. Permite evaluar discrepancias entre la observacin y el cultivo posterior. Por
ejemplo, en algunos cultivos de secreciones abdominales existe slo desarrollo de
bacilos gramnegativos, pero en la coloracin se observaba abundante flora de
grampositivos. En estos casos, se deduce con facilidad que existe flora de
anaerobios que no desarrollaron pues no se sembr en esa atmsfera. De hecho,
la sola observacin de flora polimicrobiana en presencia de leucocitos hace pensar
en anaerobios, aun antes del desarrollo en cultivo.
4. En algunos casos tiene utilidad cuantitativa, v.g.: si se observan bacterias en la
coloracin de la orina sin centrifugar, generalmente puede deducirse que el cultivo
ser positivo a ms de 100,000 UFC por mL.
5. Permite observar la presencia de la flora normal. El ejemplo ms claro es la
observacin del exudado vaginal. Si existe flora normal (bacilos grampositivos)
generalmente indica que no se encontrarn patgenos en cultivo, ya que stos
generalmente la desaparecen. En este mismo caso, el cultivo puede desarrollar
Candida, pero seguramente tendr representacin clnica slo si la levadura puede
14

observarse tambin en la coloracin de Gram, ya que de otro modo corresponde a

un colonizador normal.
Estos ejemplos explican de sobra que se diga que un cultivo sin una coloracin de
Gram es como una primavera sin sol. El tiempo que suele invertirse en la
elaboracin de la coloracin se justifica fcilmente por la utilidad que representa un
informe temprano y por el ahorro de tiempo y recursos por no procesar muestras
inadecuadas. La coloracin de Gram ha sido tambin la base para clasificar las
bacterias ms comunes, como se observa en la Tabla 2. Algunos grmenes se
tien mal, o no se tien, con la coloracin de Gram, por lo que no es posible
clasificarlos aqu (Tabla 3).
TABLA 2. BACTERIAS MAS COMUNES, DE ACUERDO CON SU TINCION
AEROBIOS
COCOS GRAMPOSITIVOS
BACILOS GRAMPOSITIVOS SIN
ESPORAS
BACILOS GRAMPOSITIVOS CON
ESPORAS
COCOS GRAMNEGATIVOS
BACILOS GRAMNEGATIVOS
INTESTINALES

Streptococcus, Staphylococcus
Nocardia, Erysipelothrix,
Corynebacterium, Listeria
Bacillus

COCOS GRAMPOSITIVOS
BACILOS GRAMPOSITIVOS SIN
ESPORAS
BACILOS GRAMPOSITIVOS CON
ESPORAS
BACILOS GRAMNEGATIVOS

Peptococcus, Peptostreptococcus
Actinomyces

Neisseria
Escherichia, Citrobacter
Klebsiella, Enterobacter
Serratia, Proteus
Salmonella, Shigella, Yersinia
BACILOS GRAMNEGATIVOS
Pseudomonas, Pasteurella
NO FERMENTADORES
Brucella, Haemophilus
Legionella, Francisella, Acinetobacter
ANAEROBIOS ESTRICTOS

Clostridium
Bacteroides, Fusobacterium

TABLA 3. BACTERIAS QUE NO SE TIEN ADECUADAMENTE

CON LA COLORACIN DE GRAM
ESPIROQUETAS
MICOBACTERIAS
MICOPLASMAS
INTRACELULARES OBLIGADOS

Treponema, Borrelia, Leptospira

Mycobacterium
Micoplasma, Ureaplasma
Chlamydia, Rickettsia, Coxiella

15

La coloracin de Ziehl-Neelsen generalmente se usa para detectar micobacterias

(tuberculosis, lepra), aunque algunas variantes se emplean en el diagnstico de
actinomicosis o criptosporidiosis. Su elaboracin es tambin sencilla:
1. Prepare el extendido igual que para la coloracin de Gram,
2. Cbralo con fushina. Caliente durante 5 minutos, manteniendo emanacin de
vapor. No permita que hierva o se seque! Si se requiere, agregue ms colorante.
Enjuague con agua,
3. Decolore con alcohol cido hasta que slo las regiones ms gruesas
4. mantengan algo de color (generalmente uno o dos minutos). Enjuague,
5. Contratia con azul de metileno por un minuto. Seque y observe. Los grmenes
cido-alcohol resistentes se observan de color rojo vivo sobre fondo azul.

La coloracin de Kinyoun, es una modificacin de la anterior, solo que se utiliza

fushina combinada con un detergente, y no requiere calor. Por lo tanto, el nico
cambio es la colocacin del colorante por 3 a 5 minutos, siendo igual el resto de la
tcnica.
La coloracin de Wright es excelente para teir muestras con clulas hemticas. Su
proceso es el siguiente:
1.
2.
3.
4.
5.
6.
7.
8.

Fije el extendido con metanol por 5 segundos.

Insufle aire seco.
Cubra el extendido en el colorante de Wright (el tiempo depende de cada lote)
Aada buffer hasta producir una superficie verdosa.
Mezcle el colorante y el buffer soplando suavemente.
Deje reposar por 5 minutos.
Lave con buffer.
Seque.

Las tinciones de inmunofluorescencia, utilizan un anticuerpo acoplado a un

compuesto fluorescente, dirigido contra un antgeno especfico que permite
visualizar microorganismos u otras estructuras dentro de las clulas. Bajo un
microscopio de fluorescencia, un rayo de luz UV excita el compuesto fluorescente,
que emite luz de longitud de onda mayor (visible). Estas tinciones se utilizan para
detectar bacterias de difcil crecimiento, como Legionella, o Chlamydia, o para
deteccin de algunos virus (citomegalovirus, herpes).
1.4. Obtencin y transporte de muestras
Las tcnicas de cultivo implican colocar una muestra en un medio apropiado, que
sirve como mecanismo de amplificacin, gracias al crecimiento bacteriano. Nunca
puede insistirse demasiado en que una muestra inadecuada lleva a la falta de
aislamiento del agente causal, o al aislamiento de agentes que no estn causando
la enfermedad. Para la recoleccin y transporte, existen principios que son
generales y otros, particulares para cada muestra. En los principios generales
conviene mencionar:
1.
Enve la muestra al laboratorio en cuanto sea posible. Asegrese de conocer
los procedimientos para guardar muestras cuando el laboratorio est cerrado.
2.
Tome el espcimen antes de administrar antibiticos. Sin embargo, el uso
de antibiticos no contraindica la toma de la muestra.
16

3.
Acompae la muestra de una solicitud en que se viertan los datos clnicos
ms importantes para que el laboratorista pueda seleccionar los medios
apropiados.
4.
Tome inters por el destino de la muestra. Si la enva a travs de una tercera
persona asegrese que sea entregada a tiempo. Para muestras valiosas, es mejor
que la lleve usted mismo, recuerde un dicho de los campesinos mexicanos: No
hay como uno.
5.
Solicite resultados preliminares de coloraciones y cultivos.
Los principios particulares para cada muestra se mencionan en las secciones
posteriores, pero conviene adelantar los ms importantes:
Sangre La sangre es una de las muestras ms importantes del laboratorio de
microbiologa. La piel se prepara primero con un antisptico yodado y se deja
actuar por 3 minutos y se limpia con alcohol. En el adulto, se debe tomar un mnimo
de cinco a 10 mL y vaciar en un frasco con la cantidad suficiente de medio para
lograr una dilucin mnima de 1:10 (o sea, 100mL de caldo). Siempre es preferible
la extraccin en pico febril (con excepcin de los neonatos o pacientes debilitados
incapaces de responder con fiebre) y la toma de al menos dos botellas (y un
mximo de cinco) separadas por un lapso de 10 15 minutos. Es aconsejable
inocular el frasco con una aguja diferente a la utilizada para la extraccin, para
evitar la contaminacin con flora de la piel. En los nios pequeos, se toma de 1 a 2
ml de sangre. NOTA XX 40mL, puncin nica, ventajas de....
Expectoracin y aspirado bronquial Un requisito fundamental para la obtencin
del esputo es que el paciente sepa expectorar. Se pide al paciente que enjuague
primero su boca con agua, para evitar un exceso de flora oral.
La muestra debe recibirse en frasco estril y transportarse antes de una hora. A su
llegada al laboratorio, primero se efecta la coloracin de Gram para evaluar la
calidad. Si existe un excesivo nmero de clulas epiteliales orales, no debe
sembrarse, con excepcin de las muestras tomadas por aspirado. Para la toma de
aspirados procure utilizar alguno de los contenedores o
trampas fabricadas
ex profeso. El uso de este tipo de dispositivos mejoran con mucho la calidad de los
resultados del proceso al reducir contaminantes, aumentar el volumen de muestra y
reducir la expocision del personal a patgenos.
Exudado farngeo Debe tomarse con abatelenguas e hisopo, para lograr el
raspado de la faringe y de ambas amgdalas, tocando lo menos posible el resto de
la mucosa oral. Debe preferirse la inoculacin inmediata en el laboratorio; si no es
posible, utilice un medio de transporte para introducir el hisopo. Este es uno de los
pocos casos en que no suele hacerse una coloracin de Gram a la muestra, pues la
flora normal es muy abundante, y se reserva para los casos en que se sospecha
difteria o candidosis.
Secreciones Siempre es preferible la secrecin que se toma por puncin con
jeringa, ya que permite incluso el cultivo de anaerobios. Si cuenta con tubos de
transporte para anaerobios, vace ah la muestra. No vace el contenido en tubos
ordinarios pues, como estn oxigenados, se pierde el cultivo de anaerobios; es

17

preferible entonces transportar de inmediato en la jeringa. Si no es posible aspirar

con jeringa, tome con hisopo, de la regin ms profunda posible, separando los
bordes de la herida, o de donde observe ms secrecin, y coloque en medio de
transporte. Elabore por separado un extendido para la coloracin de Gram, ya que
siempre es preferible observar la secrecin sin el artefacto del medio de transporte.
Orina Para hacer una recoleccin correcta de la muestra, se limpia la regin
periuretral (vulva y labios, o pene) con agua y jabn. Se desecha la primera parte
de la miccin y se captura el chorro medio en frasco estril. La orina constituye un
medio de cultivo ideal, y como el urocultivo es cuantitativo, es fundamental su envo
inmediato al laboratorio. Si usted prevee retraso en transporte, coloque en hielo y
enve (no la congele!).
Excremento Para el coprocultivo generalmente se solicitan slo muestras
diarreicas (con excepcin de los cultivos de inters epidemiolgico),
preferentemente obtenidas durante los primeros tres das de la enfermedad. Al
observar la muestra, se toma de donde tenga moco. Si no se puede obtener
muestra espontnea, se introduce un hisopo en la ampolla rectal, o
preferentemente, una cucharilla especial de vidrio. Las muestras deben procesarse
de inmediato pues se produce una rpida proliferacin de comensales y
desaparicin de patgenos. Si no se puede procesar de inmediato, se coloca en
medio de transporte (generalmente Cary-Blair).
Exudado vaginal Slo tiene utilidad cuando se toma con tcnicas adecuadas en el
laboratorio (ver captulo correspondiente). Dado que debe observarse en fresco,
tomarse pH y otras pruebas, carece de utilidad cuando se enva slo el hisopo en
medio de transporte.
Lquidos corporales Si se obtienen en jeringa, envese intacta al laboratorio. Si se
obtienen en tubos envense preferentemente con tapn de hule. El retraso en el
transporte ocasiona prdida rpida de patgenos, principalmente de Hemophilus
influenzae.
1.5. Incubacin
Temperatura y humedad Casi todos los cultivos de rutina deben sembrarse en
incubadora de 35 a 37 oC . Es importante revisar todos los das la temperatura de la
incubadora y anotar en registro adherido por fuera, ya que el calor excesivo puede
inactivar a muchos patgenos y el enfriamiento, retardar su aparicin. Para evitar la
desecacin de los cultivos, es deseable una incubadora con control de humedad o,
en su defecto, la colocacin de un recipiente con agua en el interior. Cuando se
busca rutinariamente Campylobacter en coprocultivos, se debe contar con una
incubadora a 42 oC.
Tiempo Casi todos los cultivos en aerobiosis se incuban entre 18 y 24 h. En pocos
casos se requiere esperar hasta 48 h. Desde luego, esto es verdad slo para las
bacterias habituales, pues los anaerobios pueden requerir varios das, y algunos
grmenes como hongos o

18

micobacterias, varias semanas. Es una buena costumbre mantener los caldos

hasta 5 das, examinndolos todos los das en busca de turbidez. Esto es
particularmente til cuando el inculo fue pobre o el paciente estaba bajo
prescripcin de antibiticos.
Atmsfera Muchas de las bacterias patgenas tienen la capacidad de crecer en la
atmsfera normal. Sin embargo, casi todos los grmenes desarrollan mejor es un
ambiente rico en C02, que se obtiene con incubadoras especiales alimentadas con
cilindro de gas, que producen un ambiente con 6% de CO2. Si no se cuenta con
ella, pueden introducirse los medios en un frasco con vela de extincin (Figura 4).
Este sistema proporciona una atmsfera con 3% de C02, que, sin ser ideal, es
suficiente para la mayora de los grmenes que lo requieren (capnoflicos).
Siempre que se siembre un medio de chocolate o Thayer Martin, habr de
incubarse en ambiente capnoflico.
Figura 4 La extincin de una vela
produce una atmsfera con 3% de
CO2
Este ambiente capnoflico, no es una
atmsfera
anaerobia,
como
en
ocasiones se cree. Para el logro de
una atmsfera anaerobia, se requiere
una jarra hermtica en que se coloca
un sobre generador de CO2 y de H2,
los cuales, en contacto con un
catalizador,
producen
agua
y
consumen el oxgeno, logrando
adems un medio reducido (Figura 5).

Figura 5
Para lograr una atmsfera
anaerobia, se requiere una jarra especial, un
sobre generador y un catalizador. Se coloca
un indicador para asegurar que se logr el
ambiente deseado.

19

Bibliografa
1.
Carr DT, Karlson AG, Stillwell GG. A comparison of cultures of induced
sputum and gastric washings in the diagnosis of tuberculosis. Mayo Clin Proc
1967;42:23-5.
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9.
Robinson A. Rationale for Cost-effective medicine. Clin Microbiol Rev
1994;7:185-99

20

Parte 2. LA FLORA NORMAL

Los microorganismos que estn presentes en las superficies del cuerpo son
comensales, habitualmente no patgenos, y hasta tiles por dos motivos: pueden
ayudar al funcionamiento del husped (como ocurre con la flora intestinal, que
facilita la absorcin y la sntesis de la vitamina K) y compiten por el ecosistema
contra grmenes potencialmente patgenos, en un mecanismo conocido como
interferencia bacteriana. La supresin de estos microorganismos normales crea un
vaco ecolgico, que tiende a ser llenado de inmediato por grmenes contra los que
no estamos evolutivamente preparados para convivir.
Debe aclararse, sin
embargo, que los grmenes habituales pueden tambin causar enfermedad si se
conjuntan las condiciones propicias, con la invasin de las enterobacterias en
pacientes hospitalizados o en aquellos con deficiencia grave de neutrfilos,
secundaria a la quimioterapia contra el cncer. Normalmente, Bacteroides fragilis
es una de las bacterias ms comunes en el intestino grueso y es absolutamente
inocua, pero cuando un traumatismo ocasiona su salida masiva al peritoneo, causa
sepsis a menudo mortal.
Tanto el mdico como el personal del laboratorio de microbiologa
deben conocer los componentes de la flora normal, tambin conocida como
microbiota normal. Y es que, si bien el reporte de un germen aislado de un sitio
normalmente estril (como la sangre o el lquido cefalorraqudeo) no suele
representar problemas en su interpretacin, el informe y la interpretacin de cultivos
de sitios normalmente colonizados es un arte mal dominado por la mayora. Por
ejemplo, si en un exudado uretral se informa E. coli, no significa por ello que esta
enterobacteria est causando problema alguno, sobre todo cuando sabemos que
es un componente normal de la flora de la uretra terminal. Lo mismo puede decirse
de estafilococos aislados de la garganta, de enterobacterias de la vagina, de
estreptococos de la conjuntiva, etc.
Conviene agregar que la flora normal puede dividirse en residente y transitoria. La
primera est dada por tipos de microorganismos relativamente constantes que, si
se trastornan (con el uso de antibiticos, por ejemplo), se restablece con rapidez.
La segunda consiste de grmenes que provienen del ambiente y se establecen slo
por horas o das, y no tienen importancia habitual siempre y cuando no se trastorne
la flora normal; cuando ello ocurre, o cuando el husped sufre inmunosupresin, la
flora transitoria puede proliferar y causar enfermedad.
Resultara complejo describir con precisin toda la flora normal. Para empezar
puede decirse que existe una gran cantidad de anaerobios en la piel, las vas
digestivas y las vas respiratorias altas, as como la vagina de la mujer. Por ello, no
deben hacerse cultivos para anaerobios de muestras tomadas de alguna de estas
superficies, o que hayan estado en contacto con ellas. De los anaerobios normales,
generalmente predominan los grampositivos, con excepcin del colon, en donde
predominan los bacilos gramnegativos (Bacteroides fragilis). En pequeas
cantidades, puede existir una flora normal de hongos, generalmente del gnero
Candida. Existe una gran variedad de parsitos monocelulares que viven
normalmente en el tubo digestivo, como amebas no histolticas, Endolimax,
21

Blastocystis, Trichomonas (no vaginalis) y Chilomastix. No se sabe bien si existe

una flora viral normal, por lo que cualquier virus aislado en cultivo suele
considerarse patgeno. Adems de la flora mencionada, existen muchas bacterias
de acuerdo con los siguientes sitios especficos:
Piel y parte terminal de la uretra
Estafilococo coagulasa negativo
Estafilococo coagulasa positivo (escasa cantidad)
Candida (escasa cantidad)
Acinetobacter (escasa cantidad)
Boca, mucosa nasal y farngea
Estreptococos (con excepcin de betahemolticos)
Estafilococos (coagulasa positivo y negativo)
Enterobacterias (en escasa cantidad)
Neumococo (30% de las personas)
Tubo digestivo
Estafilococos coagulasa positivo y negativo
Todas las enterobacterias, excepto Salmonella, Shigella, Yersinia, Edwarsiella y
Vibrio
Bacilos gramnegativos no fermentadores como Pseudomonas
Enterococos
Estreptococos alfa hemolticos y no hemolticos
Vagina
Lactobacilos
Estreptococos alfa hemolticos y no hemolticos
Enterococos
Enterobacterias
Bacilos gramnegativos no fermentadores
Estafilococo coagulasa negativo
Staphylococcus aureus (escasa cantidad)
Conjuntiva
Estafilococo coagulasa negativo
Estreptococos alfa hemolticos y no hemolticos
S. aureus (escasa cantidad)
Bibliografa:
1. Maciwiak PA. The normal microbial flora. New Engl J Med 1982;307:83-6

22

Parte 3. IDENTIFICACION BACTERIANA

Generalidades
La identificacin bacteriana es una de las funciones primordiales del laboratorio,
pero nada causa mayores diferencias de opinin entre los microbilogos que la
comparacin de criterios aplicados a la identificacin entre un laboratorio y otro. Sin
embargo, debemos reconocer que las diferencias taxonmicas no siempre
significan diferencias en infectividad, respuesta al tratamiento o pronstico. En
realidad, no es generalmente el nombre del microorganismo lo que cuenta.
Mientras que algunos laboratorios especializados podrn identificar todos los
microorganismos hasta sus ltimas consecuencias, sin reparo en tiempo y costo, es
claro que la mayora de los laboratorios generales no pueden hacerlo, ni los
mdicos a que sirven proporcionarn un mejor cuidado a sus pacientes como
consecuencia de ello. De hecho, los mdicos que tratan enfermedades infecciosas
slo intermitentemente tendern a usar esta informacin.
Generalmente se identifican todas las bacterias aisladas en cultivo puro, o hasta un
mximo de tres aislamientos de crecimientos polimicrobianos (cuando la coloracin
de Gram muestra abundancia de leucocitos y escasez de clulas epiteliales). En
otros casos, los aislamientos no debern identificarse completamente. Por ejemplo,
cuando hay desarrollo de cuatro o ms grmenes, la identificacin completa y
sensibilidad a antibiticos no contribuyen ms al diagnstico y al tratamiento que
una identificacin presuntiva basada en las caractersticas generales de las
colonias, en ocasiones auxiliada por pruebas rpidas (catalasa, coagulasa, oxidasa,
etc.). La identificacin incompleta se aplica tambin a microorganismos presentes
en cuentas menores que 105/mL de orina, o cuando se obtienen ms de dos
grmenes en cuentas significativas. El dar utilidad a la identificacin bacteriana de
cultivos mixtos implica en ocasiones identificar al germen que desarrolla ms
abundantemente, cuando correlaciona con lo que se observa en la coloracin de
Gram. Es tambin un ejercicio clnico que requiere que el personal del laboratorio
mantenga contacto con el mdico tratante para tomar decisiones.
Debe advertirse que los costos de la identificacin deben balancearse contra la
utilidad clnica. Por ejemplo, la identificacin con antisueros es ms precisa que la
sensibilidad a la bacitracina para la identificacin del estreptococo del Grupo A,
dado que algunos estreptococos de otros grupos pueden por excepcin dar esta
prueba positiva. Sin embargo, el costo es al menos 10 veces mayor con el primer
mtodo, por lo que, para los fines clnicos, el segundo es generalmente
satisfactorio.
Incluso cuando se ha decidido efectuar una identificacin completa de uno o varios
microorganismos, el trabajo debe considerar el tiempo, puesto que un informe es
ms til mientras sea ms rpido. Por ejemplo, si existe duda en la identificacin
precisa de una especie, ser mejor informar Enterobacter sp que esperar 24 horas
ms para enviar un resultado definitivo. De hecho, es siempre importante enviar
informes preliminares como Desarrollo de bacilo gramnegativo, lactosa positivo, y
no esperar hasta la identificacin y antibiograma completos pues es comn que,
cuando se recibe el resultado, ha dejado de tener utilidad. Nunca debe permitirse
que una muestra permanezca ms de 48 horas en un laboratorio sin haber
23

enviado algn informe, as sea preliminar. Un informe inmediato que indique que
la coloracin de Gram de la muestra contiene leucocitos y bacterias puede ser
mucho ms valioso para el clnico que una identificacin y antibiograma precisos
dos das despus. Conforme con la estructura de este manual, se indican los
criterios mnimos de identificacin, conscientes de que la pureza acadmica
aconsejara, en muchos casos, un trabajo ms exhaustivo, que frecuentemente
excede las posibilidades de los laboratorios generales. Por ello mismo, nos
limitaremos a la identificacin de grmenes aerobios y con orientacin sobre las
pruebas bioqumicas ms que de otro tipo (como el uso de antisueros,
cromatografa o sondas moleculares). En el captulo siguiente se comentan algunos
procedimientos para anaerobios.
3.1. Identificacin de cocos grampositivos
Generalidades
Despus de las enterobacterias, los cocos grampositivos son los microorganismos
ms comunes en el organismo humano, ya que se encuentran prcticamente en
todos los sitios que se encuentren habitados por bacterias. Aun cuando son
comensales, frecuentemente se les encuentra involucrados en cuadros infecciosos
que pueden ir desde una leve infeccin de la piel, hasta un cuadro septicmico
mortal. Estos microorganismos son aerobios y anaerobios facultativos. Los grupos
ms importantes son la familia Micrococcaceae, de la cual destacan los
estafilococos, y el grupo de los estreptococos.
Debido a su importancia mdica por la gran cantidad de cuadros que producen, y a
la confusin que pudiera generar su aislamiento en un momento determinado en
alguna muestra clnica, vamos a tratar especficamente a los
gneros
Staphylococcus y Streptococcus. Aunque las caractersticas de las colonias de los
dos gneros son muy diferentes, puede existir alguna duda al momento de
identificarlas, sobre todo al realizarse una coloracin de Gram y observar cocos
positivos. La prueba diferencial entre ambos gneros es la produccin de catalasa,
que resulta positiva slo para los estafilococos.
3.1.2. Estafilococos
Existen varias especies de estafilococos que se pueden aislar de muestras clnicas,
pero para fines prcticos, se pueden clasificar en dos grupos dependiendo de su
capacidad para coagular el plasma: los coagulasa positivos, existiendo en este
grupo nicamente el S. aureus, y los coagulasa negativos, dentro de los cuales
destaca el S. epidermidis. Hay que recordar que, aun cuando las cepas que
coagulan el plasma se consideran patgenas, las que no lo hacen pueden estar
produciendo una infeccin, y el criterio para determinarlo deber de ser clnico.
Existen otras pruebas auxiliares para diferenciar a S. aureus de los dems, como
son la utilizacin del manitol y la produccin de DNAsa.
Para los fines clnicos, una vez que se ha determinado que la prueba de coagulasa
es negativa, se acostumbra informar slo Estafilococo coagulasa-negativo, ya que
24

una identificacin completa de la especie rara vez tiene beneficio para el paciente.
Sin embargo, debemos aclarar que no todos los estafilococos coagulasa negativos
son S. epidermidis, por lo que es mejor el informe con la primera denominacin.
3.1.3. Estreptococos
En este grupo se encuentran algunos de los microorganismos que producen
ms enfermedad y muerte a escala mundial. La clasificacin del gnero
Streptococcus se basa en los carbohidratos de su pared celular (polisacrido C) y
consta de 18 grupos antignicos denominados de la A a la H y de la K a la T. Los
estreptococos considerados patgenos pertenecen principalmente a los grupos A,
B y D. Existen adems otros grupos potencialmente patgenos que no se
encuentran dentro de la clasificacin anterior, son el S. viridans y el S.
pneumoniae.
Una de las caractersticas ms importantes de estos grupos es la de producir
hemlisis en medios con sangre, clasificndose sta en alfa cuando es parcial, beta
cuando es completa, y gamma cuando no se produce (lo cual parece una
denominacin incorrecta, pero est muy arraigada).
Al grupo A pertenece el S. pyogenes, es beta-hemoltico y se diferencia de los
dems por su sensibilidad a la bacitracina. Es considerado el ms importante desde
el punto de vista clnico debido a la gran variedad de cuadros que produce, ya sea
por lesin directa, o bien por fenmenos inmunolgicos secundarios a la infeccin.
Al grupo B pertenece el S. agalactiae, que tambin es beta hemoltico y se
caracteriza por presentar reaccin de CAMP positiva (se forma una punta de flecha
en la hemlisis del estreptococo, cuando es sembrado perpendicularmente a un
estafilococo, en agar sangre),por ser sensibles al trimetoprim/sulfametoxazol y por
producir hidrlisis del hipurato de sodio.
Los del grupo D se dividen en enterococos y no enterococos, de los cuales existen
varias especies. Son ms importantes clnicamente como grupo. Se caracterizan
por ser bilis esculina positivos y pueden presentar cualquier tipo de hemlisis.
Existen otras pruebas para su clasificacin como son el crecimiento en medios con
6.5% de cloruro de sodio y la produccin de pirrolidonil peptidasa. Actualmente, los
del grupo enterococo se han agrupado en un gnero diferente (Enterococcus).
Ms que una especie, el S. viridans es un grupo de microorganismos, los
cuales no presentan hemlisis o la presentan de tipo alfa. Con frecuencia se
encuentran involucrados en cuadros de endocarditis infecciosas.
Por ltimo, el S. pneumoniae, conocido como neumococo, produce cuadros
neumnicos y menngeos. Este se caracteriza por ser sensible a la optoquina y por
su solubilidad en bilis, lo que lo diferencias de los S. viridans.
Existen en el mercado mltiples equipos de identificacin para estreptococos, as
como antisueros para tipificarlos por grupos, pero son costosos y muchas veces no
est justificado su uso pues los procedimientos anteriormente mencionados son
suficientes para una identificacin satisfactoria desde el punto de vista de la
microbiologa clnica. En la figura 1 se muestra un diagrama de flujo para la
identificacin de los cocos grampositivos aerobios.

25

3.1.3. Procedimientos para identificacin de cocos grampositivos

Se procede a utilizar las colonias obtenidas de un agar adicionado con sangre de
carnero. Primero se analiza el tipo de hemlisis de las colonias aisladas y
posteriormente se realiza la prueba de catalasa para distinguir entre el gnero
Staphylococcus y Streptococcus. Es importante efectuar una coloracin de Gram
para confirmar que se trata de cocos grampositivos pues las colonias de levaduras,
o incluso algunos cocos gramnegativos, pueden ser de fenotipo semejante.
3.1.4. Pruebas para diferenciacin de estafilococos
Prueba de catalasa Se procede a colocar una gota de perxido de hidrgeno
(H2O2) al 3% en un portaobjetos. Enseguida se sumerge en ella colonia aislada
sospechosa, levantada con una asa de piquete (procurando no tomar agar),
interpretndose como positiva la formacin de burbujas. Es conveniente hacer una
observacin microscpica en fresco ya que Candida spp. podra dar reacciones
falsamente positivas y mostrar colonias similares en agar sangre.
Prueba de coagulasa La prueba de coagulasa sirve para identificar al S. aureus.
Se puede realizar en placa o en tubo, la primera sirve para coagulasa ligada (la cual
se encuentra en la pared de la bacteria) y la segunda, para observar la accin de la
coagulasa libre. Cualquier prueba negativa en placa debe de comprobarse
mediante una en tubo.
Prueba de coagulasa en placa Se coloca solucin salina estril sobre un
portaobjetos y se emulsifica en ella una o varias colonias del microorganismo a
estudiar, hasta tener una suspensin lechosa. Se agrega luego una gota de plasma
y se mezcla. Enseguida, se mueve el portaobjetos. La prueba se considera positiva
al observar la formacin de grumos blancos, lo cual requiere de 15 a 20 segundos,
dndose como negativa si stos no se forman al cabo de 3 minutos.
Prueba de coagulasa en tubo Se colocan 0.5 ml de plasma humano o de conejo
en un tubo de prueba. Se agrega con una asa una colonia del microorganismo y se
coloca el tubo en bao Mara a 37 oC. La prueba se hace positiva de 1 a 4 horas,
en que se observa la produccin del cogulo, aunque algunas cepas requieren
hasta de 18 h. Algunos estafilococos producen fibrinolisina que destruye el cogulo
despus de formado, por lo que siempre hay que hay que hacer dos observaciones
(2-4h y 18h), para evitar pruebas falsas negativas.
3.1.4b. Pruebas para diferenciacin de estreptococos
Sensibilidad a la bacitracina Se realiza una siembra de la colonia sospechosa
por estra cerrada en un medio de agar enriquecido con sangre de carnero.
Enseguida se coloca un disco con bacitracina en bajas concentraciones (0.04 U)
sobre la estra. Se incuba durante 24 horas y se observa. La prueba se considera
positiva cuando se observa un halo de inhibicin en el medio. Esta prueba es
sensible para el estreptococo del Grupo A (S. pyogenes). De manera paralela
pruebe la sensibilidad a trmetoprim/sulfametoxazol (TMP/SMX) , antibitoco al cual
S. pyogenes es regularmente resistente.

26

Prueba de CAMP Esta prueba consiste en el incremento de la actividad hemoltica

de la beta lisina estafiloccica mediante un factor producido por los estreptococos
del grupo B. El acrnimo CAMP pertenece a los apellidos de los descubridores
de la prueba. Para realizarla se siembra en lnea una colonia del estreptococo en
estudio, perpendicular a otra siembra en lnea de una cepa de S. aureus, en medio
de agar sangre. Las lneas no deben tocarse. La prueba se considera positiva si se
observa una hemlisis aumentada en forma de punta de flecha en el lugar de
aproximacin de ambas lneas. Esta prueba es positiva para el estreptococo del
Grupo B (S. agalactiae).
Prueba de bilis esculina Se basa en la caracterstica de algunos estreptococos
de crecer en agar con una concentracin de 1 a 4% de sales biliares y de hidrolizar
la esculina. El medio de bilis esculina se prepara en caldo, tubos inclinados o bien,
en placas de agar. La prueba se realiza tomando de dos a cuatro colonias
sospechosas y realizando una siembra en S en el tubo o en la placa. La prueba se
considera positiva cuando se forma una coloracin negruzca en el medio debido a
la produccin de esculetina, la cual se combina con sales de hierro contenidas en el
medio. Esta prueba es positiva para los estreptococos del Grupo D y los
enterococos (S. bovis y Enterococcus spp.)
Sensibilidad a la optoquina La prueba se realiza igual que la de la bacitracina,
con la diferencia de que el disco a utilizar ser con 5 ug de optoquina. La
incubacin se realizar por 18 a 24 horas en una jarra con vela de extincin. Un
halo de inhibicin se interpreta como positivo. Esta prueba es muy til pues es
positiva para el neumococo, lo que ayuda a diferenciarlo de otros estreptococos alfa
hemolticos (S. viridans y enterococos).
3.2. Identificacin
fermentadores

de

enterobacterias

bacilos

gramnegativos

no

Generalidades
Como hemos visto captulos anteriores, las enterobacterias son un grupo de
primordial importancia en la medicina porque se pueden encontrar en casi todas las
partes del organismo, y por ende, producir infecciones. Para comenzar diremos que
las enterobacterias, como su nombre lo dice, son microorganismos que habitan en
el tubo digestivo del hombre, son gramnegativos y anaerobios facultativos. Existen
otras bacterias que coinciden en estas condiciones con las enterobacterias, pero
hay tres caractersticas adicionales que deben de cumplir para pertenecer a este
grupo:
1.
2.
3.
4.

Reducen los nitratos a nitritos.

Fermentan la glucosa.
Carecen de actividad de oxidasa.
Crecen en el medio de MacConkey

La prueba de oxidasa, conocida tambin como citocromo-oxidasa, es generalmente

de primera en la lnea pues, cuando es positiva, descarta la posibilidad de que el
germen sea una enterobacteria (con muy raras excepciones). Slo se requiere
27

tomar una colonia de algn medio no selectivo y rasparla contra un papel filtro
impregnado del reactivo de la prueba. La inmediata aparicin de color azul indica
resultado positivo. Con excepcin de algunos biotipos de Enterobacter agglomerans
y algunas especies de Erwinia, todas las enterobacterias reducen los nitratos a
nitritos. Sin embargo, esta es una prueba bioqumica que se realiza pocas veces,
toda vez que la prueba de oxidasa es mucho ms sencilla.
Como se mencion anteriormente, existen bacilos gramnegativos no fermentadores
que pueden aislarse en muestras clnicas del medio de MacConkey, por lo cual hay
que diferenciar entre stos y las enterobacterias.
3.2.1. Identificacin de las Enterobacterias
Una vez que el microorganismo se ha aislado en un medio selectivo como el
MacConkey y se sospecha que es una enterobacteria por tener un olor intestinal y
oxidasa negativa, se procede a identificarlo mediante pruebas bioqumicas, las
cuales se realizan en medios diferenciales. Las pruebas generalmente utilizadas
son:
1.
2.
3.
4.
5.
6.
7.
8.
9.
10.

Utilizacin de hidratos de carbono.

Produccin de indol.
Produccin de acetil metil carbinol (Voges-Proskauer).
Utilizacin de citrato.
Produccin de ureasa.
Descarboxilacin de aminocidos (lisina, ornitina y arginina).
Desaminacin de fenilalanina
Produccin de sulfuro de hidrgeno.
Movilidad
DNAsa

Existen otras pruebas que pueden utilizarse como la de rojo de metilo, la actividad
de ortonitrofenilgalactosidasas (ONPG), o la de fenilalanina desaminasa, pero
nosotros consideramos que las anteriores permiten resolver la mayora de los
problemas en identificacin.
1.
La utilizacin de hidratos de carbono se puede verificar en tubos como el
agar hierro de Kligler o el agar hierro triple azcar. El primero es el que nosotros
acostumbramos, se inocula por picadura y siembra adems en superficie del
inclinado o pico de flauta. Se observa la utilizacin aerbica de lactosa en el pico
de flauta y la fermentacin (anaerobia) de glucosa en el fondo, con produccin de
gas o sin l. Como se mencion, todas las enterobacterias acidifican el fondo del
tubo de Kligler. El medio contiene un indicador de pH, de tal forma que al
fermentarse los carbohidratos existe un cambio en la coloracin (vira al amarillo).
Este medio tambin contiene hierro el cual pone en evidencia la produccin de
sulfuro de hidrgeno (vira al negro), que se ve mejor en el fondo cido ya que el
microorganismo requiere de un pH bajo para producirlo.
2.
El indol es un producto de la degradacin del triptofano, y se puede hacer
patente en el medio mediante la adicin de reactivo de Ehrlich o de Kovac,
formndose un sobrenadante rojo en el medio. El primer reactivo es ms sensible,
28

por lo cual es preferible. El medio ms comn para observar la produccin de indol

es el SIM, cuyas siglas significan sulfuro, indol y movilidad, por lo tanto sirve para
otras dos caractersticas, que trataremos posteriormente. El medio es semislido y
se siembra por picadura.
3.
El acetil metil carbinol (acetona) es un producto de la degradacin del cido
pirvico proveniente de la fermentacin de la glucosa y su produccin se hace
patente mediante la reaccin de Voges-Proskauer en el medio lquido del mismo
nombre. La reaccin se basa en la conversin de la acetona en diacetil por accin
del KOH que se agrega al medio y del oxgeno atmosfrico. Es necesario agregar
adems alfa naftol para catalizar la reaccin dando un pigmento rojo. El medio es
lquido y se siembra mediante la agitacin del asa en su interior. Esta prueba es
muy til para la identificacin de los miembros de la tribu Klebsiella (Klebsiella,
Enterobacter, Serratia).
4.
Algunas bacterias utilizan el citrato como fuente de energa para su
metabolismo. Para esta prueba se utiliza el medio de citrato de Simmons, que
contiene citrato de sodio y fosfato de amonio (como fuente de nitrgeno). Las
bacterias que usan citrato utilizan la sal de amonio para extraer el nitrgeno,
produciendo as amoniaco, el cual se convierte en hidrxido de amonio que
alcaliniza el medio. El medio se debe sembrar mediante estra en la superficie y
basta para considerarse positivo el crecimiento de la colonia en la estra, o su
acidificacin (se torna azul).
5.
Los microorganismos que hidrolizan la urea liberan amoniaco y dixido de
carbono; el amoniaco forma carbonato de amonio, alcalinizando el medio y
produciendo una coloracin rojo-rosado. Existen dos medios disponibles para
realizar esta prueba, el de Stuart que detecta solo grandes cantidades de amonio
y el de Christensen, que est menos amortiguado y es por lo tanto, ms
recomendable por ser sensible a menores cantidades de amoniaco. El medio se
inocula mediante la siembra en la superficie en pico de flauta.
6.
La descarboxilacin de aminocidos libera aminas de reaccin alcalina y
dixido de carbono requirindose de un pH inicial cido. El medio que se utiliza es
el de Moeller, el cual es de color azul-grisceo. En un inicio el color vira a amarillo
por la fermentacin de glucosa pero al producirse la descarboxilacin regresa a su
color original. El medio es slido, se inocula mediante picadura ya que la reaccin
debe llevarse en anaerobiosis, por lo que se observa en el fondo del tubo. El
medio tiene la ventaja de permitir observar tambin la desaminacin de la
fenilalanina en el pico de flauta, que se torna rojizo.
7.
La produccin de sulfuro de hidrgeno mide la capacidad de los
microorganismos para liberar azufre de aminocidos. Como vimos anteriormente,
el medio debe contener una fuente de azufre y un indicador de H2S en el medio
(sales de hierro). Los medios que se utilizan son el Kligler y el SIM, los cuales ya
describimos. La prueba es positiva al verse pigmento negro en el medio. El SIM es
ms sensible.
29

8.
La movilidad se observa en bacterias que son flageladas o que tienen la
capacidad de formar flagelos a ciertas temperaturas. Pueden hacerse
coloraciones especiales para flagelos, pero resultan poco prcticas. El medio para
observar esto debe de ser semislido, utilizndose el de SIM (sulfuro, indol,
movilidad) o el MIO (movilidad, indol, ornitina). La prueba es positiva cuando el
medio se ve turbio en lugar del crecimiento slo en el sitio de la picadura (debido a
la diseminacin bacteriana). En las bacterias inmviles el piquete de la inoculacin
permanece claramente visible. El movimiento bacteriano se observa mejor
mediante otras tcnicas como en la de gota suspendida. Esta tcnica requiere ver
la movilidad directamente al microscopio, en una gota de solucin salina que se
coloca en un cubreobjetos que habr de invertirse para que la gota quede
pndula. Finalmente, el cubreobjetos se descansa sobre un portaobjetos al que se
le han colocado dos pilares para evitar que la gota pndula haga contacto con la
superficie de ste. Debe distinguirse el movimiento bacteriano del que poseen
todas las partculas microscpicas, o movimiento browniano.
9.
La prueba de DNAsa generalmente se efecta en una caja de Petri con agar
que contiene DNA y un indicador (azul de toluidina) que vira a rosado en
presencia de la enzima. Es til para distinguir especies de Serratia (resultado
positivo) de las de Klebsiella y Enterobacter (resultado negativo).
Se pueden realizar todas estas pruebas y otras ms. Inclusive existen paquetes
completos ya disponibles para diagnstico rpido, pero no tienen ninguna ventaja
sobre los convencionales y s aumentan considerablemente su costo. Una vez que
se incuban los medios diferenciales inoculados por 18 a 24 horas se anotan los
resultados para compararlos posteriormente con tablas realizadas para el fin, las
cuales tienen el porcentaje de reaccin a cada una de ellas de los diferentes
microorganismos para lograr su identificacin, que puede llegar a ser incluso de
gnero y especie. En nuestro laboratorio utilizamos una tabla simplificada (anexa)
que nos permite resolver la identificacin de la mayora de las enterobacterias.
Cuando no nos es posible lograr la identificacin con este esquema simplificado,
procedemos a identificar por un sistema comercial, que requerimos con poca
frecuencia.
3.2.2. Bacilos McConkey positivos no fermentadores
Se conoce como no fermentadores a un grupo diverso de bacilos gramnegativos,
incapaces de acidificar el fondo del tubo de Kligler y de crecer adecuadamente en
anaerobiosis. Entre estos se consideran generalmente a Pseudomonas,
Acinetobacter, Xantomonas, Brucella, Moraxella y Hemophilus Estos tres ltimos
requieren medios enriquecidos para su desarrollo, por lo que no suelen considerarse
junto con los primeros. Entonces, la designacin de no fermentador suele
reservarse para los bacilos gramnegativos que no acidifican el fondo del tubo de
Kligler, pero que crecen en el medio de MacConkey. El panel bioqumico
convencional utilizado para identificar enterobacterias no es de utilidad en este caso.
En su lugar, se utilizan pruebas rutinarias como la oxidasa, la morfologa
microscpica, la movilidad, el crecimiento en agar MacConkey y la apariencia de la
30

colonia. En realidad, la identificacin de bacilos no fermentadores en laboratorios

generales no se realiza meticulosamente, lo cual se debe, principalmente, a que la
mayora de las infecciones por no fermentadores derivan de los mencionados
gneros Pseudomonas, Xantomonas y Acinetobacter, los cuales son fciles de
identificar sin necesidad de invertir en medios costosos. Obviamente, se corre el
riesgo de tomar algn otro gnero como una Pseudomonas oxidasa negativa o como
un Acinetobacter.
Cuando se cuenta con un bacilo que desarroll en el agar de MacConkey y que, por
su fenotipo colonial, sugiere un no fermentador (olor no intestinal, generalmente
lactosa negativa) se procede a realizar una prueba de oxidasa (tomar colonia de
algn medio no selectivo pues tomadas del MacConkey pueden ocurrir falsas
positivas). Si sta resulta positiva y adems se observa que la colonia produce un
pigmento verde azulado en el agar de Meller-Hinton (piocianina) se identifica como
P. aeruginosa. En el caso de no resultar positiva la prueba de oxidasa se investiga la
movilidad de la cepa, con lo cual podemos diferenciar a otras especies de
pseudomonas (mviles), del gnero Acinetobacter (inmvil). Toda investigacin de
movilidad de un germen no fermentador debe hacerse en gota suspendida. Un
germen no fermentador que ha adquirido gran importancia en infecciones
nosocomiales es Xantomonas maltophilia (Stenotrophomonas maltophilia) que puede
identificarse fcilmente por su color verde lavanda en agar sangre, olor amoniacal,
oxidasa negativa, movilidad positiva y crecimiento en MacConkey como lactosanegativa. Es afortunado que P. aeruginosa, X. maltophilia y Acinetobacter sp. sumen
ms del 90% de los no fermentadores que crecen en MacConkey, por lo que la
identificacin no suele ser complicada. Puesto que resulta poco prctico contar con
una gran diversidad de pruebas bioqumicas requeridas para identificar no
fermentadores poco comunes, recurrimos a sistemas comerciales cuando no
logramos identificar a los no fermentadores con pruebas sencillas, como puede
observarse en el diagrama anexo.
3.2.3.
Bacilos gramnegativos McConkey negativos exigentes
Entre los bacilos exigentes, o de difcil crecimiento, se cuentan H. influenzae,
Campylobacter, Bordetella, Brucella, Gardnerella y Pasteurella. Caractersticamente,
no desarrollan en el agar MacConkey y requieren atmsfera capnoflica. Suelen ser
cocobacilares ms que bacilares, por lo que incluso Moraxella y Neisseria (cocos
gramnegativos) suelen confundirse con ellos. Para su identificacin son importantes
caractersticas como: crecimiento en agar sangre (por 48 h, en atmsfera
capnoflica), oxidasa, acidificacin del fondo del tubo de Kligler y catalasa. Nosotros
utilizamos el algoritmo de Blachman, que reproducimos enseguida
3.3.

IDENTIFICACION DE BACILOS GRAMPOSITIVOS

Los bacilos grampositivos aerobios que se aslan con mayor frecuencia

corresponden al gnero productor de esporas Bacillus, que generalmente
corresponden a contaminantes, aunque B. cereus puede ocasionar un cuadro de
intoxicacin por alimentos y B. anthracis, el ntrax, enfermedad de animales

31

herbvoros y humanos en contacto con ellos, que ocurre principalmente en pases

del Asia. De los no productores de esporas son importantes Listeria,
Corynebacterium, Erysipelothrix y Lactobacillus. Ocasionalmente, algunas cepas
aerotolerantes de los anaerobios Clostridium, Propionibacterium y Actinomyces
(anaerobios estrictos) pueden desarrollar en aerobiosis, aunque lo hacen
pobremente. Como se observa en el diagrama de flujo anexo, el primer paso de la
identificacin de un bacilo grampositivo consiste en determinar la presencia de
esporas. Esta identificacin puede lograrse de varias maneras, como la simple
observacin de las esporas en la coloracin de Gram despus de incubar 24 h a 45
oC o la induccin de esporas por choque con alcohol o por calentamiento. Este
ltimo es el que preferimos por ser menos subjetivo; consiste en efectuar una
dilucin del germen en un caldo y calentar en bao Mara a 70 oC por 10 minutos.
De la dilucin se toma luego una asada para resembrar en agar sangre a 36 oC por
18 a 24 h. Si hay crecimiento, puede deducirse que el
microorganismo forma esporas. La identificacin se contina con pruebas sencillas
como la catalasa, la movilidad observada en gota suspendida, el crecimiento en
agar de bilis esculina (con hidrlisis de la esculina), la morfologa en el Gram, la
hemlisis y la produccin de sulfuro.
Los bacilos grampositivos aerobios ramificados, Nocardia y Streptomyces, se
conocen como actinomicetos aerobios. Se consideraron antiguamente como
hongos por su apariencia en los tejidos, pues parecen formar hifas. Ocasionan
cuadros de micetoma, o pie de Madura, as como neumona e infecciones
diseminadas en pacientes con deficiencia inmune. Se les distingue fcilmente por
su apariencia ramificada, su crecimiento lento en agar sangre (cinco a 10 das) y su
buen desarrollo en agar Sabouraud para hongos. Sus colonias semejan trozos de
gis.
Bibliografa
1. Baron EJ, Weissfeld AS, Fuselier PA, Brenner DJ. Clasification and identification of bacteria. In
Murray PR, Baron EJ, Pfaller MA, Tenover FC, Yolken RH (ed.), Manual of Clinical Microbiology,
6th ed. American Society for Microbiology, Washington D.C., 1995:249-64.
2. Pratt-Rippin K, Pezzlo M. Identification of commonly isolated aerobic Gram-positive bacteria. In:
Isenberg HD (Ed.). Clinical Microbiology Procedures Handbook, 1th ed. American Society for
Microbiology, Washington D.C.,1992:1.20.1-1.20.44.
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Significance of Medical Microbiology in the Care of Patients. The Williams and Wilkins Co,
Baltimore, 1977:87-95.
4. Shigei J. The methods used in the identification of commonly isolated aerobic Gram-negative
bacteria. In: Isenberg HD (Ed.). Clinical Microbiology Procedures Handbook, 1th ed. American
Society for Microbiology, Washington D.C.,1992:1.19.1-1.19.104

32

3.4 Identificacin de cocos gramnegativos

Los cocos gramnegativos son patgenos relativamente poco comunes. De los
anaerobios, predomina con mucho el gnero Prevotella, que tiene poca importancia
como causante de enfermedades especficas, pues casi siempre ocurre en
infecciones polimicrobianas. Los aerobios s son causantes de enfermedades
especficas y se les reconoce como la familia Neisseriaceae, constituda por cocos
gramnegativos que tienen tendencia a agruparse en parejas. Se divide en 4
gneros: Neisseria, Kingella, Acinetobacter y Moraxella (Bramhamella).
El gnero Neisseria es el ms importante y est constituido por cocos que tienden a
agruparse en forma de granos de caf. Sus especies patgenas, el meninigococo y
el gonococo, no desarrollan en el agar sangre y requieren del medio de chocolate;
esto las distingue de otros miembros de la familia. El resto de las Neisserias son
comensales de las vas respiratorias altas y casi nunca actan como patgenos.
Aunque existen medios bioqumicos para su diferenciacin, la asociacin clnica
suele ser bastante caracterstica, por lo que no suele identificrseles hasta el nivel
de especie; por ejemplo, cuando se aslan de secrecin uretral, generalmente se
infiere que se trata del gonococo. Desde luego que, para fines legales, la
identificacin deber llevarse a sus ltimas consecuencias. En el cuadro se
muestran las pruebas que ms comnmente se usan para la distincin en gneros.
El gnero Acinetobacter se estudia tambin, comnmente, con los bacilos
gramnegativos no fermentadores debido a que desarrolla en el medio de
MacConkey y a que, bajo influencia de antibiticos, es capaz de formaciones
bacilares. Ha adquirido cada vez ms importancia como causante de neumonas
hospitalarias, pues muestra gran propensin a adquirir resistencia a los antibiticos
de uso ms comn, lo que facilita su seleccin. En algunos hospitales se encuentra
ya entre los primeros 5 agentes causales de infeccin. Bramhamella catarrhallis,
conocida antiguamente como Moraxella catarrhallis, es un habitante normal de la
boca y las vas respiratorias altas, pero se le encuentra frecuentemente como
causante de neumona en pacientes ancianos con enfermedad pulmonar conocida.
El grupo Kingella es parte de la flora normal de la boca y raramente causa
enfermedad, pero se le ha descrito en algunos casos de endocarditis subaguda.
Caracterstica
Oxidasa
Catalasa
Reduccin de Nitritos
Crecimiento en
MacConkey

Neisseria

Bramhanella

Acinetobacter

Kingella

+
+
+
-

+
+
-

+
-

+
+
-

33

Parte 4. EL PROCESO DE LA MUESTRA

4.1. SECRECIONES DE PIEL Y TEJIDOS BLANDOS
Generalidades
La piel es la interfase del organismo con el medio ambiente y constituye el
rgano ms accesible. Se compone de una zona superficial llamada epidermis y
una zona profunda llamada dermis. La epidermis carece de vasos sanguneos y se
nutre slo por difusin. En la piel existen los llamados anexos, que comprenden los
folculos pilosos, glndulas sebceas y glndulas sudorferas. Debajo de la dermis
se encuentra la grasa subcutnea y la siguen las membranas que cubren los
msculos (fascias), ligamentos y otros tejidos conectivos (Figura 1). Por fortuna los
planos fasciales suelen ser inicialmente impenetrables para las infecciones. Sin
embargo, las infecciones graves penetran ms all de las fascias, como ocurre en
extremidades de pacientes diabticos, o a consecuencia de golpes severos. Aqu

Figura 1. Corte esquemtico de la piel

normal. Observe los distintos planos.

se tratarn nicamente las infecciones comunes de piel y tejidos subcutneos.

Las infecciones cutneas se clasifican en primarias y secundarias. La primaria
ocurre de novo en pacientes sin una puerta de entrada obvia como sucede en las
erisipelas. Las secundarias son complicaciones de lesiones de la piel como
raspaduras, heridas quirrgicas y heridas penetrantes. Algunas veces estas
infecciones son monomicrobianas como en la infeccin por Staphylococcus aureus,
o polimicrobianas, como en las gangrenas. Caractersticamente, estas infecciones
polimicrobianas asientan sobre tejido muerto y no curan si no se procede a su retiro
quirrgico, como en el caso del pi diabtico. Las infecciones tambin pueden ser
agudas o crnicas: la erisipela desaparece despus de unos das; en cambio, las
infecciones por hongos, o tias, pueden durar aos.
Clnicamente, las lesiones se dividen en eritematosas superficiales, lceras,
ndulos y fstulas, as como las infecciones de heridas y de quemaduras.
4.1.2. Toma de muestras, inoculacin e interpretacin de resultados
Infecciones superficiales con eritema La infeccin ms frecuente de este tipo es la
erisipela. Comnmente es causada por estreptococos betahemolticos del Grupo A
(Streptococcus pyogenes). La infeccin primaria involucra la dermis y la parte ms
superficial del tejido subcutneo. Los datos clnicos son dolor, enrojecimiento,
34

inflamacin y endurecimiento de la piel, ocasionalmente con pequeas vesculas o

bulas en la superficie. Hay apariencia de cscara de naranja y existe un borde bien
definido. En forma aguda hay fiebre y se pueden tocar los ganglios linfticos del
pliegue ms cercano. Pueden aparecer algunas vesculas, pero es poco comn que
la infeccin se haga profunda.
A diferencia de la erisipela, la celulitis es una infeccin difusa que tiende a expandirse
por debajo de la dermis, afectando la grasa subcutnea. Existe dolor local,
reblandecimiento, eritema e inflamacin, asociados con fiebre, escalofros e
inflamacin de los ganglios linfticos de la regin. El margen de la lesin est mal
definido, no elevado ni demarcado. El estreptococo del Grupo A y el S. aureus son la
etiologa ms comn. En los diabticos, el estreptococo del Grupo B (S. agalactiae)
es una causa comn. Hemophilus influenzae es una causa poco comn pero
distintiva de la infeccin asociada con bacteriemia y tpicamente afecta a
nios de 6 meses a 4 aos de edad. En individuos con eosinofilia crnica, son
comunes las infecciones cutneas recurrentes (sndrome de Job).
El diagnstico de erisipelas y celulitis generalmente es clnico y se puede iniciar el
tratamiento antimicrobiano empricamente, guiado por las causas conocidas. Para las
erisipelas suela prescribirse penicilina y para las celulitis, oxacilina o clindamicina. En
nios menores de 4 aos con celulitis, es mejor prescribir amoxicilina con cido
clavulnico para cubrir H. influenzae. En el laboratorio puede realizarse cultivo con
tcnica de aspiracin con jeringa. Si no se aspira ningn material, se puede inyectar
0.1 a 0.5 mL de solucin salina estril en el tejido, aspirando de inmediato. Se
siembra en agar sangre y algn caldo, como el BHI. En los nios, debe sembrarse
adems un medio de chocolate (para aislar H. influenzae, en su caso). Debe
aclararse que la posibilidad de obtener un cultivo positivo en estos casos es menor
del 50%, por lo que la clnica es el arma ms til en el diagnstico de las erisipelas y
celulitis comunes no complicadas.
Erisipeloide Es una infeccin poco comn causada por un bacilo grampositivo:
Erysipelothrix rhusiopathiae. Clnicamente se parece a la erisipela, pero es
predominantemente una enfermedad ocupacional de pescadores. En el laboratorio,
la coloracin de Gram y el cultivo usualmente son negativos. Se puede comprobar la
etiologa de la lesin mediante biopsia del margen de la lesin y cultivo.
Imptigo
Es una lesin superficial de la epidermis, que produce lesiones
eritematosas que se acompaan generalmente de bulas (ampollas). El imptigo no
buloso comnmente es producido por estreptococos del Grupo A, y es difcil
distinguirlo de la erisipela. Por otra parte, la forma bulosa se asocia con S. aureus.
Despus de algunos das, las bulas se llenan de pus (pstulas) y se rompen. La
secrecin purulenta forma la caracterstica costra de miel y cera de abeja (melicrica)
con un halo rojizo. Como se mencion para la erisipela, el diagnstico se basa en el
hallazgo clnico. En este caso, el cultivo tendr mayores posibilidades de desarrollo,
sobre todo si se aspira lquido de las ampollas, o se toma secrecin suficiente con
hisopo. La muestra se inocula en agar sangre y algn medio lquido de respaldo. El
tratamiento requiere retiro de las costras y prescripcin de antibiticos.
Foliculitis, furunculosis y carbnculo Las foliculitis son abscesos cutneos
localizados. Se observan como pequeos abscesos, del tamao de una cabeza de
alfiler y son causadas por S. aureus. Como su nombre lo indica, nace del mismo
35

folculo piloso (Figura 2). La etiologa se confirma con el cultivo del pus. Causas poco
comunes son gramnegativos de la familia de las enterobacterias y ocurre en
pacientes con acn que reciben antibiticos por perodos prolongados.

Figura 2. Foliculitis. La infeccin se desarrolla en el folculo piloso.

Furnculo Es un absceso que nace tambin de los folculos pilosos, pero forma una
masa mayor, firme y tensa, que puede incluso acompaarse de datos generales
como fiebre (Figura 3).

Figura 3. Furnculo.
Un carbnculo es ms profundo y extenso. Puede presentarse como varios abscesos
que envuelven algunos folculos pilosos y glndulas sebceas; algunos drenan por
los folculos. Se asocia con fiebre y muchas veces, con bacteriemia (Figura 4).
Tambin en este caso, S. aureus es el patgeno ms frecuente (recuerde que S.
aureus es el germen productor de abscesos por excelencia). El cultivo puede
obtenerse de la secrecin, cuando ha drenado, pero es ms conveniente el aspirado
con jeringa. Algunos autores se refieren a esta lesin como ntrax cutneo, pero
nosotros hemos preferido una traduccin semiliteral de la expresin del ingls
(carbuncle), para diferenciarla de la lesin especfica de Bacillus anthracis, que es
muy semejante (anthrax), pero ocurre como una enfermedad ocupacional en
cardadores de lana y
que, paradjicamente, se traduce al espaol como carbunco.

36

Figura 4. Carbnculo. Observe la formacin de un gran absceso, que drena a

travs de mltiples sitios.
Paroniquia Es una infeccin superficial de la piel que circunda las uas, y puede
ser aguda o crnica. La infeccin aguda es causada por S. aureus. La infeccin
crnica se asocia con Candida en personas que frecuentemente sumergen las
manos en lquidos (enfermedad ocupacional, comn en enfermeras). Se utiliza para
cultivo el drenaje del pus.
Infecciones superficiales por hongos Involucran la capa queratinizada de la piel
(la capa ms superficial), el pelo o las uas. Es causada por dermatfitos, Candida
o levaduras lipoflicas. En general, los dermatfitos: Epidermophyton, Thichophyton
o Microsporum produce la tia del cuerpo (empeine o jiote). Cndida albicans
coloniza la piel o las membranas mucosas especialmente si hay maceracin, por
ello generalmente produce lesin alrededor de algn pliegue (intrtrigo monilisico),
principalmente en personas obesas, y es la causante de la tia inguinal.
Malassesia furfur (P. ovale) es una levadura lipoflica que produce la pitiriasis
versicolor, que se observa como manchas blanquecinas en personas morenas, o
manchas oscuras en personas blancas.
Si se sospecha tia de la piel, uas o pelo, la lesin se limpia y se raspan sus
bordes activos. El material obtenido se disuelve en KOH (que lisa las clulas de la
piel, pero no las formas micticas), y se examina al microscopio en busca de hifas.
Es un procedimiento sencillo, y generalmente resulta positivo en presencia del
germen, por lo que es de gran utilidad cuando el diagnstico clnico de micosis no
es claro. Tambin puede cultivarse, para los casos en que pudiera escapar el
hongo a la observacin en fresco. El medio de cultivo de eleccin es el Mycosel,
que contiene inhibidores para evitar el crecimiento de contaminantes. Cuando se
sospecha pitiriasis versicolor se pega una cinta adhesiva transparente en la lesin;
al desprenderse, se coloca en un portaobjetos con azul de metileno o azul de
algodn: las levaduras e hifas se colorean intensamente, resultando de fcil
observacin al microscopio (imagen de espagueti con albndigas).
Ndulos y lceras En stos se afectan la epidermis y parte de la dermis. Una
gran variedad de microorganismos puede causar ndulos y lceras despus de
inocularlos directamente en la piel. Ejemplos importantes son Bacillus anthracis,
especies de Nocardia, Mycobacterium marinum y Sporothrix schenckii.
Alternativamente, la infeccin cutnea puede ser secundaria a diseminacin
sangunea, como las lesiones mltiples de pacientes con endocarditis bacteriana.
Un caso muy peculiar es el de la esporotricosis, que generalmente causa un ndulo
37

en el sitio de la inoculacin, que despus se ulcera y va formando nuevos ndulos a

travs del trayecto linftico; es una enfermedad comn en jardineros y campesinos,
pues el hongo es ubicuo y se inocula a travs de picaduras con espinas. Los
ndulos y lceras por M. marinum suelen ocurrir en las manos de personas que las
introducen frecuentemente en acuarios.
Las lceras cutneas preexistentes pueden infectarse como ocurre en lceras por
presin en pacientes con movilidad pobre o Diabetes mellitus. Las coloraciones y
cultivos son los mtodos diagnsticos. En este caso, los responsables
frecuentemente son bacilos gramnegativos y cocos grampositivos aerobios y
anaerobios; de hecho, puesto que habitualmente existe tejido muerto, en la
coloracin de Gram puede observarse una flora abundante y polimicrobiana, lo que
sugiere desde luego la presencia de anaerobios (recuerde que los anaerobios son
flora de putrefaccin que siguen al tejido muerto).
Fstulas Son una comunicacin entre un tejido profundo infectado o un absceso del
tejido subcutneo y abierto a la superficie de la piel. Es frecuente encontrar flora
polimicrobiana, por la presencia de
anaerobios, como en las infecciones intestinales fistulizadas. En algunos casos, el
patgeno da caractersticas especiales al proceso, como en los casos de
infecciones por micobacterias, actinomicosis y nocardiosis. El cultivo de la
secresin es difcil de interpretar pues los microorganismos presentes pueden ser
contaminantes de la superficie. En todo caso, el manejo con antibiticos no suele
resolver estos problemas, que requieren drenaje del absceso y retiro del tejido
muerto; desde luego, al tratamiento quirrgico se puede agregar el antibitico de
acuerdo con los hallazgos del cultivo y la coloracin de Gram. Ocasionalmente, es
posible aspirar los abscesos con jeringa. Si ocurre as, la muestra ser ms valiosa.
Las especies de Nocardia ocasionan el micetoma de las extremidades (pie de
Madura) con abscesos y fstulas crnicos, que producen una secrecin descrita
como baba de nopal.
Infecciones en quemaduras La superficie de la quemadura contiene tejido muerto
y lquido rico en protenas, que constituyen un verdadero medio de cultivo. Cuando
la concentracin de microorganismos es alta, ocurre la infeccin invasora con
bacteriemia. Para cultivos, se recomienda un trozo de tejido obtenido por tcnica
quirrgica; de este modo, el resultado ser fidedigno. Sin embargo, es poco comn
que los clnicos hagan biopsias para cultivo en estos casos, por lo que pueden
hacerse cultivos de sitios diferentes (preferentemente si existe secrecin) con
hisopo, y considerar como patgenos los que aparezcan en dos ocasiones o de dos
sitios diferentes. Desde luego, en los pacientes febriles conviene la toma de
hemocultivos, pues el germen de esta fuente seguramente ser patgeno.
Histricamente, los responsables de estas infecciones son los estafilococos y
estreptococos, pero con el advenimiento de la teraputica antimicrobiana,
actualmente predominan P. aeruginosa y C. albicans.
Infeccin de heridas quirrgicas La infeccin de heridas quirrgicas ocurre
cuando existe contaminacin en la ciruga. Los agentes ms frecuentes incluyen S.
aureus y otros microorganismos de vas digestivas y piel. Los anaerobios se
38

caracterizan por el mal olor de las secreciones. Para el cultivo se aspira el pus o se
impregna de l un hisopo estril.
Infecciones de heridas complicadas Estas ocurren despus de una herida
contaminada por un traumatismo. Muchas de estas infecciones son severas y
asociadas con alta mortalidad, por la presencia de tejido o muerto que es asiento
para infecciones por anaerobios. Un ejemplo de ello es la gangrena gaseosa y la
fascitis causada por Clostridium perfringes (anaerobio estricto). En presencia de
tejido muerto tambin son comunes los estafilococos, estreptococos,
enterobacterias y otros anaerobios. La coloracin de Gram es de gran ayuda para
iniciar el tratamiento. Si es posible tomar secrecin por aspiracin, o biopsia, debe
sembrarse en bsqueda de anaerobios. Especies de Aeromonas y Vibrio no
cholerae son causa de celulitis aguda seguida de la introduccin de estos
microorganismos en heridas o laceraciones provocadas en agua salada.
Mordeduras complicadas con infeccin Estas heridas estn muy contaminadas
con flora de la cavidad oral. La infeccin va de acuerdo a la profundidad de la
herida y la flora presente en los dientes (generalmente estreptococos aerobios y
anaerobios). La mordedura humana puede causar severas lesiones con necrosis.
La rabia y el ttanos son infecciones que complican a las mordeduras por animales,
pero no se investigan generalmente por cultivo. Las mordeduras de gato suelen ser
serias pues casi siempre contienen Pasteurella y los largos colmillos del animal
pueden inocular profundamente, perforando las fascias.
El mejor material para cultivo de las mordeduras es el aspirado de la herida en su
parte profunda, aunque es comn que se indique el manejo basado slo en el
conocimiento epidemiolgico de las causas ms comunes.
Bibliografa
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organisms. In: Isselbacher KJ, Braunwald E, Wilson JD, Martin JB, Fauci AS, Kasper DL (ed.),
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Society for Microbiology, Washington D.C., 1995;19-32.

39

4.2. LIQUIDO CEFALORRAQUDEO Y OTROS LIQUIDOS CORPORALES

Generalidades
El lquido cefalorraqudeo (LCR) es producido por los plexos coroideos y se trata de
un filtrado de plasma. Su funcin principal es la de nutrir al sistema nervioso central
(SNC) as como de proporcionarle un sistema de amortiguamiento para los
movimientos bruscos. Su cantidad normal oscila alrededor de los 150 mL en el adulto
y de 10 a 60 mL en el recin nacido. El estudio del LCR es de primera eleccin en
muchos problemas del SNC debido a la facilidad de su obtencin y a lo relativamente
barato del mtodo, adems de que proporciona datos de utilidad en un rango amplio
de enfermedades, desde traumatismos hasta enfermedades tumorales. Cuando se
solicita el estudio microbiolgico del LCR, el mdico sospecha infeccin del SNC.
Debido a que el riesgo de muerte o de dao irreversible es grande, excepto si el
tratamiento se inicia de inmediato, sta es una de las urgencias en infectologa, por lo
que el personal del laboratorio debe dar prioridad a su estudio e informe temprano.
4.2.2.Toma de muestra
El LCR se extrae mediante puncin lumbar a nivel del tercer o cuarto espacio
intervertebral de la columna lumbar. La muestra, aproximadamente 5 mL, debe
extraerse en tubo estril para el estudio fsico, qumico, citolgico y microbiolgico.
En prematuros y nios pequeos es necesario trabajar muestras menores. Es de
suponerse que la tcnica para la obtencin debe realizarse bajo condiciones lo ms
aspticas posibles para evitar una contaminacin de la muestra y la introduccin de
microorganismos al espacio subaracnoideo, lo que conllevara a una meningitis. Una
vez obtenida la muestra, debe de enviarse inmediatamente al laboratorio para su
estudio, pues grmenes como Hemophilus y neumococo mueren si hay retraso.
4.2.3. Anlisis del LCR
El anlisis microbiolgico no debe disociarse del anlisis fsico y citoqumico, pues
frecuentemente es el conjunto de datos lo que permite llegar a un diagnstico. Por
ello comentaremos brevemente cada uno.
Examen fsico Debe rendirse informe del volumen recibido, as como su aspecto.
Normalmente es transparente, con aspecto de agua de roca. Si el aspecto es
sanguinolento se centrifuga y se anota si el sobrenadante es xantocrmico
(amarillento) o claro.
Examen qumico Se puede realizar una amplia gama de estudios qumicos del
LCR, pero los ms importantes son la concentracin de protenas y de glucosa. La
cantidad de cloruros que antes se supona importante en las meningitis tuberculosas,
ahora se encuentra en desuso debido a que no tiene buena especificidad. Las
protenas aumentan en cualquier enfermedad inflamatoria, aguda o crnica, como en
meningitis pigena o tuberculosa. El nivel de glucosa en LCR depende de su nivel en
sangre y tambin de la presencia de clulas inflamatorias y grmenes pigenos, en
cuyo caso estar baja. Esta determinacin se hace por el mismo mtodo que para la
sangre.
Examen citolgico Debe efectuarse en forma rutinaria dentro de los 30 minutos
despus de su extraccin. Para la cuenta se utiliza la cmara de Neubauer, pues las
40

clulas a contar son generalmente, eritrocitos o leucocitos. La muestra puede

analizarse directamente o utilizando diluciones si se encuentran muchas clulas.
Para obtener el por ciento de linfocitos y neutrfilos se efectan tinciones sencillas,
siendo necesario algunas veces destruir los eritrocitos, si es que se encuentran, para
realizar una buena cuenta de leucocitos.
Con los estudios iniciales, se puede inferir si existe enfermedad infecciosa del SNC,
como se observa en la Tabla 1. El objetivo inicial ser distinguir entre meningitis
bacteriana aguda, meningitis o encefalitis viral, as como meningitis tuberculosa o
mictica. La decisin inicial podr modificarse con el resultado de las tinciones, el
cultivo y la serologa. Los exmenes de control son importantes pues la
normalizacin del LCR es buena seal de una teraputica adecuada.
Tabla 1. Caractersticas comunes del lquido cefalorraqudeo en diversas entidades
clnicas.
Apariencia
Leucocitos/m Glucosa
Protenas
m3
Agua de roca
0-3
0.5-0.6/
15-45
Normal
Plasmtica
mg/dL
Viral

Agua de roca

10-100

Normal

Normal

Bacteriana

Turbia

100 a
incontables

Muy baja

Muy altas

Micobacmictica

Xantocrmica o
algo turbia

100 a 1000

Baja

Altas

Examen microbiolgico y cultivo Este consiste en la elaboracin de coloraciones

de Gram para bacterias, Ziehl-Neelsen para micobacterias y tinta china para
hongos. Asimismo, debe sembrarse agar sangre, agar chocolate y caldo de
respaldo. En el caldo deben sembrarse entre 1 y 5 mL, pero cuando la muestra es
pequea puede sembrarse todo el sobrante. Sobre todo en cultivos de nios es
imprescindible una excelente calidad en el agar chocolate, para poder aislar H.
influenzae. Algunos autores recomiendan que la siembra se haga del precipitado de
un centrifugado, pero esto no se encuentra bien evaluado. Es posible que sea
mejor sembrar todo el volumen disponible en caldo de hemocultivo. Cuando lo
indica el clnico, debe sembrarse el botn del centrifugado en algn medio general
para hongos (como Sabouraud, a 25-30 oC) o micobacterias (como LowensteinJensen). Las coloraciones deben informarse el mismo da.
Examen serolgico y deteccin de antgenos La serologa se ha convertido en
una herramienta muy importante en el estudio integral del LCR, debido a que,
mediante ella, se pueden realizar diagnsticos preliminares es en un lapso muy
corto. Existen preparados comerciales de anticuerpos adsorbidos a partculas de
ltex o a bacterias muertas (coaglutinacin), que pueden aglutinar en presencia de
antgenos especficos de algunas bacterias, como es el caso de los neumococos y
estreptococos del grupo B, meningococo y H. influenzae. Tambin se pueden
realizar pruebas de otros tipos, ELISA por ejemplo, para distintas enfermedades,
41

tales como criptococosis, cisticercosis, toxoplasmosis, amebosis, etc. Si se

efectan estas ltimas es importante contar con mtodos estandarizados e informar
al mdico la sensibilidad y especificidad de la prueba en particular.
4.2.4. Otros lquidos corporales
Otros lquidos corporales normalmente estriles (articular, pleural, pericrdico,
amnitico, ascitis) deben procesarse para examen microscpico directo y cultivo, de
manera semejante al LCR. Como regla general, si se observa una bacteria por
objetivo de inmersin en las tinciones, existen al menos 105 bacterias por mL de
muestra. Frecuentemente, el nmero de bacterias en un lquido normalmente estril
es muy bajo, por lo que se recomienda que se concentre por centrifugacin para
obtener un botn de precipitado. Esto debe intentarse slo si se cuenta con
centrfuga refrigerada que sea capaz de obtener una fuerza de 1500 g, durante 15
min., seguidos de la preparacin de extendido y cultivo del botn, as como cultivo
en caldo del sobrenadante. Si no se cuenta con centrfuga adecuada, deber
inocularse un volumen de hasta 10 mL en botella de hemocultivo, adems del
cultivo directo en placas.
4.2.5. Lquido de dilisis
La dilisis peritoneal continua ambulatoria (DPCA) se ha vuelto muy comn como
modalidad de tratamiento para paciente con insuficiencia renal avanzada, pero se
complica por una alta incidencia de peritonitis. En el procedimiento, se introduce un
alto volumen de lquido en el peritoneo, a travs de un catter permanente, y se
saca hacia la misma bolsa, en un sistema cerrado que acta por gravedad.
Desgraciadamente, la infeccin complica frecuentemente estos procedimientos y
deber sospecharse siempre que el paciente aqueje fiebre o dolor abdominal
acompaados de enturbiamiento del lquido. Este lquido puede utilizarse para
estudio microbiolgico y citolgico. Se acepta que si la cuenta de leucocitos es
mayor de 100/mm3 la probabilidad de infeccin es alta. Aun en presencia de
infeccin, el aislamiento del patgeno es un reto para el laboratorio puesto que el
contenido bacteriano es muy bajo. Se acepta ya que debe procesarse como si se
tratara de un hemocultivo, adems de la siembra directa en placa, lo que
incrementa notablemente la posibilidad de aislar el germen.
Bibliografa
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42

4.3. SANGRE Y MEDULA OSEA

Generalidades
Se llama bacteriemia a la presencia de microorganismos vivos en la sangre, que
ocurre cuando falla el confinamiento de una infeccin en tejidos extravasculares, o se
omite el drenaje o tratamiento adecuado de un foco infeccioso. Habitualmente, un
repentino flujo de bacterias hacia la sangre (como el que puede ocurrir despus de
someterse a tratamiento dental) es limpiado en minutos u horas, excepto cuando se
trata de una infeccin grave o existe un foco intravascular de infeccin. La entrada
directa de bacterias a la sangre ocurre en infecciones intravasculares, catteres y
lquidos intravenosos o intraarteriales contaminados. Tambin puede originarse en
una flebitis. Cuando la bacteriemia no procede de los vasos sanguneos se conoce
como bacteriemia secundaria y es ms comn en pacientes no hospitalizados. Las
bacteriemias secundarias pueden originarse en el sistema genitourinario (25%), el
sistema respiratorio (20%), los abscesos (10%), las heridas quirrgicas (5%) y las
vas biliares (5%). El patrn clnico de una bacteriemia puede ser:
1. Transitoria, como ocurre despus de la manipulacin de tejidos infectados, instrumentacin
de mucosas colonizadas y ciruga en reas contaminadas. Tambin ocurre en infecciones
generales o localizadas como meningitis, neumona y osteomielitis.
2. Intermitente, generalmente asociada con abscesos intra-abdominales: plvico,
perinefrtico, heptico, etc.
3. Continua, caracterstica de la endocarditis bacteriana y otras infecciones intravasculares,
as como de la etapa temprana de la fiebre tifoidea y brucelosis.

Una comprensin de las circunstancias en que ocurre una bacteriemia es

provechosa en la planeacin de estudios diagnsticos y la interpretacin de
resultados del hemocultivo. Un hemocultivo est indicado en todo paciente con
sospecha de bacteriemia, con fiebre o hipotermia menor de 36C, leucocitosis
(especialmente con formas de banda) o granulocitopenia, un relativo incremento en
el pulso, cambios inexplicables en la conciencia e hipotensin sangunea. Puede
haber excepciones para esta indicacin, como los pacientes con fiebre y foco
sptico evidente, como el enfermo con infeccin urinaria no nosocomial, en donde
es mejor cultivar la orina y la informacin del hemocultivo no aadira mucho al
diagnstico. Sin embargo, conviene acotar que el hemocultivo es un estudio
subutilizado en nuestro medio, pues es comn que no se indique en situaciones de
utilidad evidente, como el paciente con fiebre en un hospital, por lo que se dejan de
reconocer cuadros de bacteriemia que son imposibles de diagnosticar por la clnica
4.3.2. Procedimiento
El mayor problema para interpretar los hemocultivos es la contaminacin por los
grmenes normales de la piel, lo que se puede evitar preparando la zona a puncionar
con alcohol etlico al 70% y despus con solucin antisptica de yodo (Isodine R).
Una vez hecho esto, la piel se podr palpar nicamente si se portan guantes estriles
para evitar nuevamente la contaminacin, o si se ha preparado tambin con
antisptico la piel de quien punciona. Aunque en algunos pacientes puede ser la
nica alternativa (como en los neonatos), debe evitarse la aspiracin de la vena
femoral ya que la piel de la regin es muy difcil de desinfectar y existe un nmero

43

menor de microorganismos en el drenaje venoso de las extremidades inferiores que

en los brazos. Aunque se discute si la obtencin de sangre a travs de catteres
pueda auxiliar en el diagnstico de la colonizacin de stos, en general se acepta
que la sangre para hemocultivo no debe obtenerse de catteres, cuando sea posible.
Se ha demostrado que la sangre venosa o arterial no tiene diferencias para los fines
del cultivo. El volumen a obtener es diferente en el adultos que en nios y siempre
debe tenerse en consideracin la posibilidad de producir anemia en el paciente,
especialmente si se trata de un recin nacido. La sangre deber entrar en dilucin
con el caldo de cultivo en proporcin 1:10, por lo que se obtendr en un adulto 10 mL
de sangre y en un nio lactante 2 mL, en un mnimo de caldo de 100 y 20 mL,
respectivamente. De inmediato se inocula el frasco con el medio de cultivo para no
alterar la viabilidad de los microorganismos. Es aconsejable utilizar, para la
inoculacin, una aguja diferente a la de la puncin pues sta puede acarrear
colonizadores cutneos. En algunas instituciones se acostumbra inocular junto a un
mechero de alcohol, pero no es un requisito indispensable.
La muestra debe obtenerse en la primera hora de la elevacin de la temperatura si se
presenta el patrn en picos. Cuando la fiebre es continua se recomienda obtenerla
despus de la mayor elevacin. Al terminar la recoleccin se debe limpiar la piel de
los restos de yodo usando un algodn con alcohol, para evitar fenmenos de
hipersensibilidad cutnea.
La mxima eficiencia del hemocultivo se consigue mediante la toma de un volumen
suficiente de sangre. Para los pacientes adultos 40 mL suele considerarse el mnimo
suficiente. La toma en una sola puncin venosa reduce las dificultades de
interpretacin de falsos positivos, permite instalar tratamiento antibitico sin que ste
afecte la actividad bactericida suero, adems de reducir las molestias derivadas de
punciones mltiples. Tomar tales volmenes se consige mediante el uso de las
botellas preparadas con vaco a manera del sistema Vacutainer.
Una buena alternativa para los hemocultivos en caldo la constituyen los cultivos de
lisis-centrifugacin (Isolator). Con este sistema, la sangre se lisa en un tubo especial
y se centrifuga. El botn del centrifugado se siembre entonces como si fuera una
secrecin, por lo que no se requieren resiembras y es posible cuantificar las colonias.
Este sistema tiene la ventaja adicional de permitir un desarrollo acelerado de algunos
grmenes intracelulares (como hongos y micobacterias). Para laboratorios que
procesan un gran nmero de muestras, existen diversos mtodos de lectura
automatizada, cada uno con ventajas y limitaciones.
4.3.3. Proceso de la muestra
Los medios de cultivo se expenden en el comercio ya preparados, aunque se les
puede preparar fcilmente para ahorrar costos. Hay diferentes tipos de medios de
cultivo que se pueden utilizar: caldo de soja tripticasa, tioglicolato, infusin de
cerebro-corazn (BHI), etc. Como estndar se utiliza el caldo de soja tripticasa que
por sus propiedades nutritivas favorece el crecimiento de mltiples microorganismos
aerobios y anaerobios. Pero, independientemente del medio utilizado, debe contener
sulfato sdico de polietanol (SPS) como anticoagulante, el cual no es txico para las
bacterias, inhibe el complemento y la actividad de la lisozima, interfiere con la
fagocitosis e inactiva algunas sustancias como los aminoglucsidos. Algunos frascos
44

tienen una atmsfera rica en un gas inerte que facilita el crecimiento de aerobios y
anaerobios. Una vez inoculado, el medio se incuba a 36 oC durante 7 das,
realizando observaciones y resiembras a las 24 horas de incubacin; si resulta
negativo, se vuelve a revisar a las 48 horas y nuevamente a los 7 das. Algunos
autores recomiendan efectuar slo las primeras dos resiembras. Las resiembras se
efectan extrayendo una gota del medio, e inoculndolo en agar sangre y agar de
McConkey. En hemocultivos tomados de nios menores de 5 aos, debe efectuarse
tambin la resiembra en agar chocolate (para detectar Hemophilus).
Un cultivo positivo se reconoce por turbidez del medio, con o sin burbujas de gas,
colonias en el sedimento de sangre, colonias compactas en la superficie del
sedimento y hemlisis, adems del resultado de los subcultivos. Dado su costo y
baja probabilidad de positividad, nosotros consideramos que las resiembras
rutinarias en anaerobiosis no son recomendables, sino que deben reservarse para
pacientes con abscesos abdominales o cuando lo solicite el clnico.
Tambin se consiguen en el comercio los frascos de Ruiz Castaeda, que tienen
una fase slida y una lquida. Tienen la ventaja de que las resiembras requieren
slo invertir el frasco, inoculndose as el medio slido, donde se podrn ver las
colonias a travs del vidrio.
4.3.4. Informe de resultados
A las 24 horas de incubacin, el laboratorio hace un reporte preliminar informando la
negatividad o positividad del cultivo. Si se obtiene desarrollo de un germen, se
informan sus caractersticas de Gram, lo que permite al clnico iniciar el tratamiento.
Generalmente, a las 24 horas se debe conocer el tipo de germen, a las 48 horas ya
se debe contar con la identificacin presuntiva del microorganismo, y a las 72, la
sensibilidad a antibiticos e identificacin fina, con lo que se pudiera modificar el
tratamiento emprico inicial. En todos estos pasos se deben enviar informes
preliminares al expediente del enfermo o, preferentemente, hablar con el clnico a
cargo. En el caso de un hemocultivo negativo a las 48 horas de incubacin, se
contina sta hasta completar 7 das, lo cual es el lmite para esperar un crecimiento,
excepto cuando se sospechan condiciones especiales que se deben informar al
laboratorio, como las infecciones micticas, cuyo desarrollo puede tardar an ms. Si
se sospecha infeccin mictica (pacientes inmunodeficientes u hospitalizados bajo
manejo antibitico), deber ventilarse una de las botellas con una aguja que se
encaja en la goma del frasco, de entrada por salida. Esta maniobra incrementa las
posibilidades del aislamiento de hongos.
Los cultivos por lisis-centrifugacin se interpretan como si se tratara de una secrecin
y se informa, adems de los grmenes desarrollados, el nmero de colonias.
4.3.5. Interpretacin de resultados
La causa de la bacteriemia puede generalmente inferirse del germen aislado.
Cuando se obtienen Bacillus (bacilos grampositivos) o S. epidermidis, generalmente
existe contaminacin en la toma, aunque debe comentarse siempre con el clnico la
posibilidad de que sean verdaderos patgenos si el paciente tiene accesos
vasculares por infusin, porta vlvulas cardiacas artificiales o est gravemente
inmunodeprimido. El resultado se relaciona con el comportamiento clnico del

45

paciente. Si se aslan estreptococos no hemolticos en ausencia de un foco de

infeccin, excluyendo los enterococos, el significado es incierto, y debe platicarse el
caso con el clnico. El enterococo generalmente indica infeccin agregada en
paciente que est recibiendo antibiticos parenterales (cefalosporinas). El aislamiento
de un estreptococo betahemoltico en un recin nacido generalmente indica sepsis
neonatal por estreptococo del grupo B (S. agalactiae).
Enterobacterias, Pseudomonas, Hemophilus, S. aureus y S. pneumoniae son la
causa ms comn de bacteriemias, y generalmente puede encontrarse clnicamente
el foco primario de infeccin. Cuando el paciente est hospitalizado y no se
encuentra el foco infeccioso, debe considerarse la colonizacin de los catteres
vasculares. En hospitales de pases en desarrollo es comn la contaminacin de los
lquidos de infusin por tcnicas deficientes de enfermera; generalmente desarrollar
Klebsiella o Enterobacter, que son microorganismos que pueden utilizar las
soluciones como medio de cultivo.
Los cultivos de mdula sea deben obtenerse por un mdico experimentado. Se
procesan de manera semejante, aunque con un volumen menor (generalmente 1 2
mL) y sembrando de inicio un tubo para micobacterias (Lowenstein-Jensen) y una
caja de Petri en algn medio general para hongos (Sabouraud). Las resiembras
sern semanales y deben seguirse hasta por dos meses. Los cultivos de mdula
sea revelan el agente etiolgico en pacientes con salmonelosis, brucelosis,
tuberculosis y micosis profundas. En algunas instituciones, la mdula sea se inocula
directamente en un tubo de Isolator 1.5, de donde se sembrarn los distintos medios.
Parece una opcin muy razonable puesto que muchos de los patgenos que se
encuentran en mdula sea son predominantemente intracelulares.
Bibliografa
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4.4. ORINA
Generalidades
El anlisis de orina marc probablemente el inicio del laboratorio mdico. En la
antigedad los mdicos eran capaces de obtener informacin diagnstica a partir de
observaciones bsicas como color, turbidez, olor, volumen, viscosidad y sabor. Es
interesante notar que todava el personal de laboratorio determina estas
caractersticas urinarias (con excepcin del sabor, desde luego!). Sin embargo, el
anlisis de orina ha expandido su alcance para incluir no slo el examen fsico de la
orina, sino tambin el anlisis qumico y el examen microscpico del sedimento,
adems del cultivo. Aunque trataremos principalmente aspectos microbiolgicos,
revisaremos brevemente el examen general de la orina, pues ambos se mezclan en
las decisiones clnicas. Adems, el examen general de orina es uno de los
procedimientos bsicos en el laboratorio, siendo muy til no slo para revelar
anomalas en el sistema urinario, sino tambin para detectar algunas enfermedades
generales o de otros rganos que puedan reflejarse en la orina.
4.4.2.Obtencin de la muestra
El hecho de que la muestra de orina se obtenga con tanta facilidad, con frecuencia
lleva a descuidos en el tratamiento despus de su obtencin. Puesto que la orina es
un medio de cultivo ideal, existen mltiples cambios que pueden ocurrir por el
almacenamiento inadecuado, por lo que es necesario el manejo correcto despus de
que se obtiene la muestra. En realidad, las tres reglas principales para el manejo de
las muestras de orina se aplican en todas las muestras recibidas en el laboratorio:
1. La muestra se debe depositar en un recipiente limpio y seco. Para cultivo, el frasco deber
ser estril. Los recipientes desechables son cada vez ms populares.
2. Los recipientes se deben etiquetar con el nombre del paciente, fecha y hora de obtencin,
as como informacin adicional, como el nmero de cama de hospital.
3. Se debe enviar la muestra al laboratorio en forma rpida y examinar dentro de una hora. Se
deben refrigerar las muestras que no se pueden enviar o examinar en una hora.

Existen diferentes tipos de toma de muestra para el examen de la orina. El ms

utilizado es la toma de la mitad de la miccin, que consiste en tomar la muestra
despus de que el paciente ha orinado un poco, lo cual sirve como arrastre mecnico
para la flora que se encuentre en el tercio terminal de la uretra proporcionndonos
orina menos contaminada. Tambin se les da instruccin completa sobre los
mtodos de limpieza de genitales y la obtencin slo de la mitad de la miccin. Las
muestras peditricas son un reto para su obtencin. Existen bolsas de plstico
transparente con un adhesivo para pegar en el rea genital de los nios y nias, o
bien de pacientes adultos sin sonda pero con incontinencia urinaria o prdida de la
conciencia. Las muestras de bolsa recolectora pueden ser tiles cuando los
resultados se interpretan en conjunto con la coloracin de Gram de la orina sin
centrifugar y al anlisis del sedimento. Se puede obtener orina mediante sondeo
vesical, lo cual lleva el riesgo de introducir bacterias del tercio terminal de la uretra
hacia la vejiga. Se puede recurrir a la aspiracin por puncin suprapbica, en cuyo
caso la orina ser estril, pero la tcnica es cruenta y se realiza con rareza.

47

4.4.3. Tcnica para el examen general de orina

El estudio de la orina es fsico, qumico y microscpico. Para el estudio fsico de la
orina basta con observar las caractersticas de la muestra, como: color, olor, aspecto,
turbidez y volumen. La gravedad especfica se mide por urinmetro, o en ausencia de
ste, mediante tira reactiva, que servir tambin para el estudio qumico. Mediante la
utilizacin de la tira reactiva se analizan las caractersticas qumicas de la orina. El
nmero de metabolitos estudiados depender de los reactivos que contenga la tira en
cuestin, siendo comn en la mayora de ellas: hemoglobina, sangre, urobilingeno,
bilirrubinas, cuerpos cetnicos, protenas, glucosa, pH y nitritos.
El examen microscpico se realiza centrifugando 15 mL de orina a 1000 rpm durante
5 minutos. Posteriormente se tira el sobrenadante y se vierte el sedimento sobre un
portaobjetos, se le coloca un cubreobjetos y se procede a observar al microscopio
con seco fuerte. En este estudio se buscarn: clulas propias del organismo y del
tejido, como son las del epitelio y que pueden ser, desde clulas del meato, hasta del
epitelio renal. Clulas propias del organismo pero que no pertenecen al sistema
urinario como los leucocitos y los eritrocitos, o de epitelio vaginal, lo cual nos habla
de contaminacin de la muestra. Clulas ajenas al organismo, pudiendo ser estas
bacterias, hongos o protozoarios. Finalmente, se pueden diagnosticar enfermedades
por metazoarios como en el caso de la esquistosomiasis, donde se observan los
huevos del parsito en la orina. Los cristales son otro objeto de estudio en el
sedimento urinario, siendo los ms importantes los uratos, fosfatos y oxalatos, cuya
presencia depender de la dieta as como del pH urinario. La mayora de los autores
concuerdan en que la observacin de los cristales tiene poco inters clnico.
La enumeracin cualitativa o semicuantitativa del tipo y nmero de elementos
observados en el examen microscpico del sedimento urinario es de utilidad para el
diagnstico de problemas infecciosos. La orina normal recogida del chorro medio no
contiene ms de uno o dos eritrocitos o leucocitos y una clula epitelial por campo de
400 aumentos. Un aumento de 10 o ms leucocitos por campo se ha correlacionado
bien con infeccin urinaria. Por ltimo, otro elemento de importancia en el estudio del
sedimento son los cilindros, los cuales son formaciones tubulares de protena que se
filtra por los glomrulos y que se gelifica en los tbulos. La presencia de estas
estructuras refleja una lesin glomerular, ms an cuando contiene alguna sustancia
o clulas en su matriz. Los cilindros granulosos estn formados de leucocitos y son
comunes en estados infecciosos; los cilindros de eritrocitos se forman en la
glomerulonefritis. Para observarlos al microscopio es necesario recorrer el campo
hasta las orillas del cubreobjetos, ya que frecuentemente se desplazan a la periferia.
Como se mencion en el captulo de microscopia, es necesario recorrer la muestra
en grecas y observar por lo menos 10 campos para poder obtener un promedio de
las clulas.
4.4.4. Urocultivo. Generalidades
Las infecciones de vas urinarias (IVU), cuyas manifestaciones van desde bacteriuria
asintomtica hasta pielonefritis y abscesos retroperitoneales, constituyen uno de los
problemas ms comunes en la poblacin general y en individuos hospitalizados. La
mayora de los casos estn causados por enterobacterias y en menor proporcin, por
cocos grampositivos. Las mujeres sufren con mayor frecuencia de IVU porque la
48

uretra femenina es mucho ms corta que la del varn. La uretra provee una barrera
mecnica que asla el aparato urinario del exterior. En el varn, cuando no existen
anormalidades anatmicas la infeccin es rara. Se conoce como el factor
contribuyente ms comn la obstruccin secundaria a hipertrofia prosttica, o la
contaminacin por va ascendente (instrumentacin).
El diagnstico de las IVU est basado en el nmero de bacterias o unidades
formadoras de colonias (UFC) por mL en un cultivo urinario. La presencia de
100,000 UFC de una bacteria por mL es suficiente para establecer el diagnstico de
bacteriuria significativa, si bien existen casos de infecciones sintomticas con cuentas
menores y de cuentas significativas sin sintomatologa. Afortunadamente, la mayor
parte de las IVU son monomicrobianas y la presencia de dos o ms grmenes
habitualmente indica contaminacin, aunque debe evaluarse la posibilidad de
infeccin polimicrobiana en pacientes con sonda vesical a permanencia o vejiga
neurognica.
El laboratorio de microbiologa debe procesar sus estudios considerando siempre el
beneficio para el paciente. Esto requiere que las muestras se procesen lo ms rpido
posible, con un costo razonable y un informe temprano al mdico tratante. Como las
infecciones urinarias constituyen uno de los problemas ms comunes en la prctica
mdica, es frecuente que el tratamiento deba iniciarse sobre las bases empricas en
espera del resultado del urocultivo o en ausencia de ste, por lo que se han
propuesto procedimientos de diagnstico rpidos y econmicos como la coloracin
de Gram en la orina sin centrifugar, la determinacin de nitritos urinarios por tira
reactiva y la cuenta de leucocitos en el sedimento urinario.
La gran mayora de las infecciones urinarias son causadas por enterobacterias
(Escherichia coli, Klebsiella sp., Proteus sp., etc.), que son capaces de reducir el
nitrato presente en la orina hasta nitrito, por lo que se ha utilizado esta propiedad
para predecir el diagnstico de infeccin urinaria. Desgraciadamente, esta prueba no
resulta de utilidad para descartar infecciones por Pseudomonas, Candida o
estafilococos, pues stos no reducen el nitrato (no son enterobacterias).
4.4.5. Procesamiento para el cultivo de orina
El urocultivo se realiza mediante la inoculacin en agar sangre y agar MacConkey.
Hay que recordar que para este estudio la orina debe ser recolectada en frasco
estril y previo lavado. La siembra de la orina en agar sangre es para realizar el
cultivo cuantitativo; en este caso se usa una asa calibrada de 1 uL y se vaca en una
lnea vertical sobre el agar, sobre la que se efectuar una sola estra corrida
perpendicularmente, sin quemar el asa, como se describi en su momento. La
siembra en agar MacConkey se realiza para aventajar en la identificacin de las
bacterias causantes de infeccin ya que generalmente son gramnegativas.
La buena prctica obliga a elaborar un examen general de orina paralelamente. Si no
se solicit por el clnico debe al menos analizarse el sedimento luego de centrifugar
10 a 15 mL por cinco minutos a 1000 RPM. Los valores numricos normales para el
sedimento no estn bien establecidos pero son aproximadamente de 0-2 eritrocitos,
de 0-5 leucocitos y de 0-2 cilindros hialinos por campo seco fuerte. En los casos de
obtencin de muestra con bolsa recolectora, deber efectuarse siempre la coloracin
de Gram de una gota de orina sin centrifugar, ya que si se observa una o ms
49

bacterias por campo de inmersin en la muestra existen al menos 106/mL. Es

aconsejable tambin determinar la presencia de nitritos por tira reactiva.

50

4.4.6. Informe de resultados del cultivo

Se informa siempre el nmero de leucocitos promedio por campo seco fuerte.
Cuando se hayan efectuado, se informa la coloracin de Gram de la orina sin
centrifugar y la presencia de nitritos. Por ltimo, se informa el resultado del cultivo.
Cada colonia que observamos procede de una sola bacteria (unidad formadora de
colonias o UFC), por lo que de su nmero podemos inferir la cuenta de bacterias
presentes en la muestra. Se cuentan las colonias en el agar sangre, y se multiplican
por el factor del asa. Por ejemplo, si se cuentan 120 colonias, y se utiliz asa de 1 uL
para la inoculacin, se calculan 120,000 UFC por mL de orina, aunque se informar
slo que el nmero sobrepasa a las 100,000 UFC. Cuando existe un nmero escaso
de colonias, o existe flora polimicrobiana, habitualmente se puede atribuir a
contaminacin, aunque, como se mencionar, debe efectuarse correlacin clnica.
4.4.7. Interpretacin clnica de los resultados
Hemos llegado al punto ms importante para el clnico. Lo ms comn es que no
exista problema para la interpretacin. Por ejemplo, si tenemos un urocultivo con ms
de 100,000 UFC/mL, proveniente de un paciente con sntomas como dolor para la
miccin, el diagnstico est fuera de toda duda. Pero no es raro que existan dudas
en la interpretacin, como el urocultivo positivo en un individuo sin molestias urinarias
y sin leucocitos en el sedimento; en este caso debe repetirse la toma para confirmar
el hallazgo (este individuo portara lo que se conoce como bacteriuria asintomtica).
Un caso opuesto se encuentra cuando el cultivo es negativo pero existen ms de 10
leucocitos por campo en el sedimento (piuria estril). Lo ms probable es que el
paciente sufra infeccin y se encuentre tomando ya un antibitico eficaz. Recuerde
que la mayora de los antimicrobianos se excretan por va renal, alcanzando
concentraciones muy altas en orina, incluso mayores que en el suero. El caso ilustra
tambin la necesidad de comunicarse con el clnico, o poner una nota aclaratoria
pues, si el paciente no se encuentra bajo prescripcin con antibiticos, habrn de
descartarse grmenes que no desarrollan en cultivos convencionales, como
micobacterias o chlamydias.
Cuando existe desarrollo abundante de dos o ms grmenes debe sospecharse que
el enfermo sea portador de sonda vesical permanente, o que padezca alteraciones
en la funcin de la vejiga, como la vejiga neurognica, comn en diabticos y
parapljicos, que ocasiona la incapacidad de vaciar completamente la vejiga, con la
consecuente orina residual, asiento de infecciones. Si no es el caso, debe
comunicarse al clnico la posibilidad de contaminacin de la muestra.
El diagnstico de infeccin urinaria (o de ausencia de infeccin) es particularmente
difcil en nios en que la orina debe colectarse con bolsa. Por ello, varios autores
sugieren que debe cultivarse slo orina obtenida por puncin de la vejiga. Sin
embargo, nuestra experiencia muestra que raramente se toman esas muestras y que
generalmente la muestra obtenida por bolsa permite establecer el diagnstico si se
efectan adems el anlisis del sedimento, la prueba de nitritos y la coloracin de
Gram de la orina sin centrifugar. Por ejemplo, aunque exista contaminacin con flora
de la piel puede establecerse que existe infeccin cuando la prueba de nitritos es
positiva, la coloracin de Gram muestra bacilos gramnegativos gruesos y el cultivo
desarrolla predominantemente una enterobacteria. Por otro lado, puede establecerse
51

ausencia de infeccin si ninguna de las anteriores es positiva y el cultivo desarrolla

menos de 100,000 UFC/mL de algn germen.
Bibliografa

1. Bartlet RC. Medical microbiology: How fast to go-How far to go. In: Lorian V
(Ed.). Significance of Medical Microbiology in the Care of Patients. The
Williams and Wilkins Co, Baltimore, 1977:15-35.
2. Boineau FG, Lewy JE. Urinary tract infection in children: An overview. Pediatr
Ann 1975;64:515.
3. Miller JM, Holmes HT. Specimen collection, transport, and storage. In Murray
PR, Baron EJ, Pfaller MA, Tenover FC, Yolken RH (ed.), Manual of Clinical
Microbiology, 6th ed. American Society for Microbiology, Washington D.C.,
1995;19-32.
4. Weldon DB, Slack M. Multiplication of contaminant bacteria in urine and
interpretation of delayed culture. J Clin Pathol 1977;30:615-9.

52

4.5 EXPECTORACION Y ASPIRADO BRONQUIAL

Generalidades
El estudio de la expectoracin se ha realizado desde la poca de Hipcrates, cuando
se utilizaban las caractersticas fsicas de la muestra para el diagnstico: el color,
olor, consistencia y sabor, eran fundamentales (al igual que la orina!). La
expectoracin, o esputo, es una mezcla de agua, sales, plasma, moco y clulas,
cuyas proporciones son inconstantes. El anlisis de las caractersticas
macroscpicas del esputo vino a enriquecerse con el descubrimiento del microscopio
y las tcnicas de cultivo, ya que los hallazgos obtenidos han marcado la pauta para el
estudio integral de muchas enfermedades respiratorias, principalmente las de origen
infeccioso.
En realidad, una muestra de esputo no siempre es representativa de las secreciones
de vas respiratorias bajas, ya que stas generalmente son deglutidas, y cuando
llegan a ser expectoradas, a su paso por la faringe sufren contaminacin tanto de las
clulas de la zona como de la flora all presentes; adems, en la cavidad oral se
contaminan an ms y se diluyen con la saliva. Otro problema con respecto a las
muestras de expectoracin, sobre todo en lo que a infecciones se refiere, es que los
patgenos pulmonares tales como Streptococcus pneumoniae y Hemophilus
influenzae pueden formar parte de la flora normal de la faringe y confundir los
diagnsticos. Por todo lo anterior, la obtencin de una muestra adecuada ha sido
motivo de mltiples estudios para llegar a un consenso de los requerimientos
necesarios para que dicha muestra sea representativa de las vas respiratorias bajas.
Conviene tambin agregar aqu que el diagnstico de infeccin respiratoria debe
efectuarse clnicamente y que los hallazgos microbiolgicos sirven para apoyar la
sospecha y atribuir un agente causal.
El aspirado bronquial, por su parte, se toma generalmente de pacientes con sondas
(tubos) para respirar, y suelen ser de mejor calidad que el esputo, aunque tambin
las sondas sufren colonizacin con el transcurso de los das. Con el desarrollo de la
broncoscopia con instrumento flexible, se han vuelto tambin comunes las muestras
obtenidas por lavado bronquial.
4.5.2. Obtencin de la muestra
Existen varias formas de obtener muestras de vas areas inferiores. La ms utilizada
de todas, por cmoda y prctica tanto para el mdico como para el paciente, es la
recoleccin del material expectorado por la maana, ya que, aun cuando la mayora
del esputo es deglutido, puede obtenerse una porcin del que se acumul durante
toda la noche. En pacientes hospitalizados, el horario no se restringe a la maana.
Cuando el paciente tiene dificultad para expectorar, se pueden utilizar nebulizaciones
para facilitarlo, siendo las ms utilizadas de agua destilada estril, o bien una
solucin de cloruro de sodio al 10% con propilenglicol al 10% para aumentar la
penetracin del vapor. Es recomendable que se instruya al paciente para la toma de
muestra, indicndole que realice un enjuague bucal as como gargarismos antes de
recoger la muestra, con lo cual se disminuye la contaminacin sin alterar las
caractersticas de la misma. En pacientes hospitalizados que sean incapaces de
expectorar se pueden realizar mtodos alternativos para la toma de muestra, como la
aspiracin con sonda o por puncin transtraqueal y el lavado bronquial por
53

broncoscopia. Los dos ltimos eliminan la posibilidad de contaminacin de la muestra

pero deben de ser realizados en medios hospitalarios por personal calificado, ya que
pueden tener complicaciones importantes.
4.5.3. Manejo y estudio macroscpico de la muestra
La muestra debe recogerse en un recipiente de boca ancha (lo cual es vlido para
muestras expectoradas, ya que las aspiradas pueden ir en tubos), estril, de material
desechable o de plstico incinerable, de preferencia con tapn de rosca o que pueda
ser cerrado hermticamente a presin para que la muestra no contamine el exterior
del frasco. El recipiente debe rotularse y ser enviado de inmediato al laboratorio,
donde ser analizado durante las primeras horas. La muestra puede ser refrigerada
por un da sin que se afecte su celularidad, pero no es recomendable, ya que la
valoracin microbiolgica no podr realizarse adecuadamente debido a que la
cantidad de microorganismos disminuye.
En el laboratorio el estudio inicia por la descripcin de las siguientes caractersticas:
1) Aspecto y consistencia: se describe como lquido, mucoso, sanguinolento,
purulento, seropurulento, mucosanguinolento, etc.; 2) Color: est dado por las
sustancias contenidas en el mismo, puede ser blanquecino, amarillo, verdoso (por
pus o pigmentos bacterianos), asalmonado, rojizo, etc.; 3) Olor. Generalmente no se
altera, pero en algunos casos puede ser muy ftido, como en los abscesos
pulmonares por anaerobios, y 4) Otros hallazgos. Estos pueden ser de varios tipos,
tales como objetos extraos, restos de alimentos (en casos de broncoaspiracin
nocturna en pacientes con hernia hiatal), moldes bronquiales, masas caseosas,
clculos pulmonares, etc. En algunas ocasiones y en zonas endmicas, estos
hallazgos pueden incluir larvas de nemtodos que se encuentren migrando por
pulmn, como en el caso de la ascariosis, estados larvarios de cstodos.
4.5.4. Estudio microscpico de la muestra
Una vez terminado el estudio macroscpico, se realiza un extendido que se deja
secar al aire y posteriormente se fija por calor o alcohol metlico. Se tie con la
tcnica de Gram, que sirve para analizar, adems de si la muestra es buena para el
cultivo, el tipo de flora predominante. El principal problema de una muestra de esputo
es su representatividad, la cual se puede valorar de acuerdo a diferentes criterios,
validos nicamente para muestras expectoradas, ya que las obtenidas por mtodos
instrumentales se suponen representativas. En el caso de encontrar macrfagos,
podemos decir que la muestra proviene del rbol bronquial, ya que no se encuentran
en las secreciones farngeas, lo mismo sucede cuando encontramos clulas
pulmonares. Desgraciadamente, en algunas ocasiones, aun cuando la muestra tiene
este tipo de clulas, se encuentra contaminada por flora farngea. Para tratar de
discernir si la muestra es adecuada para el cultivo, se han realizado cuantificaciones
de dos tipos de clulas; escamosas de faringe y leucocitos. Existen diferentes
criterios de clasificacin que dependen del investigador en cuestin para decidir si la
muestra es adecuada para cultivo o no. Los criterios ms utilizados son el de Welch y
Kelly y el de Bartlett, los cuales analizan campos a bajo aumento (10x) y cuantifican
tanto clulas escamosas como leucocitos. Para fines prcticos, cualquier muestra
con menos de 10 clulas escamosas y ms de 25 leucocitos por campo es adecuada
54

para cultivo, aunque hay laboratorios que solo toman en cuenta el nmero de clulas
escamosas (menor de 10) para realizarlo.
Otro aspecto del estudio microscpico del esputo es la bsqueda de Mycobacterium
tuberculosis, para la cual se requiere de tinciones especiales para cido alcohol
resistentes, hongos como Coccidioides, Criptococcus e Histoplasma, as como
Pneumocystis carinii de pacientes con inmunosupresin. Este ltimo se busca slo
de muestras obtenidas por lavado bronquial que debern primero ser sometidas a
centrifugacin.
Una vez que se ha realizado el estudio microscpico y que se ha visto que la muestra
es buena, se procede a cultivarla en agar sangre, agar chocolate y agar McConkey,
medios que van a permitir el crecimiento de la mayora de los patgenos pulmonares.
Solo se utilizaran otros medios de cultivo y otras tcnicas de diagnstico, tales como
la utilizacin de anticuerpos fluorescentes y tinciones especiales, cuando el clnico
as lo solicite.
4.5.5. Informe de resultados
Es obligacin del laboratorio discernir entre las muestras adecuadas y las que no lo
sean, sobre todo cuando procede a cultivarlas, ya que, de otra manera, al realizar
siembras de muestras malas y reportar el crecimiento de algn germen, el clnico
puede dar tratamiento para un microorganismo que muy probablemente no se
encuentre involucrado en el proceso. As pues, una vez que se ha observado una
muestra que no sea adecuada para cultivo, el laboratorio debe reportrselo al clnico
dicindole la razn de ello, como: La muestra enviada al laboratorio no es adecuada
para cultivo debido a que contiene ms de 10 clulas escamosas por campo de bajo
aumento, favor de enviar nueva muestra.
La identificacin y reporte de los patgenos se efecta de manera convencional. Es
importante el informe cuantitativo de la intensidad del desarrollo. Es comn que haya
desarrollo de flora polimicrobiana, por lo que habr de efectuarse correlacin con los
grmenes observados en la tincin de Gram, para trabajar aquellos que con mayor
probabilidad se relacionen con el problema del paciente. Algunos autores sugieren
que, cuando se obtenga slo un escaso desarrollo de estreptococos y estafilococos
coagulasa negativos, se informe que hay slo flora contaminante. Nosotros estamos
de acuerdo con esta costumbre.
Bibliografa
1. Allen SD. An approach to the diagnosis of pleuropulmonary infections. Clin Lab Med 1982;2:285303.
2. Miller JM, Holmes HT. Specimen collection, transport, and storage. In Murray PR, Baron EJ,
Pfaller MA, Tenover FC, Yolken RH (ed.), Manual of Clinical Microbiology, 6th ed. American
Society for Microbiology, Washington D.C., 1995;19-32.
3. Murray PR, Washington JA II. Microscopic and bacteriologic analysis of expectorated sputum.
Mayo Clin Proc 1975;50:339-44.

55

4.6 EXUDADO DE LA FARINGE, NASOFARINGE Y OIDO

Exudado farngeo. Generalidades
Como su nombre lo indica, el estudio consiste en la toma de una muestra de la
orofaringe en su pared posterior, para su cultivo en busca de bacterias patgenas.
Para entender su utilidad y limitaciones, conviene recordar la flora normal y patgena
de la faringe: Una vez que el individuo nace, la cavidad oral, y por ende, la faringe, se
colonizan por bacterias comensales durante las primeras horas de vida; estas
bacterias provienen seguramente de las vas respiratorias altas de los familiares que
tienen mayor contacto con ellos y consisten principalmente en cocos grampositivos
aerobios como estreptococos alfa hemolticos, Streptococcus pneumoniae y especies
de estafilococos. Posteriormente se agregan cocos gramnegativos (Branhamella**) y
bacilos grampositivos como los difteroides, adems de algunas especies de cocos
anaerobios. Con la denticin, la cavidad oral es colonizada por flora anaerobia, la
cual va a persistr en una proporcin de 2:1 con respecto al aerobio ms frecuente y
va a acompaar al individuo por el resto de su vida. Esta flora anaerobia esta
compuesta principalmente por bacilos gramnegativos de los gneros Bacteroides y
Fusobacterium, as como de espiroquetas, cocos grampositivos y algunas especies
de vibrios y lactobacilos. La cavidad es colonizada tambin por levaduras escasas
(Candida). En los individuos adultos es comn encontrar tambin algunas especies
de actinomicetos. En lo que respecta a la flora patgena, los criterios para clasificarla
son ahora muy distintos a los que se utilizaban hace algunos aos, ya que especies
que antes se consideraban patgenas a ese nivel, como por ejemplo el
Staphylococcus aureus, son conocidas ahora como comensales. Tambin es
importante mencionar que en la faringe pueden encontrarse otros organismos que
son patgenos pero a otros niveles, como vas areas bajas, senos paranasales,
odo medio y sistema nervioso central. Estos microorganismos, como Hemophilus
influenzae, Neisseria meningitidis y el ya mencionado S. aureus, no deben informarse
en el cultivo del exudado farngeo.
Las bacterias que con ms frecuencia producen alteraciones farngeas son:
Streptococcus pyogenes, el cual pertenece al grupo A de la clasificacin de
Lancefield y es betahemoltico; Corynebacterium difteriae, germen productor de la
difteria y que es poco comn actualmente; Neisseria gonorrhoeae, por contacto
sexual y por ltimo, Bordetella pertussis, la cual produce la tos ferina. Es importante
recalcar que el exudado farngeo esta encaminado a cultivar principalmente a los
estreptococos del grupo A, ya que es, como dijimos antes, el patgeno ms
frecuente, adems de que para cultivar a los otros organismos patgenos se requiere
de medios especiales y slo se har ante solicitud especial de casos espordicos.
Mdicos y personal del laboratorio deben tener siempre este hecho en mente, para
no atribuir al cultivo farngeo propiedades diagnsticas que no posee.
4.6.2. Tcnica para toma de muestra y cultivo de exudado farngeo
La tcnica para el hisopado de la faringe vara dependiendo de quien la realice, pero
para fines prcticos, la que produce mejores resultados es la siguiente: Se pide al
individuo que abra la boca, se ilumina la cavidad oral y la faringe lo mejor posible
(puede realizarse con la iluminacin ambiental) y se le pide al paciente que inhale
56

aire por la boca tratando de decir una A larga, esto se realiza con dos finalidades;
primero, el aire al pasar inhibe parcialmente a los nervios vago y glosofarngeo, con
lo cual se puede disminuir en alguna medida el reflejo nauseoso, y en segundo lugar,
al tratar de producir el sonido la epiglotis se deprime, permitiendo una mejor
visualizacin de la faringe y, por ende, una mejor toma de muestra. Mientras el
paciente realiza lo anterior se procede a tomar la muestra con un hisopo estril
frotndolo bien en los pilares anteriores y la retrofaringe, teniendo cuidado de no
tocar la vula para no despertar el reflejo nauseoso. Es conveniente tomar la muestra
sin abatelenguas cuando sea posible, aunque en algunos casos, como cuando la
muestra se toma en un nio que no coopera, su utilizacin es inevitable. Una vez
tomada la muestra se procede a realizar la siembra por estra diluida, como se
explica en el captulo correspondiente. La muestra se siembra slo en agar sangre,
que deber ser forzosamente de carnero y debern efectuarse piquetes en el agar
para observar mejor la hemlisis. La incubacin se hace en atmsfera capnoflica.
Habr de informarse slo la presencia o ausencia de estreptococo betahemoltico del
Grupo A. El mdico deber ser consciente de que este estudio no tiene ninguna otra
finalidad.
4.6.3. Exudado nasofarngeo y de odo
El cultivo del exudado nasofarngeo tiene poca utilidad en la prctica clnica, y quiz
su nica indicacin sera en el caso de un paciente con tos ferina y se quisiera aislar
al agente etiolgico de la secrecin nasofarngea. Anteriormente se utilizaba en
casos de otitis media aguda porque se supona que el germen encontrado en el
cultivo era el mismo que produca la infeccin, pero estudios posteriores demostraron
que no existe una relacin directa entre el cultivo nasofarngeo y el agente etiolgico
de la otitis. Para obtener una muestra es necesario contar con una asa de alambre
con punta de Dacrn, o bien con hisopos de alginato de calcio, ya que ambos son
preferibles a los hisopos de algodn. El hisopo, el cual se humedece previamente
con solucin salina estril, se introduce lenta y cuidadosamente por una narina,
pegndose al tabique nasal, en caso de que ste no pase por alguna obstruccin,
puede utilizarse la otra narina. Una vez que la punta del hisopo se encuentre en
nasofaringe, se realizan movimientos circulares para que se impregne bien y se
extrae para realizar la siembra. La siembra se realiza en un medio especfico para
Bordetella pertussis (Bordet Gengou). Debe mencionarse que es comn que le
mdico solicite cultivo del exudado nasofarngeo como auxiliar en el diagnstico de
sinusitis, lo cual es un error.
En lo referente al cultivo del exudado de odo, este es un mtodo que actualmente se
encuentra en desuso por varias razones, la primera y ms importante es debido a
que este tipo de cuadros son generalmente tratados de manera emprica con
antibiticos de amplio espectro. La segunda es porque las muestras obtenidas de la
secrecin a travs del odo externo se encuentran contaminadas con la flora nativa y
no corresponden al germen causal, o bien la membrana timpnica ya lleva mucho
tiempo rota y la flora tiende a ser polimicrobiana. La toma de estas muestras se
reserva para casos de otitis media aguda con perforacin y salida de secrecin as
como las obtenidas por timpanocentesis (puncin del tmpano).

57

BIBLIOGRAFIA

1.

58

Bartlet RC. Medical microbiology: How fast to go-How far to go. In: Lorian V
(Ed.). Significance of Medical Microbiology in the Care of Patients. The
Williams and Wilkins Co, Baltimore, 1977:15-35.

4.7. HECES. CULTIVO Y PARASITOSCOPICO

Generalidades
Las infecciones intestinales, junto con las infecciones respiratorias, son los problemas
infecciosos ms comunes en el ser humano, y constituyen prioridades de salud
pblica en casi todos los pases. Por ejemplo, en Mxico la diarrea infantil causa
graves problemas de desnutricin pues suele ser recurrente en el mismo enfermo a
quien adems, por atavismos, se le suprime la alimentacin en cada cuadro. El
descubrimiento de que los pacientes con diarrea deben recibir lquidos y alimentos
orales se considera uno de los grandes descubrimientos de la medicina en el Siglo
XX. Pudiera sorprender que se le equipare en importancia al desarrollo de los
antibiticos o de mtodos sofisticados de diagnstico, pero nos ubica en la prioridad
para todo paciente con infeccin intestinal: antes de preocuparse por el diagnstico
etiolgico, atienda el estado de hidratacin y las condiciones generales;
generalmente, el manejo del paciente con diarrea no incluye un antibitico y, cuando
lo incluye, no hay urgencia por iniciarlo.
La gran diversidad de la flora bacteriana normal en el tubo digestivo complica el
diagnstico por el laboratorio. Como en ningn otro sitio, podemos entonces
reafirmar lo que se menciona en el captulo introductorio: No todo lo que desarrolla en
cultivo es patgeno. El postulado complementario es verdadero tambin en la
medida en que conocemos que muchos cuadros estn causados por grmenes no
cultivables o de cultivo no convencional, o sea: No todos los patgenos crecen en
cultivos convencionales, como el caso de las diarreas por rotavirus o campylobacter.
Conviene desde ahora aclarar un hecho: aun en los laboratorios mejor equipados, el
diagnstico etiolgico de un problema diarreico no se logra en ms del 20 por ciento
de los nios y el 10 por ciento de los adultos. Entonces, resulta que el coprocultivo no
debe ser un estudio rutinario para todos los casos de diarrea, pues sta habr curado
cuando se disponga del resultado, sino para casos seleccionados por su gravedad,
duracin mayor de cinco das, fiebre elevada o heces mucosas o sanguinolentas.
Por su etiologa, las gastroenteritis puede ser de diversas categoras. Las frecuencias
relativas implican en primer lugar a grmenes que no invaden la mucosa, como las
infecciones virales y las intoxicaciones por alimentos, asociadas a toxinas de
Staphylococcus aureus, Clostridium perfringens, Bacillus cereus, Vibrio cholerae,
Aeromonas y E. coli enterotoxignica; en estos casos, es poco comn la coexistencia
de fiebre o de leucocitos en la evacuacin. Slo
recientemente se han identificado los agentes virales: en adultos y nios mayores de
dos aos el virus Norwalk es el ms comn; en nios menores suele ser el rotavirus.
El S. aureus es un contaminante habitual de productos de pastelera y carnes
procesadas por manejadores de alimentos que lo portan en la nariz; sus toxinas
causan vmitos, diarrea y retortijones dentro de dos a ocho horas de la ingestin,
limitndose en pocas horas. El C. perfringens prolifera en carnes recalentadas que se
dejaron a temperatura ambiente, en donde se producen esporas y enterotoxinas;
esta gastroenteritis aparece de 8 a 24 horas despus de la ingestin. El B. cereus
produce toxinas que contaminan granos y legumbres; el perodo de incubacin es de
8 a 16 horas. La E. coli toxignica es causa de la mayora de los casos de la llamada
diarrea del viajero (venganza de Moctezuma).

59

La fiebre suele estar presente cuando la infeccin est causada por Salmonella,
Shigella, Edwarsiella, Campylobacter o E. coli enteroinvasora; en estos casos, existe
invasin de la mucosa intestinal y es comn que el paciente aqueje clicos y heces
con moco o sangre (disentera), siendo usual la presencia de leucocitos. Es en este
segundo grupo en donde el cultivo tiene su mayor aplicacin. La infeccin por
Shigella es la causa ms reconocida de disentera bacilar, y generalmente ocurre
despus de la ingestin de alimentos contaminados. La infeccin por Campylobacter
jejuni se reconoce cada vez ms por su importancia, sobre todo en nios menores de
cinco aos (causa ms casos de diarrea que Salmonella y Shigella juntos). Cuando
existen leucocitos o eritrocitos en la evacuacin, debe descartarse tambin la
etiologa parasitaria (E. histolytica y G. lamblia, as como Cryptosporidium e Isospora
en inmunosuprimidos). En la tabla 1 se esquematizan las principales causas de
diarrea infecciosa y su mecanismo.
Finalmente, el clnico y el laboratorista deben considerar que existen muchas causas
de diarrea no infecciosa, como la malabsorcin de alimentos, el consumo de laxantes
y aceites y la alimentacin excesiva en solutos (diarrea osmtica). Incluso el
consumo de antibiticos puede causarla, al favorecer el crecimiento de especies
potencialmente patgenas, como Clostridium difficile, causante de la colitis
seudomembranosa por el consumo de clindamicina o betalactmicos. En trminos
generales puede decirse que el coprocultivo debe hacerse slo de heces diarreicas,
con excepcin de los casos estudiados con fines epidemiolgicos (como la bsqueda
de vibrios o Salmonella en manejadores de alimentos).
4.7.2. Toma de la muestra
En los adultos, la muestra se recibe en un frasco de boca ancha por el propio
paciente. En los nios, puede obtenerse del paal o a travs de un hisopo o
cucharilla rectal que se introduce a travs del ano. En cualquier caso, debe hacerse
llegar de inmediato al laboratorio pues es comn que los grmenes no patgenos
desarrollen con ms facilidad que los patgenos en el excremento evacuado.
Cuando no pueda hacerse llegar de inmediato debe colocarse un poco de la muestra
en un medio de transporte adecuado (Cary-Blair).
4.7.3. Proceso de la muestra
En el laboratorio, siempre debern anotarse las caractersticas de las evacuaciones y
hacer una observacin en fresco en busca de leucocitos o eritrocitos, incluso cuando
el clnico no lo ha solicitado. Esta es una parte integral del estudio pues, como se
menciona en las generalidades, las diarreas con excrecin de leucocitos suelen
indicar invasin de la mucosa (Salmonella, Shigella, campylobacter, E. coli invasora,
parsitos), mientras que sin ellos generalmente indica problema txico o viral (S.
aureus, B. cereus, C. perfringens, E. coli toxignica, Vibrio cholerae, Aeromonas,
rotavirus y virus Norwalk).
No existe un panel aceptado de medios que han de sembrarse. Nosotros
recomendamos un medio selectivo para Salmonella y Shigella (Agar SS), un medio
de agar sangre (slo para efectuar la prueba de oxidasa) y un medio de XLD, o
xilosa-lisina-desoxicolato). Cuando la muestra procede de nios menores de 5 aos y
tiene leucocitos, conviene sembrar un agar para campilobacter, que deber
60

sembrarse en atmsfera de CO2 a 42 oC. En condiciones de epidemias, o cuando el

paciente adquiri la diarrea en zona costera, conviene sembrar un medio de TCBS
para vibrios.
4.7.4. Interpretacin de los resultados
Una informacin importante para la interpretacin se da aun antes de contar con el
desarrollo en las cajas; nos referimos a la observacin de leucocitos pues, como se
mencion, es un dato pivote para sospechar la etiologa.
El primer paso en la interpretacin del desarrollo consiste en una prueba de oxidasa
de un barrido de colonias del agar sangre; una prueba negativa prcticamente
descarta la presencia de Vibrio y Aeromonas. Una prueba positiva obliga a su
bsqueda (observar el TCBS o sembrarlo, en su caso). Algunos pacientes pueden
tener Pseudomonas en la evacuacin con la consecuente prueba de oxidasa
positiva. Afortunadamente, la hemlisis verdosa o lavanda y el olor caracterstico
habitualmente permite apreciar su presencia y no continuar la bsqueda del germen
oxidasa positivo, pues Pseudomonas no se considera patgeno en heces.
A continuacin, se procede a revisar el agar SS en busca de colonias lactosa
negativas (incoloras) o sulfuro positivas (centro negruzco), que generalmente
corresponden a Salmonella, Shigella, Edwarsiella o Proteus. Se toman varias
colonias por separado y se efectan pruebas bioqumicas de al menos 3 colonias
diferentes. Puede efectuarse preliminarmente slo una minibioqumica con tubos de
Kligler, ureasa y hierro-lisina, lo que permite efectuar pruebas con antisueros al da
siguiente (del tubo de Kligler); existen en el mercado antisueros polivalentes contra
Salmonella, de uso muy sencillo. Si se trata de proteus, generalmente puede verse
el swarming u oleadas en el agar sangre, y en ningn caso se considera patgeno en
excremento. Cuando existe un inculo muy escaso de Salmonella o Shigella, el
medio de SS no mostrar su desarrollo pues es un medio muy selectivo. Por ello
debe observarse el medio de XLD para buscar colonias rojizas, que corresponden
usualmente a Salmonella o Shigella. En este caso, se efectan las pruebas
bioqumicas o de antisueros. Cuando hay un germen productor de sulfuro, ureasa
negativa e indol positivo, debe sospecharse Edwarsiella tarda. Nosotros no
recomendamos el cultivo de caldos de enriquecimiento en heces, pues en nuestra
experiencia (y la de otros) no mejora el aislamiento de patgenos.
Cuando existe desarrollo en el medio de TCBS se buscan colonias amarillas (Vibrio
cholerae) o verdosas (V. parahemoliticus). En ambos casos, deben separarse en
agar sangre para efectuar pruebas confirmatorias por aglutinacin con antisueros al
da siguiente. Cuando se sembr el medio de Campylobacter, se observa su
desarrollo. Si hay colonias, se efecta una prueba de oxidasa (debe resultar positiva
en presencia de Campylobacter). De las colonias se efecta una coloracin de Gram
para observar su apariencia caracterstica (gramnegativos en alas de gaviota).
Finalmente, cuando no se encuentre patgeno especfico alguno, se informa el
resultado como ausencia de ellos. Es decir, no debe reportarse como negativo sino,
por ejemplo:
Coprocultivo: No desarroll Salmonella, Shigella, Vibrio, Edwarsiella, Aeromonas, ni
Campylobacter.

61

4.7b METODOS COPROPARASITOSCOPICOS

Introduccin
Como su nombre lo indica, un mtodo coproparasitoscpico, al que desde ahora
vamos a referirnos como CPS, es una tcnica de laboratorio para estudiar el
excremento en busca de parsitos, tanto protozoarios como helmintos, ya sea
porque habiten en el tubo digestivo o porque aparezcan en l en algn momento de
su ciclo vital. La importancia de un CPS radica en la capacidad del mdico para
indicarlo en el momento apropiado, ya que es bastante comn que se solicite al
laboratorio ante la presencia de algn sntoma digestivo vago, que difcilmente puede
atribuirse a las parasitosis.
Si bien es cierto que las parasitosis intestinales no tienen un cuadro clnico
especfico, tambin es cierto que existen ciertos signos o sntomas que nos obligan a
inclinarnos hacia el diagnstico de una u otra enfermedad. Esto depende
fundamentalmente del hbitat del parsito y de su mecanismo patognico; un
ejemplo comn es la diarrea por Giardia lamblia, parsito que habita en el duodeno y
que lesiona la mucosa mediante su disco suctor evitando la absorcin de los
alimentos, principalmente grasas, las cuales aparecen en el excremento en la
enfermedad aguda. En este caso, el CPS de Faust, que es muy bueno para obtener
quistes del parsito en la enfermedad crnica, nos resulta poco apropiado debido a
que slo vamos a encontrar grasa en las muestras estudiadas, ya que concentra la
muestra por flotacin. As pues, es importante conocer los diferentes mtodos que
existen y sus indicaciones para lograr un resultado til.
4.7b.2 Clasificacin
Los mtodos coproparasitoscpicos los podemos clasificar en tres grupos
principales:
1. Mtodos cualitativos
Por su fcil realizacin son los ms utilizados, slo nos indican si existe la parasitosis
pero no nos refieren la cantidad de parsitos por gramo de heces. Son tiles para
todas las parasitosis cuando no se quiere cuantificar sta, sobre todo en las
protozoosis, en las cuales esto no es necesario. Dentro de los mtodos cualitativos
ms utilizados se encuentran los siguientes:
a) CPS directo en fresco.
b) CPS por concentracin-flotacin de Faust.
c) CPS por concentracin-sedimentacin de Ritchie o mtodo de formalina-ter.
d) CPS por decantacin en copas.
2. Mtodos cuantitativos
Se utilizan poco, principalmente en las helmintiasis en las cuales es importante
conocer la magnitud de la enfermedad, tales como las uncinariasis o la tricocefalosis.
En ellas se utiliza una cantidad determinada de excremento y posteriormente se
multiplica el nmero de huevecillos encontrados por diferentes factores dependiendo
de la consistencia de las heces. Dentro de este grupo, los mtodos ms utilizados
son:
a) CPS por concentracin-flotacin de Ferreira.
62

b) CPS de Stoll.
c) CPS de Kato.
3. Mtodos especiales
Sirven para recolectar o concentrar parsitos obtenindolos de su hbitat normal, de
algn lugar especial en el que se encuentren en un momento determinado por las
caractersticas de su ciclo, o bien por ciertas caractersticas biolgicas propias de
cada parsito tales como el termo e hidrotropismo. Las tcnicas son muy variadas
dependiendo del parsito en cuestin. Los mtodos ms comunes son:
a) Sondeo duodenal. Para parsitos de duodeno o vas biliares.
b) Tamizado de heces. Para progltidos de tenias.
c) Mtodo de Graham. Para huevecillos de oxiuros o larvas de strongyloides.
d) Mtodo de la cucharilla rectal. Para parsitos de colon, principalmente amebas
patgenas.
e) Exudado vaginal. Para Trichomonas vaginalis.
Mtodo de Ritchie
De los mtodos anteriores describiremos slo los ms utilizados. Uno de ellos es el
de concentracin por centrifugacin de Ritchie o mtodo de la formalina-ter.
4.7b.3. Manejo de la muestra
El nmero de muestras a estudiar es generalmente de tres, aunque para algunas
parasitosis es necesario un mayor nmero. Para facilitar el estudio es conveniente
dar al paciente un recipiente de boca ancha que contenga un conservador como el
FAF (formol, alcohol, fenol), el cual servir adems para mantener los parsitos en
buenas condiciones para estudios posteriores. Con este paso, podemos estudiar en
una sola muestra las heces de diferentes das. Se le pide al paciente que deposite en
el frasco una cantidad moderada de excremento (aproximadamente 10g, o el tamao
de una nuez) durante tres das consecutivos de la primera evacuacin del da.
Proceso
1. Se procede a homogeneizar la muestra mediante un abatelenguas.
2. Se filtra la muestra por una malla de gasa a un tubo de centrfuga.
3. Se centrifuga a 2000 rpm durante un minuto y se tira el sobrenadante virtiendo
nuevamente FAF en el tubo. Este paso se realiza las veces que sea necesario para
obtener un sobrenadante claro ( generalmente bastan tres veces).
4. En caso de no tener la muestra previamente en FAF y estar realizndolo con
solucin salina, despus de la ltima centrifugacin se vierten 10 ml de formol al 10%
en el tubo de ensaye y se deja reposar por 15 minutos para la fijacin de los
parsitos. Este paso no es necesario cuando la muestra ya se encuentra en FAF, en
cuyo caso se le coloca nuevamente FAF en lugar de formol
5. Se colocan en el tubo 5 ml de ter, se coloca un 0tapn de corcho y se agita
vigorosamente durante 30 segundos.
6. Se retira el tapn cuidadosamente debido a la formacin de gases por el ter y se
centrifuga a 1500 rpm durante dos minutos, tiempo despus del cual, la muestra se
retira de la centrfuga.
63

Al observar el tubo, vamos a distinguir cuatro fases diferentes en l, la superior, en la

cual se encontrar el ter y las grasas, la segunda que contendr detritus vegetales,
una tercera que contiene el formol o el FAF y por ltimo, el sedimento en el cual se
van a encontrar los parsitos. Esta ltima se extraer del tubo mediante una pipeta
Pasteur y se colocar en los extremos de un portaobjetos limpio, una con solucin
salina, y la otra con lugol parasitoscpico para teir algunas estructuras de los
parsitos. A ambas se les coloca un cubreobjetos y se procede a su revisin en el
microscopio a seco dbil y en grecas en busca de quistes, larvas o huevecillos. Se
utiliza el seco fuerte para la identificacin.
4.7C. TINCION TRICROMICA PERMANANTE
Introduccin
Las tcnicas de coloracin de parsitos preservadas con fijadores como el Schaudin
o el PVA (polivinilalcohol) han demostrado ser muy superiores a los mtodos
convencionales de diagnstico en el caso de las enfermedades parasitarias del tubo
digestivo. Esto es debido a que el anlisis de la muestra se realiza mejor con la
fijacin y coloracin de los parsitos. De hecho, los expertos aceptan que para la
mayora de los protozoarios, la identificacin con los CPS convencionales, o en
fresco, es slo presuntiva y debe confirmarse siempre en tincin. Otra ventaja
es que puede ser leda por diferentes observadores en tiempos distintos. Para
realizar una coloracin es necesario preparar las muestras con fijadores como los
anteriormente mencionados, lo cual facilita su adhesin a las laminillas as como su
coloracin.
4.7c.1. Tcnica
Al momento de obtener la muestra, la cual debe de ser fresca, puede procesarse
inmediatamente introduciendo un extendido de la misma en fijador de Schaudin
durante una hora, aunque el tiempo puede variar desde 20 minutos hasta 24 horas o
ms, o bien puede mezclarse una cantidad de muestra con tres de PVA para
procesarse en cualquier momento posterior, conservndose de esta manera
indefinidamente. El extendido se realiza de forma circular en un extremo de un
portaobjetos, dejndose secar por un lapso de una hora, al trmino de la cual se le
pasa una hoja de papel secante por encima para retirar el exceso de lquido. Luego
puede procederse a la coloracin. Es conveniente mencionar que da mucho mejor
resultado la coloracin si se deja secar el extendido durante 24 a 72 horas. Es
tambin conveniente que la muestra llegue ya preservada en PVA al laboratorio pues
evita la descomposicin del transporte. Sin embargo, cuando se entrega el recipiente
con PVA al paciente, debe mostrar un rtulo de toxicidad (debe mostrar calavera)
pues es muy txico y algunas madres lo han dado a ingerir a los nios en la creencia
de que sirve como laxante para obtener la muestra. Para los reactivos de la
coloracin se utilizan jarras de Coplin, en los cuales se van introduciendo los
portaobjetos con los extendidos de la manera
siguiente:
1. Alcohol iodado, 10 minutos.
2. Etanol al 70%, 3-5 minutos.
64

3. Etanol al 70%, 3-5 minutos.

4. Coloracin tricrmica, 6-8 minutos.
5. Alcohol cido, 5-10 segundos. Durante este paso se observar cuidadosamente
cuando el exceso de colorante se retire de la preparacin, para lo cual basta con
introducirla dos veces de manera rpida en la jarra con el reactivo, pasndose
rpidamente a la siguiente jarra.
6. Etanol al 95%. Dos introducciones rpidas.
7. Etanol al 95%, 5 minutos.
8. Etanol al 95%, 5 minutos.
9. Etanol absoluto, 3 minutos.
10. Xileno, 3 minutos.
11. Montar con resina o material apropiado inmediatamente despus de salir del
paso 10, sin dejar que se seque.
Bibliografa
1. Garca LS, Bruckner DA. Diagnostic Medical Parasitology. American Society for Microbiology,
Washington, D.C., 1993.
2. Garca LS, Bullock-Iacullo S, Palmer J, Shimizu RI. Diagnostic of parasitic infections: Collection,
processing , and examination of specimens. In Murray PR, Baron EJ, Pfaller MA, Tenover FC,
Yolken RH (ed.), Manual of Clinical Microbiology, 6th ed. American Society for Microbiology,
Washington D.C., 1995;1145-1158.

65

8. EXUDADO VAGINAL, CERVICAL Y URETRAL

8.1. Exudados cervical y vaginal
Estos estudios se solicitan generalmente por la presencia de flujo vaginal (vaginitis),
en ocasiones acompaado de dolor bajo de abdomen (cervicitis y enfermedad
plvica inflamatoria). Es sorprendente que, a pesar de ser uno de los problemas ms
comunes de la consulta ginecolgica, an se desconozca mucho de la etiologa de
ambas enfermedades. Es importante que el mdico y el personal del laboratorio
conozcan la utilidad y limitaciones de los estudios microbiolgicos para evitar
tratamientos inadecuados. Recuerde que existe una flora vaginal normal
(lactobacilos, anaerobios, cocos grampositivos, bacilos gramnegativos, levaduras),
por lo que no puede pretenderse que cualquier aislamiento en cultivo tenga
implicaciones clnicas.
Las infecciones o infestaciones vaginales son: 1) Candidosis; 2) Trichomoniasis; y 3)
Vaginosis bacteriana. La candidosis vaginal es comn y tienen predisposicin a ella
las mujeres que utilizan anticonceptivos, las diabticas y las que han tomado
antibiticos. El flujo es blanquecino y produce comezn intensa, aunque no suele
haber mal olor. Puesto que Candida es parte de la flora vaginal normal, su
aislamiento en cultivo no siempre tiene importancia y se prefiere la coloracin de
Gram y/o el examen en fresco del flujo. La trichomoniasis es una enfermedad
venrea muy comn que se diagnostica con facilidad en el examen en fresco;
produce un flujo amarillento y comezn intensa.
La vaginosis bacteriana es una enfermedad comn que generalmente se presenta en
el 35% de las mujeres con enfermedades de transmisin sexual, del 15 al 20% de las
mujeres embarazadas y del 5 al 15% de pacientes con algn problema ginecolgico .
Los factores de riesgo se asocian con actividad sexual promiscua y uso de
anticonceptivos, as como la utilizacin del dispositivo intrauterino. La vaginosis
bacteriana se considera una infeccin polimicrobiana donde Gardnerella vaginalis,
bacilos gramnegativos (enterobacterias y anaerobios), Peptostreptococcus,
Ureaplasma y micoplasmas casi siempre se estn presentes. Las especies de
Mobiluncus se han encontrado hasta en el 97% de pacientes y su papel en esta
enfermedad todava est por determinarse. Por otro lado, los lactobacilos se
encuentran muy disminuidos en las pacientes con vaginosis bacteriana y se les
considera protectores de la vagina debido a la produccin de perxido de hidrgeno,
bacteriocinas y la disminucin del pH que inhibe la colonizacin por otros
microorganismos. Debido a la gran variedad de grmenes que se postulan como
causantes, actualmente el diagnstico no se basa en el cultivo, sino en la coloracin
de Gram del exudado vaginal.
La cervicitis suele manifestarse por flujo mucopurulento, a veces acompaado de
dolor bajo de vientre. Generalmente es causada por Chlamydia trachomatis o
Neisseria gonorrhoeae. Sin embargo, hasta en la mitad de los casos no puede
encontrarse ninguno de los dos y, aunque se han postulado muchos agentes
causales, hasta el da de hoy se deben considerar desconocidos. El diagnstico debe
sospecharse clnicamente, en conjunto con una coloracin de Gram del exudado
cervical.
66

8b.1. Exudado uretral del varn

La sola salida de secrecin purulenta, comnmente acompaada de ardor para
orinar, es suficiente para hacer el diagnstico clnico de uretritis en el hombre. Sus
causas ms comunes son N. gonorrhoeae y C. trachomatis. Existen algunos casos
por herpes y por Trichomonas. Ureaplasma urealyticum ha sido implicado en algunos
casos, pero la asociacin es an dudosa. Cuando slo existe la disuria, pero no
puede encontrarse secrecin, deber descartarse prostatitis o cistitis.
8.2.Toma e interpretacin de la muestra
8.2a. Exudado cervical y vaginal
El estudio del exudado cervical y vaginal debe incluir siempre la observacin de las
caractersticas del flujo (volumen, color, olor), el examen en fresco para observar T.
vaginalis y levaduras, la prueba de aminas (KOH), la coloracin de Gram del
exudado vaginal (fondo de saco) y cervical, as como el cultivo del exudado cervical
en medio de Thayer Martin. Como se deduce de los antecedentes, es generalmente
intil la toma de cultivos vaginales. En esto estn de acuerdo la mayora de los
autores.
El examen en fresco se hace de un poco de solucin salina donde se ha introducido
un hisopeado del fondo de saco posterior. Se observa a 400X para buscar T.
vaginalis o levaduras. Otro hisopado se introduce en KOH para detectar el olor de las
aminas (olor a pescado). La coloracin de Gram es muy importante. Si las clulas
epiteliales son normales y existen abundantes bacilos grampositivos con morfologa
de Lactobacillus, puede decirse en general que el resultado es normal pues los
patgenos (con excepcin de Candida) los desaparecen. La presencia de levaduras
en el Gram indica candidosis con ms precisin que el cultivo. Para indicar la
presencia de vaginosis bacteriana, existen varios criterios para su interpretacin,
siendo el ms aceptado el criterio de Spiegel, en donde cada morfotipo bacteriano es
cuantificado por el objetivo de inmersin mediante el siguiente esquema:
1+, 1 por campo;
2+, 1 a 5 por campo;
3+, 6 a 30 por campo;
4+, ms de 30 por campo.

Bacilos largos grampositivos se consideran Lactobacillus y bacilos pequeos

gramvariable se les considera Gardnerella. Otros organismos se caracterizan como
cocos positivos o negativos. Cuando el morfotipo del Lactobacillus se encuentra
presente solo o nicamente en combinacin con el morfotipo de Gardnerella, la
coloracin se interpreta como normal. Cuando hay presencia de flora mixta
incluyendo no solamente el morfotipo de Gardnerella sino otras bacterias
gramnegativas y grampositivas, y cuando el morfotipo del Lactobacillus est
ausente o solo en nmeros muy pequeos (1+, 2+), la coloracin se considera
diagnstica de vaginosis bacteriana. En estos casos, suelen existir las clulas
clave, o clulas epiteliales de bordes mal definidos por la colonizacin con flora
mixta.
El Gram del exudado cervical es de utilidad para auxiliar en el diagnstico de
cervicitis, en cuyo caso podrn observarse ms de 30 leucocitos por campo de

67

inmersin. El cultivo en Thayer Martin es 90% sensible para confirmar la presencia

del gonococo. Para confirmar la presencia de Chlamydia habrn de efectuarse
pruebas de fluorescencia o ELISA. Recuerde que hasta el 50% de las cervicitis son
de causa desconocida, por lo que es muy importante reportar el Gram, para ayudar
en su sospecha.
8.2b. Exudado uretral del varn
Para el estudio del exudado uretral del varn, generalmente es necesario ordear
la uretra y obtener secrecin para Gram, cultivo en Thayer Martin y, eventualmente,
estudios de fluorescencia o ELISA para Chlamydia. La observacin de diplococos
intracelulares gramnegativos en grano de caf es lo suficientemente
caractersticos para hacer el diagnstico de gonorrea. Cuando la uretritis no es
gonoccica, deber buscarse Trichomonas en un sedimento urinario, as como
buscar la presencia de Chlamydia.
Bibliografa
1. Mrquez-Davila G, Martnez-Barreda CE. Predicive value of the clue cellsinvestigation and the
amine volitilization test in vaginal infections caused by Gardnerella vaginalis. J Clin Microbiol
1985;22:686-7.
2. Nugent RP, Krohn MA, Hillier SL. Reliability of diagnosing bacterial vaginosis is improved by a
standardized method of Gram stain interpretation. J Clin Microbiol 1991;29:297-301.
3. Spiegel CA. Diagnosis of bacterial vaginosis by direct Gram stain vaginal fluid. J Clin Microbiol
1983;18:170-7.
4. Vontver LA, Eschenbach DA. The role of Gardnerella vaginalis in non-specific vaginitis. Clin
Obstet Gynecol 1981;24:439-60.

68

4.9. Secreciones oculares

Generalidades
El ojo y sus estructuras asociadas estn predispuestas a la infeccin por una gran
variedad de microorganismos. Las indicaciones y tcnicas de la investigacin
microbiolgica estn determinadas por el sitio de infeccin, severidad del proceso y
conocimiento del microorganismo probablemente responsable. Los pacientes con
infeccin ocular representan un gran problema para la recoleccin de las muestras
porque el ojo es un rgano de dimensiones pequeas y altamente sensible; adems,
la muestra generalmente es pequea y el crecimiento del germen puede alterarse
por diversos factores como la dilucin que sufre al inocularse en un medio
relativamente grande, o el uso previo de antibiticos que, por ser de uso local,
alcanzan altas concentraciones.
La flora normal del ojo puede variar diariamente, y por lo tanto, no puede usarse el
trmino germen patgeno pues resulta obsoleto. Como se ha insistido en otros
captulos, la connotacin de patgeno depende de interrelacin con el clnico. El
desarrollo de Staphylococcus aureus puede representar slo una colonizacin si la
muestra se tom, por ejemplo, como escrutinio en un paciente hospitalizado sin
problemas oculares.
4.9.1. Toma de muestras
Para mantener una calidad ptima en la muestra, se recomienda que sta sea
tomada en el laboratorio generalmente con hisopos de dimensiones adecuadas. Los
hay fabricados de algodn, polister y alginato de calcio. En ocasiones se utiliza un
esptula de material que permite la esterilizacin rpida y con l se realiza un
raspado en el sitio deseado para obtener la muestra. Si se trata de una secrecin
purulenta o lquida en un compartimento cerrado, se prefiere el mtodo de aspiracin
con jeringa estril para conservar la viabilidad de los microorganismos anaerobios.
Es importante tomar en cuenta el sitio de probable puncin pues sta se encuentra
contraindicada en algunas zonas del ojo. En todo caso, es un procedimiento que
debe efectuar slo el especialista.
Los anestsicos tpicos tienen propiedades antimicrobianas que pueden alterar el
resultado del cultivo, por lo que se recomienda la toma de la muestra antes de su
aplicacin. El hidroclorato de proparacana al 0.5% es el menos antisptico y el de
eleccin cuando no se puede evitar su uso, como en la obtencin de material
proveniente de crnea. Los anestsicos locales no interfieren con las tcnicas
citolgicas.
Los medios de cultivo utilizados en las secreciones oculares, comnmente son
medios generales como agar sangre y chocolate. Como la causa de infeccin puede
ser amplia, incluyendo bacterias, virus y hongos, segn la sospecha clnica, est
indicado el cultivo en medios como Thayer-Martin, Sabouraud, etc. Generalmente, no
se efecta cultivo para anaerobios pues la superficie ocular est colonizada
normalmente, por lo que se reserva
para muestras obtenidas por puncin con jeringa. Las tinciones tambin se realizan
de acuerdo con la sospecha clnica. La coloracin de Gram acompaar a todo
cultivo. Slo si la solicita el clnico debern hacerse baciloscopias o tinciones
especiales.
69

Los prpados son rganos que forman parte del aparato protector del ojo. Estn
expuestos a multitud de afecciones por lo que toda lesin atpica en ellos debe ser
estudiada con biopsia. Generalmente el cultivo de muestras provenientes de la piel
intacta del prpado es de difcil interpretacin como es el caso de las erisipelas, por
lo que su estudio es relegado. Si la lesin est abierta, se toma la muestra con un
hisopo de algodn rotndolo sobre la superficie y se inoculan con l los medios de
cultivo. Si la lesin es cerrada y candidata a aspirar se procede a realizarla con
jeringa estril no sin antes limpiar la piel con alcohol y antisptico yodado (Isodine).
En ocasiones, existen lesiones purulentas de los prpados constituidas por
lipogranulomas estriles (como el orzuelo o chalacin).
A pesar de la proteccin que brindan las pestaas, los prpados, la capa lagrimal
preocular y el epitelio, la conjuntiva est predispuesta a la infeccin por diversos
microorganismos. Las principales rutas de inoculacin son fomites, contacto manoojo y la extensin de la infeccin de los anexos. La conjuntiva est en interrelacin
constante con hongos y bacterias del aire y los anexos, y hacen que la flora normal
sea compleja y determinada por muchos factores. Es obligatorio hacer cultivo de las
dos conjuntivas aun en infeccin unilateral. Por las caractersticas clnicas se puede
distinguir una conjuntivitis bacteriana, viral o por Chlamydia (pero esta afirmacin no
es vlida en conjuntivitis neonatal) y as indicar qu tipo de microorganismo se
espera recuperar en el cultivo e indicar el medio de cultivo adecuado. Para obtener la
muestra, un hisopo de algodn se pasa por la conjuntiva inferior tarsal y frnix
(ngulo del ojo) y se inoculan los medios. El proceso se repite en el otro ojo. La
coloracin Gram se hace siempre, ya que nos auxiliar en la identificacin de las
formas infecciosas, alrgicas o irritacin conjuntival. Cuando se sospecha Chlamydia
como causa, se deber usar hisopos de alginato de calcio porque el algodn le
resulta txico. En este caso, resulta ms importante la coloracin o las
determinaciones por ELISA que el cultivo.
La infeccin de la conjuntiva en el recin nacido ocurre por inoculacin en la infeccin
ascendente de vagina y crvix en la ruptura prematura de membranas, por
secreciones al nacer o por contacto con personas o materiales contaminados.
Caractersticamente, es causada por Neisseria gonorrhoeae o Chlamydia pero, a
diferencia del adulto, no tiene signos que orienten a la etiologa por lo que se
recomiendan los cultivos que cubran todas las posibilidades.
Factores exgenos y alteraciones locales y generales del husped, hacen a la crnea
susceptible de infectarse por diversas bacterias, causando una infeccin seria que
requiere una pronta y meticulosa investigacin por el laboratorio. La principal va es el
dao a la crnea con material contaminado o invasin de un defecto preexistente,
pues son pocas las bacterias capaces de penetrar el epitelio intacto de la crnea. El
mtodo de obtencin del material es el raspado en mltiples reas de la crnea con
esptula, excepto cuando hay una lesin focal o perforacin. Este procedimiento
idealmente lo realiza el oftalmlogo auxiliado de la lmpara de hendidura o con
microscopio quirrgico. El material obtenido pasando un hisopo por la superficie, no
ser representativo.
La endoftalmitis (infeccin de las estructuras internas del ojo) es la infeccin ms
severa. Para lograr conservar la funcin ocular, se requiere un alto grado de
sospecha, rpida investigacin en el laboratorio y un agresivo tratamiento
70

antimicrobiano. El procedimiento para obtener la muestra depende siempre del

especialista pues requiere muestras por puncin. Sin embargo, lo ms comn es que
el tratamiento se establezca por posibilidad epidemiolgica y que se relegue el
cultivo.
4.9.2. Proceso e interpretacin
La coloracin Gram que acompaa al cultivo apoyar sus hallazgos. En los extendido
de conjuntiva, la respuesta inflamatoria se estima contando los leucocitos por cada
10 clulas epiteliales. En una conjuntivitis aguda bacteriana, hay ms de 10
polimorfonucleares por cada 10 clulas epiteliales. Las infecciones virales producen
comnmente menos de 10 linfocitos y monocitos por cada 10 clulas epiteliales.
Tambin se pueden observar las inclusiones dentro del citoplasma producidas por C.
trachomatis.
Los extendidos de crnea reconocen las bacterias responsables de las queratitis y
pueden identificar hongos elementales. La queratitis alrgica se sospecha cuando
hay secrecin escasa y presencia de eosinfilos (tincin de Wright).
Para la interpretacin de los cultivos de conjuntiva, se requiere familiarizarse con la
flora normal (ver anexo), pues el aislamiento de algn germen de ella requiere
interpretacin juiciosa, en conjunto con el clnico. La seleccin para la identificacin y
sensibilidad a antibiticos depende de la orientacin clnica. El microorganismo ms
frecuentemente aislado es Staphylococcus aureus seguido por Streptococcus del
grupo A y Streptococcus pneumoniae. En nios menores de cinco aos predomina
Hemophilus influenzae. Las enterobacterias son raras en los cultivos oculares,
aunque esto no es vlido en pacientes hospitalizados y postoperados. En el recin
nacido es ms frecuente encontrar Neisseria gonorrhoeae y C. trachomatis que a
otras edades. En una infeccin crnica, frecuentemente se aslan hongos, y de stos,
Aspergillus es el ms comn.
Cuando el inicio del tratamiento es urgente, se puede orientar por los hallazgos de la
coloracin y la identificacin parcial que da el cultivo y posteriormente en el
laboratorio se contina la identificacin total. El reporte incluye la descripcin de los
hallazgos en las tinciones y el nombre del germen aislado en el cultivo, ya
identificado totalmente y con su respectiva sensibilidad a antibiticos. Sin embargo,
casi siempre es importante el envo de informes preliminares.
Bibliografa

1. Jones DB, Liesengang TJ, Robinson NM. Cumitech 13, Laboratory Diagnosis
of Ocular Infections. Washington JA (Ed.). American Society for Microbiology,
Washington D.C., 1981
2. Miller JM, Holmes HT. Specimen collection, transport, and storage. In Murray
PR, Baron EJ, Pfaller MA, Tenover FC, Yolken RH (ed.), Manual of Clinical
Microbiology, 6th ed. American Society for Microbiology, Washington D.C.,
1995;19-32.

71

4.10. CULTIVO DE SONDAS Y CATETERES

Generalidades
El procedimiento de invasin ms frecuentemente aplicado a los pacientes
hospitalizados es la colocacin de catteres endovenosos. De hecho, es tan comn
que el lector pensar que nos referimos ahora a los catteres centrales. Esta
imagen de inocuidad de los catteres perifricos, y frecuentemente por extensin,
los centrales, ha sido responsable de una buena parte de las bacteriemias
nosocomiales. Por ello es importante conocer cmo y para qu se cultivan estos
dispositivos.
Al respecto de las sondas (intrapleurales, vesicales, endotraqueales, nasogstricas
etc.) mencionaremos en sntesis -lo que sirve y lo que no sirve-. En lo general se ha
establecido que es mejor cultivar el lquido que se ha drenado que la sonda que lo
dren. Para estas ltimas no existen parmetros definidos de las cuentas
bacterianas asociadas a enfermedad. En estos trminos parece ms razonable
cultivar la orina que el catter vesical. Aun as, le recomendamos no rechazar las
solicitudes de cultivo de otros mdicos; es probable que no le enven el lquido y
pierda al cliente. Abordaremos algunos casos particulares de procedimientos de
otros dispositivos especiales.
4.10.1. Cultivo de catteres endovenosos
La tcnica ms aceptada del cultivo de catteres endovenosos es la descrita por
Maki hace ms de 20 aos. Esta se basa en el rodamiento de la punta del catter
(3-5 cm) en agar sangre.
Obtencin, Transporte y Siembra de muestras. Se retira el catter con el
cuidado convencional de esterilidad (guantes, cubrebocas). Se cortan 3 a 5 cm de
punta del catter y se coloca en un tubo estril. El transporte al laboratorio y
siembra debern hacerse cuanto antes. En el laboratorio, (aunque podra hacerse a
la cabecera del paciente) se coloca la punta del catter en una placa de agar
sangre y se rueda en 4 5 sentidos con la ayuda de un hisopo estril. Se cuentan
las unidades formadoras de colonias despus de incubarse por 24 horas a 35 oC.
Se procede luego a la identificacin y determinacin de sensibilidad de los las
colonias con mtodos convencionales.
Las cuentas obtenidas de este procedimiento se informan como: Negativo,
Menos de 15 UFC de..., Ms de 15 UFC de...; o bien Contaminacin masiva
de con la identificacin y sensibilidad al germen. Raramente se presentan casos
con cuentas limtrofes; algunos autores consideran cuentas entre 10 y 15 UFC
como colonizacin, mientras que cuentas superiores se describen como
contaminacin. Los informes preliminares siempre sern tiles. La bondad del
mtodo est basada en la facilidad del procedimiento de siembra, el bajo consumo
de material de laboratorio y la sencillez para generar un criterio cuantitativo con
buena asociacin con enfermedad.
4.10.2. Otros procedimientos
Se han ensayado otros procedimientos para mejorar el aislamiento en dispositivos
endovenosos, de derivacin ventriculo-peritoneal etc. Estos incluyen la siembra en
placa de volmenes controlados de solucin salina instilada a travs del catter. El
72

informe llevar un criterio cuantitativo que, sin embargo, no ha superado al obtenido

por la tcnica de Maki.
La coloracin directa de los catteres con naranja de acridina y la bsqueda de
bacterias con microscopio de fluorescencia, tiene la ventaja de ser una prueba rpida
que dar un resultado cualitativo controlable slo en manos experimentadas. La
superficie de los catteres contaminados mostrar bacterias o levaduras y
eventualmente la posibilidad de dar un resultado presuntivo de la identidad a travs
del morfotipo. En suma, hasta ahora el procedimiento mejor controlado para el cultivo
de catteres endovasculares es el efectuado por rodamiento. En el caso de los
catteres ventriculo-peritoneales, peritoneales de dilisis, endopleurales, etc., efecte
un procedimiento similar (rodamiento) y establezca comunicacin con el mdico que
lo solicita. Los grmenes aislados y la sensibilidad a antibiticos pueden aportar
informacin til (aunque limitada) al tratamiento del problema. Como se dijo, es
mejor cultivar los lquidos que estos dispositivos drenaban.
Bibliografa
1. Gross PA, Harkavey LM, Barden GE, Kerstein M. Positive Foley catheter tip cultures-fact or
fancy? JAMA 1974;228:72-3.
2. Macas-Hernndez AE, Corts Gallo G, Muoz-Barrett JM, Gonzlez-Campos H, MedinaValdovinos H, Ruiz-Martnez LM. Contaminacin de catteres endovenosos en un servicio
peditrico. Boletn Med Hosp Inf Mex 1994;51:524-7.
3. Maki D, Weise CE, Safarin HW. A semiquantitative culture method for identifying intravenouscatheter-realted infection. New Engl J Med 1977;296:1305-9.
4. Martin MA, Pfaller MA, Wenzel RP. Coagulase-negative staphylococcal bacteremia. Ann Intern
Med 1989;110:9-16.

73

5. EL LABORATORIO EN INFECCIONES POR HONGOS

Generalidades
La micologa ha cobrado cada vez ms importancia por la mayor proporcin de
pacientes inmunosuprimidos, adems de las infecciones superficiales comunes.
Tradicionalmente, el manejo de muestras se considera como el prototipo de riesgo y
su estudio se ha relegado en casi todos los laboratorios generales. De hecho, es
importante que no se trabajen hongos de micosis profundas si no se cuenta con
personal capacitado y equipo de seguridad biolgica, como campana con filtro de alta
eficiencia. Sin embargo, los laboratorios generales estn obligados al estudio de
estos problemas; pueden trabajar estudios de poco riesgo, como los relativos a
dermatofitosis (micosis superficiales) e inocular los medios en casos de micosis
profundas, para luego enviarlos a laboratorios especializados para su identificacin,
en caso de que exista desarrollo.
Los hongos son ubicuos en la naturaleza y tienen una gran variedad pues se
conocen ms de 200 mil especies. Sin embargo, slo poco ms de 100 se reconocen
como patgenos para el humano. En general, pueden dividirse en hongos
verdaderos (mohos) y levaduras. Los primeros semejan a las plantas en que
producen ramificaciones (hifas) que en conjunto forman un micelio que es fcilmente
reconocible en los cultivos por su apariencia vellosa. Por otra parte, las levaduras
(como Candida o Cryptococcus) son hongos unicelulares redondeados que se
reproducen por gemacin; sus colonias suelen ser mucoides y circulares, parecidas a
colonias bacterianas. Algunos hongos, como los de las micosis profundas
(Histoplasma, Blastomyces, Coccidioides) existen como un moho en la naturaleza
pero en los tejidos aparecen como una levadura; stos se conocen como hongos
dimorfos.
Los mohos se reproducen por esporas que en ocasiones se agrupan en rganos
especializados, o frutos, que se conocen como macroconidias. El reconocimiento
microscpico de estas fructificaciones es importante en la identificacin de los
mohos. En esta rea, la micologa es diferente que la bacteriologa pues sta
depende generalmente de caractersticas bioqumicas para la identificacin, mientras
que aqulla requiere ms de la experiencia de quien observa las colonias a simple
vista y las formas en el microscopio.
5.1. Procedimientos de laboratorio
En general, los procedimientos de la micologa son semejantes a los de la
bacteriologa, pero los hongos requieren ms tiempo para su generacin, lo que
obliga a tener medios que resistan la desecacin y la contaminacin por saprofitos. El
primer requisito se obtiene sellando las cajas de Petri o incubndolas en ambientes
hmedos. Como se mencion en la seccin de incubacin, los cultivos de hongos
deben incubarse a temperatura ambiente o en una incubadora a 30 oC. Los medios
se dividen en generales o selectivos (a stos se les agregan inhibidores de
saprfitos) y existen en una gran variedad. Sin embargo, consideramos que todo
laboratorio debe contar con un medio general, como el agar Sabouraud, y uno
selectivo, como el de Mycosel; ste contiene cicloheximida para inhibir el desarrollo
74

de Aspergillus y otros hongos ambientales, pero permite en desarrollo de los

dermatfitos y hongos dimorfos.
A continuacin, describiremos brevemente situaciones particulares en estudios de
micologa, que representan los casos ms comunes en la prctica diaria.
5.2. Estudios de piel, cabello y uas para micosis superficiales
El diagnstico de las micosis superficiales, o dermatofitosis, suele ser sencillo y el
mdico generalmente indica un tratamiento aun sin auxilio del laboratorio. Sin
embargo, en ocasiones hay lesiones atpicas y el mdico solicita observacin en
fresco y cultivo de las escamas. En todos estos casos, se limpia el rea a estudiar
con alcohol y se raspa con una laminilla estril para obtener escamas que habrn de
vaciarse directamente en un medio de Sabouraud, uno de Mycosel y una laminilla
para su estudio directo. Los medios se sellan con cinta y se incuban a 30 oC, o a
temperatura ambiente; entre cinco y siete das despus se podr observar el
desarrollo tanto en el medio no selectivo (Sabouraud) como en el selectivo (Mycosel),
ya que los dermatofitos no se inhiben por cicloheximida. Si se observa desarrollo slo
en Sabouraud, generalmente se trata de contaminantes. La identificacin definitiva
requiere adherir una cinta Scotch a la colonia y pegarla en una laminilla que contenga
un fijador coloreado, generalmente azul de algodn. La observacin microscpica de
las macroconidias permite identificar al dermatfito despus de que ha desarrollado
en cultivo (Epidermophytum sp., Microscoporum sp., Trichophytum sp).
Para la observacin directa en fresco, se agrega hidrxido de potasio (KOH, 10%) a
la laminilla con escamas y se calienta en el mechero sin permitir la ebullicin,
tratando de disolver la queratina. Una vez enfriada, la muestra se observa
directamente en el microscopio (100 y 400 aumentos) para encontrar hifas o
levaduras. La sola observacin de ellas suele ser suficiente para el clnico, quien
frecuentemente no estar interesado en la identificacin definitiva, ya que el manejo
ser semejante para todas las especies. Es por ello que se dice que si la observacin
en fresco es claramente positiva para hongos o levaduras, podr muchas veces
obviarse el cultivo. Sin embargo, conviene aclarar que el cultivo es un estudio de
mayor sensibilidad, por lo que es imprescindible en todos los casos en que la
observacin en fresco sea negativa o dudosa.
5.3. Lquidos corporales (LCR, pericrdico, peritoneal, sinovial)
Deben obtenerse bajo condiciones de puncin estril y enviarse de inmediato al
laboratorio o almacenarlos a 4 oC hasta por doce horas. En estos casos el mdico
persigue micosis profundas y es comn que los cultivos se siembren en conjunto con
los cultivos convencionales. El slo mantener las cajas por varios das, cuando los
cultivos convencionales son negativos, es una costumbre que permite detectar en
ocasiones micosis inesperadas, pues casi todos los hongos desarrollan en agares
convencionales, como el agar sangre, y resisten la temperatura de incubacin de 37
o
C. Sin embargo, siempre conviene sembrar una agar especial para hongos, como el
Sabouraud que deber incubarse por lo menos cuatro semanas, si bien no es muy
necesario sembrar medios selectivos pues estos lquidos generalmente carecen de
flora contaminante. Puesto que es riesgoso trabajar con hongos verdaderos de
micosis profundas, debern abrirse las cajas slo en campana de seguridad biolgica
75

o enviarse a un laboratorio especializado si se observa desarrollo. En estudios de

LCR, se efecta una observacin mezclando una gota del centrifugado de la muestra
con una de tinta china para descartar la presencia de cryptococo.
5.3. Orina
Estos cultivos se solicitan casi siempre en busca de infecciones por Candida, pues
los hongos verdaderos no suelen aparecer en orina, incluso en micosis profundas.
Candida suele desarrollar en el agar sangre que se siembre rutinariamente en los
urocultivos, en donde suele confundirse con estafilococo. Cuando se solicita
especialmente, conviene tambin sembrar un medio de Sabouraud.
5.4. Exudado vaginal
Slo Candida se busca rutinariamente en el exudado vaginal. Sin embargo, debe
decirse que este hongo es parte de la flora vaginal normal de muchas mujeres, por lo
que el cultivo tiene poca utilidad. Sin embargo, la observacin en fresco de levaduras
directamente de la muestra, o su aparicin en la coloracin de Gram, indica su
presencia en cantidad suficiente como para considerarla patgena, por lo que estos
estudios han sustituido al cultivo.
5.5. Secreciones respiratorias
Puesto que estas secreciones pasan por las vas superiores, es importante que se
evale su calidad (abundantes leucocitos, escasas clulas epiteliales) antes de
pretender cultivarlas. Se prefiere la expectoracin matutina. Se persigue Candida
(generalmente pacientes hospitalizados o inmunosuprimidos), Cryptococo o, en
zonas endmicas, Coccidioides.
5.6. Sangre y mdula sea
Cuando el mdico sospecha candidosis diseminada, debe dar aviso al laboratorio
para ventilar los medios convencionales de hemocultivo con una aguja. Es preferible
la toma de estos cultivos en tubos de lisis-centrifugacin (vase seccin de
hemocultivos), de donde posteriormente se sembrar un medio de agar sangre y
Sabouraud, como si fuera una secrecin. Si hay desarrollo de levaduras, se procede
a su identificacin. Si hay desarrollo de un hongo verdadero en las cajas, debern
enviarse a un laboratorio especializado. Incubar al menos cuatro semanas.
5.7. Secreciones purulentas
Estas se siembran bsicamente para descartar la presencia de abscesos por
Coccidioides en zonas endmicas o esporotricosis. Se siembra como una secrecin
convencional. Si hay desarrollo, debern enviarse las cajas a un laboratorio
especializado. Incubar al menos 4 semanas. Tambin es posible observar las
levaduras directamente de la muestra al aclarar con KOH.
Bibliografa
1. Holmberg K. New diagnostic methods in medical microbiology. Scand J Infect Dis 1982;36:121-6
2. Roberts GD. Laboratory diagnosis of fungal infections. Hum Pathol 1976;7:161-8.
76

6. EL LABORATORIO EN INFECCIONES POR

MICOBACTERIAS
Generalidades
La tuberculosis es sin duda la enfermedad infecciosa ms prevalente en el mundo.
A pesar de esto, nuestros laboratorios no han generado la capacidad de cultivar
micobacterias. En los pases en desarrollo se generan frecuentemente cepas
resistentes a antifmicos ante las limitaciones diagnsticas del sistema de salud y
falta de apego a los tratamientos por parte de los pacientes y mdicos tratantes.
Cada laboratorio que procesa muestras en microbiologa recibir eventualmente
alguna de stas y al menos deber conocer algunos de los fundamentos del
proceso de recoleccin y cultivo de micobacterias. Para ello abordaremos en este
manual algunos procedimientos, puesto que cada laboratorio ha de participar hasta
la medida de sus posibilidades en la tarea diagnstica hasta donde est en sus
posibilidades.
6.1. Recoleccin de muestras
Para obtener resultados ptimos, hemos de procurar que las muestras renan las
siguientes condiciones:
Que sean tomadas antes de iniciar el tratamiento; aun unos cuantos das de
tratamiento podrn inihibir el desarrollo de micobacterias y lo que llevar a serias
dudas en el diagnstico. Recoja las muestras en contenerdores plsticos limpios,
estriles y desechables. De no ser as posible, utilice contenedores de vidrio que
hayan sido sometidos a limpieza y esterilizacin profunda.
Que se obtengan una serie de tres a seis muestras individuales, nicas
matinales en das suscesivos.
Que se transporten inmediatamente al laboratorio. Refigere (3 a 5 oC) por un
mximo de 48 horas si no pueden ser entregadas o procesadas en el momento.
Selle y empaque los contenedores de manera cuidadosa para evitar fugas o
ruptura durante su transporte.
6.2. Enfermedad pulmonar
Aunque Mycobacterium tuberculosis tiene la capacidad de producir enfermedad en
cualquier rgano, al menos 85% de stas afectan los pulmones. De ah que la
mayora de las muestras provienen de secreciones pulmonares, que se han obtener
de diferentes maneras:
Esputo. Para obtener una muestra deseable se deber instruir al paciente en el
sentido de:
Enjuage bucal con agua antes de recolectar el esputo. Esto reducir el nmero
de partculas de alimento y medicamentos que pudieran afectar el proceso. La
saliva y moco nasofarngeo no son esputo.
Reunir slo materal proveniente de los pulmones despus de tos profunda y
productiva.
La recoleccin del esputo deber hacerse en contenedores adecuados. El nmero de
muestras a procesar depender de los resultados de las bsquedas previas de

77

bacilos cido-alcohol resistentes (BAAR). Cuando al menos dos de tres muestras

han sido positivas, entonces tres muestras sern suficientes para el cultivo. Si
ninguna o slo una de tres ha sido positiva, se necesitan ms para establecer el
diagnstico (habitualmente seis). Si el paciente produce muy poca expectoracin se
puede hacer una recoleccin de 24 horas; sin embargo sta tendr mayores
posibilidades de resultar contaminada, por lo que es poco recomendable
Esputo inducido. La inalacin de solucin salina en aerosol genera la suficiente
irritacin como para inducir muestras tiles. Este tipo de muestras suelen ser
lquidas y asemejarse a saliva, por lo que debern ser etiquetadas como muestra
inducida. De esta manera no debern desecharse para ser procesadas como
esputo.
Lavado gstrico. Este tipo de muestra debe ser obtenida en caso no no poder
obtener los anteriores. Para resultados ptimos el paciente deber hospitalizarse la
noche anterior; temprano en la maana antes de que el paciente se levante o coma
la muestra deber obtenerse luego de colocar una sonda nasogstrica.
Lavados bronquiales, biopsias y aspirados transtraqueales. Generan no slo
una muestra til, sin que inducen la produccin natural de esputo de tal manera que
ms muestras podrn ser obtenidas para proceso.
6.3. Enfermedades extrapulmonares
Dos grupos de muestras podrn obtenerse de enfermedades extrapulmonares;
aspticas y muestras potencialmente contaminadas con flora del sitio en que son
obtenidas.
6.4a. Especmenes aspticos -fluidosLas muestras de lquido (cefaloraqudeo, pleural, pericrdico, sinovial, pus, o sangre
y mdula sea) podrn contener pequeas cantidades de micobacterias por lo que
es posible que los mejores resultados se obtuvieran mediante el cultivo de grandes
volmenes en medios lquidos (Middlebrook 7H-9, Dubos Tween o Proskauer-Beck)
en relacin de volumen 1/5 o 1/10. Estas muestras podrn ser inoculadas
directamente y requieren atmsfera rica en CO2 a 35 - 35 oC y someterlas a agitacin
manual suave diariamente.
Cada semana estas muestras debern ser sometidas a bsqueda de BAAR para
sembrarlas una vez que sea positiva la bsqueda. Al cabo de cuatro semanas de
negatividad se recomienda sembrar el sedimento producto de centrifugacin a
3,000g. Aquellas muestras que pudiesen coagularse espontneamente debern ser
adicionadas de heparina (0.2mg/mL) al momento de la toma.
El uso de la tcnica de lisis-centrifugacin ha mostrado particular utilidad en el caso
de sangre o mdula sea de pacientes con SIDA e infeccin por micobacterias no
tuberculosas. A 10 mL de sangre colocada en un tubo Isolator se le agita
manualmente de manera suave y se le deja por una hora para completar la lisis de
los elementos formes. La muestra es sometida a centrifugacin (3,000g) para
sembrar 1.5 a 2 mL en medios slidos. Es factible que sta tcnica fuese aplicable
78

para otro tipo de muestras lquidas y puede recomendarse para todos los laboratorios
que slo cuenten con medios slidos como el Lowenstein-Jensen.
6.4b. Especmenes aspticos -tejidos slidosEste tipo de muestras no debern ser conservadas o fijadas antes de su envo. Ser
suficiente la refrigeracin previa. Para las muestras slidas deber, mediante un
mortero estril, obtenerse un fluido capaz de ser colocado en los medios de cultivo
slidos. La adicin de solucin salina estril o albmina puede facilitar la tarea. En el
caso de recibir muestras de las que no se puede asegurar su esterilidad, se
recomienda dividir la muestra licuada para siembra directa y siembra despus de
descontaminacin. La siembra en medios lquidos de respaldo pudiera aplicarse en
este proceso como antes se ha descrito.
6.4c. Especmenes potencialmente contaminados
La mayora de las muestras recibidas en el laboratorio caen en esta categora.
Debern ser manejadas como esputo. En esta categora cae la orina y todas
aquellas muestras de las cuales no se puede asegurar la toma o transporte estriles.
Se requieren dos procedimientos bsicos: la descontaminacin (a fin de eliminar
otros elementos bacterianos viables) y la centrifugacin (para concentrarlas). Para
digerir y eliminar las bacterias y moco acompaantes se suele utilizar hidrxido de
sodio slo o adicionado de N-acetil-L-cistena (NALC). Brevemente los
procedimientos de centrifugacin/digestin y descontaminacin sern descritos.
Centrifugacin/Digestin La eficiencia mxima del proceso de centrifugacin estar
en relacin con la capacidad para concentrar la mayor proporcin de micobacterias y
que stas permanezcan viables. Someter a elevadas fuerzas gravitacionales a
cualquier microorganismo pudiera bien concentrarlo, pero la friccin inducida afectar
su viabilidad.
Si a esto agregamos el efecto txico de las soluciones
descontaminantes, el proceso podra esterilizar por completo las muestras. Por ello
en lo general se recomienda el uso de centrfugas refrigeradas y soluciones alcalinas
con pH controlado. Las siguientes son recomendaciones generales estimar la fuerza
gravitacional a emplear y la preparar las soluciones empleadas en la digestin.
1) Prepare alcuotas de 10 mL de NaOH/Citrato de Sodio en condiciones de
esterilidad. Esta solucin deber manetener pH cercano a 6.8; esto se logra
con la preparacin mediante la siguiente tabla:

79

Tabla 1. Preparacin de solucin decontaminante/digestiva NALC-NaOH

Volumen de solucin a 4% Na OH* mL 2.9% Citrato de Sodio Agregue NALC
preparar (mL)
2H2O **mL
50

25

25

0.25

100

50

50

0.50

200

100

100

1.00

500

250

250

2.50

* Agregue 4.0 g de NaOH a 100 mL de agua destilada

** Agregue 2.9 gr de citrato de sodio dihidratado (o 2.6 g de citrato de sodio anhidro) a 100 mL
de agua destilada.

2) Estime la fuerza gravitacional de su centrfuga para alcanzar 3000g durante 25

a 30 min, habitualmente 2000 rpm (o el mximo de rpm de su centrfuga). La
temperatura a fijar en la centrfuga deber ser entre 4 y 6 oC. Para el clculo
de la fuerza centrfuga relativa (RCF) es aplicable la siguiente frmula:

RCF= (1.12) (R max) (rpm/1000)2

En donde R max es el radio mximo de los cabezales de la centrfuga en milmetros
y rpm el nmero de revoluciones por minuto. El resultado obtenido ser en unidades
gravitacionales g. Para estimar el nmero de rpm para generar una fuerza
gravitacional dada la frmula quedara como sigue:
rpm=1000 RCF/1.12 (r max)
A falta de una centrfuga refrigerada deberemos considerar que el tiempo no deber
exceder a 15 minutos dado que la temperatura de la preparacin se ver
incrementada por efecto de la friccin. El incrementar el nmero de rotaciones por
minuto y aplicar tiempos menores podr tener tan buenos efectos como aquellos
conseguidos con centrfugas refrigeradas. Recuerde siempre que tanto los tubos
utilizados como la centrfuga debern ser capaces de contener los aerosoles
potencialmente infectantes. Idealmente los tubos a utilizar debern estar diseados
con capacidad alta (50 mL) que toleran altas fuerzas gravitacionales, stos suelen
ser plsticos de fondo cnico y tapn de rosca.
Otras soluciones que se pueden utilizar para la digestin /decontaminacin seran
el Z-TSP, Hidrxido de Na de Petroff, Acido oxlico o bien Acido sulfrico. Sin
embargo, en nuestra experiencia, es ms controlable y econmico efectuar los
procedimientos antes mencionados.
6.5. Siembra
El diagnstico definitivo de las enfermedades causadas por micobacterias es la
recuperacin en cultivo y su identificacin. Comnmente se utiliza el medio de
Lowenstein-Jensen (LJ), medio que contiene bsicamente huevo y verde de
malaquita. Estos medios tiene como ventaja el hecho de que pueden ser
almacenados por tiempos prolongados sin deterioro por la prdida de humedad y en
lo general son ms accesibles comercialmente. Como desventajas mencionaremos
80

la dificultad para prepararlos y que, de sufrir contaminacin, la superficie completa

ser cubierta por otros grmenes.
Existen medios lquidos y otros slidos como el Middlebrook que contiene una base
de agar. Las ventajas de estos radican bsicamente en la facilidad para observar el
desarrollo de las colonias toda vez que se trata de medios transparentes. Las
desventajas radican en su labilidad a la desecacin y que, si se exponen de manera
prolongada a la luz se generaran gases de formaldeido suficientes para inhibir el
desarrollo de las micobacterias. Adems, la preparacin y limitado acceso en el
mercado podran generarle dificultades.
Las muestras a manejar podrn ser inoculadas directamente, unas cuantas gotas
distribuidas homogneamente en la superficie del medio sern suficientes. Despus
de unos minutos ser absorvida por el medio y la muestra aparecer escasamente
sobre la superficie. Si utiliza los tubos de LJ, mantgalos en posicin ligeramente
inclinada en una jarra con atmsfera rica en CO2 (5% CO2 / 95% aire ambiental; que
se consigue mediante la extincin de una vela). Asegrese de que el tapn de rosca
quede un poco abierto a fin de que la atmsfera de la jarra sea compartida con
aquella de los tubos.
Revise la superficie de los medios incubados cada semana de manera visual y
prepare frotis para bsqueda de BAAR. Al trmino de 10 a 12 semanas podr emitir
los informes de negatividad. Cada semana enve reportes preliminares.
En caso de obtener aislamientos de BAAR informe tales como Mycobacterium sp. y
busque completar identificacin y drogoresistencia a travs de los laboratorios de
referencia de particulares o de la Secretara de Salud.
DIGESTION PARA CULTIVO DE MICOBACTERIAS
EXPECTORACION Y LAVADO GASTRICO.
1. Ponga 10 mL de la expectoracin en el tubo de plstico 50mL. Si el volumen es
menor de 10 mL, complete con agua estril.
2. Agregue 10 mL de NaOH/Citrato de sodio estril (hasta la marca de 20 mL).
3. Agregue una pizca de acetilcistena
4. Deje actuar por 15 minutos exactos, mezcle de tiempo en tiempo por inversin
pero no agite intensamente.
5. Agregue agua estril hasta la marca de 50 mL.
6. Centrifugue por 25 minutos en centrfuga refrigerada, velocidad mxima. Espere
a que la centrfuga pare sola, no use el freno.
7. Tire el sobrenadante en recipiente con antisptico.
8. Agregue 1.5 mL de solucin salina estril.
9. Siembre aproximadamente 100 a 200 microlitros en L-J utilizando una jeringa de
insulina. Incube en C02
10.Haga un frotis del precipitado y tia con BAAR.
11.Enve el tubo a esterilizacin.

81

MUESTRAS DE ORINA.
1.
2.
3.
4.
5.

Tome muestra con tcnica de urocultivo.

En tubo estril de 50 ml centrifugue 20 a 50 mL por 20 minutos.
Deseche el sobrenadante y complete hasta 10 mL con agua estril
Agregue 10 mL de NaOH/Citrato de sodio estril (hasta la marca de 20 mL).
Deje actuar por 15 minutos exactos, mezcle de tiempo en tiempo por inversin
pero no agite intensamente.
6. Siga el procedimiento de expectoraciones a partir del paso 5.
BIOPSIAS.
1. Recorte pequeos trozos y muela en mortero estril con un poco de solucin
salina.
2. Coloque el macerado en un tubo y agregue el mismo volumen de NaOH/Citrato
de sodio
3. Espere 15 minutos y agregue agua 1:1.
4. Si la biopsia est en el fondo no requiere centrifugar. Si se suspendi,
centrifugue por 10 minutos.
5. Tire el sobrenadante y agregue 1 mL de solucin salina.
6. Siembre como en expectoraciones.
SANGRE .
1. Solicite muestra en tubo de lisis-centrifugacin de adulto, centrifugue y siembre
directamente micobacterias y hongos.
MEDULA OSEA
Solicite muestra en tubo de lisis-centrifugacin de nio (Isolator 1.5). Siembre
directamente.

Bibliografa
Public Health Mycobacteriology. A guide for the level III laboratory. Kent BT, Kubica GP. CDC
Atlanta GA 1985.

82

7. ESTUDIOS PARA ANAEROBIOS EN LABORATORIOS

GENERALES
Generalidades
La inexperiencia del personal de muchos laboratorios, el tiempo y costos de los
procesos, los requerimientos para la toma y transporte de la muestra, aunados a las
dificultades para obtener la especiacin y sensibilidad a antibiticos, han hecho que
se subestime la importancia de los anaerobios en la clnica. Como se ver en este
captulo, estas dificultades no deben ser obstculo para que cualquier laboratorio
estudie e informe racionalmente la presencia de anaerobios, ya que un abordaje que
no pierda de vista la clnica podr vencer fcilmente muchos de esos problemas.
Para fines clnicos, se consideran como anaerobios slo los anaerobios estrictos,
pues si bien muchos grmenes aerobios son anaerobios facultativos (principalmente
las enterobacterias y los cocos grampositivos), las infecciones que causan estos
grmenes son diferentes a las de aqullos. Los anaerobios son los microorganismos
colonizadores ms comunes del cuerpo; en algunos sitios llegan a superar a los
aerobios en proporcin de 1000:1. En cada reservorio, las especies de anaerobios
predominantes son diferentes.
Las infecciones por anaerobios son caractersticamente mezclas polimicrobianas de
microorganismos aerobios y anaerobios de la flora normal, lo que permite que los
primeros consuman el oxgeno y los segundos se aprovechen de esta circunstancia,
en un sinergismo caracterstico. De hecho, los anaerobios se pueden considerar
como oportunistas; generalmente son causa de infecciones endgenas que se
producen al romperse barreras mucosas o cutneas por necrosis, tumores, trauma,
diabetes, etc. Al romperse la barrera, los anaerobios se diseminan y colonizan tejidos
adyacentes normalmente estriles. Por fortuna, los tejidos tienen un alto potencial de
xido-reduccin, lo que inactiva rpidamente a los anaerobios. Las infecciones
anaerobias monomicrobianas son relativamente raras y comnmente privativas de
gangrena gaseosa, ttanos (clostridios), actinomicosis y colitis por Clostridium
difficile. As pues, debe sospecharse la presencia de anaerobios cuando la coloracin
de Gram del espcimen muestre flora polimicrobiana. Clnicamente, se sospecha que
una infeccin incluye anaerobios si existe olor ftido o produccin de gas, la infeccin
aparece cerca de superficies mucosas o tejido muerto, o si se obtiene un cultivo
convencional negativo de una rea claramente infectada, en cuyo caso la coloracin
de Gram mostr la mencionada flora polimicrobiana.
7.1. Toma de la muestra
Para demostrar una infeccin por anaerobios deben utilizarse tcnicas especiales
para la recoleccin, transporte y proceso de la muestra. Para la recoleccin es de
vital importancia evitar la contaminacin con la flora adyacente, por lo que el mtodo
preferido es la puncin con jeringa de un material contenido en espacio cerrado,
expulsando el aire de la jeringa y vacindolo en medio de transporte especial.
Muchos mdicos desconocen estos sencillos procedimientos y vacan muestras
adecuadas de la jeringa a tubos ventilados, destruyendo los anaerobios. Por ello,
cuando no se dispone de medio de transporte especial para anaerobios (lo cual es

83

muy comn en laboratorios generales) debe transportarse de inmediato la jeringa al

laboratorio pues el propio material purulento es un medio de transporte adecuado.
(Sin embargo, por cuestiones de seguridad, algunos laboratorios tienen por norma no
recibir muestras en jeringa).
Es importante no sembrar muestras inadecuadas para evitar gastos innecesarios y
dar informacin que desoriente. En nuestro laboratorio sembramos rutinariamente
para anaerobios slo las siguientes muestras:
Secreciones aspiradas con jeringa
Biopsias
Aspirados transtraqueales o transparietales (pared torcica)
Grnulos sulfurosos de pacientes con sospecha de actinomicosis.
Slo cuando el clnico lo considera necesario, se siembran los cultivos de sangre.
Otros lquidos corporales se siembran para anaerobios slo cuando son purulentos.
Antes de continuar con los mtodos para obtener la atmsfera anaerobia debemos
recordar que todo cultivo de anaerobios debe precederse de una coloracin de
Gram, pues la sola presencia de flora polimicrobiana sugiere su existencia.
7.2. Mtodos para el estudio de anaerobios
Es comn que se crea que una atmsfera anaerobia es slo la falta de oxgeno, pero
esto es un error, pues se requiere adems de un bajo potencial de xido-reduccin.
Histricamente, los anaerobios se estudiaron primero en medios lquidos a los que se
les agregaban sustancias reductoras, como el tioglicolato o la carne molida. Sin
embargo, los medios lquidos no permiten la observacin y discriminacin de las
colonias que es posible en medios slidos en caja de Petri. Por ello, actualmente se
prefiere la siembra en atmsfera anaerobia que permite sembrar medios slidos
adems de los medios lquidos de respaldo.
De todos los mtodos empleados para obtener la atmsfera anaerobioa el de uso
ms comn en laboratorios generales es, sin duda, la jarra de anaerobios en la que
se colocan sobres generadores de gas y un catalizador. Nosotros lo recomendamos
tambin porque es de bajo costo, fcil operacin y poco requerimiento de espacio.
7.3. Medios para la siembra
Se dispone en el comercio de muchos medios para el desarrollo de anaerobios,
como el agar sangre enriquecido con vitamina K, pero en nuestro laboratorio
sembramos las muestras en agar sangre convencional, agar feniletilalcohol (inhibe el
desarrollo de gramnegativos aerobios) y en caldo de tioglicolato. Es una buena
alternativa siempre y cuando se encuentren previamente reducidos en anaerobiosis.
Por ello, cuando llega una muestra y los medios no estn preparados, es preferible
primero prerreducirlos por una hora en la jarra de anaerobios, pues si se toman
directamente del refrigerador estarn oxigenados y pueden causar la muerte de los
anaerobios de la muestra.
Una vez sembrada la muestra en los medios prerreducidos, se cierra la jarra y se
espera entre 48 y 72 h antes de observar el crecimiento. Siempre que se efecta un
cultivo de anaerobios debe hacerse tambin la siembra en aerobiosis y en jarra con
84

vela, pues esto sirve de control para descartar la existencia de aerobios o grmenes
exigentes de CO2.
7.4. Interpretacin de los cultivos
Al interpretar los cultivos, debe poderse responder inicialmente la pregunta: Existen
anaerobios en la muestra? La respuesta ser afirmativa cuando haya desarrollo en
anaerobiosis, pero no en aerobiosis, o bien, cuando en anaerobiosis desarrollan
grmenes distintos a los que aparecen en aerobiosis. Esta situacin existe, por
ejemplo, cuando en anaerobiosis hay desarrollo de gramnegativos que no
aparecieron en el MacConkey. La prueba definitiva para asegurar que un germen es
anaerobio se obtendr al resembrar la colonia en aerobiosis y en CO2, observando la
ausencia de desarrollo. Desde luego la sola presencia de flora polimicrobiana en las
tinciones permite sospechar anaerobios con anticipacin y enviar un informe
preliminar.
Conocer la existencia o ausencia de anaerobios resulta de gran utilidad para el
clnico, ya que su presencia generalmente indica la necesidad de retirar tejido muerto
o de drenar colecciones purulentas. Adicionalmente, habrn de agregarse
antibiticos eficaces contra estos grmenes.
7.5. Informe de anaerobios y sensibilidad a antimicrobianos
Identificar con precisin un anaerobio e informar su patrn de sensibilidad no es tarea
fcil y generalmente se reserva para laboratorios especializados. El tiempo y costo
de los procedimientos limita su utilidad clnica pues los resultados se informan
generalmente una semana despus de obtenida la muestra. Esto causa desilusin
en algunos laboratorios que deciden olvidarse de los anaerobios. Conviene entonces
abrir un parntesis para hablar de la utilidad clnica de los resultados de cualquier
laboratorio. EL SOLO INFORME DE QUE LA MUESTRA CONTIENE ANAEROBIOS
SUELE RESOLVER EL PROBLEMA DIAGNOSTICO. De este modo, casi nunca se
requiere de una identificacin fina si consideramos que se conoce la bacteriologa
usual de los diferentes tipos de infecciones causadas por anaerobios y que los
patrones de sensibilidad antimicrobiana estn convencionalmente aceptados de
acuerdo con la experiencia de laboratorios especializados y, sobre todo, con la
experiencia clnica. Adems, no existe una razn epidemiolgica para la
identificacin pues las infecciones por anaerobios son predominantemente
endgenas. El clnico puede elegir fcilmente el antibitico adecuado, toda vez que el
laboratorio haya informado la presencia de anaerobios y sus caractersticas en la
coloracin de Gram, de acuerdo con conocimientos convencionales de sensibilidad,
como lo muestra la tabla siguiente.

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TABLA 1. Sensibilidad de bacterias anaerobias

Todos los ANE
B. fragilis
Penicilina
++
Tetraciclina
++
Cloramfenicol
++
Clindamicina
++
++
Metronidazol
++
ANE: Anaerobios no esporgenos

++

Como puede verse, el clnico requiere saber, adems de la presencia de

anaerobios, si alguno de ellos sugiere ser B. fragilis, puesto que, con excepcin de
este germen, los anerobios suelen ser sensibles a penicilina y tetraciclina. Es por
ello que el informe definitivo es algo como lo siguiente:
El cultivo desarroll anaerobios estrictos, que incluyen Bacteroides. Se recomienda
utilizar clindamicina o metronidazol
7.5. Conclusiones
De acuerdo con lo anterior, se pueden proponer algunas conclusiones importantes
para el clnico y el laboratorio:
1. Cualquier laboratorio clnico debe estar capacitado para ayudar al mdico en el
estudio de infecciones por anaerobios.
2. Para el estudio de anaerobios no es indispensable contar con instalaciones o
personal especializados. Lo substancial puede resolverse con equipo de costo
bajo y, sobre todo, con la comunicacin con el clnico.
3. Toda vez que puede establecerse la presencia de anaerobios y sus
caractersticas en la coloracin de Gram, el problema diagnstico suele estar
resuelto para los fines clnicos.
4. Tambin para los fines clnicos, generalmente no es necesario utilizar los
servicios de laboratorios especializados para establecer especie y patrn de
sensibilidad antimicrobiana de los anaerobios.
Bibliografa
1. Bartlett JG, Sullivan-Sigler N, Louie TJ, Gorbach S. Anaerobes survive in clinical specimens
despite delayed processing. J Clin Microbiol 1976;3:133-37.
2. Macas Hernndez AE, Hernndez Ramos I, Medina Valdovinos H. Anaerobios en laboratorios de
recursos limitados: Sugerencias para optimizar su estudio. Enf Infec Microbiol 1992;12:239-45.
3. Swenson RM, Lorber B. Speciation of anaerobic bacteria: A clinically based rationale. In: Lorian V
(Ed.). Significance of Medical Microbiology in the Care of Patients. The Williams and Wilkins Co,
Baltimore, 1977:104-114.

86

8. SENSIBILIDAD A ANTIBIOTICOS
Generalidades
Existen una serie de estudios que ayudan al clnico a definir el plan con respecto al
tratamiento antimicrobiano. Estos estudios pueden clasificarse en seis categoras:
1.
2.
3.
4.

Sensibilidad de los microorganismos a los antimicrobianos.

Determinacin de la actividad bactericida del antimicrobiano.
Sinergia en la actividad de diferentes antimicrobianos.
Actividad de beta lactamasa por diferentes microorganismos ante antibiticos
beta lactmicos.
5. Determinacin de la actividad bactericida del suero o prueba de Schilchter.
6. Concentracin del antimicrobiano en los diferentes tejidos humanos.
Puesto que es prcticamente la nica prueba a realizar en los laboratorios
generales, en este captulo nos referiremos nicamente a la primera de estas
categoras, o sea, a la sensibilidad in vitro a los antimicrobianos, lo cual se conoce
en microbiologa clnica como antibiograma. La necesidad de estas pruebas surgi
con el advenimiento de la antibioticoterapia y con la presencia, cada vez ms
comn, de cepas de microorganismos resistentes, por lo cual el tratamiento
emprico tena que suplirse por uno ms fundamentado. Para escoger el
antimicrobiano adecuado para un tratamiento hay que tomar en cuenta diferentes
variables que rigen tambin las decisiones al realizar un antibiograma, stas
pueden ser inherentes al paciente, al microorganismo y al antibitico. A
continuacin enumeramos algunas de ellas:
Paciente Estado general de salud. Estado especfico de algunos rganos,
principalmente hgado y riones. Estado inmunolgico. Sitio y gravedad de la
infeccin. Antecedentes alrgicos a antimicrobianos.
Microorganismo Virulencia de la cepa. Resistencia conocida a algunos
antimicrobianos, o facilidad para adquirirla. Lugar de procedencia del
microorganismo (nativo o intrahospitalario).
Antimicrobiano Vas de administracin y excrecin. Vida media. Biodisponibilidad.
Efectos secundarios. Costo.
Existen varios mtodos para medir la sensibilidad de un microorganismo a un
antimicrobiano. Estos son: la dilucin en caldo, la dilucin en agar, la difusin en
agar mediante discos impregnados con antimicrobianos y la dilucin en lquido o
agar mediante discos con antimicrobiano. Finalmente, existen los sistemas
automatizados por microdilucin en tubos, que se reservan para instituciones que
procesan un gran nmero de antibiogramas. Por la facilidad en su procedimiento,
por su costo, y porque nos brinda resultados que han mantenido una buena
correlacin con la curacin clnica durante muchos aos, nosotros utilizamos la
prueba de difusin en agar mediante discos con antimicrobianos, tambin conocida
como prueba de Kirby-Bauer.

87

8.1. Sensibilidad por difusin en placa (Kirby-Bauer)

Hay que hacer nfasis en que una prueba de susceptibilidad a los antimicrobianos
por el mtodo de Kirby-Bauer debe de realizarse para microorganismos que tengan
un tiempo de crecimiento de 18 a 24 horas y que puedan crecer en aire atmosfrico.
Adems, para la realizacin de estas pruebas y para obtener resultados
reproducibles con los realizados en otros laboratorios y que estos puedan ser
confiables, hay que seguir ciertas normas ya establecidas en lo concerniente al tipo
de medio de crecimiento (Mueller Hinton), pH y concentracin de cationes del mismo,
atmsfera y temperatura a las cuales se debe incubar, tipo y cantidad de inculo para
su siembra, as como concentracin estandarizada de los antibiticos.
De todos los microorganismos patgenos, existen algunos para los cuales no es
necesario realizar una prueba de sensibilidad debido a que han mantenido, salvo
raras excepciones, un patrn homogneo de susceptibilidad a determinados
antibiticos. Un ejemplo de este tipo de grmenes es el Streptococcus pyogenes. Los
grmenes a los que regularmente se les realiza el antibiograma, tomando en cuenta
que se han obtenido de algn lugar en el cual estn produciendo una infeccin, son:
Enterobacterias, Pseudomonas, Acinetobacter, Estafilococos y Enterococos.
Asimismo, puede realizarse el procedimiento para microorganismos que requieran de
nutrientes o condiciones atmosfricas especiales para su crecimiento siempre y
cuando est bien estandarizado; dichos microorganismos son: Hemophilus
influenzae, Neisseria gonorrhoeae, Streptococcus pneumoniae y anaerobios.
La seleccin del antibitico debe realizarse conforme a la sensibilidad conocida del
germen en cuestin y puede realizarse de dos formas, la primera es con base en
grupos de antibiticos (panel) dependiendo de si el germen es grampositivo o
negativo, o bien si pertenece a un grupo bacteriano especfico (v.gr. Estafilococos), o
si est produciendo una enfermedad en algn sitio en particular (v.gr. vas urinarias).
El segundo es en base a la divisin de los antibiticos en cuatro grupos:
a) Antimicrobianos que se incluyen en forma rutinaria contra diversos agentes,
sobre todo en infecciones comunitarias.
b) Antimicrobianos contra agentes de importancia en infecciones nosocomiales, lo
que los hace rutinarios en el laboratorio de hospital.
c) Agentes alternativos contra grmenes muy resistentes, sobre todo en lugares
donde se presentan epidemias, o bien con fines de investigacin epidemiolgica.
d) Antibiticos contra agentes obtenidos de vas urinarias.
Nosotros utilizamos ambas formas para la seleccin de los antibiticos en nuestras
pruebas de susceptibilidad, dependiendo del germen y de la procedencia de la
muestra. Es importante la comunicacin con los clnicos, para asegurarse de estar
procesando los antibiticos que a ellos interesen ms.
8.2. Procedimientos del mtodo de Kirby Bauer
Primero se procede a preparar el inculo, para lo cual existen dos mtodos, el de
crecimiento bacteriano y el de suspensin directa de las colonias. Nosotros
utilizamos el segundo, que tiende a utilizarse ms. Se toman de tres a cinco colonias
del microorganismo a estudiar de un medio que tenga de l8 a 24 horas de
incubacin. Se suspenden en solucin salina estril en un tubo de ensayo, ajustado
88

visualmente a una turbidez de 0.5 de Mc Farland, comparando contra un tubo de

control (esta turbidez es aproximadamente aqulla que es suficiente para verse a
simple vista, pero que permite leer con facilidad un peridico a travs del tubo).
Para inocular el medio de cultivo, se introduce un hisopo en la suspensin, se gira
varias veces dentro y se presiona contra las paredes del tubo al momento de sacarlo,
para exprimir el excedente. Se toma el medio de Mueller Hinton, el cual debe de
tener un pH de 7.2 a 7.4 y 4 mm aproximados de espesor, y se inocula en forma
uniforme rotndolo 60 grados cada vez, para repetir la operacin dos veces ms.
Una vez hecha la inoculacin, se espera por 5 minutos para que el agar se seque y
se procede a colocar los discos con los antibiticos, los cuales han sido escogidos de
acuerdo a los criterios anteriormente mencionados. Estos se pueden colocar
mediante un distribuidor automtico (dispensador multidisco) o uno a uno mediante
una pinza, cuidando de no colocarlos muy cerca el uno del otro para que no
interfieran en la lectura de los halos de inhibicin. La distancia ideal entre el centro de
un disco al otro de 24 mm, por lo que una caja convencional no permite acomodar
ms de seis discos. Las cajas de 150 mm permiten acomodar hasta 12 discos. Hay
que asegurarse de que los discos queden bien presionados en el agar para que la
distribucin del antibitico sea la adecuada. Despus de colocar los discos se
procede a incubar la muestra a 35C para ser examinada despus de 18 a 24 horas.
En este punto conviene agregar que la inoculacin debe hacerse con cepas puras.
En cultivos mezclados, es mejor separar primero las cepas para evitar que el
antibiograma se contamine. Aunque puede requerir un da ms, es mejor hacerlos
as, pues, de otro modo, tendremos una alta proporcin de resultados
indeterminables.
8.3. Lectura de resultados
Al momento de realizar la lectura, hay que asegurarse de que la siembra del medio
sea homognea y de que los bordes de las zonas de inhibicin se observen
claramente, de no ser as, la prueba debe de repetirse. Se debe de medir el dimetro
del halo de inhibicin de borde a borde interno, mediante una regla con aproximacin
al mm o mediante algn aparato de lectura acondicionado para tal caso (calibres
deslizantes). Hay que hacer hincapi en que en algunos casos, como en el de cepas
de Proteus que producen swarming, no se debe de tomar en cuenta ste para
delimitar el halo, sino el margen externo. Debe en este paso confirmarse la pureza de
la cepa pues, si se observan dobles halos, indica mezcla, por lo que ser necesario
repetir la prueba.
8.4. Informe de resultados
Los halos de inhibicin por s solos no tendran ninguna importancia si no hubieran
sido comparados con resultados obtenidos por mtodos de dilucin en caldo y con
las MICs (concentraciones inhibitorias mnimas) para los diferentes antibiticos. Esto
se ha logrado mediante tablas de regresin, las cuales nos dan una idea bastante
cercana de cul ser la actividad del antibitico reportado sobre el microorganismo
en estudio. Para el reporte de los resultados se deben de comparar los dimetros de
inhibicin con las medidas proporcionadas por los fabricantes de los discos, y
dependiendo del tamao de los mismos, reportarse el microorganismo como
89

susceptible, intermedio o resistente. Para evitar confusiones, nosotros preferimos

informar los halos intermedios como resistentes.
En ocasiones, el laboratorio debe informar como resistente a pesar de que se
observe halo adecuado. El caso ms comn es el estafilococo resistente a oxacilina,
en que se informa resistente a todas penicilinas, cefalosporinas o aminoglucsidos,
sin importar los halos. Por otra parte, Salmonella siempre debe informarse resistente
a aminoglucsidos y cefalosporinas de primera generacin.
8.5. Interpretacin de los resultados
Una vez recibido el informe, la decisin de qu antibitico utilizar depender del
criterio del clnico, que deber tomar en cuenta los factores discutidos al inicio.
Citaremos algunos ejemplos. En una infeccin en que la sensibilidad del germen a
los antibiticos sea buena para uno muy txico y otro de menor toxicidad, es
recomendable utilizar el de baja toxicidad. El mismo criterio se usa con el costo:
siempre debe preferirse el ms barato. Por otra parte, en caso de infecciones graves
el criterio predominante debe ser el antibitico que tenga mayor eficacia y mejor
concentracin en el tejido infectado pues vale ms tener un paciente con alguna
secuela por la antibioticoterapia, que uno muerto. Como se puede ver, para que el
clnico norme su criterio requiere de conocimientos generales sobre antimicrobianos,
as como de experiencia, la cual se adquiere con la prctica mdica.
8.6. Control de Calidad
El mtodo de Kirby-Bauer est diseado para el uso de antibiticos individuales y no
se recomiendan los multidiscos, pues sus concentraciones son cambiantes, sobre
todo cuando envejecen. Para asegurarse que los discos que utilizamos tengan la
concentracin adecuada del antibitico (ni menos ni ms) debern efectuarse
pruebas contra cepas conocidas, generalmente E. coli ATCC25922, P. aeruginosa
ATCC27853 y S. aureus ATCC2593.
Bibliografa
1. Bauer AW, Kirby WMM, Sherris JC, Turck M. Antibiotic susceptibility testing by standardized
single disk method. Am J Clin Pathol 1966;45:493-6.
2. Goods GL, Washington JA. Antibacterial susceptibility tests: Dilution and disk diffusion methods.
In Murray PR, Baron EJ, Pfaller MA, Tenover FC, Yolken RH (ed.), Manual of Clinical
Microbiology, 6th ed. American Society for Microbiology, Washington D.C., 1995;1327-41.
3. Sanders WE, Sanders CC. Signifacnce of in vitro antimicrobial susceptibility tests in care of the
infected patient. In: Lorian V (Ed.). Significance of Medical Microbiology in the Care of Patients.
The Williams and Wilkins Co, Baltimore, 1977:186-97.

90

9. EL LABORATORIO EN LAS INFECCIONES

NOSOCOMIALES.
Generalidades
Las infecciones nosocomiales representan un importante problema en todos los
hospitales, ya que afectan entre cinco y 15% de los pacientes internados, se asocian
con prolongacin de la estancia y aumentan la mortalidad, los costos de operacin, el
uso de antibiticos y procedimientos, y desde luego, el sufrimiento del paciente. Para
contar con un programa de control de infecciones nosocomiales se requiere un
laboratorio de microbiologa clnica que apoye al comit de control de infecciones
intrahospitalarias en la realizacin de diversas actividades, que describiremos
posteriormente. Es indispensable que el laboratorio sea manejado por personal
calificado y sensibilizado para conocer la importancia de su trabajo. La mayora de
los hospitales en pases en desarrollo cuentan con un laboratorio general, donde el
laboratorio de microbiologa clnica es slo una seccin manejada por personal sin
contacto con los problemas clnicos y con funciones meramente tcnicas. Con
frecuencia en el hospital no existe siquiera una enfermera dedicada a la vigilancia y
control de las infecciones. Por ello, debemos anotar que, para lograr un control de las
infecciones nosocomiales debe lograrse una coordinacin entre los clnicos, las
enfermeras y el personal del laboratorio de microbiologa, con participan activa dentro
del comit.
Para el comit, la comunicacin con el laboratorio permite evaluar los resultados de
los estudios microbiolgicos, sugerir el tipo de muestras necesarias para confirmar
infeccin o simple contaminacin, y hacer recomendaciones especficas en el manejo
adecuado de las muestras clnicas. Por su parte, para el clnico representa ventajas
como: promocin de educacin del personal mdico y de enfermera en el rea de
microbiologa, y fomento del empleo de mtodos de diagnsticos nuevos y
econmicos. Finalmente, esta comunicacin es un canal por el que se van definiendo
los manejos de las muestras (inters clnico o inters epidemiolgico), la
identificacin y el tipo de sensibilidad antimicrobiana.
Un ejemplo puede mostrar la importancia de la comunicacin: suponga que en un
hospital aparece una epidemia de infecciones de sangre. Inicialmente, el laboratorio
encuentra dos o ms hemocultivos para un mismo germen. El personal del
laboratorio, o la enfermera encargada del control, alertan a los clnicos sobre la
necesidad de tomar hemocultivos a todos los pacientes febriles sin foco infeccioso
evidente. Al persistir el aislamiento inusual en hemocultivos, el comit de infecciones
establece programas emergentes de vigilancia y control. Si los hemocultivos
sospechosos provienen de una zona especfica del hospital, se buscan all los
factores causales (personal inexperto, equipos contaminados, relajacin de las
medidas de control). Si provienen de zonas diversas (como pediatra y medicina
interna), se buscan condiciones generales como soluciones parenterales
contaminadas o contaminacin del sistema de agua potable, etc. Puede observarse
que slo la interrelacin puede limitar tempranamente estos problemas que, de otra
forma, terminan slo con el agotamiento de susceptibles, que es una forma elegante

91

de llamar al egreso o la muerte de los pacientes en riesgo. Tambin puede

observarse que, en ocasiones, la toma de cultivos tiene un inters de grupo.
9.1. Participacin del laboratorio en el comit de infecciones
El laboratorio, a travs de un representante, debe siempre participar en el comit;
entre ambos establecern el panel de antibiticos para incluir en las pruebas de
sensibilidad y la definicin de muestras adecuadas o inadecuadas, as como el tipo
de cultivos a efectuar. Entre ambos debe evaluarse la carga de trabajo para el
laboratorio y la utilidad de los estudios, as como la gestin de fuentes alternas de
recursos para evitar su cobro a los pacientes o la merma significativa de los recursos
del laboratorio en las instituciones.
9.2. Qu hacer si en su hospital no existe un comit de infecciones?
La respuesta debe ser directa: sugiera de inmediato la instalacin de uno, en el
que est representado cada uno de los servicios, el laboratorio y el representante de
la direccin. Prcticamente nada trascendente puede hacerse de otra manera. Debe
iniciarse por conocer el problema; no es raro que los hospitales que carecen de un
comit informen tasas bajas de infeccin: es ms bien la regla pues, cuando no se
les busca con intencin, las infecciones nosocomiales parecen no existir. De hecho,
siempre que se inician las funciones de un comit de infecciones debe advertirse a
las autoridades del hospital que aparecer informacin hasta entonces inexistente,
que debe manejarse con discrecin y diplomacia para evitar problemas: los
hospitales gubernamentales temen acciones superiores y los privados, alarma entre
sus clientes (Esto puede causar que se frustre la integracin del comit!). Si trabaja
usted en el laboratorio, sugiralo a los clnicos ms interesados; si se desempea en
la clnica, comntelo con el jefe del laboratorio.
Los sistemas de vigilancia que se emplean en cada hospital varan en relacin con el
nmero de camas, el tipo de pacientes y la cobertura que se desea (es decir, si no se
cuenta con personal, vigile al menos las reas de mayor riesgo, como las unidades
de cuidados intensivos y recin nacidos). Los sistemas ms utilizados son los de
visita en el laboratorio, en donde se detectan los cultivos positivos de sangre, orina o
secreciones, dos o tres veces por semana, lo que permite detectar hasta el 80% de
las infecciones nosocomiales, as como problemas de alta contagiosidad, como la
hepatitis B o infecciones por bacterias multirresistentes (como bacilos gramnegativos
resistentes aminoglucsidos o estafilococo resistente a meticilina). Adems, esta
visita al laboratorio tiene por objeto definir si el microorganismo es infectante o
colonizante, para indicar medidas especficas con oportunidad, y evitar riesgos de
infeccin en otros pacientes. Por otra parte, un enfermera entrenada en
epidemiologa debe visitar las salas de internacin, para detectar otras infecciones
mediante entrevistas con el personal o revisin de la curva de temperatura de los
pacientes, anotando en un sistema de tarjetas.
Es necesaria la jerarquizacin de los procedimientos y estudios que se realizarn
para la deteccin o seguimiento de un problema epidmico o endmico porque, con
relativa frecuencia, se solicitan al laboratorio diversos estudios como la toma de
cultivos farngeos, nasales o cutneos al personal, muestreos bacteriolgicos de
materiales esterilizados, anlisis microbiolgico del agua o del aire, as como una
92

diversidad de estudios de superficies inanimadas. Estos estudios son una gran carga
de trabajo para el laboratorio, incrementan exageradamente los costos de operacin
y generan informacin abundante pero poco til. Tambin puede ocurrir la aparicin
de falsos brotes a consecuencia de defectos en el manejo de las tcnicas para la
identificacin bacteriana (como aumento del nmero de hemocultivos positivos
debido a contaminacin cruzada dentro del laboratorio). Por ello, la acciones
unilaterales, clnicas o de laboratorio, suelen ser contraproducentes.
9.3. Funciones especficas que debe apoyar el laboratorio para el control de
las infecciones nosocomiales
Para que el laboratorio sirva de apoyo al sistema de vigilancia de infecciones, es
necesario tener un control estricto en las siguientes actividades:
Toma y transporte de la muestra La toma y transporte de las muestras son factores
vitales para el aislamiento de los patgenos. Incide tambin en la optimizacin de los
recursos, al evitar el procesamiento de muestras inadecuadas. La toma de la muestra
debe hacerse en el sitio adecuado, por ejemplo, si se sospecha meningitis, debe
hacerse puncin lumbar, y no esperar el resultado del hemocultivo para confirmar
infeccin. Adems, el tiempo debe ser el oportuno; por ejemplo, los hemocultivos
deben tomarse en el momento de la fiebre y no despus, ya que las bacteriemias
suelen ser transitorias o intermitentes en la mayora de las infecciones. Adems,
debe emplearse el procedimiento adecuado; por ejemplo, en pacientes con abscesos
es mejor obtener muestras por puncin que esperar al drenaje para enviar el
espcimen en hisopo.
Las muestras deben llegar cuanto antes al laboratorio. Una vez all, deben
procesarse sin demora para evitar contaminacin y asegurar una atmsfera
adecuada a los patgenos. Si la muestra va a enviarse con demora, debe
transportarse en medio adecuado.
Evaluacin inicial de las muestras Todos los laboratorios deben hacer una
evaluacin inicial de las muestras para definir si son adecuadas para cultivo. Las
razones para ello son epidemiolgicas, econmicas, de volumen de trabajo y clnicas.
Los motivos epidemiolgicos son la eliminacin de muestras no significativas o no
indicativas de infeccin con lo que se eliminara el riesgo de incrementar los
grmenes sin significado. En cuanto a la economa, es costoso y poco prctico
procesar muestras de mala calidad, dado lo difcil de su interpretacin para definir
cul es el verdadero patgeno. Las razones clnicas son para definir si el paciente
est infectado o colonizado, y evitar el uso indiscriminado de antibiticos.
Identificacin de los microorganismos
Los grmenes ms comnmente
involucrados en las infecciones nosocomiales son los bacilos gramnegativos
(Klebsiella, Enterobacter, Pseudomonas, Serratia, Proteus, E. coli y Acinetobacter),
seguidos de los estafilococos (incluyendo los coagulasa negativos), enterococos y
Candida. Aunque con menor frecuencia, pueden ocurrir infecciones por Legionella, o
infestaciones por amiba, as como enfermedades virales como herpes, rotavirus o
citomegalovirus.
La identificacin de los grmenes, con gnero y especie permite consolidar el
programa de infecciones nosocomiales, y hace posible definir si un agente especfico
predomina en alguna sala. Esta labor se facilita por el hecho de que ms del 90% de
93

los bacilos gramnegativos de un hospital corresponden a enterobacterias,

Pseudomonas y Acinetobacter. Por otra parte, la mayora de los cocos corresponden
a estafilococos y estreptococos.
Es de particular importancia que el laboratorio est al acecho para detectar
patgenos nuevos, como el estafilococo resistente a meticilina, bacilos
gramnegativos multirresistentes (Pseudomonas, Enterobacter y Acinetobacter),
enterococo y levaduras. En ocasiones, es importante para el clnico saber si dos
aislamientos corresponden exactamente al mismo germen (por ejemplo, cuando dos
pacientes de la misma sala tienen neumona por el mismo germen). Por desgracia, lo
medios para obtener esta tipificacin (anlisis de plsmidos, fagotipificacin,
polimorfismo gentico, etc.) suelen estar fuera del alcance los laboratorios no
especializados. Sin embargo, en cualquier laboratorio puede efectuarse un
resistotipo, es decir, la comparacin de la sensibilidad a antibiticos, o una
identificacin bioqumica.
Investigacin epidemiolgica Los brotes epidmicos aparecen inesperadamente,
por lo que es importante que el laboratorio informe a los clnicos tan pronto como
observe una proporcin desmedida de algn patgeno. Por su parte, el clnico debe
hacer lo propio cuando note un acmulo de casos con caractersticas semejantes.
Sistema de hemocultivos Este rubro mereci mencin aparte puesto que el
diagnstico de bacteriemia se establece en el laboratorio, lo que marca una
diferencia franca con otras definiciones. Es decir, si usted quiere definir infeccin de
herida quirrgica requiere encontrar pus en la herida, y si requiere definir
gastroenteritis debe observar diarrea. Por el contrario, la bacteriemia puede slo
sospecharse clnicamente y debe confirmarse en el laboratorio. Es por ello
imprescindible que el sistema de hemocultivos funcione bien cuando el laboratorio
atiende pacientes hospitalizados (tiempo preciso de toma, volumen adecuado de la
muestra, dilucin suficiente en caldo).
Reporte oportuno de los resultados Los resultados son ms tiles cuanto ms
temprano se informen. Los resultados de identificacin deben informarse de
inmediato al clnico o a la enfermera epidemiloga. Generalmente, la notificacin se
hace primero con una identificacin presuntiva que luego se confirma con el
resultado definitivo.
Estudios en personal del hospital y del medio ambiente Cuando se habla del
papel que le laboratorio debe desempear en el control de las infecciones
hospitalarias, es comn que se piense de inmediato en cultivos del personal o del
medio ambiente. Debe establecerse, sin embargo, que este tipo de estudios
raramente estn indicados y deben limitarse dado su alto costo y dificultad para la
interpretacin. Por excepcin se efectan cuando se busca la participacin de
portadores asintomticos o de fomites en la etiologa de un brote por un germen ya
definido, pero nunca suplen a la necesidad de intensificar las medidas de control y
educacin del personal.
Otras rutinas aceptadas como tiles son el control semanal de eficacia de
esterilizacin de autoclaves, el muestreo de la frmula para infantes, el cultivo del
agua utilizada en hemodilisis. El agua para uso corriente en un hospital puede ser
fuente de infecciones en pases en desarrollo, pero no deben hacerse cultivos
indiscriminados, sino mantener vigilancia cotidiana en el nivel de cloracin. No deben
94

hacerse rutinariamente cultivos ambientales, de productos comerciales estriles o de

equipo respiratorio.
En suma, el laboratorio de microbiologa tiene gran valor en la prevencin y control
de las infecciones nosocomiales, pero no puede trabajar aisladamente. Si no existe
un comit de infecciones que integre las acciones mdicas y paramdicas, poco o
nada puede hacerse.
Bibliografa
1. Herwaldt LA, Wenzel RP. Dynamics of hospital-acquired infection. In Murray PR, Baron EJ,
Pfaller MA, Tenover FC, Yolken RH (ed.), Manual of Clinical Microbiology, 6th ed. American
Society for Microbiology, Washington D.C., 1995;169-81.
2. Isenberg HD. Significance of environmental microbiology in nosocomial infections and the care of
the hospitalized patient. In: Lorian V (Ed.). Significance of Medical Microbiology in the Care of
Patients. The Williams and Wilkins Co, Baltimore, 1977:220-34.
3. Sifuentes-Osornio J. Funciones del laboratorio en el control de las infecciones nosocomiales.
Enfermedades Infecciosas y Microbiologa 1993;13:263-74.

95

10. INMUNODIAGNOSTICO Y SEROLOGIA

Generalidades
El diagnstico microbiolgico por el laboratorio suele hacerse de varias maneras,
siendo las ms comunes:
Identificacin del agente en cultivo Esta tcnica se considera el estndar. Sin
embargo, tiene el inconveniente del tiempo y las dificultades para lograr el desarrollo
de algunos microorganismos (como los virus). Adems, como se mencion al
principio de este manual, es comn que se requiera criterio en su interpretacin pues
no todo lo que crece en cultivo es un patgeno y no todo lo que es patgeno crece en
cultivo.
Identificacin de productos microbianos El ejemplo ms demostrativo puede ser
la capacidad de lisar el limo (protena lbil) por el suero de pacientes con sepsis por
gramnegativos o la identificacin de la toxina de Clostridium difficile en heces en
pacientes con colitis por antibiticos. Estas pruebas se usan poco, pero la segunda
puede ser gran utilidad para limitar el uso indiscriminado de antibiticos en los
hospitales.
Identificacin de anticuerpos especficos contra microorganismos Son las
pruebas ms utilizadas y en las que nos enfocaremos mayormente. Esta rea es la
que se conoce propiamente como serologa. Requiere tambin un criterio para su
interpretacin pues las enfermedades suelen dejar una huella y, en fase aguda, se
requiere de un perodo de conversin (perodo de ventana).
Identificacin de anticuerpos inespecficos (reaccin cruzada) Por coincidencia
biolgica, en algunas enfermedades se producen anticuerpos contra antgenos que
cruzan con el agente biolgico de algunas enfermedades. Los casos clsicos son
las pruebas no treponmicas para la deteccin de sfilis (VDRL y RPR), en las que
se aprovecha que los enfermos generalmente producen anticuerpos que cruzan
contra los extractos de corazn de ternera unida a lpidos (cardiolipina); estos
anticuerpos se conocen como reaginas y no deben confundirse contra la
denominacin de reaginas para referirse a anticuerpos causantes de alergia. Otro
prototipo de anticuerpos en reaccin cruzada es la que los pacientes con tifo
desarrollan contra antgenos del Proteus OX19. Al igual que en pruebas
especficas, se requiere un perodo de ventana.
Identificacin de antgenos especficos Estas pruebas resultan de gran utilidad
pues no requieren perodo de seroconversin ni dejan huella serolgica. La prueba
ms utilizada de este grupo es la deteccin del antgeno de superficie de Hepatitis
B. Utiliza las mismas tcnicas de la serologa, pero muchas pruebas se hacen en
tejidos o productos, como la deteccin del antgeno de rotavirus en heces, de virus
respiratorios en secreciones, o de Chlamydia trachomatis en exudado cervical o
uretral. Mencin especial requiere la deteccin de antgenos de Hemophilus,
neumococo o neisseria en lquido cefalorraqudeo por la tcnica de coaglutinacin o
aglutinacin en ltex. Existen algunas pruebas que pueden efectuarse con
inmunofluorescencia directa sobre un frotis de la muestra (deteccin de Chlamydia,
Herpes, Bordetella)

96

Identificacin de fracciones especficas de cidos nucleicos Estas pruebas

estn causando gran expectativa por el desarrollo de tcnicas como la reaccin en
cadena de polimerasa (PCR). Se describen brevemente en el captulo 11.
El principio de la serologa es simple, es el estudio del suero en busca de
anticuerpos. Las tcnicas serolgicas son muchas, existen pruebas de aglutinacin,
floculacin, precipitacin, inmunoelectroforesis, fijacin de complemento,
inmunofluorescencia directa o indirecta, ELISA, electroinmunotransferencia (mejor
conocida como Western blots), entre otras. Sin duda las tcnicas de aglutinacin y
las de ELISA son las ms difundidas, tanto por su facilidad de realizacin, como por
su bajo costo, lo cual facilita su implementacin en laboratorios de bajos recursos. En
este captulo nos referiremos a estas pruebas as como a un ejemplo de cada una.
10.2. Aglutinacin y precipitacin
En este tipo de reacciones, se utilizan antgenos solubles para buscar anticuerpos en
el suero. Una vez que el reactivo y el suero se ponen en contacto, los anticuerpos
son compartidos por los antgenos, con lo que se logra un conglomerado
(aglutinacin) el cual puede verse a simple vista. El conocimiento de este fenmeno
ayuda a interpretar las reacciones y a comprender por qu, al existir una gran
cantidad de anticuerpos en el suero de un paciente, puede ocurrir el fenmeno de
prozona (aglutinacin negativa cuando hay exceso de anticuerpos). Un ejemplo de
pruebas de aglutinacin son las reacciones febriles, las cuales trataremos en
seguida.
10.3. Reacciones febriles
Son pruebas que se implementaron con el fin de poder discernir, mediante el
laboratorio, sobre la etiologa de un cuadro febril generalmente agudo, en
enfermedades con caractersticas clnicas semejantes. Inicialmente, estas pruebas
se utilizaban para cuatro enfermedades: tifo, tifoidea, brucelosis y tularemia. En la
actualidad, las pruebas son para el diagnstico de: tifo, tifoidea, paratifoidea y
brucelosis. Estas pruebas pueden ser cuantitativas mediante la dilucin del suero en
estudio, con lo cual se puede inferir si existe o no una infeccin actual, o se trata
nicamente de memoria inmunolgica. Los antgenos se encuentran preparados
comercialmente en suspensin acuosa, provistos de un gotero que permite hacer la
dilucin.
10.3.1. Tcnica
10.3.1.a. Prueba en placa
Separar el suero,
En una placa de vidrio, haga una cuadrcula con lpiz graso (cada cuadro debe medir
aprox. 2.5 cm de lado) para formar varias columnas de 5 cuadrados. (Una por cada
reaccin a estudiar).
En cada uno de los cinco cuadrados deposite las siguientes cantidades de suero, con
pipeta manual (evite pipetear con la boca). En cada cuadrado se aadir una gota del
antgeno para obtener la dilucin, segn la siguiente tabla:

97

mL de suero

Antgeno

Dilucin final

1
0.08
1 gota (0.03mL)
1:20
2
0.04
1 gota
1:40
3
0.02
1 gota
1:80
4
0.01
1 gota
1:160
5
0.005
1 gota
1:320
_____________________________________________________________
Los antgenos que se van a utilizar son:
a)
b)
c)
d)
e)

Tfico O
Tfico H
Paratficos A y B
Brucelar (extracto de membrana de Brucella abortus).
Proteus OX19, el cual da reaccin cruzada con algunas ricketsias.
1. Proceder de inmediato a mezclar el contenido de cada cuadro con un aplicador de
madera (uno para cada reaccin), comenzado por la dilucin mayor (1:320->1:20).
2. Mezclar durante tres minutos con suave movimiento de rotacin. Debe leerse de
inmediato, prolongar la observacin ocasiona que algunas reacciones negativas
comiencen a parecer positivas.
3. Informar el ttulo como aqul en el que se obtenga una aglutinacin visible
claramente, para cada reaccin. Si no existe aglutinacin alguna se informa como
negativa. Si existe aglutinacin, se informa el mximo ttulo alcanzado, y nunca como
positiva, pues este criterio depende del clnico. Si existe duda en algn cuadrante, la
reaccin es negativa. Por ejemplo, si encuentra aglutinacin clara en 1:80, pero tiene
dudas en 1:160, se informa 1:80. Este punto es importante, pues generalmente se
procede al contrario, informndose valores inexistentes.

10.3.1.b. Tcnica en tubos

Esta tcnica no se utiliza rutinariamente pues es laboriosa, pero debe
efectuarse para confirmar ttulos positivos en placa, ya que es menos subjetiva y
ms reproducible. Por ello, se considera como el estndar de oro. Es
particularmente til en las reacciones de Brucella.
1. En una serie de ocho tubos numerados, deposite en c/u 0.5 ml se solucin salina al 0.9%.
2. En otro tubo, deposite 0.8 mL de solucin salina, agregndole 0.2 mL del suero en estudio
(dilucin 1:5) y mezcle.
3. Pase 0.5 mL del suero diluido al primer tubo de solucin salina. Mezcle perfectamente y pase 0.5
mL al tubo siguiente. Repita esta operacin hasta llegar al tubo 7. Despus de mezclar este tubo,
se toman 0.5 mL y de descartan.
4. En un tubo aparte, se hace una dilucin del antgeno a estudiar en solucin salina, en dilucin
1:20. Para ello, se aaden 0.020 mL (200 uL) del antgeno a 4 mL de salina.
5. A cada tubo de suero diluido (incluyendo el octavo) se agregan 0.5 mL de la suspensin diluida
de antgeno y se mezcla agitando vigorosamente. En el primer tubo tendremos una dilucin 1:20,
en el segundo 1:40, hasta 1:1280 en el sptimo. El tubo 8 servir como control del antgeno.
6. Se incuba de acuerdo con la siguiente tabla:

98

7.

Antgeno
Brucella
Proteus
Tfico H
Tfico 0 y paratficos

Incubacin
48 h en bao a 37 oC
15-18 h a 37 oC
1-2 h a 37 oC
15-18 h a 50 oC

La reaccin positiva se aprecia por la precipitacin completa de los antgenos

en forma de grumos en el fondo del tubo, quedando totalmente cristalino el
sobrenadante. La reaccin negativa muestra turbiedad semejante a la del testigo
(octavo tubo). Se informa de acuerdo con el mximo ttulo alcanzado.
10.3.2. Consideraciones para la interpretacin adecuada
Las pruebas que detectan anticuerpos, como las reacciones febriles, tienen la
desventaja de requerir un tiempo para que las inmunoglobulinas aparezcan en el
suero. Este tiempo, o perodo de ventana, aunque conocido desde hace varias
dcadas, se hizo de fama cuando se desarrollaron las pruebas para detectar
anticuerpos contra el virus de inmunodeficiencia humana (VIH). Pudo observarse que
cuando un individuo se contagiaba, manifestaba una enfermedad leve con fiebre,
sarpullido y crecimientos de ganglios del cuello; sin embargo, la deteccin de
anticuerpos anti VIH se tornaba positiva entre 3 semanas y 6 meses despus,
cuando generalmente el portador no tena ya molestias. Este perodo de ventana es
variable para cada enfermedad; en las enfermedades agudas es de una a dos
semanas. En las crnicas, puede tomar varios meses. El fenmeno de laboratorio
(cambio de negativo a positivo) se conoce como seroconversin, y para las
reacciones de aglutinacin se requiere de un cambio en la titulacin de cuatro veces.
Por ejemplo, si inicialmente (suero agudo) el ttulo de anticuerpos contra Antgeno H
es de 1:80, se requerir un ttulo mnimo de 1:320 en la segunda determinacin 10
15 das despus (suero convaleciente). Por ello, es difcil determinar cul es el ttulo
positivo de un suero convaleciente, cuando se desconoce el valor del suero agudo,
en cuyo caso se exige un mnimo de 1:320.
El conocimiento de este fenmeno es elemental para saber interpretar las pruebas
serolgicas. Suponga que atiende a un enfermo con cuadro febril de dos das de
evolucin y otros datos clnicos compatibles con tifoidea. Si solicita las reacciones
febriles sern, obviamente, negativas ese da, pues habrn de seroconvertir unos 10
das despus, cuando probablemente el enfermo se encuentre ya sin molestias. Ello
explica por qu las reacciones febriles son uno de los estudios ms mal utilizados en
la prctica mdica: a pacientes con tifoidea se les asegura que no la padecen pues
sus reacciones son negativas. Por otra parte, a pacientes con serologa positiva se
les indica tratamiento para infecciones que pudieron haber curado hace varios aos,
dejando una huella serolgica.
En el caso del tifo existe un problema semejante. Es una enfermedad poco comn en
la actualidad, pero an observamos casos espordicos. El paciente es llevado en mal
estado, con fiebre elevada, sarpullido generalizado y desorientacin mental. Todos
los estudios microbiolgicos resultan negativos, incluyendo las reacciones febriles.
Cuando se indica un tratamiento adecuado (generalmente por un clnico que tiene
99

idea de cmo se interpretan las reacciones febriles) el paciente responde

rpidamente y puede ser egresado. Si se le cita dos semanas despus, acudir sin
molestia alguna, pero el ttulo de OX19 se encontrar generalmente por arriba de
1:640.
Un caso particular es el de las reacciones contra Brucella (prueba de Huddleson),
pues esta enfermedad es de inicio indolente, lo que hace que el enfermo busque
atencin despus de la segunda semana, cuando ya ocurri la seroconversin.
Adems se espera que, al resolverse la enfermedad, el ttulo de la reaccin sea
menor de 1:80. Por ello se dice que, de las reacciones febriles, slo las reacciones de
Brucella son de utilidad en la primera consulta.
Por ltimo, conviene remarcar lo que se coment en las tcnicas: frecuentemente se
dan ttulos falsamente elevados pues se tiende a hacer lecturas tardas o se dan
como positivas aglutinaciones mnimas en placa, sin confirmar en tubo. Por ello, una
gran cantidad de personas reciben tratamiento mltiples por supuesta tifoidea
crnica, o brucelosis crnica, cuando en realidad slo muestran huellas serolgicas
de enfermedades previas ya resueltas. Es comn tambin que se soliciten
reacciones febriles a personas que se sienten crnicamente fatigadas, sin fiebre o
prdida de peso; nunca falta un laboratorio que informe febriles positivas con las
consecuencias en el manejo del paciente. Hemoa conocido pacientes que, despus
de cuatro aos, han recibido ms de 20 esquemas diferentes de manejo contra
tifoidea o brucelosis que no padecen. Paradjicamente, resulta casi imposible
convencer al paciente de que no tiene enfermedad orgnica. Y lo que es peor, es
que tambin resulta imposible convencer a su mdico.
10.4. Tcnica de ELISA
Las siglas quieren decir: anlisis inmunoadsorbente ligado a enzimas, lo cual significa
que se marca un reactivo, generalmente un anticuerpo, con una enzima. El suero
problema se incuba, suponiendo que contiene anticuerpos, con una fase slida que
contiene antgeno. Despus de un tiempo, se lava la fase slida y se incuba con un
antianticuerpo marcado con una enzima. De existir anticuerpos en el suero, stos
debieron pegarse al antgeno de la fase slida; entonces el antianticuerpo se pega a
los anticuerpos presentes y slo basta lavar nuevamente y agregar un sustrato para
evidenciar la presencia del anticuerpo mediante la coloracin, por la accin de la
enzima sobre el sustrato. Debido a que el anticuerpo buscado queda emparedado
entre el antgeno de la fase slida y el antianticuerpo marcado con la enzima, el
mtodo se conoce como de sandwich.
10.5. El perfil de TORCH
TORCH es un acrnimo que se utiliza para definir a varias enfermedades
(toxoplasmosis, otras, rubola, citomegalovirus, y herpes). En el rubro de otras
pueden agregarse sfilis, Sida y hepatitis B. Se le considera en conjunto pues todas
ellas pueden causar problemas en productos de mujeres embarazadas con la
enfermedad, que van desde el aborto hasta cuadros indetectables en un recin
nacido aparentemente normal. Tambin este complejo manifiesta en ocasiones un
sndrome al nacimiento: productos pequeos, malformaciones diversas del sistema
100

nervioso y cardiovascular, hepatosplenomegalia, dificultades para el crecimiento y

desarrollo. A menudo se refiere a estas manifestaciones como el sndrome de Torch.
En todas las enfermedades del complejo de Torch existen dificultades en el
diagnstico pues se trata de grmenes no cultivables o de difcil cultivo. Es por ello
que la serologa ha desplazado al resto de los mtodos de diagnstico. Por ejemplo,
ya nuca se busca el cultivo de virus de la rubola para los fines clnicos. En las
infecciones por citomegalovirus, aunque el cultivo tiene utilidad, est fuera del
alcance de muchos laboratorios y la serologa lo ha desplazado con creces; lo mismo
puede decirse para infecciones por virus de inmunodeficiencia o hepatitis. Debe
aclararse, sin embargo, que el desconocimiento de la aplicacin adecuada de la
serologa ha hecho que se abuse de este perfil, con fines de escrutinio. Y es que el
clnico generalmente no considera que est detectando anticuerpos
(inmunoglobulinas), y que para todas las enfermedades existe un perodo de
ventana, como ya se describi. Una dificultad adicional deriva de que algunas
inmunoglobulinas de la madre filtran libremente a travs de la placenta a la sangre
del producto y, frecuentemente, dan pruebas positivas en ste hasta por varios
meses.
Para cada una de las enfermedades, existen mltiples tcnicas de serologa
(aglutinacin, hemaglutinacin, inmunodifusin, inmunofluorescencia, Elisa, etc.). Por
su fcil elaboracin, la tcnica de Elisa ha desplazado al resto en casi todos los
laboratorios. As, aunque la tcnica de inhibicin de la hemaglutinacin se utiliz
durante dcadas para la deteccin de anticuerpos contra rubola, actualmente casi
ningn laboratorio la realiza; la prueba de Sabin-Feldman, otrora de uso difundido en
la toxoplasmosis, ha quedado en desuso en favor de la de Elisa. Adems de la
facilidad en su realizacin, algunos de los equipos de Elisa permiten discriminar entre
inmunoglubulinas de tipo G y M. Esto es de gran importancia por dos motivos: la
aparicin de las inmunoglubulinas de tipo M antecede por varios das a las de tipo G,
adems de que las primeras no se filtran a travs de la placenta. Por ello, la
presencia de IgM especfica en el recin nacido indica que padeci la enfermedad in
tero, diagnstico imposible si slo se busca IgG, que puede ser de la madre.
Discriminar el tipo de inmunoglobulina tiene una importancia adicional: la IgG
generalmente permanece durante toda la vida del individuo, mientras que la IgM
desaparece despus de algunas semanas de la enfermedad. La figura 1 muestra las
curvas caractersticas de las inmunoglobulinas G y M para la mayora de las
enfermedades; conocer este fenmeno permite interpretar adecuadamente la
serologa.
La descripcin de breves casos clnicos har entender mejor la utilidad y el criterio
para interpretar las pruebas.
Casos clnicos
Caso 1 (Perodo de ventana) Mujer con 15 semanas de embarazo, maestra de
kinder, alarmada porque le apareci un leve sarpullido, desde dos das anteriores a
la consulta. Quiere descartar la posibilidad de rubola. El mdico le solicita
anticuerpos contra rubola. El resultado informado es: negativo. El mdico le
indica a la paciente que no debe preocuparse pues no padece rubola.
101

Este caso ejemplifica el compromiso que el mdico tiene para interpretar

adecuadamente la serologa y la necesidad de contar con determinaciones
confiables. Aqu existe un grave error en la interpretacin que es, adems, muy
comn. Si el cuadro de la paciente es de rubola, se encuentra en la primera
semana y estar en perodo de ventana. Repetir la prueba 10 15 das despus
encontrara la seroconversin y llegara al diagnstico correcto. De hecho, un
mdico bien informado sabra que el resultado inicial negativo puede ser un
signo ominoso (suero agudo). Es muy probable que, si se hubiera solicitado
especficamente la fraccin IgM, el resultado hubiera sido positivo, aunque
pudiera no serlo en los primeros siete das. El perodo de ventana para IgM es
ms corto que el de IgG, pero existe de todos modos. Cuando se cuenta con
determinacin de IgM, un solo suero tomado en etapa convaleciente puede
hacer el diagnstico; de hecho, si no se cuenta con un suero agudo, es la nica
alternativa aceptable. Si se cuenta slo con la determinacin de IgG, debe
tomarse un suero agudo y repetir la toma dos semanas despus para atestiguar
la seroconversin. Cuando el laboratorio no informa el tipo de inmunoglobulina
estudiada, generalmente significa que se busc slo IgG. En caso de duda, sin
embargo, debe comunicarse al laboratorio.

Figura 1. Respuesta serolgica a las infecciones

Caso 2 (Memoria) Acude una paciente por aborto recurrente. El mdico solicita al
laboratorio perfil de TORCH. El laboratorio informa anticuerpos contra Toxoplasma:
positivo, resto negativos. El mdico indica tratamiento contra la toxoplasmosis.
Este es un error muy comn tambin, y muestra cmo un estudio de laboratorio no
sustituye al criterio clnico. En primer lugar, la toxoplasmosis (como la rubola) no
son causa de abortos recurrentes pues es una enfermedad que ocurre una sola vez
y deja huella serolgica, como en este caso. De hecho, el laboratorio seguramente
determin IgG y la paciente est protegida contra la toxoplasmosis pues ya la
habra padecido. En todo caso, el mdico puede solicitar estudio de la fraccin IgM
102

para confirmar que no existe enfermedad actual. La solicitud de perfiles de manera

indiscriminada, como estudios de escrutinio, resulta muy costosa y generalmente
de poco valor en el diagnstico.
Caso 3 (Filtracin placentaria) Un recin nacido tiene peso bajo. La exploracin
muestra hepatosplenomegalia. El pediatra solicita al laboratorio perfil de Torch. El
laboratorio informa anticuerpos contra Citomegalovirus: positivo. El mdico hace
diagnstico de infeccin por este virus.
No se efectuaron pruebas discriminatorias de las fracciones IgG e IgM, por lo que
los anticuerpos pueden pertenecer a la madre. En el recin nacido debe
determinarse la fraccin IgM. El resultado positivo confirmara el diagnstico.
Bibliografa
1. Herrmann JE. Immunoassays for the diagnosis of infectious diseases. In Murray PR, Baron EJ,
Pfaller MA, Tenover FC, Yolken RH (ed.), Manual of Clinical Microbiology, 6th ed. American
Society for Microbiology, Washington D.C., 1995;110-22.
2. Herrmann JE, Blacklow NR, Perron DM, et al. Enzyme immunoassay with monoclonal antibodies
for the detection of rotavirus is stool specimens. J Infect Dis 1985;152:831-2.
3. Larsen SA, Steiner BM, Rudolph AH. Laboratory diagnosis and interpretation of tests for syphilis.
Clin Microbiol Rev 1995;8:1-21.
4. Laughon BE, Viscidi RP, Gdovin SL, Yolken RH, Bartlett JG. Enzyme immunoassays for detection
of Clostridium difficile toxins A and B in fecal specimens. J Infect Dis 1984;149:781-8.
5. Tam MR, Stamm WE, Handsfield HH, et al. Culture-independient diagnosis of Chlamydia
trachomatis using monoclonal antibodies. N Engl J Med 1984;310:1146-50.

103

11. BIOLOGIA MOLECULAR APLICADA A LA

MICROBIOLOGIA CLINICA.
Como se mencion en el captulo anterior, el mtodo tradicional para la identificacin
de un agente patgno es el cultivo. Sin embargo, los cultivos de virus, hongos,
micobacterias, chlamydias y micoplasmas es en ocasiones difcil, lento o costoso. En
esos casos, suele confiarse en la identificacin por serologa o histologa; por
desgracia, estos mtodos proporcionan slo evidencia circunstancial de infeccin y
en algunos casos es poco reproducible. Por estas razones existe una tendencia
hacia el diagnstico molecular para la deteccin directa de secuencias especficas de
DNA o RNA de un microorganismo en particular. Estas tcnicas han reducido el
tiempo requerido para el diagnstico de grmenes de difcil crecimiento; de hecho,
algunos agentes se han descubierto slo por tcnicas moleculares, como el virus del
herpes asociado al sarcoma de Kaposi.
Las dos principales tcnicas moleculares usadas para deteccin microbiana son la
hibridacin de cidos nucleicos con sondas moleculares especficas de DNA o RNA,
y la amplificacin por reaccin en cadena de polimerasa (PCR). Existen otros
muchos mtodos, pero son generalmente variaciones de los anteriores. Para los
mtodos basados en sondas moleculares se requiere una muestra que contenga una
alta cantidad del microorganismo buscado o una muestra de cultivo bacteriano.
Cuando la cantidad del agente es escasa, la muestra debe someterse primero a
amplificacin por PCR; de esta manera, ha sido posible la deteccin microbiana en
muestras tan pequeas como salpicaduras de sangre.

11.1. Tcnicas de hibridacin

Bajo condiciones apropiadas de temperatura y pH, los cidos nucleicos de cadena
nica (como el RNA o el DNA desnaturalizado) tienen la propiedad de combinarse
para formar una doble cadena estable. Este fenmeno se conoce como hibridacin
pues puede lograrse incluso con cidos nucleicos de especies diferentes como el
hombre y las bacterias.
En las pruebas de hibridacin, la muestra se somete a agentes alcalinos para que el
DNA se desnaturalice en dos cadenas y se coloca entonces en una superficie
adherente como nitrocelulosa para evitar que las cadenas se recombinen (Figura 1).
Gracias a las propiedades fsicas de los cidos nucleicos, la unin con la
nitrocelulosa ocurre sobre el soporte de azcar-fosfato, lo que permite que las bases
nitrogenadas (A,T,C,G) se proyecten afuera. Para caracterizar o identificar el DNA
blanco (target DNA), se agrega una solucin que contiene una sonda,
compuesta por una secuencia conocida de DNA o RNA, marcada con un marcador,
generalmente radiactivo. Se permite entonces que ocurra la hibridacin y le lava
luego de un perodo de incubacin para remover toda la sonda no ligada. Despus
de los lavados, permanecer en la nitrocelulosa el DNA blanco y la sonda ligada, en
su caso. La identificacin del DNA blanco se logra entonces al captar la presencia del
marcador. En el caso de materiales radiactivos, se puede colocar una placa

104

radigrfica, en donde aparece una mancha o blot, en un proceso conocido como

autoradiografa. En la figura 1 se esquematiza el procedimiento.

Figura 1. Hibridacin del DNA. Cuando una molcula de DNA (a) se calienta o se
coloca en un medio alcalino, se desnaturaliza en dos cadenas separadas (b). Esas
cadenas se adhieren entonces en superficies de nitrocelulosa (c) con solo calentar
hasta que se evapore todo el lquido. Se agrega una solucin que contiene una
sonda marcada con material radiactivo y se deja algn tiempo para permitir la
hibridacin con el DNA blanco fijado en la membrana. Luego se hace un lavado para
barrer toda la sonda que no se lig; finalmente se coloca la nitrocelulosa sobre una
placa radiogrfica para revelar la mancha.
La prueba de Southern blot es otro ejemplo de esta aplicacin. En este caso, el
DNA se fracciona primero con enzimas bacterianas que lo cortan en puntos
especficos (enzimas de restriccin). La intensidad de la mancha puede medirse,
con lo que se logra la cuantificacin del agente.
La sonda generalmente contiene menos de 30 bases de una secuencia conocida.
Por ejemplo, la secuencia TTAGGC, se ligara al blanco AATCCG, de acuerdo con
las reglas conocidas de comibacion de las bases (A-T, C-G). Para ser til, la sonda
105

debe tener dos caractersticas: debe contener una secuencia caracterstica del
agente estudiadio y no debe hibridarse con el DNA propio del husped de quien se
tom la muestra.
Las tcnicas de hibridacin son tiles para la deteccin directa de microorganismos
en muestras clnicas. Debido a que se detectan secuencias genticas y no antgenos
o anticuerpos, estas pruebas tienen mayor sensibilidad y especificidad que las
serolgicas. Existen actualmente tcnicas de hibridacin en laminillas de
microscopio, utilizando marcadores fluorescentes, que se utilizarn cada vez ms en
histopatologa (hibridacin in situ).

Figura 2. Prueba de Southern blot. El DNA primero se fracciona con enzimas de

restriccin y se le corre en un gel por electroforesis (a). Por capilaridad se transfieren
entonces los fragmentos a una membrana de nitrocelulosa (b). Finalmente, se
efecta la hibridacin (c), con lo que se puede observar el fragmento deseado.

11.2. Tcnicas de PCR

Normalmente, la reproduccin del material gentico se efecta por enzimas llamadas

polimerasas del DNA. Estas enzimas inician la sntesis del DNA a partir de una
plantilla iniciadora (primer). Estas plantillas con oligonucletidos de 20 a 30 bases,
muy semejantes a las que se utilizan en las tcnicas de hibridacin, pero que, en el
caso de la PCR, debern ser dos colocadas en direcciones opuestas en ambas
cadenas del DNA (Figura 3). De este modo, cualquier segmento del material gentico
puede ser multiplicado miles de veces seleccionando un par de plantillas que
106

flanqueen el segmento deseado. La muestra se coloca en un tubo en solucin con

las plantillas, la polimerasa y bases de DNA. Cuando la mezcla se calienta, el DNA
se desnaturaliza y las plantillas se hibridizan, lo que permite que la enzima inicie el
proceso de extensin del DNA. Cuando la muestra se somete a ciclos de
calentamiento y enfriamiento, la reaccin se repite, lo que lleva a una amplificacin
exponencial en cada ciclo. Generalmente se utilizan enzimas de bacterias que
toleran altas temperaturas, como la enzima Taq, derivada del bacilo Thermus
aquaticus, que vive en ambientes con temperaturas cercanas a los 100 oC. Cuando
se requiere amplificar RNA, debe primero sintetizarse un DNA complementario por
medio de alguna enzima transcriptasa reversa.
La PCR requiere tres temperaturas o pasos de incubacin que se repiten de 20 a 50
veces. Cada repeticin se conoce como ciclo. En el primer paso (desnaturalizacin),
la mezcla se calienta a 90 oC para que las cadenas de DNA se separen. En el
segundo paso (hibridacin) la muestra se enfra a 60 oC, con lo que se hibridizan las
plantillas en las dos cadenas del DNA. En el tercer paso (extensin) la muestra se
calienta a 70 oC para permitir la accin de la enzima termoestable. Todos los
componentes de la prueba se agregan al inicio en un tubo y no requiere detenerse
para agregar ms reactivos pues se le coloca en excedente. Al final de la reaccin
los productos de PCR sern millones de copias del segmento blanco del DNA
flanqueado por las plantillas (amplicones). Estos amplicones pueden detectarse
fcilmente por tcnicas de hibridacin como la mencionada anteriormente. Tambin
pueden detectarse por corrimiento en electroforesis. Un esquema del procedimiento
se observa en la figura 3.
Las tcnicas de PCR han tenido un impacto sustancial en el diagnstico de las
enfermedades infecciosas. Este mtodo logra la amplificacin especfica de
pequeas cantidades de DNA microbiano incluso cuando se encuentra en mezcla
con DNA del propio husped. Su mayor ventaja es que es mucho ms sensible que
las tcnicas de hibridacin. En trminos de sensiblidad, las tcnicas de hibridacin
requieren un mnimo de 1000 copias del DNA blanco, mientras que las tcnicas de
PCR pueden identificar desde 10 copias. Adems, la muestra puede obtenerse de
cualquier lquido o tejido corporal, aun cuando se encuentre contaminado o
parcialmente degradado. Por ejemplo, pueden hacerse pruebas en tejidos fijados en
parafina por muchos aos, incluso cuando ya hayan sido teidos para su
observacin microscpica.

107

Figura 3. Representacin esquemtica de un ensayo de PCR. El objetivo es la

amplificacin dirigida de un segmento deseado de DNA. Inicialmente, la mezcla se
calienta para lograr la desnaturalizacin del DNA (a). Al permitir el enfriamiento, las
plantillas (primers) se hibridizan con sus secuencias complementarias (b). Entonces
toma lugar la accin de la polimerasa para sintetizar el DNA (c) a partir de las
plantillas. Los pasos se repiten en un equipo ciclador por 20 a 50 veces, para lograr
una amplificacin exponencial.
11.3. Usos actuales de tcnicas moleculares en el diagnstico
Una vez que se estandaricen y sean ms econmicas, una gran cantidad de pruebas
moleculares se efectuarn en el futuro para suplementar y reemplazar las tcnicas
actuales. En los pases desarrollados, las tcnicas moleculares han desplazado a las
tradicionales en muchas enfermedades por grmenes que no crecen en cultivo
habitual, como virus, micobacterias, hongos, chlamydias y bacterias de difcil
crecimiento. Incluso en sitios donde se cuenta con el cultivo de estos grmenes, en
algunos casos los estudios moleculares son ya la primera eleccin, como la
deteccin de citmegalovirus en tejidos, papovavirus en exudado cervical, o chlamydia
en orina. Otra aplicacin promisoria de la PCR es el diagnstico de condiciones
infecciosas en las que se encuentran muy pocos microorganismos, como el virus del
herpes en lquido cefalorraqudeo de pacientes con encefalitis. Se les utiliza tambin
ampliamente para la cuantificacin viral en plasma (carga viral) en pacientes con
108

infecciones por virus de inmunodeficiencia o de la hepatitis C. Estos mtodos han

sido de gran utilidad tambin para el diagnstico de enfermedades que se
encuentren en perodo de ventana de formacin de anticuerpos. En fin, se han
identificado ya por tcnicas moleculares ms de 100 microorganismos patgenos.
Sin embargo, debe decirse que estos procedimientos requieren un estricto control de
calidad y no deben ofrecerse para fines clnicos si no se les ha estandarizado en
cada laboratorio y si no han sido aprobados para ese fin. En tales casos, deben
considerarse an como tcnicas en investigacin y no deben reemplazar a los
mtodos actuales.
BIBLIOGRAFIA
Naber SP. Molecular pathology. Diagnosis of infectious disease. N Engl J Med 1994;331:1212-15.
Stansfield WD, Colome JS, Cano RJ. Molecular and cell biology. McGraw-Hill, New York,1996.

109

ANEXO 1. SEGURIDAD EN EL LABORATORIO DE

MICROBIOLOGIA
A1.1. Generalidades
Existen tratados enteros acerca de la seguridad en el laboratorio, y nunca es
exagerado insistir en ella. En general, puede decirse que en el laboratorio de
microbiologa existen los riesgos biolgicos adems de los ya conocidos en
laboratorio generales (radiacin, intoxicacin, electrocucin, inflamacin y trauma
mecnico con equipos). Todos son importantes, pero abundaremos en los
primeros.
Las medidas de control de riesgo estn diseadas para proteger a quien trabaja en
el laboratorio y al pblico en general (control de los desechos). La mayora de los
riesgos dentro del laboratorio se reducen significativamente efectuando tcnicas y
procedimientos apropiados, colocando equipos de contencin y barreras de
proteccin, as como adecuando las instalaciones. Pero lo ms importante es que,
quien trabaja en el laboratorio, est consciente del riesgo y los caminos para
reducirlo. No es posible eliminar por completo los riesgos, pero s lo es reducirlos al
mnimo.
De acuerdo con las estadsticas internacionales, las enfermedades que ms
comnmente se transmiten en el laboratorio de microbiologa son (en ese orden):
1.
2.
3.
4.
5.
6.
7.
8.
9.

Brucelosis
Tifoidea
Tuberculosis
Hepatitis
Coccidioidomicosis
Shigellosis
Leptospirosis
Fiebre Q (laboratorios con animales de experimentacin)
Tularemia (laboratorios con animales de experimentacin)

Pueden ocurrir algunas otras infecciones, pero con mucho menor probabilidad, por
lo que no las trataremos aqu. Adems, si se tienen precauciones para las antes
mencionadas, se tendr generalmente proteccin automtica contra las otras.
Analizaremos por qu ocurren las principales infecciones y cmo evitarlas. Como
ocurre para el control de infecciones nosocomiales, el lavado de manos despus de
trabajar es una medida importante para el control de todas.
Brucelosis Generalmente ocurre cuando el personal no reconoce que una especie
de Brucella est desarrollando en hemocultivo y la trabaja sin precaucin. Se
presume que el mecanismo ms comn de transmisin es por aerosoles. Sospeche
Brucella en cualquier bacilo gramnegativo, MacConkey negativo, aislado de un
hemocultivo. Trabaje de preferencia en campana de seguridad biolgica.
Salmonellosis y shigellosis Esta infeccin generalmente se adquiere al trabajar
coprocultivos e ingerir los microorganismos. Debe evitarse comer o beber en el
rea de trabajo. Nunca se toque la cara en el laboratorio, ni se aplique maquillaje.
110

Nunca pipetee con la boca. Nunca utilice Salmonella o Shigella para fines de
enseanza.
Tuberculosis Se estima que la incidencia de tuberculosis en el personal de
laboratorio es tres a diez veces mayor que en la poblacin general. La mayora de
los casos ocurren luego de procesar muestras de pacientes con tuberculosis activa
a travs de la generacin de aerosoles. Debe evitarse destapar las muestras
despus de agitadas o introducir el asa caliente en ellas. Para efectuar cultivos de
micobacterias, debe preferirse siempre su manejo en campana de seguridad
biolgica.
Hepatitis Las hepatitis de mayor riesgo en el laboratorio son las de tipo B y C. Se
contraen por punciones accidentales con agujas contaminadas, o por inoculacin
directa en mucosas con lquidos corporales. Siempre debern usarse guantes para
el manejo de sangre, suero y otros lquidos corporales. Si existe posibilidad de
salpicadura, utilizar lentes o acrlico protector. Desechar todos los objetos
punzocortantes en contenedores especiales. La adherencia a estas precauciones
protege tambin contra las infecciones por virus de inmunodeficiencia (VIH). Toda
persona que trabaja en un laboratorio clnico debe estar vacunada contra la
hepatitis B.
Infecciones por hongos El manejo de hongos levaduriformes como Candida y
Cryptococcus es seguro y pueden manejarse como bacterias convencionales.
Asimismo, el manejo de los hogos verdaderos de lesiones superficiales (tias,
dermatomicosis) no se considera de riesgo. Sin embargo, los hongos dimorfos
(levaduras en tejidos que se convierten en hongos verdaderos en el laboratorio),
como Coccidiodes, Histoplasma y Blastomyces se inoculan fcilmente en los
pulmones al inhalarlos cuando las cajas se destapan por accidente o ignorancia.
Siempre que siembre un cultivo de hongos, selle la caja con cinta adherible. Nunca
inhale cajas que puedan contener hongos verdaderos. Cuando observe desarrollo
en un cultivo de hongos de lesiones profundas, destape la caja slo en una
campana de seguridad biolgica o enve la muestra a un laboratorio de referencia.
A1.2. Comportamiento en el laboratorio
Cuando una persona desconoce los riesgos en el laboratorio, o cuando su conducta
o actitud desdea dichos riesgos, se vuelve un riesgo para s y los dems. Los
estudios han mostrado que quienes tienen ms accidentes son quienes se
interesan poco por el riesgo, las que quieren terminar rpidamente y las que
desconocen cmo conducirse en el laboratorio.
En trminos generales, debe actuarse con sentido comn; los accidentes suelen
ser consecuencia de descuidos personales, ms que defectos en el material y
equipo. Asegrese entonces de cumplir las siguientes normas elementales:
1. Si desconoce cmo efectuar un procedimiento, no vacile en preguntar.
2. Utilice bata en el trabajo. Es preferible el uso de ropa de algodn. Las ropas sintticas suelen ser
de fcil combustin. Si sa ocurriera busque la fuente de agua ms cercana. Cercirese de
conocer la localizacin de los extintores.
3. Los alcoholes y sus vapores son inflamables o explosivos. No los trabaje cerca del mechero. No
utilice el mechero de alcohol si presenta derrames del contenido.
4. No toque equipos elctricos si tiene las manos mojadas, puede sufrir una descarga.

111

5. Evite salpicaduras de cidos o custicos. Si ocurre, lave de inmediato el rea con agua corriente.
Si diluye cidos o custicos en agua, siempre agrguelos poco a poco. Nunca agregue agua a
cidos concentrados.
6. Todas las botellas o picetas de reactivos deben estar rotuladas. Nunca d por supuesto su
contenido.
7. Considere todas las muestras de pacientes como potencialmente infectantes. Evite punciones
accidentales o aspiracin de agentes infecciosos con pipeta. Si va a tener contacto con sangre o
lquidos corporales, utilice guantes.
8. No se toque la boca, nariz u ojos. Nunca inhale cajas con cultivos que pudieran contener hongos
o micobacterias.
9. No fume, come ni beba en el rea de trabajo.
10. No se distraiga en el trabajo, mantenga sus sentidos en lo que est haciendo.
11. Si usa el pelo largo, evite tenerlo suelto.
12. Lave sus manos antes de salir del laboratorio.
13. Vacnese contra la hepatitis B
14. Si sufre un accidente, avise al jefe del laboratorio

A1.3. Manejo de derrames

Se debe tener un protocolo para el manejo de materiales infecciosos que se han
derramado accidentalmente. Derrames pequeos se limpian de inmediato con una
solucin de blanqueador casero al 1:10. Cuando hay un derrame mayor, cubrir de
inmediato con toallas desechables y verter en ellas blanqueador casero 1:10 hasta
cubrirlo. Desconecte ventiladores o fuentes de aire acondicionado. Deje actuar el
blanqueador por 10 minutos y recoja utilizando guantes y doble cubreboca. Avise
del accidente al jefe del laboratorio.
A1.4. Manejo de los desechos
Los objetos punzocortantes deben desecharse en contenedores especiales. Los
desechos infecciosos se deben enviar a incinerar o bien, esterilizar en autoclave y
hacerlos irreconocibles antes de desecharlos a la basura general. Los materiales de
biopsia y tejidos corporales debern ser enviados a incineracin. La sangre, el
suero, los lquidos corporales, heces y secreciones podrn desecharse
cuidadosamente en el drenaje, por personal experimentado y con equipo de
proteccin para evitar salpicaduras.
Bibliografa
1. Blazer MJ, Fatal salmonellosis originating in a clinical microbiology laboratory. J Clin Microbiol
1981:13:855-8.
2. Grist NR, Emslie JAN. Infection in British clinical laboratories 1988-89. J Clin Pathol 1991;44:6679.
3. Jacobson JT, Orlob RB, Clayton JL. Infections acquired in clinical laboratories in Utah. J Clin
Microbiol 1985;21:486-9.

4. Muller HE. Laboratory acquired mycobacterial infection. Lancet 1988;ii:331.

5. Sewell DL. Laboratory-associated infections and biosafety. Clin Microbiol Rev 1995;8:389-405.

112

ANEXO 2. ESPECTRO ANTIMICROBIANO. LO QUE TODOS

DEBEMOS SABER.
El descubrimiento y uso de antibiticos signific una revolucin en la medicina
moderna; sin embargo, su uso adecuado ha requerido (y seguir requiriendo)
siempre de buena informacin y criterio clnico. No sirve de nada conocer a
profundidad aspectos bsicos si la aplicacin clnica es inadecuada. Por ejemplo,
puede conocer que Escherichia coli es una enterobacteria gramnegativa, que no
utiliza el citrato, que es anaerobia facultativa, que es sensible a tales y tales
antibiticos, etc; sin embargo, este conocimiento es intil si un laboratorio informa
E. coli en exudado farngeo y el clnico decide iniciar un tratamiento sin reconocer
que este microorganismo no es causa de faringitis. Se insiste aqu en la necesidad
de que el personal de laboratorio cuente con conocimientos clnicos fundamentales.
Cuando se describe el espectro de accin de un antibitico, se refiere a que una
especie determinada puede ser sensible a ese antibitico, pero debe considerarse
que no siempre es as. Por ejemplo, sabemos que E. coli se encuentra dentro del
espectro de la ampicilina, pero ya casi nunca esperamos que este antibitico sea
eficaz contra esta especie cuando se le asla de una infeccin hospitalaria; sin
embargo, el antibiograma deber incluirlo en todo caso. Por otra parte, sabemos
que Pseudomonas aeruginosa no es parte del espectro antimicrobiano de la
ampicilina, por lo que siempre ser un disparate un informe que indique sensibilidad
en este caso. De hecho, es un disparate incluir ampicilina en el panel de
sensibilidad de P. aeruginosa, dado que siempre se presume resistente. Esta
consideracin avala la importancia que tiene conocer el espectro de accin de los
antibiticos, tanto para el clnico como para el laboratorista. Describiremos
sucintamente los antibiticos ms comunes; el resto debe consultarse en cada
caso. Se anotan los nombres comerciales ms comunes slo para fines de
consulta; no debe intentarse memorizarlos.
A2.1. Antibiticos betalactmicos
Su nombre deriva de la existencia de un anillo betalactmico en su estructura.
Estos incluyen las penicilinas, las cefalosporinas, los carbapenemes y los
monobactmicos. Las penicilinas constituyen un grupo de agentes antibacterianos
muy tiles debido a su eficacia y baja toxicidad.
Penicilinas
Bencilpenicilinas o penicilinas propiamente dichas
Penicilina G (PenprocilinaR)
Penicilina V (Pen V KR)
Penicilina benzatina (BenzetacilR)
Activas contra cocos y bacilos grampositivos (aunque ya la mayora de
estafilococos son resistentes) y anaerobios (con excepcin de Bacteroides fragilis).
Tambin tienen accin contra neisserias, aunque ya no se les considera de primera
eleccin en este caso, dada la alta proporcin de resistencias.

113

Aminopenicilinas
Ampicilina (Binotal, PentrexilR)
Amoxicilina (AmoxilR)
Adems de que poseen todo el espectro de la penicilina G y V, tienen accin
contra E. coli, Salmonella, Shigella, Proteus mirabilis y Hemophilus influenzae. Ya
no se les utiliza como primera eleccin contra Hemophilus, pues la resistencia es
muy comn. Sigue utilizndoseles mucho para infecciones urinarias pues se
absorben bien por va oral.
Penicilinas resistentes a penicilinasas
Dicloxacilina (PosipenR)
Se utilizan cuando se sospecha S. aureus, dado que ste es generalmente
resistente a la penicilina. Tiene tambin accin contra cocos grampositivos (como
estreptococos aerobios y anaerobios) pero en accin significativamente menor que
la penicilina G y V.
Penicilinas contra Pseudomonas
Carbenicilina (CarbecilinR)
Ticarcilina (TicarcilinR)
De su nombre se deduce su accin. Cubren tambin el espectro de la ampicilina.
Desafortunadamente, una gran proporcin de las cepas hospitalarias de
Pseudomonas son ya resistentes a ellas, por lo que han sido desplazadas por los
aminoglucsidos o las cefalosporinas de tercera y cuarta generacin.
Cefalosporinas Las cefalosporinas se dividen en primera, segunda, tercera y
cuarta generacin, designacin relativa a su espectro antibacteriano y orden de
aparicin.
Primera generacin
Cefalotina (KeflinR)
Cefalexina (KeflexR)
Cefadroxilo (DuracefR)
Tienen accin contra cocos grampositivos, incluyendo S. aureus, pero no cocos
anaerobios (peptoestreptococo), ni enterococo. De los gramnegativos, cubren slo
E. coli, Klebsiella sp. y Proteus mirabilis (PEK).
Segunda generacin
Cefaclor (CeclorR)
Cefuroxima (ZinnatR)
Tienen accin semejante a las de primera, ms Hemophilus, Enterobacter y
Neisseria (HENPEK). Existen algunas, como la cefoxitina, con excelente accin
contra anaerobios, pero no estn disponibles en Mxico.

114

Tercera generacin
Cefotaxima (ClaforanR)
Ceftriaxona (RocephinR)
Ceftazidima (FortumR)
Cefodizima (ModividR)
Ceftibutn (CedaxR)
A la cobertura de las de primera y segunda generaciones, se agregan casi todos los
gramnegativos y algunos anaerobios (excluyendo B. fragilis). La ceftazidima es
notable por su poder contra Pseudomonas aeruginosa. Conviene aclarar que, en la
medida que incrementan su accin contra gramnegativos, las cefalosporinas de
tercera generacin pierden un poco su accin contra grampositivos, y no son una
buena eleccin cuando se requiere cubrir S. aureus. Estos antibiticos ocasionan
un gran vaco ecolgico, que en ocasiones resulta en infecciones agregadas por
Candida, enterococo o gramnegativos resistentes (Enterobacter y Pseudomonas).
El ceftibutn se encuentra disponible por va oral y se absorbe casi el 100%.
Cuarta Generacin
Cefepima (MaxipimeR)
Cefpiroma (CefromR)
El uso de las cefalosporinas de tercera generacin ha seleccionado cepas
resistentes de Pseudomonas y Enterobacter. Las de cuarta generacin tienen
buena accin contra stos, por lo que pueden ser una mejor eleccin para la terapia
emprica de infecciones nosocomiales, al menos mientras se cuenta con el
antibiograma. Debemos usarlas con responsabilidad para evitar que ocurra como
con las de tercera generacin.
Carbapenemes
Imipenem (TienamR)
Meropenem (MerremR)
Estos compuestos son lo que ms se asemeja a un antibitico total. Tienen accin
contra casi todos los grampositivos y gramnegativos, aerobios y anaerobios, con la
notable excepcin de Pseudomonas maltophilia, P. cepacia y S. aureus resistente a
meticilina. Son tambin notorios por su alto costo. Deben reservarse para el manejo
de cepas resistentes de enterobacterias y P. aeruginosa.
Monobactmicos
Aztreonam (MonobacR)
A diferencia del anterior, este nuevo antibitico tiene un espectro muy reducido, y
cubre slo los bacilos gramnegativos, en un espectro muy semejante a los
aminoglucsidos,. Tiene por ventaja que se puede dosificar como una penicilina, sin
el riesgo de la toxicidad de aqullos.
Inhibidores de betalactamasas
Se trata del cido clavulnico, que se adiciona a la amoxicilina (AugmentinR), para
inhibir grmenes productores de bectalactamasas, como H. influenzae, S. aureus,
E. coli o B. fragilis. Por s solo el cido clavulnico tiene muy poca actividad

115

antibacteriana, por lo que siempre se prepara en combinacin. Existen otros

inhibidores (como el sulbactam) y combinaciones con diversos betalactmicos,
como la ticarcilina, para accin contra Pseudomonas.
A2.2. Aminoglucsidos
Estreptomicina
Kanamicina (KantrexR)
Tobramicina (TobraR)
Gentamicina (GaramicinaR)
Amikacina (AmikinR)
Netilmicina (NetromicinaR)
Los aminoglucsidos son excelentes antibiticos pues tienen un espectro muy
restringido a los bacilos gramnegativos aerobios (Pseudomonas, enterobacterias).
De los grampositivos, cubren discretamente a los estafilococos y estreptococos,
pero no a los anaerobios, por lo que no ocasionan grandes vacos ecolgicos, ni se
acompaan de infecciones agregadas.
Desgraciadamente, todos pueden
desencadenar intoxicacin renal u tica cuando se les dosifica sin cuidado.
Actualmente, la estreptomicina se reserva slo para la tuberculosis y la brucelosis.
La kanamicina ya no debe utilizarse pues es muy txica e induce fcilmente
resistencias. Del resto, se prefiere utilizar la amikacina pues induce menos cepas
resistentes, o la gentamicina por su bajo costo.
La espectinomicina (TrobicinR), es un congnere de los aminoglucsidos, que tiene
actividad slo contra N. gonorrhoeae, por lo que se usa slo para infecciones
genitales.
A2.3. Tetraciclinas
Tetraciclina clorhidrato (TetrexR)
Minociclina (MinocinR)
Doxiciclina (VibramicinaR)
El espectro de todas las tetraciclinas es casi idntico. Son activas contra casi todos
los cocos grampositivos (incluyendo anaerobios) y E. coli, aunque casi todas las
cepas de hospital son ya resistentes. Actualmente se les utiliza ms bien por su
accin contra gonococo y chlamydia, por lo que son excelente opcin en la
uretritis. En combinacin con estreptomicina o rifampicina, se utilizan en la
brucelosis. Son activas tambin contra las espiroquetas o algunos grmenes
intracelulares como ricketsias (adems de clamidias).
La minociclina y doxiciclina tienen la ventaja de una vida media prolongada, lo que
permite su dosificacin cada 12 a 24 h, aunque la minociclina es ototxica y debe
evitrsele.
A2.4. Cloramfenicol
(ChloromycetinR, QuemicetinaR)
Es activo contra muchas bacterias, incluyendo espiroquetas, ricketsias, clamidias,
micoplasmas, neisseirias y pneumococo. Sin embargo, se le utiliza principalmente
en infecciones por salmonella o por H. influenzae ya que su actividad es buena en
estos casos. Tambin es un antibitico con buena accin en casi todas las
116

infecciones por anaerobios, incluyendo las causadas por B. fragilis. La absorcin

oral es casi del 100 por ciento, y se obtienen niveles semejantes a la administracin
intravenosa. Desafortunadamente, con relativa frecuencia ocasiona depresin
reversible de mdula sea (anemia y leucopenia) en relacin con la dosis o,
incluso, reacciones idiosincrtica de anemia aplstica irreversible (1 por 10,000
pacientes tratados).
A2.5. Rifampicina
(RifadinR)
Es activa contra casi todos los cocos grampositivos, incluyendo S. aureus y S.
epidermidis. De los gramnegativos incluye a las neisserias y H. influenzae. Sin
duda, la mayor utilidad de este antibitico la representa su excelente accin contra
micobacterias, lo que revolucion el manejo y pronstico de la tuberculosis. De
hecho, el pronstico de un paciente tuberculoso es pobre cuando su cepa es
resistente a este antibitico, lo cual empieza a ser un hecho cada vez ms comn
en el mundo, a consecuencia de tratamientos incompletos que inducen la
resistencia. Dada la carencia de antifmicos, debemos procurar utilizar este
antibitico lo menos posible para otras indicaciones.
A2.6. Metronidazol
(Flagyl, VertisalR)
El metronidazol es un antibitico muy potente contra los anaerobios gramnegativos,
incluyendo B. fragilis, aunque es poco activo contra los grampositivos por lo que
suele asociarse a la penicilina, pues casi todas las infecciones por anaerobios son
polimicrobianas.
Se le utiliza aun ms por su accin antiparasitaria en amibiasis, giardiasis y
trichomoniasis. Su administracin frecuentemente produce estado nauseoso y
sabor metlico en la boca. Es bien conocido que produce fenmeno antabs
(reacciones graves al ingerir alcohol).
A2.7. Macrlidos y clindamicina
Eritomicina (PantomicinaR)
Claritromicina (KlaricidR)
Roxitromicina (RulidR)
Azitromicina (Azitrocin)
Clindamicina (Dalacin CR)
La eritromicina tiene buena accin contra cocos grampositivos, aunque S. aureus
es generalmente resistente en la actualidad. Se le utiliza ms actualmente por su
accin contra clamidia, legionella y micoplasma. La claritromicina y roxitromicina
son nuevos macrlidos con un espectro muy semejante a la eritromicina pero con
dos grandes ventajas: tienen vida media ms prolongada y tienen buena accin
contra S. aureus y H. influenzae. No tienen accin contra enterococo. La
azitromicina tiene una prolongada vida media por lo que se utiliza para manejos de
dosis nica en infecciones por clamidia.

117

Por otra parte, la clindamicina tiene tambin buena accin contra cocos
grampositivos (incluyendo S. aureus), pero se utiliza principalmente en infecciones
por anaerobios, ya que cubre casi todo este espectro (incluyendo B. fragilis).
Desgraciadamente, no cubre Clostridium difficile, agente que prolifera cuando se
usa este antibitico y conduce frecuentemente a colitis pseudomembranosa, que se
manifiesta inicialmente como diarrea mucosa o sanguinolenta, principalmente en
hospitalizados.
A2.8. Vancomicina
(VancocinR) y Teicoplanina (TargocidR)
Son muy activas contra todos los cocos grampositivos, incluyendo enterococos. Se
le utiliza principalmente para infecciones por el estafilococos resistentes a meticilina
(a la oxacilina), pues en ese caso es casi la nica alternativa segura. Casi todas las
infecciones por estafilococo coagulasa negativo son resistentes a oxacilina, por lo
que requieren este manejo. Desdichadamente son costosos y ototxicos, adems
de que slo puede administrarse por va parenteral. La vancomicina requiere la va
intravenosa, la teicoplanina puede administrarse por va intramuscular. Se han
informado ya cepas de enterococo resistente a vancomicina, y algunos casos de
estafilococos.
A2.9. Sulfas
Sulfadiacina
Sulfisoxasol
Sulfametoxasol
Las sulfas son activas contra varios gramnegativos y grampositivos, y alcanzan
altas concentraciones urinarias, por lo que se les utiliz mucho en urosepsis. Sin
embargo, causan resistencia con gran facilidad. Su costo bajo las ha desaparecido
del mercado y slo se les encuentra actualmente en asociacin con trimetoprim
(BactrimR, SeptrimR), lo que incrementa su accin contra casi todos los cocos
grampositivos y bacilos gramnegativos aerobios y anaerobios (exceptuando P.
aeruginosa y B. fragilis). Uno de los principales efectos indeseables de las sulfas
son las reacciones cutneas, que pueden ir desde eritema fijo a drogas, hasta
reacciones graves como el eritema polimorfo y el sndrome de Steven.Johnson.
Siempre que se les presciba debe advertirse al paciente esta posibilidad para que
suspenda la administracin de inmediato ante cualquier reaccin cutnea.
La sulfadiacina de plata (SilvadeneR) se utiliza mucho en quemaduras como
antibitico tpico.
A2.10. Quinolonas
Ciprofloxacina (CiproxinaR, CiprofloxR)
Norfloxacina (NoroxinR)
Pefloxacina (PeflacinaR)
Lomefloxacina (MaxaquinR)
Las quinolonas derivan del cido nalidxico (que actualmente ya no se utiliza).
Tienen buena accin contra bacilos gramnegativos aerobios y, en menor grado,
contra cocos grampositivos. No tienen actividad contra anaerobios. Como puede
verse, su espectro se parece mucho al de los aminoglucsidos, pero a diferencia de
118

stos, por va oral alcanzan muy buenas concentraciones en sangre

(biodisponibilidad superior al 60%). Cuando aparecieron en el mercado, prometan
una revolucin en el manejo para muchos pacientes con infecciones graves por
gramnegativos. Desafortunadamente, inducen resistencias con relativa facilidad y
su comercializacin excesiva para infecciones comunes las ha vuelto menos tiles.
Por ello, debe reservrseles para gramnegativos resistentes. La ciprofloxacina
sigue siendo la moneda de cambio de las quinolonas, ya que si un germen es
resistente a ella, suele ser resistente a las dems.
A2.10.b. Nuevas quinolonas
Levofloxacina (TavanicR)
Trovafloxacina (TrovanR)
Grepafloxacina (RaxarR)
Estas nuevas quinolonas se empezaron a usar clnicamente en 1998. Adems de la
accin de las quinolonas de primera generacin, stas tienen accin contra cocos
grampositivos, Legionalla y algunos anaerobios, por lo que se les puede indicar
para infecciones respiratorias e infecciones de piel. Tienen tambin accin contra
grmenes Chlamydia y gonococo, por lo se pueden usarse para infecciones
genitales. Otra caracterstica de estas quinolonas es su alta biodisponibilidad oral,
pues se absorven casi al 100% por esta va, contra cifras del 60% de las anteriores,
as como su prolongada vida media, que permite indicarlas en una toma diaria. Se
han informado reacciones hepticas severas luego de su administracin,
principalmente con el uso de trovafloxacina, por lo que deben reservarse para
infecciones serias.
Bibliografa
1. Sanford JP, Gilbert DN, Sande MA. Guide to antimicrobial therapy. Antimicrobial Therapy Inc,
Dallas. 1996.

119

ANEXO 3. ANOTACIONES PARA ACOMPAAR ALGUNOS

RESULTADOS DEL LABORATORIO DE MICROBIOLOGIA
El laboratorio debe promover la comunicacin con el clnico a travs de notas en los
resultados. Aqu se muestran las ms comunes.
1 Urocultivo negativo con piuria
La piuria estril sugiere infeccin con uso de antibiticos. De no ser as, favor de indicrnoslo
para continuar su estudio.
2 Urocultivo positivo sin piuria
La ausencia de piuria pudiera indicar bacteriuria asintomtica o, ms remotamente,
contaminacin en la toma. Si existe duda, enviar nueva muestra sin costo para el paciente.
3 Secrecin con cultivo negativo y cocos en tincin
El Gram mostr cocos que no desarrollaron en aerobiosis. Sugiere presencia de anaerobios
estrictos. Se recomienda utilizar penicilina o clindamicina.
4 Secrecin negativa con flora polimicrobiana en tincin
El Gram mostr flora polimicrobiana, pero el cultivo no desarroll en aerobiosis. Sugiere
presencia de anaerobios estrictos. Se recomienda utilizar clindamicina, o una combinacin de
penicilina y metronidazol.
5 Secrecin con flora polimicrobiana en Gram y cultivo
Desarrollaron varios gramnegativos y grampositivos aerobios y anaerobios. Ninguno parece ms
importante que el resto, por lo que no es recomendable efectuar antibiograma. Sugiere infeccin
en presencia de tejido necrtico o drenaje insuficiente. Se recomienda asociar un aminoglucsido
o una cefalosporina, con clindamicina o con metronidazol ms penicilina.
6 Pus estril sin grmenes en tincin
El cultivo negativo sugiere infeccin por grmenes no convencionales. Requerimos mayor
informacin clnica para continuar el estudio. Si considera que esto es necesario, favor de
comunicarse con nosotros
7 Hisopados de mala calidad
En el Gram hay escasos leucocitos y abundantes clulas epiteliales. Indica muestra de calidad
insuficiente para diagnstico.
8 Coprocultivo negativo con leucocitos en el fresco
La presencia de leucocitos puede indicar diarrea invasora. Este cultivo no puede descartar la
presencia de Campylobacter, E. coli invasora o parasitosis.
9 Expectoracin de mala calidad
En la tincin de Gram se observaron abundantes clulas epiteliales y pocos leucocitos. Existe
contaminacin oral, por lo que la muestra es de insuficiente calidad para el diagnstico. Puede
solicitarse nuevo estudio sin costo.

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GERMENES A LOS QUE NO SE EFECTUA ANTIBIOGRAMA

10 Estreptococo betahemoltico (grupos A o B)
No se efectu sensibilidad pues el fenmeno in vitro no corresponde con la respuesta clnica. Este
germen es siempre sensible a betalactmicos, eritromicina y clindamicina.
11 Peptoestreptococo
No se efectu sensibilidad pues el fenmeno in vitro no corresponde con la respuesta clnica. Se
recomienda utilizar penicilina o clindamicina.
12 Gardnerella vaginallis
No se efectu sensibilidad pues el fenmeno in vitro no corresponde con la respuesta clnica. Se
sugiere utilizar metronidazol.
13 Haemophilus influenzae
No se efectu sensibilidad pues el fenmeno in vitro no corresponde con la respuesta clnica. Se
sugiere utilizar cefalosporina de segunda o tercera generacin, amoxicilina con clavulanato, o
cloramfenicol.

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