Manual Micro

Instituto Tecnolgico de Oaxaca
Manual de Prcticas de Microbiologa de Alimentos
Manual de
Prcticas de
Microbiologa
de Alimentos
INSTITUTO TECNOLGICO DE OAXACA
CONTENIDO
1

Normas Y Sugerencias Para Trabajar En El Laboratorio De Microbiologa .................

3
Prctica 1: Identificacin Y Uso Del Equipo, Materiales Y Reactivos Del Laboratorio
De Microbiologia De Alimentos ...................................................................................... 5
Prctica 2: Preparacin Y Esterilizacin De Medios De Cultivo ................................. 18
Prctica 3: Cuenta De Bacterias Mesofilas erobias En Placa .................................. 23
Prctica 4: Cuenta De Mohos Y Levaduras De Alimentos ......................................... 30
Prctica 5: Tincin Simple Y Modelo Clsico De Tincin Diferencial (Tincin De
Gram), Y Observacin De Los Microorganismos Al Microscopio .............................. 33
Prctica 6: Recuento De Coliformes Por La Tcnica Del Nmero Ms Probable
(Nmp) .............................................................................................................................. 36
Prctica 7: Determinacion De Salmonella En Alimentos ........................................... 42
Prctica 8: Recuento De Staphylococcus Aureus ....................................................... 45
Referencias .................................................................................................................... 49
NORMAS Y SUGERENCIAS PARA TRABAJAR EN EL LABORATORIO DE

MICROBIOLOGA
1. El uso de la bata de laboratorio es indispensable para asistir a la prctica.

2. No se debe comer, fumar, ni beber en el laboratorio.
3. Mantenga las mesas de trabajo libre de todo lo que no sea esencial.
4. Limpiar y desinfectar la superficie de las mesas antes y despus del trabajo del da.

5. Lave sus manos con agua y jabn antes y despus de cada prctica. Luego asegure
de frotarse las manos con alcohol.
6. Llevar registro de sus anlisis indicando: Tipo de muestra, procedencia, fecha, tipo de
siembra o mtodo, cultivos empleados y resultados obtenidos.
7. Identificar las muestras antes de comenzar el anlisis, no desechar la muestra hasta
obtener el resultado (contra muestra).
8. El material a examinar debe manipularse exclusivamente con instrumentos estriles.
9. En caso de derramar un cultivo sobre la mesa o el piso o cualquier accidente como
cortadura, quemaduras, cada del material infectado en la conjuntiva ocular, ruptura de
una lmina montada al microscopio de aviso inmediato al profesor o monitor.
Tome todas las precauciones posibles para evitar estos accidentes.
10. Cuando tenga el asa bacteriolgica cargada con algn cultivo de microorganismos no
se desplace de un rea a otra ya que puede crear aerosoles, trabaje solo en el rea
estril.
11. Flamee el asa antes y despus de usarla.
12. Descarte todo el material usado en recipientes destinados para tal fin; por ningn
motivo en los desages o lavatorios.
13. Tenga cuidado con las preparaciones teidas ya que puede salpicar colorantes a
mesas y pisos.
14. Al final de la prctica dejar el lugar limpio y ordenado.
Sugerencias para el trabajo en el laboratorio
1. Es muy importante la asistencia a la prctica a la hora indicada, ya que las

explicaciones se darn en los primeros minutos.
2. Antes de comenzar la prctica, lea el manual
de laboratorio. Esto le ayudar a
entender mejor y a realizar un ordenado y eficiente trabajo de laboratorio.

3. Anote todos los resultados y las explicaciones pertinentes.

4. Cada sesin de laboratorio deber iniciarse con una corta explicacin. No empiece a
trabajar hasta que haya recibido todas las instrucciones. La buena tcnica de
laboratorio depende primordialmente de que se sepa lo que se va a hacer.
5. Los instrumentos de laboratorio son muy delicados. Tenga mucho cuidado al
manejarlos. Cualquier pequeo descuido puede ocasionar una prdida irreparable.
El material entregado para la prctica debe ser devuelto antes de abandonar el
laboratorio.
PRCTICA 1: IDENTIFICACIN Y USO DEL EQUIPO, MATERIALES Y

REACTIVOS DEL LABORATORIO DE MICROBIOLOGIA DE ALIMENTOS
Introduccin
La microbiologa es una ciencia muy interesante y fascinante. Para su estudio y
comprensin es necesario efectuar algunas determinaciones prcticas por lo cual es
necesario el conocimiento y manejo de algunos materiales e instrumentos de uso comn.
Por esa razn en este material bibliogrfico se hizo un apartado al inicio para presentar el
nombre, uso y clasificacin de algunos materiales que se usan con mucha frecuencia en
esta ciencia.
El material utilizado en un laboratorio de Microbiologa es muy variado y depende
fundamentalmente de las lneas de trabajo a las que est dedicado.
Evidentemente, no se precisa el mismo equipamiento en un centro de investigacin con
un alto grado de especializacin que en un laboratorio de Bacteriologa.
El tipo de material usado en el laboratorio de microbiologa ms comn es el siguiente:
Material de vidrio o plstico: que se usa para contener o medir: aqu se incluyen tubos
de ensayo, vasos de precipitado, matraces, embudos, probetas, pipetas, dosificadores,
etc., todo ello de distintos tamaos y capacidades.
Tambin incluimos las placas de Petri, los portaobjetos y cubreobjetos, cmaras de
recuento, cestillos y cubetas para efectuar tinciones, jarras para incubar en anaerobiosis,

etc. Material de siembra: constituido principalmente por asas, filamentos de platino y
pipetas estriles.
Material para toma de muestras e inoculaciones: escobillones estriles, tubos y
frascos estriles, jeringas, agujas y material de diseccin.
Por tanto, aqu slo nos referiremos al material bsico que se suele encontrar en un
laboratorio mnimamente dotado.
Objetivo
El alumno identificar y explicar el uso de los reactivos, materiales y equipos que se
utilizan en las prcticas de la materia de Microbiologa de Alimentos.
Procedimiento
Descripcin de reactivos y medios de cultivo
Nombre
Uso
Medio
Imagen
utilizado
propsitos
para
generales,
favorece el desarrollo y
aislamiento de una gran
Peptona de Soya
variedad
de
microorganismos aerobios,
y anaerobios facultativos y
estrictos.

El Agar Papa y Dextrosa es

conocido como PDA por
Agar Papa y Dextrosa
sus siglas en ingls. Tiene

la infusin de papa como
fuente de almidones y la
dextrosa
como
para
crecimiento
el
la
base
de
hongos y levaduras.
Agar Cuenta Estndar

El Agar Mtodos Estndar
es un medio utilizado para
el recuento de bacterias
aerbicas a partir de agua,
aguas
residuales,
alimentos
y
productos
lcteos.
Medio recomendado para
deteccin y recuento de
coliformes en aguas, aguas
residuales y alimentos.
Es un medio selectivo ya
Caldo Lauril Sulfato de
que el lauril sulfato de
Sodio
sodio inhibe el desarrollo

de la flora acompaante.

Se
recomienda
prueba
presuntiva
como
para
investigar la presencia de
bacterias
coliforme
del
en
grupo
agua,
alimentos.
Caldo Lactosado
Actualmente tambin est

indicado para el preenriquecimiento
no
selectivo en la bsqueda
de Salmonella spp. a partir
de alimentos.

Caldo Bilis Verde Brillante
Este
medio
est
recomendado
para
recuento
coliformes
de
el
totales y fecales, por la

tcnica del Nmero Ms
Probable. En el medio de
cultivo, la peptona aporta
los nutrientes necesarios
para
el
desarrollo
adecuado
bacteriano,
la
bilis y el verde brillante son

los agentes selectivos que
inhiben el desarrollo de
bacterias Gram positivas y
Gram
negativas
excepcin de coliformes, y
la lactosa es el hidrato de
carbono fermentable.
Este
Agar Eosina y Azul de

Metileno
medio
(tambin
denominado
E.M.B.)
es
utilizado
para
el
aislamiento
selectivo
de
bacilos Gram negativos de

rpido desarrollo y escasas
exigencias nutricionales.
El
agar es
el
agente solidificante.

Medio de cultivo utilizado
Agar Salmonella y Shigella
para
el
aislamiento
Salmonella
spp.
de
de
algunas especies de
Shigella spp. a partir de
heces, alimentos y otros
materiales en los cuales se
sospeche su presencia. Es
un
medio
de
cultivo
selectivo y diferencial.
Caldo Tetrationato
Agar para Estafilococos
Medio de cultivo utilizado

para el enriquecimiento
selectivo de Salmonella
spp. a partir de heces,
orina, alimentos y otros
materiales de importancia
sanitaria.
Es un medio selectivo para

el
aislamiento
y
diferenciacin
presuntiva
de estafilococos, en base a
la
produccin
de
pigmentos, la fermentacin
de manitol y la hidrlisis de
gelatina,
a
partir
de
alimentos y otras muestras.

Agar Baird Parker
Medio de alta especificidad
diagnstica,
selectivo
diferencial
para
el
aislamiento y recuento de
estafilococos
coagulasa
positiva
en
alimentos
otros
materiales
y
de
importancia sanitaria.
Colorantes
1.Permite
teir
1. Azul de metileno
interior
2. Cristal violeta
microorganismos
3. Safranina
procariticos
4. Purpura de bromocresol
o vivos).
5. Verde malaquita
2.
el
celular. Tien
Se
(muertos
utiliza
clasificar
para
bacterias
destruye a las clulas.

3.Se
utiliza
como
contraste coloreando el
ncleo celular de rojo y
tie de rosa a las
bacterias G
4. Se
utiliza
para
valoraciones de cidobase.
Pigmenta
albuminas.
5. Se utiliza como tincin
de esporas bacterianas
y como contratincion de
colorantes rojos.
Descripcin de material

Se
Asas de siembra
utilizan
para
sembrar.
Pueden ser metlicas o de

plstico, curvas o rectas (para la
siembra por picadura)
Se utilizan para la extensin de

Asas acodadas
muestras y diluciones sobre la

superficie de un medio de cultivo
en placa Petri.
Pipetas
Placas de Petri
Este material existe en dos

presentaciones:
Pipetas
aforadas y Pipetas volumtricas.
Las primeras permiten medir un
volumen nico y las segundas
permiten
medir
diversos
volmenes segn la capacidad
de esta.
Recipientes de vidrio para el

cultivo de microorganismos en
un medio slido.

Porta objetos
Placas de vidrio para colocar las
preparaciones que se observan.
Sirven
Vasos de precipitados
para
contener
almacenar lquidos, as como

preparar soluciones
Son
recipientes
de
vidrio,
esfricos, de fondo redondo o

plano, provistos de un cuello.
Matraces
Sirven para contener lquidos y

preparar medios de cultivo.
Se usan para taponar tubos de

Tapones de caucho
ensayo
para
anlisis
anaerbicos.

Se
utilizan
para
transferir
muestras o medios de cultivo.

Esptulas
Es un utensilio que permite

Termmetro
medir la temperatura que tienen

algunas sustancias.
Permite contener sustancias que

Frascos goteros
se
necesitan
agregar
en
pequeas cantidades.
Permite guardar sustancias para

almacenarlas; los hay mbar y
transparentes.
Frascos reactivos
Los
de
color
mbar se utilizan para guardar

sustancias que son alteradas por
la accin de la luz del sol, los de
color transparente se utilizan
para guardar sustancias que no
son afectadas por la luz solar.

Tubo de centrifuga
Se
usa
para
obtener
precipitados de lquidos, por
medio de la centrifugacin.
Estn hechos de varilla de vidrio

Agitador de vidrio
y se utilizan para disolver slidos

en disolventes lquidos.
Gradillas
Se utiliza para colocar tubos de

ensaye.
Descripcin de equipo
Estufa de incubacin
Se utiliza para facilitar el

desarrollo de microorganismos a
su temperatura ptima de su
crecimiento.

Centrfuga
Contador de colonias
Aparato que aplica sobre los

tubos una fuerza centrfuga lo
que permite la separacin de los
distintos componentes de la
muestra
mediante
la
precipitacin en el fondo del tubo
de las partculas en suspensin.
Es un aparato que mediante la

iluminacin de la placa y una
lupa, nos permite observar con
mayor nitidez las colonias y por
tanto facilita su recuento.
Es un aparato que permite

Balanzas
pesar
sustancias,
con
precisin de 0.01 o 0.001 g.
Es el equipo ms utilizado en l
laboratorio
Realiza
Autoclave
de
la
microbiologa.
esterilizacin
mediante calor hmedo, durante

15 20 min, segn el volumen,
a 115C 121C, segn la
naturaleza del material que se
desee esterilizar.

El
microscopio
compuesto
emplea dos sistemas de lentes

separados,
consiguiendo
con
ellos mayores aumentos. Al ser

Microscopio
el microscopio compuesto un
instrumento
fundamental
en
microbiologa, el conocer los

principios
bsicos
de
la
microscopa y la pericia en el
empleo y la manipulacin de
este instrumento, son requisitos
imprescindibles
cualquier
para
estudio
en
casi
esta
ciencia.
Tubo de ensaye
Potencimetro pHmetro
Permite observar las reacciones

de las sustancias que se
depositan en l. Los hay de
diferentes medidas y tambin
sirven para preparar cultivos de
bacterias y hongos.
Es un aparato que permite

medir el pH de las sustancias.

Horno
Se usa para secar y esterilizar
el material de vidrio usado en
el laboratorio. Por calor seco.
Es un aparato que se utiliza para

Bao Mara
desgelificar los medios de cultivo

y
mantenerlos
una
temperatura constante, o como

para
incubar
cultivos
temperatura constante.
Es un utensilio metlico que

permite calentar sustancias.
Presentan una base, un tubo,
Mechero Fisher
una chimenea, un collarn y un

vstago.
Con ayuda del collarn se regula
la entrada de aire. Para lograr
calentamientos adecuados hay
que regular la flama del mechero
a modo tal que sta se observe
bien oxigenada (flama azul).

PRCTICA 2: PREPARACIN Y ESTERILIZACIN DE MEDIOS DE CULTIVO
Introduccin
Los microorganismos pueden producir enfermedades cuando infectan personas,
animales y plantas y cuya gravedad oscila entre una infeccin dbil, intoxicacin e
incluso la muerte. Pueden contaminar los alimentos y producir cambios fsicos y qumicos
en ellos, hacindolos en algunos casos incomibles e incluso venenosos. Los
microorganismos son responsables tambin de la alteracin de muchos otros materiales,
generando graves prdidas econmicas. Por ello es indispensable disponer de
procedimientos para controlar la contaminacin y el crecimiento microbiano. Las
principales razones para controlar a los microorganismos pueden resumirse de la
siguiente forma:
Para evitar la transmisin de las enfermedades y las infecciones.
Para eliminar los microorganismos de un hospedero que est infectado.
Para eliminar microorganismos de diferentes materiales y as evitar su deterioro y
alteracin.
Uno de los sistemas ms importantes para la identificacin de microorganismos es
observar su crecimiento en sustancias alimenticias artificiales preparadas en el
laboratorio. El material alimenticio en el que crecen los microorganismos es el Medio de
Cultivo y el crecimiento de los microorganismos es el Cultivo. Se han preparado ms de
10,000 medios de cultivo diferentes.
Para que las bacterias crezcan adecuadamente en un medio de cultivo artificial debe
reunir una serie de condiciones como son: temperatura, grado de humedad y presin de
oxgeno adecuada, as como un grado correcto de acidez o alcalinidad. Un medio de
cultivo debe contener los nutrientes y factores de crecimiento necesarios y debe estar
exento de todo microorganismo contaminante.


Fundamento
Tipos de esterilizacin
Calor hmedo:
El efecto que causa este calor es matar al microorganismo por la coagulacin de sus
protenas cuando se encuentran en una atmsfera hmeda y sometidos a altas
temperaturas, adems, es rpido y efectivo en su accin.
La accin letal del vapor proviene del calor latente liberado cuando se condensa en una
superficie fra aumentando de esta manera la temperatura de la zona enfriada. La
destruccin de las esporas bacterianas sigue un comportamiento de forma similar en tanto
que el vapor se condensa en la pared de la espora y aumenta su contenido en agua que
finalmente hidroliza y degrada el contenido proteico.
Este calor se aplica en forma de vapor de agua y a temperaturas mayores o menores de
100C combinadas con un aumento de la presin en algunos casos.
El uso de temperaturas por debajo de 100C son recomendadas para tratar medios que
contienen compuestos sensibles a las altas temperaturas (evitando la desnaturalizacin
de los mismos). Esta prctica no asegura una esterilizacin pero s una desinfeccin.
Para una completa esterilizacin de estos medios se recomienda el medio de
tyndalizacin o esterilizacin fraccionada.
El uso de temperatura de 100C se logra exponiendo el medio a tratamiento con agua

hirviendo, la tyndalizacin o esterilizacin fraccionada tambin aplica a estas
temperaturas. El uso de las temperaturas anteriores usualmente destruye todos los
microorganismos no esporulados y la mayora de los esporulados en 10 minutos. Esta
prctica no asegura una esterilizacin pero si una desinfeccin, por lo que no se debe
confiar mucho en los mtodos anteriores.
El uso de temperatura de 100C se logra con el uso de equipos especiales (Autoclave)

que combinan el efecto de la temperatura con la presin, as, a una presin a 760 mm
de Hg el agua hierve a 100C, pero si la presin es superior la temperatura del agua
sube (Vapor de agua), por encima de los 100C, por ejemplo, a 10 lb/pulg de presin la
temperatura del vapor de agua e de 105C y a 15 lb/pulg es de 121C. El uso de vapor
de agua a temperaturas de

121C por 15 minutos destruye todos los microorganismos incluyendo las esporas
bacterianas. Este proceso es el principio que aplica el autoclave y la olla a presin en los
laboratorios de control microbiolgico.
Calor seco:
En una atmsfera seca, totalmente exenta de humedad, las bacterias como muchas
protenas son ms resistentes y no mueren hasta que tiene lugar la oxidacin de sus
componentes, lo cual ocurre a temperaturas mucho ms elevadas que las que se
requieren para coagular las protenas.
Se recomienda el calor seco siempre que el vapor de agua que se emplea no sea
deseable o no sea posible que entre en contacto directo con el material que se va a
esterilizar. Este tipo de calor comprende: esterilizacin al rojo vivo, el flameado, aparatos
que usan aire caliente y las radiaciones infrarrojas.
Incineracin y esterilizacin al rojo: Mtodos usados para esterilizar asa metlicas,

esptulas, destruccin de carcasas, animales de laboratorio y cualquier otro material de
laboratorio infectado que es preciso eliminar o material que slo se usa por el momento y
constantemente. Estos mtodos consisten en la exposicin directa del material a la accin
de la llama hasta alcanzar una coloracin roja.
Flameado: Mtodo utilizado para esterilizar bistures, agujas hipodrmicas, boca de tubos
de ensayo, porta y cubreobjetos. Consiste en pasar varias veces el objeto (de 3 a 4
veces) a travs de la llama sin permitir que este alcance el rojo.
Aire caliente: Mtodo usado para esterilizar material de vidrio y objetos metlicos. Se debe
envolver todo el material de laboratorio en papel, adems, los tubos, matraces, pipetas y
todo material en forma cilndrica deben ser cubiertos por un tapn de algodn en su boca.
Se usan temperaturas de 160C por 2 horas y es suficiente para esterilizar el material.
Objetivo
Al trmino de esta prctica el alumno estar capacitado para realizar correctamente la
esterilizacin de material de laboratorio y la preparacin de los medios de cultivo utilizados
en el anlisis microbiolgico de alimentos.

Reactivos
Material
Equipo
Agar simple
Cajas Petri de 10 x100 mm
Olla de presin
Agua destilada
1 Matraz Erlenmeyer de 125
Potencimetro
Cloruro de sodio
Peptona
ml
Mechero Fisher
Pipetas de 1, 2,5 y 10 ml
Probeta de 100 ml
Vaso de precipitados de 100
ml
Algodn
Procedimiento
Preparacin del material estril
Pipetas con filtro
Con algodn se realizaran filtros para las pipetas se toma una pequea porcin de
algodn y se coloca en la parte superior de la pipeta. Con la aguja de diseccin, se
empuja el algodn hasta alcanzar un 1 cm de profundidad y se retira la aguja. La
porcin de algodn sobrante en la pipeta se elimina con la flama de un cerillo.
Las pipetas sern envueltas en papel aluminio para su esterilizacin.
Tapones para matraz Erlenmeyer
Se toma un poco de algodn de forma rectangular. Segn el dimetro de la boca del
matraz con unas pinzas, se toma el extremo del algodn y se gira la pinza hasta formar
un cilindro de algodn alrededor de la pinza.

Cuando el grosor de ste sea aproximado al de la boca del matraz, se corta la parte
restante y con la mano se ajusta para que tome la forma adecuada.
Se corta una proporcin de gasa de aproximadamente 10 x10 cm y se coloca en la boca
de matraz. Se introduce el tapn de algodn enrollado y se envuelve completamente con
la gasa. Con un hilo se ajusta la gasa alrededor del tapn y se anuda para darle una
forma definida. Finalmente, se corta el exceso de gasa e hilo.
Coloque todo el material en la autoclave a una temperatura de 121 C, a 15 libras de
presin durante 15 minutos.
Calor seco:
Por medio de calor seco, se esterilizan pipetas enrolladas con papel aluminio y se colocan
en el interior de un pipetero de acero inoxidable.
Calor hmedo:
Preparacin de medios de cultivo
Preparar agar simple y agua de peptona para diluciones con 3% de NaCl y esterilizar a
121C y 1.118 Kg/cm2 de presin durante 15 minutos.
En condiciones de asepsia vaciar aproximadamente 15 ml de agar simple en cada caja de
Petri de 10 x 100 mm para siembra por estra, utilizando las de 15 x 100 mm para las
pruebas de vaciado en placa. El agua de peptona para diluciones envasarla en tubos con
tapn de algodn, capucho de plstico, de aluminio, de acero inoxidable o de plstico con
rosca.
PRCTICA 3: CUENTA DE BACTERIAS MESOFILAS EROBIAS EN PLACA
Introduccin
Generalidades
33

Cuando se requiere investigar el contenido de microorganismos viables en un alimento,
la tcnica comnmente utilizada es la cuenta en placa. Esta tcnica no pretende detectar a
todos los microorganismos presentes, pero el medio de cultivo, las condiciones de
temperatura y la presencia de oxgeno, permiten seleccionar grupos de bacterias cuya
presencia es importante en diferentes alimentos; por ejemplo, las bacterias mesoflicas
aerobias, o mesfilos aerobios son un indicador general de la poblacin que pueden
estar presente en una muestra y, por lo tanto, de la higiene con que ha sido manejado el
producto.
Este grupo en particular, se determina en la mayor parte de los alimentos, pero para algunos
productos, tambin es importante determinar la presencia de bacterias termoflicas,
psicroflicas y/o psicrotrficas para predecir la estabilidad del producto bajo diferentes
condiciones de almacenamiento. La tcnica bsica es la
misma,
pero
cambian
las
condiciones de incubacin, medios de cultivo y algunos otros detalles, que se

mencionan en la tcnica. Si se modifican las condiciones de incubacin o se somete la
muestra a algn tratamiento previo, el mtodo puede aplicarse tambin a la deteccin de
otros grupos como anaerobios o esporulados, con la adecuada seleccin de medios de
cultivo.
El mtodo permite numerosas fuentes de variacin, algunas de ellas controlables, pero
sujetas a la influencia de diversos factores por lo que es muy importante apegarse a
la tcnica y controlar cuidadosamente las condiciones.
Para la correcta aplicacin de esta prctica , se deben consultar las siguientes Normas
Mexicanas:
NMX-F-285
Muestreo y transporte de muestras de alimentos para su anlisis y
microbiolgico.
NMX-F-286
Preparacin y dilucin de muestras de alimentos para anlisis microbiolgicos
La cuenta en placa es la tcnica comnmente utilizada cuando se requiere investigar el

contenido de microorganismos viables en un alimento (NOM-092-SSA1-1994). La cuenta en
placa inicia con una dilucin primaria con el objeto de distribuir lo ms uniformemente posible
los microorganismos contenidos en la muestra destinada para el anlisis. Posteriormente se
preparan diluciones decimales adicionales para reducir el nmero de microorganismos por
unidad de volumen y permitir la adecuada distribucin y conteo de microorganismos en placa
despus de la incubacin (NOM-110-SSA1-1994).
32

Fundamento
La tcnica se basa en contar las unidades formadoras de colonias o UFC presentes
en un gramo o mililitro de muestra. Se considera que cada colonia que desarrolla en el
medio de cultivo de eleccin despus de un cierto tiempo de incubacin a la
temperatura adecuada, proviene de un microorganismo o de un agregado de ellos, de la
muestra bajo estudio. Ese microorganismo o microorganismos son capaces de formar la
colonia, es decir una UFC. Para que las colonias puedan contarse de manera confiable,
se hacen las diluciones decimales necesarias de la muestra, antes de ponerla en el medio
de cultivo. La tcnica para realizar este procedimiento se describe en Preparacin de la
muestra y dilusiones.
Objetivo
El alumno ser capaz de llevar a cabo en forma correcta, el aislamiento y recuento de la flora
aerobia mesfila presente en muestras de alimentos, aplicando para ello uno de los mtodos
ms comnmente utilizados como indicador microbiolgico de calidad sanitaria.
Reactivos
Material
33
Equipo

Agar
para
recuento
en Balanza analtica
placa, agar nutritivo o pinzas,
tijeras,
agar para mtodo
(todo
estndar
esterilizado)
Agua
peptonada
salina
esptulas,
previamente
para Pipetas bacteriolgicas de
disoluciones o agua de
peptona
ellos
1, 5, 10 y 11 ml
para Placas de Petri de vidrio
diluciones.
Nota: Para cada muestra
(100x15 mm) o de plstico

(90x15 mm)
deben esterilizarse en Vaso homogeneizador

autoclave 9 ml en tubos
de ensaye.
Dispositivo de
registro automtico
del nmero de
colonias contadas
Estufa de incubacin
a
29-30 C
Refrigerador
Olla de presin
Procedimiento
Preparacin del material estril
Se preparan pipetas con filtro de 10 ml y 1.1 y se esterilizan por calor seco.
Preparacin de la muestra y diluciones
La muestra debe someterse a anlisis tan pronto como sea posible, si no puede ser
estudiada inmediatamente despus de su llegada al laboratorio conservarla en
refrigeracin a 0-5. Si la muestra est congelada, descongelarla en su envase original (o
en el recipiente que llego al laboratorio) durante un tiempo mximo de 18 horas en un
refrigerador a 2-5C. Si la muestra congelada. Puede ser fcilmente triturada (como
sucede con los helados), no es necesario descongelarla.
Pesar en el vaso estril 25 g de la muestra de alimento. Si el contenido de envase no es
homogneo, debera tomarse una muestra de 25 g a partir del macerado de todos los
componentes o se analizarn separadamente cada uno de ellos, segn la finalidad del
examen.
Aadir al vaso del homogeneizado 225 ml de agua de peptona para diluciones o de agua
de peptona salina para diluciones. De este modo se obtiene una dilucin 10-1.
32

Homogeneizar el alimento durante 1 min y preparar las diluciones inmediatamente.
Esperar 2-3 minutos hasta que desaparezca la espuma formada. Hay que tener presente
que desde el momento en que se mezclan muestra y diluyente debe evitarse cualquier
retraso innecesario.
Medir un ml de la dilucin 10 -1 del homogeneizado, evitando la formacin de espuma, y
pasarlo a uno de los tubos de dilucin contenido 9 ml de diluyente, as se obtiene la
dilucin 10-2. Agitar esta dilucin y las subsiguientes enrgicamente 25 veces en un arco
de 30 cm repetir esta operacin utilizando las diluciones progresivamente ms elevadas
para preparar las diluciones, 10-210-3, 10-4 y 10-5 o las necesarias segn indique la
experiencia para el alimento que se va a analizar.
Cuenta en placa por el mtodo de extensin de superficie

Aadir a cada placa de Petri aproximadamente 15 ml de medio para cuenta en placa y
enfriado a 45-60C y dejar solidificar. Secar las placas preferiblemente a 50C durante 1.5
a 2 horas. Si las placas se preparan con antelacin, no deben guardarse ms de 24 horas
a temperatura ambiente o de 7 das en refrigerador a 2-5C.
Preparar las muestras del alimento siguiendo el procedimiento indicado anteriormente,
para la preparacin y dilucin de los homogeneizados de los alimentos.
Tomar dos alcuotas de 0.1 ml de la dilucin ms elevada y depositarlas en la superficie
del medio contenido en dos placas de Petri (dos placas por dilucin, sembrando en cada
una 0.1 ml).
Repetir esta operacin por cada dilucin hasta llegar a la ms concentrada utilizando
siempre la misma pipeta que se vaciara y llenara tres veces antes de transferir a cada
placa 0.1 ml. Deben sembrarse por lo menos tres diluciones an en el caso de que se
conozca el nmero aproximado de microorganismos presentes en la muestra de alimento.
Extender las alcuotas de 0.1 ml sobre la superficie del medio tan pronto como sea
posible, utilizando las varillas de vidrio en forma de bastn (flamear con alcohol antes de
sembrar en cada caja).
33

Dejar secar las superficies de las placas durante 15 minutos e incubar las placas
invertidas durante 48 horas a 35 C.
Cuenta en placa por el mtodo de vaciado
Preparar las muestras y diluciones siguiendo el procedimiento indicado anteriormente
Enfriar el medio de agar simple esterilizado. Mantenindolo a una temperatura entre 43 a
45C.
En condiciones de asepsia tomar alcuotas de 1 ml de la dilucin ms elevada y
transferidas a la superficie de una caja de Petri estril, iniciando con la dilucin menos
concentrada. Repetir esta operacin por cada dilucin hasta llegar a la ms concentrada;
utilizando siempre la misma pipeta que se vaciar y llenara tres veces antes de transferir
a cada placa el inoculo de 1 ml. Deben sembrarse por lo menos tres diluciones aun en el
caso de que se conozca el nmero aproximado de microorganismos presentes en la
muestra del alimento.
Aadir aproximadamente de 15 a 20 ml de agar simple fundido a temperatura no mayor
de 45C y mezclar con 6 movimientos de izquierda a derecha; 6 movimientos de arriba
hacia abajo; 6 movimientos en el sentido de las manecillas del reloj y 6 movimientos en
sentido opuesto
Esperar a que el medio solidifique e incubar inmediatamente despus de las placas
invertidas durante 2 das a 35C.
Cuenta en placa por el mtodo de vaciado y recuento en placa por el mtodo de

siembra en superficie.
32

Clculo e interpretacin de resultados
Para calcular el nmero de grmenes por gramo o mililitro de muestra elegir dos placas,
correspondientes a una dilucin, que presentan entre 20 y 300 colonias. Contar todas las
colonias de cada placa utilizando el contador de colonias y el dispositivo de registro
automtico. Hallar la media aritmtica de los dos valores y multiplicarla por el factor de
dilucin (la inversa de la dilucin cuyas placas han sido seleccionadas). Dar el valor
obtenido como la cuenta estndar en placa.
Cuando las placas de dos diluciones consecutivas presentan entre 30 y 300 colonias,
deben hallarse los recuentos estndar en placa de cada dilucin tal como se ha sealado
anteriormente y se dar como resultado la media de los dos valores obtenidos, a no ser
que uno de ellos sea superior al doble del otro, cuyo caso se dar como recuento
estndar en placa el valor ms bajo.
33

Para dar los valores del recuento estndar en placa, deben utilizarse nicamente dos
cifras significativas. Estas dos cifras correspondientes
a los dgitos primero y segundo
(empezando por la izquierda) de la media de las colonias halladas. Los dgitos restantes
tienen que ser sustituidos por ceros. Por ejemplo, si el valor calculado fue de 523,000,
este ha de darse como 520,000 (52 x 10 3). Si el tercer digito empezando por la izquierda
es 5 o superior, se le aade una unidad al segundo digito (se redondea). Por ejemplo, si el
valor calculado es de 83,600, este debe hacerse como 84,000 (84 x 103).
Los resultados obtenidos deben darse como la cuenta estndar en placa o como la cuenta
estndar en placa estimado por gramo o por mililitro de alimento segn corresponda.
Referencias:
Norma Oficial Mexicana NOM-F403-S-1981 Alimentos Para Humanos Microbiolgicos
Cuenta De Bacillus Mecentericurs O Bacillus Suptilis (Esporas Formadoras De Hebra).
(Federacin, 2015)
Norma Oficial Mexicana NOM-092-SSA1-1994, Bienes Y Servicios. Mtodo Para La Cuenta
De Bacterias Aerobias En Placa. (Salud., 2015)
Norma Oficial Mexicana NOM-110-SSA1-1994, Bienes Y Servicios. Preparacin Y Dilucin De
Muestras De Alimentos Para Su Anlisis Microbiolgico. (Salud., 2015)
PRCTICA 4: CUENTA DE MOHOS Y LEVADURAS DE ALIMENTOS
32

|Introduccin
Los mohos y levaduras son microorganismos que tienen inters como causa de alteracin y
como elementos biolgicos utilizados en la manufactura de algunos alimentos: quesos,
cerveza, pan.
Al desarrollarse en alimentos, ciertos hongos pueden producir toxinas con efecto en los
animales y el hombre, las que genricamente reciben el nombre de mico toxinas.
Los hongos tienen una gran ubicuidad en la naturaleza, siendo muy comunes en el polvo y la
tierra; las levaduras desarrollan con facilidad en los utensilios y equipo defectuosamente
lavados, que se utilizan en industrias que manejan carbohidratos.
Es de gran importancia cuantificar los mohos y levaduras en los alimentos, puesto que al
establecer la cuenta de estos microorganismos, permite su utilizacin como un indicador de
prcticas sanitarias inadecuadas durante la produccin y el almacenamiento de los
productos, as como el uso de materia prima inadecuada.
Los lineamientos de la siguiente prctica estn basados en el mtodo propuesto por la Norma
Oficial Mexicana NOM-111-SSA1-1994.
Objetivo
Al trmino de esta prctica y mediante la aplicacin de tcnicas de aislamiento de hongos y
levaduras, el alumno ser capaz de verificar la presencia de los mismos, en muestras de
alimentos.
Material, equipo y reactivos
33

Reactivos
Medio de Agar dextrosa
y papa (PDA)
cido tartrico
Material
Equipo
Pinzas, tijeras, esptulas
Balanza analtica
(todo ellos previamente
esterilizado)
Controlador
Pipetas
bacteriolgicas
Placas de Petri de vidrio
mm)
Colonias Quebec.
Estufa de incubacin
de 1, 5, 10 y 11 ml
(100x15
de
de
a
20-24 C
Refrigerador
plstico
(90x15 mm)
Olla de presin
Vaso homogeneizador
Procedimiento
Preparar las muestras de alimento para su dilucin, aplicando el mtodo sealado en la
prctica nmero 5. Para hacer diluciones pueden utilizarse los tubos de dilucin de
diluyentes sobrantes del mtodo de recuento en placa. Es muy importante procurar que
transcurra el menor tiempo posible entre la preparacin de las diluciones y la siembra del
inoculo, para evitar la multiplicacin o muerte de los microorganismos suspendidos en el
diluyente.
Para preparar el medio PDA (agar papa dextrosa), seguir las instrucciones del fabricante y
despus de esterilizar, enfriar en bao de agua a 45 1C, acidificar a un pH de 3,5 0,1
con cido tartrico estril al 10% (aproximadamente 1,4 ml de cido tartrico por 100 ml
de medio). Despus de adicionar la solucin, mezclar y medir el pH con potencimetro.
Pipetear en placas de Petri alcuotas de 1 ml de las diluciones de 10 -1, 10-2, 10-3, 10-4, 10-5,
utilizando dos placas por cada dilucin. Se propone esta serie de diluciones para los
casos que no se conozca el nmero aproximado de unidades formadoras de colonias
presentes en la muestra. Las diluciones que han de prepararse y sembrarse siempre
sern funcin del recuento esperado.
Verter de 15 a 20 ml de agar papa dextrosa acidificado, fundido y mantenido a 45 1 C
en un bao de agua. El tiempo transcurrido entre la preparacin de la dilucin primaria y
el momento en que es vertido el medio de cultivo, no debe exceder de 20 minutos.
32

Mezclar cuidadosamente el medio con seis movimientos de derecha a izquierda, seis en
el sentido de las manecillas del reloj, seis en el sentido contrario y seis de atrs para
adelante, sobre una superficie lisa. Permitir que la mezcla se solidifique dejando las cajas
Petri reposar sobre una superficie horizontal fra.
Preparar una caja control con 15 ml de medio, para verificar la esterilidad.
Invertir las placas cuando se haya solidificado el agar e incubarlas a 20-24 durante 3-5
das.
Contar las colonias de cada placa despus de 3, 4 y 5 das de incubacin. Despus de 5
das, seleccionar aquellas placas que contengan entre 10 y 150 colonias. Si alguna parte
de la caja muestra crecimiento extendido de mohos o si es difcil contar colonias bien
aisladas, considerar los conteos de 4 das de incubacin y an de 3 das. En este caso,
informar el periodo de incubacin de 3 o 4 das en los resultados del anlisis.
Calcular el nmero de levaduras y mohos por gramo o mililitro de alimento.
Referencias:
Norma Oficial Mexicana NOM-093-SSA1-1994, Bienes Y Servicios. Prcticas De Higiene
Y Sanidad En La Preparacin De Alimentos Que Se Ofrecen En Establecimientos Fijos.
(Salud., 2015)
PRCTICA 5: TINCIN SIMPLE Y MODELO CLSICO DE TINCIN DIFERENCIAL

(TINCIN DE GRAM), Y OBSERVACIN DE LOS MICROORGANISMOS AL
MICROSCOPIO
33

Introduccin
El tamao de la mayora de las clulas bacterianas es 10 m tal que resultan difciles de ver
con el microscopio ptico. La principal dificultad es la falta de contraste entre la clula y el
medio que la rodea. El modo ms simple de aumentar el contraste es la utilizacin de
colorantes.
Si se desea simplemente aumentar el contraste de las clulas para la microscopia, son
suficientes los procedimientos que usan un solo colorante llamado de tincin simple. Sin
embargo, a menudo se utilizan mtodos que no tien de igual modo todas las clulas, es el
proceso denominado tincin diferencial. Uno muy usado en microbiologa es la tincin de
Gram. Basndose en su reaccin a la tincin de Gram, las bacterias pueden dividirse en dos
grupos: Gram-positivas y Gram-negativas. Esta tincin tiene gran importancia en
taxonoma bacteriana ya que indica diferentes fundamentales de la pared celular de las
distintas bacterias.
Mientras que las bacterias Gram-negativas son constantes en su reaccin, los
microorganismos Gram-positivos pueden presentar respuestas variables en ciertas
condiciones (son Gram-lbiles). Por ejemplo, los cultivos viejos de algunas bacterias
Grampositivas pierden la propiedad de retener el cristal violeta, y en consecuencia, se tien
por la safranina apareciendo Gram-negativas. Anlogo efecto se produce en ocasiones por
cambio en el medio del organismo, o por ligeras modificaciones en la ejecucin de la
tcnica.
Pata explicar el mecanismo de la tincin de Gram se han propuesto varias hiptesis
fundadas en la naturaleza qumica de las paredes celulares de los microorganismos.
Objetivo
Utilizando diferentes colorantes de uso comn, que el alumno observe al microscopio las
estructuras que se ponen de manifiesto por la tincin simple de organismos en suspensin.
32

Que el alumno observe al microscopio preparaciones fijas de muestras de alimentos y distinga
las estructuras que se ponen de manifiesto mediante la aplicacin de la tincin diferencial de
Gram.
Reactivos
Material
Azul de metileno
Asa bacteriolgica
Tinta china
Cubreobjetos
Verde de malaquita
Mechero Fisher
Colorante
de
cristal
Equipo
Microscopio
Portaobjetos
violeta
Alcohol-cetona
Safranina
Solucin de lugol
Muestras de alimentos.
Procedimiento
Tincin simple
Coloque en el centro de un portaobjetos perfectamente limpio y libre de grasa una gota de
azul de metileno y con el asa de platino tome una pequea porcin de muestra de algn
alimento. Mezcle perfectamente con ayuda del asa, cubra la preparacin con un
cubreobjetos limpio y observe al microscopio. Repita el procedimiento con otras muestras
de alimento utilizando safranina y verde malaquita. Anote sus observaciones.
Tenga presente, que realizar una preparacin para el microscopio, debe depositarse en el
portaobjetos una capa de clulas lo suficientemente delgada para permitir el paso de la
luz a travs de ella.
Tincin diferencial
Para preparar frotis antes de teirlos se aplica el siguiente mtodo: colocar una pequea
gota de agua destilada en el portaobjetos limpio a una distancia conveniente que permita
sujetar el portaobjetos con los dedos, tomar una pequea porcin de la muestra con
33

ayuda del asa de platino previamente esterilizada, disperse la muestra y extienda la gota
para formar un frotis delgado. Secar el frotis al aire y fijarlo pasando tres veces el
portaobjetos (con el frotis hacia arriba) por encima de la llama del mechero Fisher.
Despus de la fijacin el frotis esta listo para la tincin.
Con dos muestras de diferentes alimentos preparar dos frotis idnticos en un portaobjetos
limpio, cubrirlos con solucin colorante de cristal violeta y dejarlos reaccionar por un
minuto.
Descartar el exceso de colorante y lavar con agua utilizando una piceta, enseguida aplicar
la solucin de lugol por un minuto y lavar con agua de la llave.
Agregar la solucin decolorante de alcohol- acetona, gota a gota, con el portaobjeto
inclinado sobre el fregadero, hasta que las gotas de la solucin ya no arrastren color,
enjuagar con agua para detener la accin decolorante.
Cubrir el portaobjeto con la solucin colorante de safranina dejndola reaccionar por 10 a
20 segundos, lavar el exceso de colorante y secar al aire.
Observe al microscopio y anote sus observaciones.
Referencias:
Norma Oficial Mexicana NOM-143-SSA1-1995, Bienes Y Servicios. Metodo De Prueba
Microbiologico Para Alimentos. Determinacion De Listeria Monocytogenes. (Salud., 2015)
PRCTICA 6: DETERMINACIN DE BACTERIAS COLIFORMES. TCNICA DEL

NMERO MS PROBABLE.
32

Introduccin
Los
coliformes
comprenden
todos
aquellos
bacilos
no
formadores
de
esporas,
gramnegativos, aerbicos o facultativamente anaerbicos, que fermentan la lactosa con

formacin de gas antes de 48 horas a 35C. La definicin de un presunto coliforme
corresponde a un microorganismo que produce gas en un caldo lactosado a las 48 horas a
35C. Un presunto coliforme fecal es confirmado cuando produce gas en un medio de lactosa
con verde brillante al 2% despus de 48 horas a 35C 3.
Para determinar el nmero de microorganismos se utiliza la tecnica del nmero ms
probable. Esta tambin se conoce como tcnica de dilucin en tubo, proporciona una
estimacin estadstica de la densidad microbiana presente con base a que la probabilidad de
obtener tubos con crecimiento positivo disminuye conforme es menor el volumen de muestra
inoculado.
En esta prctica se determinarn bacterias coliformes. Este grupo es el ms utilizado en la
microbiologa de los alimentos como indicador de la realizacin de prcticas higinicas
inadecuadas. Escherichia coli, es un
patgeno potencial para el hombre, es un bacilo
aislado del tubo intestinal de los animales de sangre caliente y es considerado por esta razn
como indicador de contaminacin fecal.
Los lineamientos de la siguiente prctica estn basados en el mtodo propuesto por la
Normas Oficiales Mexicanas NOM-112-SSA1-1994 y NOM-113-SSA1-1994.
Objetivo
Al finalizar sta prctica el alumno estar capacitado para realizar el anlisis de muestras
de alimentos, para el aislamiento e identificacin de microorganismos coliformes.
Reactivos
Material
33
Equipo

Medio Caldo lauril sulfato
triptosa.
Medio
Caldo lactosa bilis
(2%) verde brillante.

Medio Agar eosina azul de
metileno.
Asa de inoculacin con
35-37 C
alambre de nicrom o de
Balanza granataria
platino-iridio
Lo
necesario
para
la
preparacin
homogeneizado
de
los
Horno de
esterilizacin
Autoclave con
termmetro y
alimentos
(cuchillos,pinzas,etc)
Pipetas bacteriolgicas de
1,1.1 ,5 y 10 ml con filtro

Tubos
Estufa de incubacin,
de
ensaye
roscados de 10 y 20 ml
Solucin
desinfectante
manometro
Bao de agua con
control de
temperatura
Licuadora, vaso de
licuadora con tapa

esterilizable.
(benzal al 1% o alcohol al
70%)
Gradilla
Procedimiento de la tcnica de NPM.

La preparacin de la muestra de alimento para su dilucin se realiza aplicando el mtodo
sealado en la prctica 5. Para hacer las diluciones pueden utilizarse los blancos de
dilucin o frascos de diluyentes sobrantes del mtodo de recuento en placa. Es muy
importante que una vez hechas las diluciones del alimento, las siembras se realicen lo
antes posible, para evitar la multiplicacin o muerte de los microorganismos suspendidos
en el diluyente.
Para agua potable y hielo. Prueba presuntiva
Transferir 10 ml de muestra a cada uno de 5 tubos con 10 ml de caldo lactosado o caldo
lauril sulfato triptosa de concentracin doble, 1.0 y 0.1 ml de muestra a cada una de las
dos series de 5 tubos con 10 ml de caldo lactosado o caldo lauril sulfato triptosa de
concentracin sencilla com purpura de bromocresol.
32

Incubar los tubos a 35C.Examinar a las 24 horas y observar si hay formacin de gas. Si
no hay formacin de gas incubar 24 horas ms y volver a observar.
Prueba confirmativa
De cada tubo que muestre formacin de gas, tomar una asada y sembrar en un nmero
igual de tubos con caldo lactosado bilis verde brillante. Incubar a 35 0.5 C. Examinar a
las 24 horas y observar si hay formacin de gas. Si no hay formacin de gas incubar 24
horas ms y volver a observar.
Para alimentos
Preparar suficientes diluciones para asegurar que todos los tubos de la ltima dilucin
sean negativas
Preparacin de la muestra
Dilucin primaria 10-1 Para muestras liquidas no viscosas, agitar la muestra manualmente
con 25 movimientos de arriba abajo en un arco de 30 cm. Tomar 1 ml de la muestra y diluir
con 9 ml de solucin diluyente (alternativamente pueden tomarse 10 ml de muestra y 90 ml
de solucin diluyente).
Para muestras solidas o semislidas pesar 10 g de muestra en un vaso de licuadora
estril. Agregar 90 ml de solucin de agua de dilucin estril .Operar la licuadora de 1 a 2
min hasta la homogeneizacin de la muestra. Permitir la sedimentacin de partculas
grandes y tomar la alcuota de la parte superior del vaso.
Dilucin 10-2 Colocar 1 ml de la dilucin primaria en un tubo roscado conteniendo 9 ml de
de solucin diluyente estril. Agitar vigorosamente.
Preparar diluciones adicionales repitiendo este procedimiento.
Prueba presuntiva
Transferir 10 ml de muestra liquida o dilucin primaria a cada uno de los tres tubos con 10
ml de caldo lactosado o caldo lauril sulfato triptosa de concentracin doble, 1.0 ml y 0.1 ml
de muestra liquida o dilucin primaria a cada una de las dos series de tres tubos con 10
33

ml de caldo lactosado o caldo lauril sulfato triptosa de concentracin sencilla con
bromocresol.
Incubar los tubos a 35C.Examinar a las 24 horas y observar si hay formacin de gas. Si
no hay formacin de gas, incubar 24 horas ms y volver a observar.
Prueba confirmativa
De cada tubo que muestre formacin de gas, tomar una azada y sembrar en un nmero
igual de tubos con caldo lactosado bilis verde brillante. Incubar los tubos a 35C.
Examinar a las 24 horas y observar si hay formacin de gas. Si no hay formacin de gas,
incubar por 24 horas ms y volver a obsevar.
Anotar el nmero de tubos confirmados como positivos de organismos coliformes a cada
dilucin.
Para obtener el NMP, proceder de la forma siguiente. Ver en cada una de las tres
diluciones seleccionadas el nmero de tubos en los que se confirm la presencia de
coliformes. Buscar en la tabla del NMP que se presenta a continuacin y anotar el NMP
que corresponda al nmero de tubos positivos de cada dilucin.
CUADRO 1 (AGUA)
CUADRO 2 (ALIMENTOS)
INDICE DE NMP Y LIMITES DE CONFIANZA INDICE DE NMP Y LIMITES DE CONFIANZA

95% PARA VARIAS COMBINACIONES DE 95% PARA VARIAS COMBINACIONES DE
RESULTADOS POSITIVOS CUANDO SON RESULTADOS POSITIVOS CUANDO SON
32

USADOS CINCO NUMEROS DE TUBOS USADOS TRES NUMEROS DE TUBOS
DILUCIONES 10, 1.0 Y 0.1 G DILUCIONES 10, 1.0 Y 0.1 G
TUBOS
NDICE
DEL
POSITIVOS
NMP/G
0-0-0
<0.02
0-0-1
0-1-0
3-3-2 0-2-0 -3-3-3 1-0-0 -4-0-0 1-0-1 0.13
4-0-1 1-1-0 0.17
4-1-0 1-1-1 0.17
4-1-1 1-2-0 0.21
4-1-2 2-0-0 0.26
4-2-0 2-0-1 0.22
4-2-1 2-1-0 0.26
4-3-0 2-1-1 0.27
4-3-1 2-2-0 0.33
4-4-0 2-2-1 0.34
5-0-0 2-3-0 0.23
5-0-1 3-0-0 0.31
5-0-2 3-0-1 0.43
5-1-0 3-0-2 0.33
5-1-1 3-1-0 0.46
5-1-2 3-1-1 0.63
5-2-0 3-1-2 0.49
5-2-1
5-2-2
5-3-0
5-3-1
5-3-2
5-3-3
5-4-0
5-4-1
5-4-2
5-4-3
5-4-4
5-5-0
5-5-1
5-5-2
5-5-3
5-5-4
5-5-5
0.70
3-2-0
0.94
3-2-1
0.79
3-2-2
1.10
3-3-0
1.40
3-3-1
1.80
1.30
1.70
2.20
2.80
3.50
2.40
3.50
5.40
9.20
16.09
--
TUBOS
POSITIV
OS
0-0-0
0-0-1
0-1-0
0-2-0
1-0-0
1-0-1
1-1-0
1-1-1
1-2-0
2-0-0
2-0-1
2-1-0
2-1-1
2-2-0
2-2-1
2-3-0
3-0-0
3-0-1
3-0-2
3-1-0
3-1-1
3-1-2
3-2-0
3-2-1
3-2-2
3-3-0
3-3-1
3-3-2
3-3-3
33
NDICE
DEL
NMP/G
<0.03
0.3
0.3
/
0.4
0.7
0.7
1.1
1.1
0.9
1.4
1.5
2
2.1
2.8
/
2.3
3.9
6.4
4.3
7.5
12
9.3
15
21
24
46
110
>110

Presentacin e interpretacin de los resultados. Los resultados obtenidos
deben darse como organismos coliformes
por gramo o por mililitro de alimento, segn
corresponda.
Referencias:
Norma Oficial Mexicana NOM-112-SSA11994, Bienes Y Servicios. Determinacin

De Bacterias Coliformes. Tcnica Del
Nmero Ms Probable.
Norma Oficial Mexicana NOM-113-SSA11994, Bienes Y Servicios. Mtodo Para La Cuenta De Microorganismos Coliformes
Totales En Placa. (Salud., 2015)
PRCTICA 7: DETERMINACION DE SALMONELLA EN ALIMENTOS
32

Introduccin
El gnero Salmonella pertenece a la familia Enterobacteriaceae. Como el nombre lo indica,
Enterobactericeae comprende bacterias que proliferan en el intestino; varios gneros de esta
familia contienen especies patgenas. Adems de Salmonella, se incluyen especies
patgenas transmitidas por los alimentos de los gneros Escherichia, Shigella y Yersinia
Salmonella es una bacteria gram-negativa en forma de bacilo que posee flagelos. Las
bacterias del gnero Salmonella son microorganismos anaerobios facultativos. Son oxidasa
negativa, fermentan la glucosa y producen cido y gas. Una de las caractersticas de este
gnero es que la mayora de los miembros no fermenta la lactosa ni la sacarosa
Shigella es un bacilo gram negativo perteneciente a la familia Enterobacteriaceae, que se
encuentra estrechamente relacionada con el gnero Escherichia, por sus propiedades
bioqumicas, serolgicas y por similitudes genticas. Se caracteriza por no fermentar la
lactosa, ser inmvil, no produce lisina decarboxilasa y raramente produce gas a partir de
hidratos de carbono. Su identificacin se basa en caractersticas bioqumicas y antignicas
Salmonella es una bacteria invasora que causa infecciones humanas, conocidas como
salmonelosis. Puesto que el intestino es el hbitat natural de algunas variedades de
Salmonella, los alimentos sin procesar de una fuente animal ocasionalmente albergan al
patgeno. Por consiguiente, Salmonella se encuentra en productos derivados de aves de
corral, incluidos pollo, huevo y pavo. De igual manera, mariscos, leche y ensaladas han estado
implicados en brotes de salmonelosis. Slo algunas especies de Salmonella son patgenas
para los seres humanos, pero todas las salmonelas son inaceptables en alimentos listos para
comer. Por tanto, el alimento se analiza para determinar la presencia o ausencia de
Salmonella
Las distintas especies de Shigella constituyen la principal causa de disentera, diarrea
caracterizada por eliminacin frecuente de heces con pus, sangre y/o mucus. El ser humano
es el nico reservorio conocido de este agente. La mayora de los casos ocurren en nios, en
general trasmitidos por contacto directo. Los brotes a gran escala, vinculados a alimentos, son
ms raros. Los mtodos convencionales de deteccin de Salmonella y Shigella dependen de
las caractersticas del cultivo. Estos mtodos implican el preenriquecimiento y el
enriquecimiento selectivo, seguidos de los pasos de aislamiento y las pruebas de
33

identificacin. Los pasos de enriquecimiento y aislamiento son tcnicas principalmente de
cultivo, en tanto que la identificacin se basa en el anlisis bioqumico NOM-114-SSA1-1994.
Objetivo
Usando las tcnicas adecuadas, al finalizar sta prctica el alumno estar capacitado para
realizar la determinacin de salmonella en muestras de alimentos.
Reactivos
Agua de peptona tamponada
Agar sulfito bismuto, para
placas.
Agar SS para Salmonella y
Shigella para placas.

Caldo lactosado, sin distribuir
Material
Equipo
Aguja y asa de inoculacin
con alambre de nicrom o de

platino-iridio
Instrumentos
para
la
cuchillos, pinzas, tenedores,

tijeras, cucharas, esptulas,
y en tubos con 10 ml, segn
todos
precise
esterilizados o pasteurizados
Caldo tetrationato, sin
distribuir y en tubos con 10 ml,

segn precise.
previamente
Pipetas bacteriolgicas de 1,
1.1, 5 y 10 ml.
Placas de Petri, de vidrio
Solucin verde brillante
(100x15 mm) o de plstico
Solucin de yodo-yoduro.
(90x15 mm)
Matraces Enlermeyer de 500
ml.
Tubos de ensayo de 16 x
150 y 20 x 100 mm.
32
de
esterilizacin.
Autoclave con
preparacin de la muestra:
ellos
Horno
termmetro y
manmetro.
Licuadora, vaso de
licuadora con tapa

esterilizable.
Balanza granataria.
Incubadora
termostato.
con

Preparacin de la muestra
La preparacin de la muestra se basara en el anlisis de 25 g de la muestra en una
proporcin de 1:9 de muestra-caldo lactosado.
Procedimiento
Pesar 25 g de la muestra y homogeneizar con 225 ml de medio de pre-enriquecimiento
(caldo lactosado) y licuar durante 1 minuto. Posteriormente transferir a un recipiente de
boca ancha con tapa de rosca y dejar reposar 60 min a temperatura ambiente. Mezclar y
ajustar a un pH de 6.8 con NaOH o HCL. 1N. incubar 24 hr a 35C.
Transferir 1 ml del cultivo de pre-enriquecimiento a un tubo que contenga 10 ml de caldo
tetrationato e incubar 24 hr a 35 C.
Para los dems productos
Aislamiento en medios de agar para salmonelas
Agitar los frascos de cultivo y con la ayuda de una asa sembrar por estra en medios
diferentes selectivos: agar verde brillante, agar sulfito bismuto y agar SS.
Procurar
obtener por cada tubo , colonias aisladas sobre la superficie de cuando menos dos placas
por medio diferencia selectivo. Incubar a 35C durante 24 horas. Observar los cultivos
para identificar morfolgicamente las colonias sospechosas. En el medio de agar verde
brillante las colonias de salmonela se presentan como colonias rojas o rosas rodeadas por
medio rojo; las bacterias fermentadoras de lactosa dan colonias amarillas.
En agar sulfito de bismuto las colonias son negras o cafs, con o sin brillo metlico,
rodeado de un halo caf que posteriormente se transforma en negro.
La salmonela desarrollada en el medio de agar SS como colonias traslucidas,
transparentes u opacas y algunas veces con centro negro. Las colonias fermentadoras de
la lactosa son rojas.
Referencias:
Norma Oficial Mexicana NOM-114-SSA1-1994, Bienes Y Servicios. Mtodo Para La
Determinacin De Salmonella En Alimentos (Salud., 2015)
33

PRCTICA 8: RECUENTO DE STAPHYLOCOCCUS AUREUS
Introduccin
El gnero Staphylococcus se describe como Gram (+), crece aisladamente, en parejas, en
ttradas o agrupaciones irregulares parecidas a racimos de uvas.
Los Staphylococcus se encuentran en las fosas nasales, la piel y en lesiones de humanos y
otros mamferos.
Su determinacin se utiliza como componente de los criterios microbiolgicos para alimentos
cocidos, para productos que son sometidos a manipulacin excesiva durante su preparacin
o despus del proceso trmico.
Cuando los alimentos se someten al proceso trmico y muestran altos recuentos de
Staphylococcus generalmente se debe a que la contaminacin proviene de la posterior
manipulacin, contacto con equipo o aire contaminado y/o conservacin inadecuada del
mismo. Este gnero comprende varias especies dentro de las cuales estn S. aureus, S.
epidermidis y S. saprophyticus.
Un nmero elevado de estos microorganismos puede indicar la presencia de toxinas
termoestables, no obstante, un recuento bajo no significa ausencia de las mismas ya que una
poblacin numerosa pudo haberse reducido a un nmero ms pequeo debido a una etapa
del proceso, por ejemplo, calentamiento o fermentacin.
El crecimiento de S. aureus en alimentos tiene gran importancia por tratarse de un
microorganismo capaz de producir una poderosa enterotoxina que al ingerirse causa severas
intoxicaciones alimentarias.
Los lineamientos de la siguiente prctica estn basados en el mtodo propuesto por la Norma
Oficial Mexicana NOM-115-SSA1-1994.
32

Objetivo
Al finalizar esta prctica el alumno estar capacitado para realizar la identificacin y el
recuento de Staphylococcus aureus en muestras de alimentos.
Material, equipo y reactivos

Reactivos
Material
Equipo
Agar Baird-Parker
Aguja y asa de inoculacin Balanza analtica
Yema de huevo
Instrumentos
para
la Bao con agua circulante a
preparacin de la muestra
(previamente
esterilizados)
430.005 C
Estufa de incubacin a 3537C
Vaso homogenizador
Pipetas bacteriolgicas de
1ml
Placas Petri
Varilla de vidrio acodada
Procedimiento
Preparar las muestras de alimento para su dilucin. Para hacer las diluciones pueden
utilizarse los tubos de dilucin o frascos de diluyentes sobrantes del mtodo de recuento
en placa. Importante: una vez hechas las diluciones del alimento, debe procurarse que
transcurra el menor tiempo posible hasta que se realizan las siembras, pues as se evita
la multiplicacin o muerte de los organismos suspendidos en el diluyente.
Utilizando una pipeta por dilucin, transferir alcuotas de 0.1 ml de las diluciones 10 -1, 10-2
y 10-3 sobre la superficie de placas de Petri conteniendo medio Agar Baird-Parker. Las
diluciones que han de prepararse y sembrarse siempre sern funcin del recuento
esperado.
33

Distribuir el inculo sobre la superficie del medio utilizando para ello varillas estriles de
vidrio dobladas en ngulo recto. Usar una varilla para cada dilucin.
Mantener las placas en su posicin hasta que el inculo sea absorbido totalmente por el
agar. Invertir las placas e incubarlas durante 45-48 horas a 35 C.
Con la ayuda del contador de colonias y el dispositivo de recuento con registro
automtico, contar las colonias en aquellas placas que contengan entre 20 y 200, colonias
tpicas de Staphylococcus aureus. Si esto no fuera posible, seleccionar las placas de las
diluciones ms altas aunque en ellas se cuenten ms de 200 colonias. Las colonias
tpicas son negras, circulares, brillantes, de 2-3 mm de dimetro y rodeadas de una zona
clara. Sin embargo, en este tipo de alimentos pueden aparecer colonias negras sin brillo,
que no presentan zona clara.
Calcular en nmero de Staphylococcus aureus por gramo o mililitro de alimento.

PRUEBA DE COAGULASA
Elegir el nmero de colonias para realizar la prueba de la coagulasa de acuerdo a la tabla
8.1 y sembrar el nmero de colonias seleccionadas, en 0.5 ml de caldo infusin cerebro
corazn.+
Despus del periodo de incubacin, pasar con una pipeta de 1 ml 0.2 ml del cultivo
anterior colocar una osada de cada columna relacionados en un tubo de ensayo que
contenga 0.2 ml de plasma de conejo.
Incubar en un bao de agua de 35 a 37 C y observar a intervalos de 1 hora hasta seis; si
hay formacin de cogulo. Observar a las 24 horas. Considerar positiva la prueba si hay
formacin de cogulo.
Tabla 8.1 Seleccin del nmero de colonias para la prueba de la coagulasa

Nmero de colonias sospechosas en la
placa
Nmero de colonias a probar
32

Menos de 50
51 a 100
3
5
101 a 200 o ms
Referencias:
Norma Oficial Mexicana NOM-115-SSA1-1994, Bienes Y Servicios. Mtodo Para La
Determinacin De Staphylococcus Aureus En Alimentos. (Salud., 2015)
33

Referencias
Federacin, D. O. (10 de 06 de 2015). Diario Oficial de la Federacin . Obtenido de Diario

Oficial
de
la
Federacin
:
http://dof.gob.mx/nota_detalle.php?codigo=4671146&fecha=16/07/1981
Salud, S. d. (22 de 06 de 2015). Secretara de Salud. Obtenido de Secretara de Salud:
http://www2.sepdf.gob.mx/petc/archivos-documentosrectores/nom_093_SSA11994.pdf
Salud, S. d. (22 de 06 de 2015). Secretara de Salud. Obtenido de Secretara de Salud:
http://www.salud.gob.mx/unidades/cdi/nom/092ssa14.html
32

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