anexo 1

Revista Cubana de Plantas Medicinales

versin On-line ISSN 1028-4796

RevCubanaPlantMedv.15n.2CiudaddelaHabanaabr.jun.2010

Actividad antioxidante y contenido de fenoles totales de

algunas especies del gnero Calophyllum
Antioxidant activity and total phenols content from some species
of Calophyllum genus
Ana M. Mesa-VanegasI; Carlos A. GaviriaII; Felipe CardonaIII; Jairo A. Sez-Vega
Blair TrujilloV; Benjamn A. RojanoVI

; Silvia

IV

Qumica. Grupo de Investigacin Malaria. Sede de Investigacin Universitaria (SIU). Facultad de Medicina,
Universidad de Antioquia. Medelln, Colombia.
II
Ingeniero Qumico. Grupo de Investigacin en Ciencias de los Alimentos. Universidad Nacional Sede
Medelln. Medelln, Colombia.
III
Mster en Ciencias en Sistemtica Vegetal. Bilogo. Grupo de Estudios Botnicos. Director Herbario
Universidad de Antioquia. Medelln, Colombia
IV
Doctor en Ciencias Farmacuticas. Grupo Qumica de Plantas Colombianas, Instituto de Qumica,
Universidad de Antioquia. Medelln, Colombia.
V
Mster en Ciencias en Historia de la Ciencias. Mdica. Grupo de Investigacin Malaria. Sede de
Investigacin Universitaria (SIU). Facultad de Medicina, Universidad de Antioquia. Medelln, Colombia.
VI
Doctor en Ciencias Qumicas. Laboratorio de Ciencias de los Alimentos. Escuela de Qumica. Universidad
Nacional de Colombia Sede Medelln. Medelln, Colombia.
I

la bsqueda de nuevos compuestos antioxidantes naturales ha sido de gran inters para la

investigacin dado que interrumpen el proceso de oxidacin por va radicalaria de lpidos, protenas,
ADN y enzimas. El gnero Calophyllum perteneciente a la familia Clusiaceae, produce una gran variedad
de metabolitos secundarios con caractersticas antioxidantes; los flavonoides, las coumarinas y las
xantonas resultan los compuestos ms reportados. Las especies de este gnero pueden ser una fuente de
antioxidantes potenciales.

Palabras clave: actividad antioxidante, radicales libres, Calophyllum.

El estrs oxidativo surge en sistemas biolgicos despus de una prolongada exposicin a oxidantes,
o a una disminucin de la capacidad antioxidante del sistema, o a ambas; y est frecuentemente
asociado con la generacin de radicales libres como las especies reactivas oxigenadas (EROs), las
cuales estn fuertemente implicadas en la patologa de enfermedades como el cncer,
enfermedades cardiacas, arterosclerosis; enfermedades cerebrales y el envejecimiento prematuro, entre
otras.1,2 Cuando un exceso de radicales libres se forma, puede causar la inhibicin de enzimas como la
superxido dismutasa, catalasas y peroxidasas. Esto genera efectos letales en las clulas por la oxidacin
de lpidos, protenas, DNA y enzimas; ocasionando reacciones en cadena que perpetan la produccin de
ms radicales libres y aumenta el dao de tejidos. Sin embargo, los compuestos antioxidantes tienen la
capacidad de inhibir o interrumpir las reacciones de transformacin que causan daos a las mencionadas
biomolculas.3

En los ltimos aos, los antioxidantes naturales provenientes de plantas han sido frecuentemente usados
en diferentes campos de la industria farmacutica como preservantes en alimentos y en medicina. Muchos
de estos compuestos como la quercetina, -tocoferol y el -caroteno, entre otros, son antioxidantes
naturales, que presentan una actividad comparable con antioxidantes sintticos de mayor uso como el 2terbutil-hidroxitolueno (BHT) y el 2-terbutil-hidroxianisol (BHA); los cuales sin embargo, pese a sus
propiedades antioxidantes presentan la desventaja de ser txicos.4
El gnero Calophyllum tiene alrededor de 200 especies, con una distribucin pantropical; muchas especies
con propiedades medicinales. Son empleadas para tratar enfermedades como ulceras gstricas,
infecciones patolgicas, procesos inflamatorios.5 De algunas plantas del gnero Calophyllum existen
reportes sobre compuestos tipo xantonas, esteroides, triterpenos, biflavonoides, piranocumarinas y
benzopiranos.6 Calophyllum brasiliense Cambess, es una planta empleada en la medicina popular para el
tratamiento de varias enfermedades, a la cual se han realizado diferentes estudios fitoqumicos y
farmacolgicos; adems, es la especie ms conocida y empleada como producto maderable por las
constructoras, para pisos e inmobiliarias. Las hojas, los tallos y las races de C. brasiliense se emplean
para el tratamiento del reumatismo, hemorragias, lceras, inflamaciones y se ha confirmado su actividad
biolgica en reportes con actividad analgsica, antiviral, antifngica, citotxica antiulcerognico,
antitumoral, antibacteriana, moluscicida.7 Respecto a la actividad antioxidante, solo un reporte de C.
brasiliense de los extractos acuoso, metanlico y etanlico fueron determinados con 110,56, 99,17 y
99,57 % de inhibicin, respectivamente, a una concentracin de 100 g/mL, mediante el mtodo de
captacin de radicales libres DPPH.8 Calophyllum inophyllum es empleada como planta medicinal y
ornamental, se reconoce por sus propiedades teraputicas: reumatismo, blenorragia y sarna, lceras y
fiebres, con reportes de actividad antitumoral, antiviral, antibacteriana.9 Se han reportado molculas de
tipo triterpenoides como la friedelina y la secofriedelina con potente inhibicin de HIV-1. No hay reporte
sobre actividad antioxidante de esta especie.
En este estudio se pretende determinar la capacidad antioxidante de extractos de diferente polaridad de
las especies Calophyllum cf. brasiliense Cambess, Calophyllum inophyllum L. y Calophyllum sp., midiendo
la actividad antioxidante por diferentes metodologas: fenoles totales, ABTS, DPPH, FRAP y en algunas
muestras seleccionadas el mtodo ORAC, con el fin de caracterizar el potencial reductor de los diferentes
extractos de estas tres plantas y poder ampliar su uso en diferentes enfermedades donde los procesos
oxidativos sean relevantes.10,11

Reactivos y equipos
El radical libre DPPH (1,1-difenil2-picrilhidracil), fosfato cido de sodio, MeOH, tricloruro de hierro, 2,4,6tri(2-piridil)triazina (TPTZ), 2,2-azinobis-(3 etilbenzotiazolin-6-sulfnico) (ABTS), AAPH [2,20-azo-bis(2amidinopropano) dihydrochlorido] usado como una fuente de radicales peroxilos, Trolox (cido 6-hidroxi2,5,8-tetrametilchromano-2-carboxlico), fluoresceinato de sodio, cido ascrbico fueron obtenidos de
Sigma Chemical Co. (St. Louis, MO), Folin-Ciocalteau fue obtenido de Merck (Darmstadt, Germany). El
agua usada en los experimentos es grado HPLC. Los ensayos ORAC se realizaron en un espectrofotmetro
de fluorescencia, Perkin Elmer LS55; los ensayos de absorcin UV- Vis se hicieron en un espectrofotmetro
Jenway 6405.
Material vegetal y elaboracin de los extractos: se obtuvieron tres tipos de muestras a partir del material
vegetal; muestras para especmenes de herbario con el fin de lograr una clasificacin taxonmica clara de
cada especie y como testigos de los especmenes colectados, as como muestras de hojas y tallos para la
obtencin de extractos. Los especmenes de herbario fueron procesados y depositados en el herbario
Universidad de Antioquia (HUA), y se determinaron como Calophyllum cf. brasiliense Cambess colectado
en el departamento de Antioquia (voucher 162,467), Calophyllum inophyllum L. colectado en el
departamento de Caldas (voucher 149,140) y Calophyllum sp. colectado en el departamento de Risaralda
(voucher 167,392).

El material vegetal [hojas de C. brasiliense (CBH), tallos de C. brasiliense (CBT), hojas y tallos C.
inophyllum L.(CIHT), hojas y tallos de Calophyllum sp. (CSHT) seco, molido de cada una de las especies],
se extrajo sucesivamente por percolacin con hexano (CBTExtH, CBHExtH CIHTExtH y CSHTExtH),
diclorometano (CBTExtD, CBHExtD CIHTExtD y CSHTExtD), acetato de etilo (CBTExtAE, CBHExtAE
CIHTExtAE y CSHTExtAE) y metanol (CBTExtM, CBHExtM CIHTExtM y CSHTExtM), concentrados a presin
reducida en un rotaevaporador y posteriormente pesados. Los extractos se monitorearon por
cromatografa de capa delgada con fase estacionaria de slica gel 60 GF254 Merck, mediante diferentes
sistemas de elucin y revelando con solucin etanlica (5 % de cido sulfrico en etanol y 1 % de
vainillina) para determinar la presencia de cumarinas y solucin de DPPH (200 mg/L) y as determinar la
decoloracin de posibles compuestos antioxidantes.
Contenido de fenoles totales (CFT): la determinacin de fenoles se realiz por el mtodo colorimtrico de
Folin-Ciocalteu.12 Se construy una curva patrn usando como estndar cido glico. Se diluy el extracto
a una concentracin en la cual el contenido de fenoles se encontraba dentro del intervalo de la curva
patrn. Los resultados se expresaron como mg de cido glico/100 g de extracto. Las lecturas se
realizaron a 760 nm.
Evaluacin de la actividad antioxidante
Ensayo de decoloracin del catin radical --difenil--picrilhidrazilo (DPPH): para cuantificar la capacidad
captadora de radicales libres de los extractos se determina el grado de decoloracin que provocan sus
componentes a una solucin metanlica de DPPH mediante el mtodo de Brand-Williams, con algunas
modificaciones.13,14 Se prepar una solucin madre de DPPH aproximadamente 20 mg/L del radical en
metanol, 990 L de esta solucin se mezclaron con 10 L de solucin de extracto (a diferentes
concentraciones). Se prepar un blanco de muestra que contena 990 L MeOH con 10 L de muestra y un
blanco de referencia con 990 L DPPH y 10 L de solvente. Se incub a temperatura ambiente durante 30
min en la oscuridad y se midi la absorbancia a 517 nm. Los resultados se expresaron como valores TEAC
(trolox equivalent antioxidant capacity) mediante la construccin de una curva patrn usando como
antioxidante TROLOX.
Ensayo de decoloracin con el radical catinico ABTS+: se fundamenta en la cuantificacin de la
decoloracin del radical ABTS+, debido a la interaccin con especies donantes de hidrgeno o de
electrones.15 El radical catinico ABTS+ es un cromforo que absorbe a una longitud de onda de 734 nm y
se genera por una reaccin de oxidacin del ABTS (2,2'-azino-bis- (3-etil benzotiazolin-6-sulfonato de
amonio) con persulfato de potasio. Las mediciones se realizaron a una longitud de onda de 734 nm.15 En la
evaluacin se utilizaron 10 L de extracto y 990 L de la solucin del radical ABTS+. A los 30 min de
reaccin a temperatura ambiente y en la oscuridad, se ley el cambio en la absorbancia respecto a la
referencia del reactivo, a una longitud de onda de 734 nm. La referencia del reactivo consisti en una
solucin del radical ABTS+ con el solvente de la muestra. Los resultados se expresaron como valores TEAC
(trolox equivalent antioxidant capacity) mediante la construccin de una curva patrn usando como
antioxidante TROLOX.
Ensayo FRAP (ferric reducing/antioxidant power): este mtodo evalu la capacidad antioxidante de una
muestra de acuerdo con su capacidad para reducir el hierro frrico (Fe+3) presente en un complejo con la
2,4,6-tri(2-piridil)-s-triazina (TPTZ) hasta la forma ferrosa (Fe+2), que tuvo un mximo de absorbancia a
una longitud de onda entre 590-595 nm.16 Este ensayo se llev a cabo en un buffer cido actico-acetato
de sodio (pH 3,4), que contena TPTZ y FeCl3. Se utilizaron 900 L de esta solucin, 50 L de muestra y
50 L de agua destilada. Luego de 60 min de reaccin se determin la absorbancia a una longitud de onda
de 593 nm. Para cada muestra se tuvo en cuenta la lectura de la absorbancia del blanco sin cromforo, de
la misma manera que en las pruebas anteriores. La curva de referencia se construy usando cido
ascrbico como patrn primario Las actividades de las muestras se expresaron como AEAC (ascorbic acid
equivalent antioxidant capacity: mg de cido ascrbico/100 g extracto).
Ensayo ORAC (oxygen radical absorbance capacity): el procedimiento experimental estuvo basado en
reportes previos de Ou y otros,17-19 en el cual se empleaba Trolox como estndar y condiciones controladas
de temperatura a 37 C y pH 7,4. Las lecturas se realizaron a una l de excitacin 493 nm y slit de
excitacin 5, l de emisin 515 nm y slit de emisin 13, con atenuador de 1 % y sin placa atenuadora. Para

el desarrollo de la tcnica se utilizaron soluciones de fluorescena 1x10-2 M en PBS (75 mM), AAPH 0,6 M
en PBS (75 mM). La muestra contena 21 L de fluorescena, 2,899 L de PBS, 30 L del extracto
ensayado y 50 L de AAPH. Como referencia se uso Trolox. El efecto protector del antioxidante fue
calculado usando las diferencias de reas bajo la curva de decaimiento de la fluorescena entre el blanco y
la muestra, se compar contra la curva del Trolox y se expres en micromoles equivalentes de Trolox por
gramo de muestra (mol Tx/g muestra), de acuerdo con la ecuacin siguiente:

Donde AUC es el rea bajo la curva de la muestra, AUC rea bajo la curva para el control, AUCTrolox rea
bajo la curva para el Trolox, f es el factor de dilucin de los extractos.18,19
Anlisis estadstico
Las mediciones se realizaron por triplicado y los resultados se presentaron como la media y su desviacin
estndar (DE). Todos los clculos se realizaron en el programa estadstico STATGRAPHICS Plus 2.0.

Los rendimientos de la extraccin provenientes de las tres diferentes especies de Calophyllum se

presentan en la tabla 1.
Los porcentajes de material extractable con los diferentes solventes mostraron mejores rendimientos para
CBH y los rendimientos mximos de extraccin se obtuvieron para los extractos metanlicos de todas las
especies siendo el porcentaje en peso con respecto al material vegetal seco result de 3,72 % para
CBH, 2,61 % para CBT, 3,59 % para CIHT y 8,14 % para CSHT.
Los resultados obtenidos con el empleo de 4 metodologas diferentes para las 16 muestras analizadas, en
latabla 2 se presentan.

Contenido de fenoles totales: el mtodo Folin-Ciocalteau se emple para evaluar los grupos fenlicos
presentes en cada uno de los extractos obtenidos a partir de las tres especies del genero Calophyllum. Las
muestras evaluadas que presentaron un mayor contenido de fenoles (expresados en mg de cido glico/g
de extracto) fueron los extractos de acetato de etilo y metanol de las tres especies, especialmente las
codificadas como CSHTExtA, CBHExtA, CIHTExtM, CSHTExtM, CBTExtM, CBHExtM, CBTExtA, CIHTExtA,
con valores de 518 7,6, 493 19,6, 266 12,8, 248 8,7, 249 15,4, 245 10,4, 198 5,8 y 17
5,9, respectivamente. Las muestras con ms bajo contenido de fenoles se presentaron en los extractos de
hexano y diclorometano de las tres especies de Calophyllum, CBTExtH, CBTExtD, CBHExtH, CBHExtD,
CIHTExtH, CIHTExtD, CSHTExtH, CSHTExtD.
Ensayo de decoloracin del catin radical --difenil--picrilhidrazilo (DPPH): una notable capacidad de
inhibicin del DPPH presentaron todas las muestras analizadas (expresados en mol Trolox/g de extracto).
Las muestras con altos valores de TEAC fueron CSHTExtA (2 737 95,0), CBTExtM (2 651 93,5),
CIHTExtM (2 554 45,9), CSHTExtM (2 325 177,7), CBHExtA (1 946 109,0), CBHExtM (1 507
86,2).
Ensayo de decoloracin con el radical catinico ABTS+: la cuantificacin de la decoloracin del radical
ABTS+se genera debido a la interaccin con especies donantes de hidrgeno o de electrones. El extracto
metanlico de los tallos de Calophyllum cf. brasiliense Cambess (CBTExtM) present los valores ms altos

de inhibicin del radical ABTS (8 492 568,7), seguido de los extractos codificados como CIHTExtM (7
153 167,1), CBHExtH (7 077 93,5) y CSHTExtA (6 791 368,1).
Ensayo FRAP (ferric reducing/antioxidant power): los valores ms altos como reductores lo poseen los
extractos de acetato de etilo y metanlico; especficamente las muestras CSHTExtA (79416 2133,3)
seguido de CBHExtA (57458 2474,0), CIHTExtM (47261 595,0), CSHTExtM (45076 857,3) y
finalmente CIHTExtM (43266 974,6).
Ensayo ORAC (oxygen radical absorbance capacity): en la tabla 3 se presentan los valores ORAC
expresados como moles Trolox/g de los extractos de las muestras CBTExtM, CIHTExtM, CSHTExtA,
CSHTExtM, CBHExtA y CBHExtM. El ms alto valor de ORAC fue para la muestra CBHExtM con valores de
11 644 1 902, y el ms bajo encontrado fue para la muestra CBHExtA con un valor de 3 491 400.
Los 5 extractos seleccionados en este trabajo estn muy por encima de esos valores; de tal manera que
los extractos medianamente polares y polares de las especies estudiadas del gnero Calophyllum tienen
una alta capacidad reductora y pueden tener un gran potencial para ser usados en diferentes eventos
biolgicos donde los mecanismos redox sean los ms relevantes.
Se realizan correlaciones entre las diferentes tcnicas de evaluacin antioxidante: en la figura 1 se
presentan los valores TEAC de ABTS+ vs. fenoles totales con R2= 9,82, en la figura 2 los valores TEAC de
DPPH vs.fenoles totales con R2= 81,0, en la figura 3 los valores FRAP vs. fenoles totales con R2= 89,5, y
en la figura 4 el ensayo FRAP vs. DPPH con R2= 88,9, como parmetro descriptivo para entender el
mecanismo oxidativo de las muestras evaluadas.
Los extractos polares y medianamente polares de las tres especies de Calophyllum presentaron una
promisoria actividad antioxidante en las metodologas evaluadas y un alto contenido de fenoles. Ninguna
asociacin se encontr entre los rendimientos de extraccin, el contenido de fenoles totales y las dems
pruebas que se realizaron. Sin embargo, se hicieron correlaciones entre las diferentes pruebas para
discutir los resultados y tener una idea del mecanismo de accin de los antioxidantes presentes en las
muestras analizadas.
Correlaciones entre los fenoles totales y las actividades antioxidantes: un buen antioxidante, para su
correcta evaluacin debe cumplir con muchos requisitos como: alta solubilidad en el medio, correcta
orientacin para interactuar con los radicales libres, proteger los lpidos oxidables, ser un buen reductor y
funcionar con alta reactividad, tener efectividad a diferentes pH. Sin embargo, ninguna tcnica de
medicin de la actividad antioxidante satisface las condiciones anteriores, y para tener una idea del
mecanismo de accin de los antioxidantes se deben establecer correlaciones entre el contenido de fenoles
y los diversos ensayos antioxidantes.20
Las medidas de los valores TEAC por la tcnica ABTS son muy altos; sin embargo, es una tcnica que no
permite discriminar extractos que contienen compuestos buenos antioxidantes como la gran mayora de
este trabajo; esto se debe a la labilidad del reactivo ABTS+, una estructura completamente plana que
reacciona fcilmente con reductores mediante un mecanismo SET y(o) HAT,21 lo anterior se refleja en la
poca correlacin entre los valores TEAC de ABTS+ vs. fenoles totales (R2= 9,82).
La concentracin de fenoles totales contra la actividad antioxidante, expresada como TEAC por el ensayo
DPPH tienen una correlacin de 81 %. Mientras que la regresin lineal entre FRAP y fenoles totales
describe en 89,5 % el fenmeno oxidativo; de tal manera, que la mayora de los compuestos fenlicos
contenidos en los extractos de las especies de Calophyllum son buenos antioxidantes y, en su mayor
parte, se expresan muy bien como agentes reductores que reaccionan fundamentalmente mediante un
mecanismo de transferencia de electrones SET. Los valores TEAC por el ensayo DPPH y AEAC FRAP, tienen
una alta correlacin entre ellos (R2= 88,9), por lo tanto, ambas tcnicas describen de igual forma el
mecanismo oxidativo, que result ms significativo estadsticamente el ensayo FRAP.22

Para concluir, los diferentes extractos obtenidos a partir de las tres especies de Calophyllum contienen
compuestos fenlicos reductores, especialmente en los extractos CBTExtM, CNHTExtM, CRHTExtA,

CRHTExtM, CBHExtA y CBHExtM, que adems, poseen valores ORAC muy altos comparados con
otros sustratos conocidos como las especies del gnero Vaccinium. La tcnica FRAP describe muy
bien el fenmeno oxidativo en los extractos CSHTExtA, CBHExtA, CIHTExtM, CSHTExtM y
CIHTExtM; en el ensayo de decoloracin del catin radical --difenil--picrilhidrazilo (DPPH), el
extracto que present los valores ms altos de TEAC por ambas metodologas, fue el extracto de acetato
de etilo Calophyllum sp. (CSHTExtA). El extracto metanlico de los tallos de Calophyllum cf.
brasiliense Cambess (CBTExtM) present los mejores valores de inhibicin del radical ABTS. En el mtodo
ORAC que generalmente es considerado de alto nivel, debido al uso de los radicales libres de importancia
biolgica, el extracto que present mejores valores fue el extracto metanlico de los tallos deCalophyllum
cf. brasiliense Cambess (CBTExtM). Las mediciones de la actividad antioxidante por diferentes tcnicas,
ofrecen ventajas en trminos de la prediccin de la capacidad antioxidante in vitro.22

Al apoyo financiero brindado por el Ministerio de Agricultura de Colombia proyecto (No. 0092007-V7552-38-07): Caracterizacin y actividad antimalarica de metabolitos secundarios de
algunas especies de plantas medicinales nativas de los gneros Piper y Calophyllum, para el
desarrollo de productos farmacuticos con actividad antimalarica. A la Universidad de Antioquia
y a la Universidad Nacional de Colombia, sede Medelln.

1. Kohen R, Nyska A. Oxidation of biological systems: Oxidative stress phenomena,

antioxidants, redox reactions, and methods for their quantification. Toxicologic Pathology.
2002;30(6): 620-50.
2. Kohen R, Chevion S, Schartz R, Berry EM. Evaluation of the total low molecular weight antioxidant
activity of plasma in health and diseases: a new approach. Cell Pharmacol. 1996;3:335-59.
3. Halliwell B. Antioxidants in human health and disease. Annual Review Nutrition. 1996;16(1):33-50.
4. Ito N, Fukushima S, Hagiwara A, Shibata M, Ogiso T. Carcinogenecity of butylated hydroxyanisole in
F344 rats. J Natl Cancer Inst. 1983;70(2):343-52.