Muestreo de material vegetal y mtodos de

desinfeccin en cultivo in vitro en planta

de guaba (Inga feuilleei)
Prez Fernanda, Medina Michell
Departamento de Ciencias de la Vida, Universidad de las Fuerzas Armadas-ESPE
Sangolqu, Ecuador
fefi_feps@hotmail.com
lore_mp13@hotmail.com

Resumen Para un proceso correcto de

desinfeccin se debe empezar por la limpieza del
rea y de los materiales de trabajo, se debe tener en
cuenta que la principal fuente de contaminacin de
un explante es el operador.
Se recolect yemas axilares obtenidas de planta de
guaba (Inga feuilleei), este tipo de plantas se ve
afectada por la presencia de tricomas, luego se
determin un protocolo adecuado de desinfeccin
especfico para este tipo de explantes con el fin de
evitar la contaminacin en cultivos in vitro. Se
realiz la limpieza respectiva pero se omiti el paso
de la aplicacin de fungicidas, despus de diez das
de siembra se observ la presencia de oxidacin en
el explante uno y crecimiento de hongos en el
explante dos.
Palabras clave: disinfection, protocolo, in vitro,
tricomas
Abstract For a correct process of disinfection it is
necessary to begin for the cleanliness of the area and
the materials of work, you must remember that the
principal pollution source of an explant is the
operator.
Axillary buds were obtained from guaba (Inga
feuilleei), this kind of plants are affected by the
presence of trichomes, then a suitable protocol of
disinfection decided specific for this type of
explantes in order to avoid the pollution in in vitro
cultivation. The respective cleanliness was realized
but there was omitted the step of the application of
fungicides, after ten days of sowing the presence of
oxidation observed in the explant one and growth of
fungi in the explant two.
Key words: disinfection, protocol, in vitro, trichomes
I. INTRODUCCIN
La guaba Inga feuilleei es un rbol pequeo, de hasta
10 metros de altura, habitualmente ramificado desde la
base; la copa es densa, de follaje verde brillante; hojas
compuestas, raquis alado, con 4-6 pares de foliolos
elpticos; envs del foliolo e inflorescencias con pelos

cortos enredados; inflorescencias axilares solitarias o

en pares; las flores dispuestas en una espiga compacta,
poco fragantes, de color verde amarillento (Pennington,
1997).
En la etapa de seleccin de la planta madre y de la
parte que dar origen al material vegetal es conveniente
utilizar rganos, tejidos o clulas de plantas jvenes,
porque se ha constatado que la edad fisiolgica del
explante presenta enorme influencia en la morfognesis
(Roca & Mroginski, 1993).
La obtencin de un cultivo completamente asptico
es una parte importante del cultivo in vitro, puesto que
el material a introducirse puede contener
vitropatgenos, el cual es un trmino usado para
denominar a aquellos microorganismos que no son
necesariamente patgenos para las plantas en el campo,
pero s son perjudiciales para clulas, tejidos u rganos
cultivados in vitro. Estos microorganismos en los
medios de cultivo resultan perjudiciales debido a que
utilizan los nutrientes de ste y producen una fuerte
presin de competencia con el explante, producen
daos directos e indirectos por la colonizacin en
tejidos o por segregacin de metabolitos txicos,
adems pueden disminuir los coeficientes de
multiplicacin, inhibir el enraizamiento y finalmente
causar la muerte del explante (Hernndez, 2007). De
ah la trascendencia de del procedimiento de
desinfeccin superficial del material vegetal, pero hay
que recalcar que este procedimiento debe causar el
menor dao posible al explante, con el objetivo de
mantener la viabilidad del explante y permitir su
desarrollo (Roca & Mroginski, 1993).
Nos hemos planteado como objetivo Evaluar el
mtodo de desinfeccin escogido de acuerdo al tipo de
explante obtenido de guaba (Inga feuilleei) para la
posterior siembra en cultivo in vitro.
II. MATERIALES Y MTODOS
Se recolect muestras de la planta madre Inga
feuilleei ubicada en el campus de la ESPE matriz en

Sangolqu-Ecuador a una latitud de 01849S y una

longitud de 782651O.
La recoleccin de la muestra se realiz con tijeras
previamente esterilizadas en autoclave cortando entre
los nudos de las hojas ms jvenes de la planta y se las
almacen en frascos autoclavados con agua estril.
Una vez recolectadas las muestras se elimin las hojas
con una tijera desinfectada con alcohol al 70% con el
propsito de dejar la yema descubierta. Al obtener los
explantes se enjuag
minuciosamente con agua
corriente para retirar tierra o cualquier insecto; se
coloc los explantes en un frasco estril con detergente
y se mantuvo en agitacin durante 20 minutos
posteriormente se realiz lavados con agua destilada
hasta eliminar todo el detergente.
Seguidamente se someti a los explantes a una
inmersin en etanol al 70% durante 1 minuto y se
realiz 3 enjuagues con agua destilada estril.
Luego se llev los explantes a cmara de flujo laminar
previamente desinfectada con alcohol, y en condiciones
aspticas se someti a los explantes a una
concentracin de hipoclorito de sodio a una
concentracin de 1.5 % v/v a un tiempo de inmersin
de 15 min; se realiz tres enjuagues con agua destilada
con un tiempo de duracin de 1 min cada uno.
Terminado el proceso de desinfeccin se coloc los
explantes sobre servilletas estriles, se realizaron
cortes con el bistur de la parte basal y de algunos
foliolos que se vieron afectados por el proceso de
desinfeccin.
Por ltimo se inocul los explantes en el medio de
cultivo de Murashinge & Skoog enriquecido con 24D.

III. RESULTADOS
En la figura 1 se observ la oxidacin de los
extremos superiores del explante, esta oxidacin se
present diez das despus de la siembra.

Figura 1. Explante 1 de Inga feuilleei

En la figura 2 se constat el crecimiento de hongos

alrededor de la siembra del explante.

Figura 2. Explante 2 de Inga feuilleei

IV. DISCUSIN
Jensen et al. (1998) indican que los rganos jvenes
tienen mejor respuesta al establecimiento in vitro que
los obtenidos de materiales adultos, es decir, entre ms
joven y menos diferenciado sea un tejido, ms fcil
ser su adaptacin y respuesta al cultivo in vitro.
Es importante para el cultivo in vitro el uso de
tratamientos para eliminar microorganismos de la
superficie del explante. Adems el lugar de trabajo y
los materiales deben cumplir con esta condicin (Uribe,
2008).
La figura 2 muestra el crecimiento de hongos en el
medio de cultivo y se observa la ausencia de estos en la
figura 1. De acuerdo a estos resultados se determin
que durante la etapa de establecimiento y desinfeccin,
el punto condicional en la supervivencia y viabilidad
del explante es el tratamiento de asepsia aplicado,
debido a que un determinado protocolo no siempre es
el ms adecuado, ya que depender de la especie en
estudio (Uribe, 2008).
La presencia de tricomas en un explante permite que
se acumulen abundante cantidad de esporas y bacterias

a medida que trascurre el tiempo (Bonkievicz, 2007).

La contaminacin se vuelve mucho ms persistente en
yemas axilares y en tejidos con tricomas, debido a la
dificultad que tiene el desinfectante para ingresar en
estos lugares.
En la figura 2 se observ la presencia de hongos una de
las causas es que la presencia de tricomas constituyen
una forma de absorcin de humedad, lo que permite
crear en el explante una fuente de contaminacin,
siendo este medio preciso para el desarrollo de hongos
y esporas (Ely et al., 2005).
En la desinfeccin de segmentos nodales,
comnmente se emplea como mtodo estndar la
utilizacin de soluciones de detergente, etanol e
hipoclorito de sodio, esto ha sido el mtodo ms
empleado con gran xito para el establecimiento in
vitro de la mayora de especies leosas. Sin embargo
Gamborg (2002) seala que la principal fuente de
contaminacin en la especie Inga feuilleei es producida
por hongos, por lo que es necesario el uso de una
solucin antifngica para disminuir la contaminacin.
Por otra parte, el hipoclorito de sodio es uno de los
agentes esterilizantes ms empleados en la etapa de
desinfeccin del explante (Klopfenstein, 1997). En el
presente trabajo se realiz un tratamiento con
hipoclorito de sodio al 1,5% v/v con un tiempo de
inmersin de 15 minutos el cual presenta los mejores
resultados segn Lozano (2011), en el estudio de
propagacin in vitro de guarango (Caesalpinia
spinosa)
donde
logr
un
porcentaje
de
descontaminacin del 70%.
La desinfeccin de la superficie vegetal debe ser
eficiente para eliminar los contaminantes, causando
dao mnimo a las clulas vegetales. El efecto
fitotxico que produce el hipoclorito de sodio sobre los
tejidos vegetales, tambin es un factor limitante en el
cultivo de tejidos in vitro. En diversas especies se ha
demostrado que el empleo de dosis elevadas de agentes
desinfectantes elimina los microorganismos causantes
de la contaminacin, pero a su vez origina la muerte de
los explantes (Klopfenstein, 1997).
El empleo de enjuagues al explante, con agua
destilada esteril, posterior al proceso de desinfeccin es
fundamental para eliminar efectivamente el agente
desinfectante, del mismo modo para remover los
fenoles oxidados y otros productos del dao celular
establecidos en la preparacin y desinfeccin del
explante (Gamborg, 2002).

Se sugiere que la presencia de manchas oscuras en el

explante 1 se debe a un error en el proceso de
desinfeccin como lo seala Lozano (2011), en su
estudio donde se determina que al ser eliminados los
tejidos que han sido afectados durante el proceso de
desinfeccin mediante cortes, puede causar que muchos
de los explantes empiecen a perder el color verde e
inician un oscurecimiento, liberando frecuentemente
exudados oscuros al medio de cultivo que se sabe que
es una mezcla compleja de sustancias fenlicas .

V. REFERENCIAS
[1] JENSEN P J, R P HANGARTER, M ESTELLE.
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Mirocarpus frondosus. Integradora II, Carrera
de Ingeniera Forestal de la Facultad de
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[3] ELY, F., TORRES, F. & GAVIRIA, J. 2005.
Morfologa y anatoma foliar de Monochaetum
meridense. Acta botnica de Venezuela: 00845906
[4] GAMBORG, O. L. 2002. Plant tissue culture.
The technology. Part 1. Exegetics Ltd.
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[5] URIBE, M (2008). Efecto de asepsia y
fitohormonas en el establecimiento in vitro de
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nodales. Universidad de Concepcin, Facultad
de Ciencias Forestalles, Departamento de
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[6] KLOPFENSTEIN, N. 1998. Micropropagation
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Populus USA: Department of Agriculture.
[7] LOZANO, Z. 2011. Establecimiento de un
protocolo para la propagacin in vitro de
guarango Caesalpinia spinosa (molina) kuntze,
apartir de plntulas como herramienta para la
preservacin de esta especie. SangolquEcuador. Tesis pregrado
[8] PENNINGTON, T. 1997. El gnero Inga en el
Ecuador. Morfologa, Distribucin y Usos.
Reino Unido: The Royal Botanic Gardens Kew.
[9] ROCA, W., & MROGINSKI, L. 1993. Cultivo
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aplicaciones. Cali: Centro Internacional de
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