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RECURSOS
NATURALES Y
MEDIO AMBIENTE
I
Docente:
Alejandro Canaza Jorges
Contacto:
canaza.a@gmail.com
70373261
BIOLOGA
MOLECULAR
PCR
Aplicaciones
Revolucion la genetica
molecular.
PCR produce enorme
numero de copias de una
secuencia especifica de DNA
Descubrimiento de Taq
DNA polimerasa permite
automatizar la PCR
Elementos bsicos de
una reaccin de PCR
Un trozo de rgano
Un hisopado
Secreciones
Sangre
etc
Componentes de la
reaccin
Puesta a punto de la reaccin
Muestra de ADN
101 106 molculas
Buffer 10x
suministrado con el kit
Cl2 Mg
1.5 mM
dNTPs
50uM c/u (2uM-50uM)
Primer
20pmol c/u
Taq
0.5-2 Unidades
Muestra de ADN
Se pueden utilizar la mayora de mtodos habituales de
purificacin para la obtencin de ADN molde.
Muestra de ADN
La cantidad por reaccin deber ser 101 106
molculas
1ug ADN humano
1 ul sangre humana
30ul semen
10ng levadura
1ng E. Coli ADN
1 x 105 molculas
7.5 x 104 molculas
3 x 105 molculas
3 x 105 molculas
1.5 x 105 molculas
Muestra de ADN
Muy poco
Demasiado
Concentracin de Magnesio
El Mg+2 es necesario para catalizar la elongacin
de las DNA polimerasas.
Una concentracin baja de iones Mg+2 disminuye el
rendimiento de amplificacin.
Una concentracin excesiva de iones Mg+2 puede
causar la obtencin de productos inespecficos y
disminuir la fidelidad del producto de PCR.
Por tanto, debe calcularse la concentracin ptima
de MgCl2 para cada PCR.
Concentracin de Magnesio
El Mg+2 forma complejos con los cidos nucleicos
(molde, producto y primers) disminuyendo la eficiencia.
La presencia de agentes quelantes en la solucin de ADN
molde (ej. EDTA) disminuye la concentracin de MgCl2.
Concentracin de Magnesio
Concentracin de Magnesio
PCR deber contener entre 0.5 y 2.5 mM
de Cl2 Mg
La concentracin de Mg puede influenciar
en:
ADN target
Annealing
Especificidad y cantidad del producto
Incremento de la sensibilidad
Actividad de la enzima
Deoxinucleotido trifosfatos
(dNTPs)
Habitualmente se emplea una concentracin final de 200
M de la mezcla de los dNTPs.
La concentracin de dNTPs depende indirectamente de la
concentracin de MgCl2.
Deoxinucleotido fosfatos
(dNTPs)
Cuando se requiere mxima fidelidad de copia, la
concentracin final de dNTPs debe estar en el
rango de 10-50 M.
Tambin debe utilizarse enzimas con actividad exo 3'5' (proof-reading).
Deoxinucleotido fosfatos
(dNTPs)
PRIMERS
INS1:5CGTGAGGGCATCGAGGTGGC
INS2: 5 GCGTAGGCGTCGGTGACAAA
Primers
La concentracin de primers deber ser de entre 0.1 y
Primers
Se pueden disear primers para que los extremos
5 pueden contener:
Sitios nicos para enzimas de restriccin
CCATGG para incrementar la traduccin
Secuencias promotoras o mismatches internos
para estudios de mutagnesis
debajo de la verdadera TM
Para mejores resultados usar un rango de entre
55-72C
El annealing requiere solo unos pocos segundos
cuando se utilizan adecuada concentracin de
primers y T
Exigente T de annealing aumenta la
especificidad y reduce la misextension
de la secuencia blanco y de la T de la
reaccin
T cercanas a los 72 son las ptimas para la
mayora de las polimerasas
% de incorporacin: 35-100 nuc/seg
1min/72= 2Kb
Un ltimo ciclo largo para asegurar que todos
los amplicones tienen el tamao adecuado
producto.
Mucha enzima resulta en producto no
especfico
Sin embargo, si hay inhibidores presentes en la
mezcla de reaccin puede ser necesario utilizar
hasta 4-5 unidades de enzima.
Nmero de
ciclos
Normalmente 25-35 ciclos son suficientes en
Tiempo y T de
desnaturalizacin
Misincorporacin, background
y poca cantidad de producto
Fidelidad de la Taq
Tasa de error de la Taq es de 1 error en
400 bases luego de 25 ciclos
Reaccin bsica
Reactivo
Concentracin final
1X
0.2 mM
10 pmol
10 pmol
1U
1-4 mM
10 pg - 1 g
c.s.p. 50ml
Desnaturalizacin
Como el ADN sintetizado de novo es habitualmente de
menor tamao que el ADN molde, es suficiente con 30
seg-2 min a 94-95 C de desnaturalizacin.
Para productos con alto contenido en GC, el tiempo de
desnaturalizacin puede ser de hasta 3-4 min.
La desnaturalizacin se puede favorecer agregando:
Glicerol (hasta 10-15 % volumen)
DMSO (hasta el 10 %)
Formamida (hasta 5 %).
El Ciclador
El Termociclador es
programable.
Existen varios
modelos
El nmero de ciclos
vara entre 30 y 40
Pasos de la PCR:
Before
cycles
cycle
5
Before
cycle
43
Visualizacin del
Producto
Consta de dos
procedimientos:
Electroforesis en geles
de Agarosa
Fotografiado o captura
digital
Fotografiado
Pelcula Polaroid o
Interpretacin
Lnea 1: Marcador
Lnea 2: Control (-)
Lnea 3: Control (+)
Lnea 4 ,5, 6 y 7
Muestra 1, 2, 3 y 4.
Lnea 8: Marcador
1 2 3 4 5 6 7 8
Otros:
RFLP
Sonda
Aplicaciones de la PCR :
Aplicaciones de la PCR :
Medicina
forense:
Criminologia
Identif Cuerpo.
test de
Paternidad
Aplicaciones de la PCR :
Secuenciacion de DNA :