Departamento de Biotecnologa

Escuela de Industria Alimentaria y Biotecnologa

Enzimoinmunoanlisis de adsorcin
(ELISA)
Ensayo de inmunoadsorcin ligado a enzima para muestra problema
por mtodo indirecto.
Xiomara Campos Lorca
Fecha: 24 de Noviembre del 2016

RESUMEN
En base a las propiedades de las protenas de adsorberse a polmeros, se realiz ensayo
inmunoezimticos ELISA el que consiste en la identificacin de antgenos por medio de
anticuerpos especficos y enzimas conjugadas los anticuerpos que revelan de forma por
observacin directa la unin antgeno-anticuerpo, esto por la reaccin que ocurre en
presencia de sustratos cromognicos que lo catalizan generando producto coloreado. En
este prctico se realiz tcnica ELISA mtodo directo que por medio de un anticuerpo
primario y secundario (anticuerpo conjugado por enzima), permiti revelar y analizar la
presencia de anticuerpos en cuatro muestras problemas. Los resultados fueron
comparativos con tres muestra control positivos y tres controles negativos. Las muestras
problemas analizadas posteriormente a terminado el ensayo, arrojaron resultados claros de
positivos en muestras 1 y 3 ante la presencia de antgeno, y negativos en muestras 2 y 4
ante la ausencia del mismo. Sin embargo, se analizaron las posibles interferencias en los
resultados y limitaciones que tiene este ensayo.
Palabras Claves:
cromognico.
1

Antgeno,

anticuerpo

Introduccin

Los anticuerpos gracias a su capacidad de

recocer y unirse a un tipo especfico de
antgeno entre muchos antgenos similares
entre s, permite aplicaciones clnicas e
investigativas debido a su destacable
especificidad. Existen varias pruebas basadas
en la reaccin antgeno-anticuerpo, y aunque
esta reaccin es a nivel microscpico no
observable a simple vista, si puede ser
detectada
fcilmente.
El
ensayo
enzimoinmuanlisis (ELISA) es una prueba
serolgica que se basa en esta reaccin, sin
embargo, la caracteriza el uso de marcaje
enzimtico el cual permite la visualizacin de
la reaccin, ya que este al estar conjugado a
un anticuerpo (ya sea primario o secundario) y
ante la presencia de sustratos cromognicos
este reacciona catalizando y produciendo un
producto coloreado.
El ensayo ELISA es muy verstil y es por esto
que tiene variantes de la misma, se
consideran tres ms comunes de los
diferentes tipos: El ELISA directo, indirecto y
Laboratorio de Microbiologa Aplicada

primario,

anticuerpo

secundario,

sustrato

ELISA tipo sandiwch. Los ELISAs directo e

indirecto el antgeno se adsorbe en fase slida
(microplacas con pocillos de plsticos),
mientras que el tipo sndwich los pocillos
son recubiertos con anticuerpos (primario)
dirigidos en contra el antgeno a analizar o
identificar, para seguidamente aplicar el
antgeno y luego el segundo anticuerpo
anticuerpo
anti-antgeno
(marcado
por
enzima). La diferencia entre Los ELISAs
directos e indirecto es que en el primero se
utiliza slo un anticuerpo marcado con una
enzima
conjugada
en
l,
unindose
directamente en el antgeno de manera
especfica, mientras que en el segundo se
utiliza un segundo anticuerpo, el primario se
utilizar contra el antgeno y el secundario
marcado enzimticamente contra el primario.
El ELISA secundario presenta una mayor
sensibilidad debido a la utilizacin del segundo
anticuerpo, que permite una amplificacin de
seal debida a la unin covalente de dos o
ms anticuerpos secundarios por cada
primario.

1|P a ge

En este prctico por medio de ensayo ELISA

mtodo indirecto, se utilizara para la deteccin
y cuantificacin de un antgeno especfico en
una muestra simulada utilizando un anticuerpo
secundario conjugado con enzima peroxidasa
de rabanito (HRP) que reacciona ante
perxido de hidrgeno (H2O2) y el sustrato
TMB, este ltimo fue utilizado como sustrato
cromognico.
2
2.1

Materiales y Mtodos
Materiales

Microplaca con 12 pocillos de plstico, Buffer

PBS-Tween
20,
Micropipetas,
muestra
problema
con
antgeno
con
sus
correspondientes anticuerpos (primario y
secundario), sustrato cromognico (solucin
de tetrametilbencidina (TMB) y perxido de
hidrgeno), cmara fotogrfica. Todos los
materiales ocupados para el desarrollo
experimental fueron otorgados por las
dependencias del laboratorio de microbiologa
de la universidad.
2.2

Preparacin Ensayo ELISA, fijacin de

las muestra.

En una microplaca con 12 pocillos de

plsticos, se rotul tres de los pocillos con
controles positivos, tres con controles
negativos
y
cuatro
pocillos
que
correspondieron a las muestras problemas. A
cada pocillo se le adicion 5L de muestra
problema, junto con 5L de muestras con
controles positivos y negativos a los tubos
correspondientes. Se dej incubar por 5
minutos
para
seguidamente
eliminar
sobrenadante y se lavar con buffer PBS los
excesos no fijados de las muestras, este
tambin funcion como agente bloqueante. Se
repiti el lavado con buffer por segunda vez.
2.3

Adicin de anticuerpos por mtodo

indirecto.

Se adicion 50L de solucin anticuerpo

primario a cada pocillo, para la unin de ste
con el antgeno que se quiso identificar. Luego
se elimin sobrenadante y se volvi a repetir
dos veces el lavado con buffer PBS. Luego se
agreg anticuerpo secundario (o conjugado)
marcado con la enzima peroxidasa de rabanito
(HRP). Se repiti la secuencia de lavado
anterior para eliminar los excesos y bloquear
uniones inespecficas.
2.4

Adicin de sustrato cromognico y

observacin de resultados.

Como ltima parte del ensayo, se agreg

sustrato cromognico correspondiente a una
solucin de tetrametilbencidina (TMB) y
perxido de hidrgeno. Una vez que se
agreg 50L a cada posillo, se esperan 5
minutos para observar y registrar resultados.
3

Resultados y Discusiones

La observacin de resultados debido a la

oxidacin de TMB por la enzima conjugada en
el anticuerpo secundario (HRP) revel una
coloracin azul en la muestra.
Tabla 1. Observaciones de las muestras
problemas en respuestas al sustrato
cromognico
Muestra Problema

Observacin

Coloracin azul

Sin coloracin

Coloracin azul

Sin coloracin

En la tabla 1 se tabularon los resultados en los

cuales las muestras 1 y 3 resultaron positivos.
Estas muestras mostraron un cambio de
coloracin azul a los pocos minutos de haber
agregado el sustrato cromognico, esto
debido a la presencia de antgeno que unido a
los anticuerpos primario y secundarios que se
agregaron. El producto color azul se debe a la
reaccin entre la enzima que esta conjuga al
anticuerpo
secundario
y
el
sustrato
cromognico, la enzima peroxidasa de
rabanito (HRP) ante la presencia de perxido
de hidrogeno cataliza la oxidacin de TMB
presente. Ante estos resultados se deduce
que los resultados 1 y 3 positivos contienen
antgenos ya que la prueba detecta la reaccin
antgeno-anticuerpo, por medio de unin entre
anticuerpo primario y antgeno, sin embargo,
se destaca tambin la unin especfica del
anticuerpo primario y anticuerpo secundario la
cual permite que la reaccin sea observable.
Se debe tener presente que ante esto, la
prueba puede presentar un falso negativo
debido a que por ejemplo si se utiliza un
anticuerpo secundario incapaz de reconocer
un anticuerpo secundario, o si se utiliza una
baja concentracin de anticuerpo secundario
no
revelar
resultado
alguno
o
la
concentracin ser insuficiente para dar una
seal detectable.

2|P a ge

Otras limitantes que se tuvo presente ante el

anlisis de los resultados, son el uso de
agente bloqueantes (en el presente prctico
se utiliz buffer PBS-Tween 20), ya que estos
saturas los espacios no ocupados por el
reactante inmunolgico que se fij en la fase
slida, evitando la adsorcin inespecfica de
reactantes ocupados durante los posteriores
pasos del ensayo. El buffer tambin cumple la
funcin de limpieza eliminado las soluciones
sobrantes que no fueron fijadas en las etapas
correspondientes. Por ltimo otro factor
importantes, son el tiempos de incubacin,
esto debido a que una insuficiencia de tiempo
en incubacin puede derivar a una mala
fijacin de ya sea antgeno o anticuerpos.

3.1

Anlisis de muestras control

reaccin de
anticuerpos.

unin

entre

antgeno

no contaminar las muestras, de esta forma si

un control arroja un resultado alejado de los
dems controles se puede descartar.
El mtodo de ELISA indirecto utilizado permite
una deteccin ms sensible del antgeno, ya
que mediante la adicin de un anticuerpo
secundario se logra una amplificacin de la
seal por la unin de ms de un anticuerpo
secundario a un anticuerpo primario. Adems
la enzima utilizada (HRP) es una catalasa de
accin muy rpida, la cual permiti la
apreciacin de los resultados segundos
despus de haber agregado la solucin
sustrato. En el caso de otras enzimas se
necesitara un tiempo de espera diferente o
uso de espectrofotometra para el anlisis
cuantitativo de las muestras.
4

Conclusiones

El mtodo de ELISA indirecto utilizado en este

prctico se aplic de manera correcta frente a
las muestras problema otorgadas para
detectar. Sin embargo, la incorrecta coloracin
Fig. 1 Observacin directa de los resultados en respuesta
a la adicin
sustrato
cromognico,
que present
uno dedelos
controles
negativos,
junto con las muestras control positivo (rotulados con signo
+) y negativo
con signo -).
permiti
analizar(rotulados
las interferencias
y
limitaciones que puede tener esta prueba.
En la figura 1 se observ los resultados de las
Pero para el caso presente en el control
muestras problemas junto con tres controles
negativo, se concluye que se debi a la mala
positivos y tres controles negativos, durante la
ejecucin de la tcnica. Por ltimo, se tuvo en
observacin de los controles, posterior a la
cuenta que las pruebas varan segn los
aplicacin del sustrato se observ una muy
reactivo inmunolgico y reactantes utilizados,
baja coloracin azul en el primer control
por ejemplo en este caso, la enzima utilizada
negativo. Este resultado se atribuye a la
en la conjugacin del anticuerpo secundario,
posible
mala
ejecucin
durante
el
presenta una catalasa de velocidad y accin
procedimiento del ensayo, ya que pudo
muy rpida, por lo que los resultados son
deberse contaminado con parte de la muestra
observado en un muy corto periodo de tiempo
de control positivo que se encontraba previo a
luego de agregado el sustrato cromgeno.
ese pocillo, por lo que produce una baja

Referencias
Jeremy Mark Berg, Lubert Stryer, John L. Tymoczko. (2007). Bioqumica. New York: Editorial Reverte.
Pg. 87-88.
scar Rojas-Espinosa. (2006). Inmunologa (de memoria). Mxico: Editorial Panamericana. Pg.
229-230.
John L. Ingraham, Catherine A. Ingraham. (1998). Introduccin a la microbiologa, Volumen 2.
E.E.U.U: Editorial Reverte Pg. 457

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