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PRCTICA 5.

INVESTIGACIN SOBRE LA ACTIVIDAD ENZIMTICA CATECOLASA.


INTRODUCCIN.
Durante esta prctica se estudiar la actividad de la enzima catecolasa contenida en
algunas frutas y vegetales. Las papas peladas y las frutas machucadas se tornan cafs cuando
son expuestas al aire debido a que la catecolasa facilita una reaccin entre el catecol y el
oxgeno. En presencia de oxgeno, el catecol es oxidado por la remocin de dos tomos de
hidrgeno. El catecol es as convertido en benzoquinona, y el oxgeno es reducido por la
adicin de dos tomos de hidrgeno para formar agua. Las molculas de benzoquinona se
unen luego para formar cadenas largas y ramificadas. Estas cadenas son la base estructural de
los pigmentos melanoides rojo y caf que causan el oscurecimiento.
OBJETIVOS.

Determinar los efectos de la temperatura sobre la actividad enzimtica catecolasa.


Determinar los efectos del pH sobre la actividad enzimtica catecolasa.
Describir los efectos del cambio en la concentracin de enzima sobre la tasa de reaccin
catalizada por la enzima.
Describir la relacin entre la concentracin de sustrato y la mxima velocidad de la
reaccin enzimtica.

Nota: tenga en mente que, aunque est utilizando jugo de papa en estos experimentos, Usted
est en realidad trabajando con un extracto enzimtico.
MATERIAL.
Por equipo.

26 tubos 16 x 150
75 mL de jugo de papa (guardar en frasco mbar)
Bao de hielo
Bao mara
Termmetro
200 mL de buffer de fosfatos pH 7.0, 0.01 M
10 mL de cada uno de los siguientes buffer de fosfatos (0.01 M): pH 4.0, 6.0, 8.0, 10.0
50 mL de solucin de catecol 0.05 M (guardar en frasco mbar y evitar contacto con la luz y
aire)
2 goteros
Parafilm

PROCEDIMIENTO.
PARTE I. Efecto de la temperatura sobre la actividad enzimtica.
Como la mayora de las reacciones qumicas, la tasa de reaccin de una reaccin
catalizada enzimticamente se incrementa al incrementar la temperatura hasta un punto en el
cual la tasa es mxima. Despus la tasa de reaccin declina abruptamente al seguir
incrementando la temperatura. Por encima de 40 0C la mayora de las enzimas en los tejidos
vivos se desnaturalizan, es decir, pierden su estructura secundaria o terciaria.
1. Llene tres tubos con 3 mL de buffer de fosfatos de pH 7. Etiquete los tubos como 10, 25
y 50.
2. Coloque el primer tubo en un bao de hielo, deje el segundo tubo a temperatura ambiente y
coloque el tercer tubo en bao mara (aproximadamente 50 0C). Mientras tanto contine
con el paso 3.

3. Tome tres tubos conteniendo jugo de papa y coloque uno en bao de hielo, otro a
temperatura ambiente y uno ms en bao mara. Haga lo mismo con tres tubos
conteniendo catecol.
4. Despus de 10 minutos, aada 10 gotas de catecol (a temperatura ambiente) a cada tubo
de buffer.
5. Aada diez gotas de jugo de papa (a temperatura ambiente) a cada tubo.
6. Espere 5 minutos (agite las mezclas varias veces durante este tiempo). Registre sus
resultados en la tabla 1 indicando la intensidad del color en cada tubo despus de los 5
minutos (0 indica sin color; +, ++ y +++ indican incremento en la intensidad del color).
Tabla 1. Efecto de la temperatura sobre la actividad enzimtica.
Tipo de tubo
Intensidad de color
10
25
Buffer
Jugo de papa
Catecol

50

Actividades:
a. A qu temperatura fue mayor la cantidad de producto obtenido en la reaccin enzimtica?
b. Cmo podra relacionarse la cantidad de producto formado por minuto con la tasa de
reaccin enzimtica?
c. Cul fue el objeto de agitar los tubos?
d. A qu temperatura fue mayor la tasa de reaccin? Grafique sus resultados (temperatura
en la abscisa y tasa de reaccin en la ordenada).
e. Colocar papas peladas en hielo antes de cocinarlas previene su oscurecimiento. Por qu?
PARTE II. Efecto del pH sobre la actividad enzimtica.
La presencia de diversos iones puede interferir con los patrones de cargas positivas y
negativas en una molcula de protena, cambiando as la configuracin de la misma. En una
enzima, la forma del sitio activo puede ser cambiada. Nosotros debemos esperar, por lo tanto,
que cambios en el pH afectarn la actividad de las enzimas.
El valor de pH ms favorable, el punto en el cual la enzima es ms activa, se conoce
como pH ptimo. Valores de pH extremadamente altos o bajos resultan usualmente en le
prdida de la actividad enzimtica debido a la desnaturalizacin de la enzima.
1. Etiquete cinco tubos con los siguientes valores de pH: 4, 6, 7, 8 y 10.
2. Llene cada tubo con 3 mL del correspondiente buffer de fosfatos y agregue 10 gotas de
jugo de papa.
3. Aada 10 gotas de catecol a cada tubo. Cubra el tubo con parafilm e invierta varias veces
para mezclar el contenido.
4. Est preparado para observar cambio en color. Espere de 3 a 5 minutos. Invierta la mezcla
de cada tubo a intervalos de 1 minuto. La tasa de reaccin enzimtica (medida por la
cantidad de producto formado durante un periodo dado de tiempo) ser cualitativamente
proporcional a la intensidad de color desarrollado en cada mezcla de reaccin. Registre sus
resultados indicando la intensidad de color en cada tubo (0=sin color; +, ++ y ++
+=incremento en la intensidad de color. Registre sus resultados en la tabla 2.
Tabla 2. Efecto del pH sobre la actividad enzimtica.
Intensidad de color
pH 4
pH 6
pH 7

pH 8

Actividades.
a. A qu pH fue mayor la cantidad de producto formado en la reaccin enzimtica?

pH10

b. Cmo puede relacionarse la cantidad de producto formado por minuto con la tasa de
reaccin enzimtica?
c. A qu pH fue mayor la tasa? Grafique sus resultados (pH en la abscisa y tasa de reaccin
en la ordenada).
d. Aadir limn o jugo de naranja sobre frutas peladas previene su oscurecimiento. Por qu
ocurre esto?
PARTE III. Efecto de la concentracin de enzima sobre la actividad enzimtica.
Cuando un sustrato de fija en el sitio activo de una enzima, se forma un complejo
enzima-sustrato. La enzima lleva a cabo una reaccin y un producto es entonces formado.
Usualmente la tasa de reaccin es directamente proporcional a
la concentracin de enzima. La tasa de reaccin se incrementar en proporcin al incremento
en la concentracin de la enzima slo si el sustrato est presente en exceso de tal forma que la
reaccin no est limitada por la disponibilidad del mismo.
1. Etiquete cuatro tubos como se indica en la tabla de abajo. Aada la cantidad indicada de
buffer de fosfatos y jugo de papa a cada tubo. NO AADA CATECOL AN. Cubra cada
tubo con parafilm e invirtalos varias veces para mezclar el contenido.
2. Aada 10 gotas de catecol a cada tubo. Cubra cada tubo con parafilm e invirtalos varias
veces para mezclar los contenidos. (No use la misma pieza de parafilm para todos los
tubos).
Tubo
A
B
C
D

Buffer de fosfatos pH 7
3 mL + 20 gotas
3 mL + 15 gotas
3 mL + 10 gotas
3 mL + 0 gotas

Jugo de papa
----5 gotas
10 gotas
20 gotas

Catecol (AADA AL
LTIMO)
10 gotas
10 gotas
10 gotas
10 gotas

3. Espere de 3 a 4 minutos; mezcle los contenidos de cada tubo a intervalos de 1 minuto.


4. La tasa de reaccin enzimtica (medida como la cantidad de producto formado en un
periodo dado de tiempo) ser proporcional a la intensidad de color desarrollado en cada
mezcla reaccionante. Registre sus resultado en la tabla 3 indicando la intensidad de color
en cada tubo despus de los 3 +o 4 minutos (0=sin color; +, ++ y +++=incremento en la
intensidad de color).
Tabla 3. Efecto de la concentracin de enzima sobre la actividad enzimtica.
Intensidad de color
A
B
C

Actividades.
a. Qu cambios observ en el periodo de tiempo durante el cual estuvo ocurriendo la
reaccin?
b. A qu concentracin de enzima fue la mayor formacin de producto?
c. A qu concentracin de enzima fue mayor la tasa de reaccin?
d. Apoyan sus resultados en concepto de que la tasa de reaccin es proporcional a la
concentracin de enzima? Explique.
PARTE IV. Efecto de la concentracin de sustrato sobre la actividad enzimtica.
Si la cantidad de enzima se mantiene constante pero la cantidad de sustrato es
aumentada gradualmente, entonces la tasa de velocidad a la cual la enzima trabaja (convierte
sustrato a producto) se incrementar hasta alcanzar un mximo. En este punto el incremento
en la concentracin de sustrato no incrementar la velocidad de la reaccin debido a que toda
la enzima disponible est participando en la formacin de complejos enzima-sustrato. As, cada
enzima tiene una velocidad mxima a la cual trabajar.

1. Diluya el extracto de papa 1:1


2. Etiquete 8 tubos con los nmero indicados en la tabla de abajo y llnelos como se indica.
Cubra cada tubo con parafilm y mezcle invirtiendo los tubos varias veces.
Tubo
1
2
4
8
16
24
32
48

Buffer de fosfatos pH 7
5 mL + 47 gotas
5 mL + 46 gotas
5 mL + 44 gotas
5 mL + 40 gotas
5 mL + 32 gotas
5 mL + 24 gotas
5 mL + 16 gotas
5 mL + 0 gotas

Catecol
1 gota
2 gotas
4 gotas
8 gotas
16 gotas
24 gotas
32 gotas
48 gotas

3. Aada 30 gotas de jugo de papa diluido a cada uno de lo ocho tubos. Cubra cada tubo con
parafilm y mezcle invirtiendo los tubos varias veces.
4. Incube la mezcla por 5 minutos; mezcle cada tubo a intervalos de 1 minuto.
5. La tasa de reaccin ser proporcional a la intensidad de color desarrollado en cada mezcla
reaccionante. Registre sus resultados en la tabla 4 indicando la intensidad de color en cada
tubo despus de los 5 minutos (0=sin color; +, ++ y +++=incremento en la intensidad del
color).
Tabla 4. Efecto de la concentracin de sustrato sobre la actividad enzimtica
Intensidad de color
1
2
4
8
16
24

32

48

Actividades.
a. Que consecuencias tiene a existencia de una mxima velocidad enzimtica sobre el
metabolismo celular?
b. Sus resultados apoyan a idea de que una enzima tiene una mxima velocidad a la cual
trabaja? Explique.
c. Grafique sus resultados (concentracin de catecol en la abscisa y velocidad de reaccin en
la ordenada).