Colecta de suelos:

El lugar del muestreo se realizar en diferentes suelos degradados de la sub cuenca de

Cumbaza en la Regin San Martn. La colecta de suelos se llevar a cabo usando la
metodologa sugerida por Dionisio y Pimentel (2016). Para los anlisis fsico-qumicos y
biolgicos del suelo las muestras se colectarn con la ayuda de una palana estril, en un
rango de 0 - 20 cm, las cuales se empacarn en sacos de polietileno y rotuladas indicndose
la fecha, el nmero y cdigo respectivo, haciendo compsitos hasta obtener 1 kg de suelo,
siendo transportadas a 4 C para mantener la poblacin de microorganismos (Dionisio y
Pimentel, 2016). Adems, se colectarn 20 kilos de suelo por cada punto de muestreo el
cual servir para el ensayo de plantas trampa.

Anlisis fsico - qumico del suelo: Las muestras de suelos sern llevadas al Laboratorio de
suelos, aguas y foliares de la Facultad de Ciencias Agrarias UNSM, Tarapoto donde se
medirn la textura, pH, materia orgnica, C.I.C, macro nutrientes (N,P,K) y cationes
intercambiables (Ca,Mg,Na,K,Al,).
Anlisis microbiolgicos del suelo.
Los anlisis microbiolgicos del suelo se realizarn en el laboratorio de microbiologa
agrcola de la Facultad de Ciencias Agrarias UNSM, Tarapoto.

Ensayo de plantas trampa:

Los suelos colectados fueron oreados a temperatura ambiente, triturados y tamizados, segn
Moreira et al. (2016). El suelo en estudio fue mezclado con vermiculita esterilizada en
proporcin (1:1) v/v (Rodrguez-Navarro et al. 2000). Se utilizarn plantas de cobertura
adaptadas a climas tropicales y a condiciones de suelos infrtiles como son: Puspino

(Cajanus cajan), canavalia (Canavalia ensiformes),crotalria (Crotalaria juncea) y caupi

(Vigna unguiculata), para poder capturar microorganismos con capacidad de solubilizar
fosfatos insolubles. Las semillas de las leguminosas, fueron pre-germinadas y sembradas en
un nmero mayor, para luego ser raleadas. El diseo experimental usado ser un factorial de
6 (Suelos) x 4 leguminosas x 3 (repeticiones). Las macetas se instalarn en el invernadero
del laboratorio de Microbiologa Agrcola y sern mantenidas por un periodo de 45 das (V.
unguiculata) y 60 das (C. juncea, C. Cajanus, , C. ensiformis), hasta el momento de su
cosecha.
Aislamiento de bacterias solubilizadoras de fosfato.
Las plantas sern cosechadas, y los sistemas radicales se pondrn en bolsas de
polipropileno de primer uso. El suelo rizosfrico ser desprendido de las races, y se
tomaron 10 g en un frasco conteniendo 90 ml de Solucin salina fisiolgica al 0.85%
(estril), siendo agitados en Vortex durante 15 minutos a 200 rpm. Se realizarn diluciones
decimales suficientes (dilucin 1:100000) para obtener bacterias aisladas. Finalmente, las
tres ltimas diluciones (10-4,10-5,10-6) se siembran en medio de cultivo Dextrosa-Extracto de
levadura (DEL) (Silvester and Bradley et al. 1982), Las placas se incubaran a 30 C por
aproximadamente 1 semana. Los conteos se llevaron a cabo tomando en cuenta aquellas
bacterias capaces de formar un halo de solubilizacin en las placas (Dionisio et al. 2010).
Purificacin/estriado y conservacin de bacterias solubilizadoras de fosfato.
El medio DEL tiene fosfato de cido de calcio como nica fuente de P, esto generado
mediante la adicin de 50 ml de una solucin de K 2 HPO 4 (10%) y 100 ml de CaCl2
(10%), para producir un precipitado de fosfato inorgnico insoluble, lo cual permiti la
seleccin directa de los microorganismos con capacidad solubilizadora. El halo
transparente que formara alrededor de las colonias, es una medida que indicara la
solubilizacin.
Aquellas bateras con un halo de solubilizacin sern reestriadas con la ayuda de un asa
bacteriolgica estril en medio TSA (Triptone Soy Agar), hasta la obtencin de cultivos

puros, siendo conservados a corto plazo a 4C en agar inclinado TSA en frascos de 10 ml y

a mediano plazo en crioviales con glicerol al 10% a -20C.

Evaluacin cualitativa de la solubilizacion en 3 fuentes de fosfato inorgnico

(Ca3PO42, FePO4, AlPO4).
Cada aislamiento seleccionado por su capacidad de solubilizar fosfato se evaluar en medio
DEL y NBRIP, empleando 4 repeticiones. Los cultivos puros sern inoculados en 2 ml
caldo TSB, y se incubarn en agitacin a 200 rpm durante 12 horas. Finalizado el
crecimiento, se inocularn 20 microlitros de inoculo en cada placa con los diferentes
medios. Las placas inoculadas sern llevadas a incubacin a 30 C por 9 das, cada tres das
se evaluar el dimetro de la colonia y del halo con la ayuda de un vernier digital, ndice de
solubilizacin.
Evaluacin cuantitativa de la solubilizacion en 3 fuentes de fosfato inorgnico
(Ca3PO42, FePO4, AlPO4).

Para la determinacin de la actividad de solubilizacin de fosfato de cada bacteria se utiliz

el mtodo colorimtrico. La tcnica se estandariz de acuerdo con las condiciones propias
del equipo del laboratorio, empleando una curva patrn con concentraciones conocidas de
fosfato soluble. Para la preparacin del pre-inoculo, las bacterias solubilizadores de fosfato
se inocularn en 2 ml medio de cultivo lquido (TSA) e incubndose durante 12 h. A
continuacin se inocularn 50 L del pre-inculo en matraces de 125 ml de capacidad
conteniendo 50 ml de caldo NBRIP autoclavado y suplementado con las tres fuentes de
fosfato insoluble. Se tomarn alcuotas del caldo de crecimiento al tercer y sexto da, sern
centrifugadas a 12500 rpm x 5 minutos y el sobrenadante ser utilizado para medir el
fosfato soluble mediante el mtodo del vanadofosfomolibdato. Una vez obtenidas las
absorbancias, se calcularon las concentraciones de fosfato, mediante interpolacin en la
ecuacin de la curva patrn. Para cada bacteria el procedimiento se ensay por triplicado.

Anlisis estadsticos:
Todos los datos estuvieron sujetos a anlisis de Varianza (ANOVA), usando el programa
XLSTAT, El test de Tukey fue usado para discernir diferencias significativas empleando un
nivel P < 0.05 para considerar las medias significantes.