Efectos diferenciales de la hidroxiurea y INC424 sobre

la carga y el alelo mutante fenotipo mieloproliferativo

en un JAK2 V617F-ratn policitemia vera modelo
Para establecer un modelo animal preclnico
para
probar
frmacos
con
efectos
potenciales
sobre
la
neoplasias mieloproliferativas (MPN), lo
primero que realiz una caracterizacin
fenotpica
detallada
de ratones transgnicos Cre-inducibles JAK2
V617F. Eliminacin del alelo JAK2 ratn
knockout
condicional
aument
de
la
eritropoyesis y acentuaron el fenotipo
policitemia vera, pero no alter los niveles de
plaquetas o de granulocitos. En un ensayo de
trasplante, clulas BM JAK2 V617F + tenan una ventaja sobre las clulas de la
competencia
de
tipo
salvaje.
El
uso
de
este
ensayo de repoblacin competitivo, se compararon los efectos de INC424
(ruxolitinib),
un
doble
inhibidor
de
Jak1/JAK2, e hidroxiurea (HU). HU condujo a la prdida de peso, pero no redujo
peso bazo. Los parmetros hematolgicos se redujeron y se observ un ligero
descenso
de
la
carga alelo mutante. INC424 tuvo poco efecto sobre el peso corporal, pero
disminuy
fuertemente
el tamao del bazo y se normalizaron rpidamente parmetros de RBC y de
neutrfilos.
No
se observ disminucin significativa de la carga alelo mutante. INC424 redujo
la
los niveles de fosfo-STAT5, mientras que HU aument fuertemente fosfo-STAT5,
lo
ms
probable
debido a los niveles de eritropoyetina elevados en respuesta a la anemia
inducida
por
HU.
Este aumento compensatorio en la sealizacin de JAK / STAT puede
contrarrestar los efectos beneficiosos de citorreduccin a dosis ms altas de HU
y representa un efecto adverso que se debe evitar.

Clulas
JAK2-V617F
muestran
una
ventaja
competitiva
frente
clulas de tipo salvaje en
el ensayos trasplante de
BM
Un modelo de ratn
preclnico
permite el examen de los
efectos de los agentes
teraputicos
en
los

Introduccin
Las neoplasias mieloproliferativas
(MPN) son enfermedades de las
clulas
madre
hematopoyticas
clonales
se
caracterizan
por
aumento
de
la
proliferacin
eritroide, de la megacarioctica, o
de linajes mieloides. Una mutacin
somtica adquirida en el gen JAK2

que resulta en una valina a

sustitucin de fenilalanina en la
posicin 617 (JAK2-V617F) est
presente en la mayora de los
pacientes con MPNs. Varios modelos
de ratn que expresan JAK2-V617F
han
establecido
que
imitan
fenotipos MPN observado en los
pacientes.
Hemos
descrito
previamente un modelo de ratn

transgnico Cre-loxP-inducible que

expresa JAK2-V617F humana bajo el
promotor JAK2 endgeno y muestra
un fenotipo que se asemeja a
policitemia
vera
(PV)
o
trombocitopenia
esencial.
El
fenotipo se correlaciona con la
proporcin entre los niveles de
mRNA BM para el JAK2-V617F
humana mutante y el ratn tipo
salvaje Jak2 con un fenotipo PV
presente en proporciones de 1: 1
(V617F:tipo salvaje), mientras que
ET se observ en proporciones de
aproximadamente
1:2.
En
el
presente
estudio,
hemos
corroborado por esta correlacin el
estudio de los efectos de la
disminucin de expresin del ratn
de tipo salvaje Jak2 mediante el
cruce de ratones transgnico JAK2V617F con una cepa inducible JAK2
knock-out. Usando un ensayo de
trasplante
competitivo,
establecimos un modelo preclnico
de
ratn
que
permite
la
monitorizacin de los efectos del
frmaco sobre la carga del alelo
mutante JAK2-V617. Utilizamos este
modelo de ratn para comparar la
eficacia de la hidroxiurea (HU), que
se
considera
el
tratamiento
estndar para el MPN, con el
inhibidor Jak1 / JAK2 INC424
(ruxolitinib).

Mtodos
Ratones Transgnicos
Los ratones que llevan un transgn
JAK2
V617F-humano
Crerecombinasa
inducible
(FF1) y un knockout condicional de
Jak2 se han descrito anteriormente.
Para activar el transgn FF1 o para
inducir el knockout JAK2, los ratones
FF1 fueron cruzados con MxCre,

SclCre, o ratones VavCre13. Cre

expresin en ratones MxCre fue
inducida por una sola inyeccin IP
de 300 g de poliinosina-policitosina
(pIpC) o en ratones SclCre por 2 mg
de tamoxifeno durante 5 das
consecutivos.
Para
repoblacin
competitiva, las clulas BM a partir
de 8 semanas de edad, raton
hembra
C57BL/6
(Harlan
Laboratories) o ratones UBC-GFP
que expresan mejorada se utiliza la
protena fluorescente verde (GFP).
Los ratones se mantuvieron bajo
condiciones libres de grmenes
patgenos especficos con libre
acceso a comida y agua. Todos los
experimentos se realizaron en
estricto cumplimiento de las leyes
suizas para el bienestar de los
animales y fueron aprobados por el
suizo Oficina Veterinaria Cantonal
de Basilea.
Compuestos y Formulaciones
sal
de
fosfato
ruxolitinib/INCB018424 (en adelante
denominado como INC424) fue
suministrado por Incyte y Novartis
Pharma. HU (H8627) se obtuvo de
Sigma-Aldrich. Cada 4 das, INC424
fue recin preparado en 0,5%
hidroxipropil
metilcelulosa.
HU
solucin
fue
preparado
recientemente
cada
da
por
disolucin en 0,9% de NaCl.
Repoblacin
competitiva
estudios del inhibidor

Clulas BM totales de JAK2-V617F o

a partir de ratones donantes
C57BL/6 se mezclaron 1:1 con
clulas BM UBC-GFP y trasplantado
en
ratones receptor hembra

C57BL/6 letalmente irradiados con

12 Gy. Alternativamente, clulas BM
JAK2-V617F/UBC-GFP mezcladas 1:1
con
C57BL/6.
Los
recuentos
sanguneos fueron realizados 5
semanas despus del trasplante.
Los ratones que muestra un
fenotipo PV se asignaron al azar en
5 grupos y se dosifica con INC424,
HU,
o
vehculo de dos veces al da (BID)
durante 21 das consecutivos.
INC424
se
administr
por sonda oral (30 o 90 mg / kg BID)
y HU se inyect IP (10, 50,
100, o 200 mg / kg BID). Los ratones
control
recibieron
0,5%
de
hidroxipropil
metilcelulosa (vehculo). En el da
21 del tratamiento, los receptores
eran
sacrificados por asfixia con CO2 y
fueron tomadas muestras de tejido
y
sangre
para su posterior anlisis.
Anlisis de sangre
La
sangre
se
recogi
en
Microenvases recubierto en EDTA
(BD
Biosciences)
por
muestreo por vena de la cola antes
del comienzo de la dosificacin y
por puncin cardiaca durante el
procedimiento de descenso. Se
determinaron
hemogramas
completos
sobre
la
analizador hematolgico ADVIA120
utilizando
mltiples
especies
software
Versin
5.9.0-EM
(Bayer).

Anlisis de Citometra de flujo

sangre total suspensiones o de una

sola clula de BM y el bazo se
tieron
con
anticuerpos
monoclonales
conjugados con PE, anti-ratn
contra
Ter119,
CD61, Mac1, y Gr1 y el anticuerpo
anti-ratn conjugado con biotina
contra
CD71 (BioLegend). , el hgado y las
clulas de la aorta del corazn se
tieron
con
CD45
conjugado
con
PE
y
anticuerpos anti-ratn CD31 Pe-Cy7conjugados
(BioLegend).
Las
muestras
se
analizaron en un citmetro de flujo
FACSCalibur
(BD Biosciences).
Ensayos
de
hematopoyticos

progenitores

Progenitores eritroides se ensayaron

con o sin 3 unidades/ml de
eritropoyetina (EPO) en medio a
base de metilcelulosa (Stem-alfa),
complementado con 100 ng/ml de
SCF (PeproTech), 310 g/ml de
transferrina humana, y 200 M
hemina (Sigma-Aldrich). Clulas BM
(2x105)
se
sembraron en placas de 30 mm por
triplicado. Colonias CFU-eritrocitos
(CFU-E)
se anotaron despus de 4-5 das y
colonias BFU-E despus de 9-10 das
de
cultivo.
Ensayos progenitoras mieloides se
realizaron con 1x104 clulas de MO
por triplicado en medio M3434
(STEMCELL Technologies) y CFU
granulocito
(CFU-G), CFU-macrfagos (CFU-M), y
CFU-granulocitos/macrfagos (CFUGM) se contaron las colonias
despus de 7 das de cultivo. CFU-

megacariocitos (CFU-MK) colonias

fueron cultivadas en portaobjetos de
cmara con o sin 50 ng/ml de
trombopoyetina
humana
recombinante a base de medio
colgeno
(MegaCult-C;
STEMCELLTechnologies)
que
contiene
50 ng/ml de IL-11, 10 ng/ml de ratn
recombinante IL-3 y 20 ng/mL
de IL-6 recombinante humano
(PeproTech). Clulas de MO (1x10 5)
se
cultivaron
durante 8 das en cmaras de
diapositivas en los duplicados. Los
portaobjetos
se
fijaron
a
continuacin y de contaron las
colonias teidas y CFU-MK.
Preparacin de la muestra y el
mtodo bioanaltico
Las concentraciones de INC424 en
la sangre se determinaron utilizando
cuantitativa
rendimiento
ultra-cromatografa
lquida de espectrometra de masas.
Para ms detalles, ver Mtodos
suplementarios (disponibles en el
sitio
BloodWeb;
vase
el
Materiales suplementarios enlace en
la parte superior del artculo en
lnea).
Ensayo ELISA de EPO
Los niveles de EPO de ratn se
cuantificaron en homogeneizados
de bazo por inmunoensayo (R & D
Systems) segn las instrucciones
del
fabricante.
Bazo
homogeneizados
(50
l)
en
RIPAbuffer
se
ensayaron
por
triplicado.
Histologa
inmunohistoqumica

BM (desde el esternn y fmur), el

bazo, el hgado y se fija con
formalina fosfato tamponada al 4%,
embebido
en
parafina,
y
se
seccionaron. Las secciones de tejido
fueron teidas con H & E para la
morfologa o con Gomori para el
anlisis de fibras de reticulina. Las
imgenes fueron tomadas con una
microscopio
Olympus
BX43
(apertura numrica de las lentes del
objetivo, 0.75 / 20x Y 0.95 / 40x) y
una
cmara
Olympus
DP73
(Olympus
Schweiz
AG).
El
software para la adquisicin de la
imagen era cellSense Version 1.6.
La
inmunohistoqumica
anticuerpos
anti-fosfo-STAT5
de
conejo (# 9359; la sealizacin
celular
Technology) se realiz como se
describe. Evaluacin y previamente
la cuantificacin de los ncleos
inmunoteidas
se
realizaron
utilizando el Zeiss escner de
diapositivas Mirax (Scan Software
Version 1.12; Zeiss). evaluacin
cuantitativa Automatizado de fosfoSTAT5+
y
fosfo-STAT5Celda
ncleos
se
realiz
utilizando
eCognition versin 1.5 del software
XD
(Definiens).
Los resultados se expresaron como
porcentaje de fosfo-STAT5+ ncleos
de ncleos totales. Para ms
detalles,
ver
Mtodos
suplementarios.
Anlisis estadstico
Los resultados se presentan como
media

SEM.
Evaluar
la
significacin
estadstica
entre
cohortes individuales, ANOVA 1-va
con posterior post-test Bonferroni
(Prism
Versin
4.00
software,
GraphPad) o el ranking Mann-

Whitney. P<0,05 fue considerado

significativo.

Para caracterizar las variaciones

fenotpicas de nuestro descrito
anteriormente
Los ratones transgnicos JAK2V617F inducibles con Cre-loxP (FF1),
los cruzamos con 3 diferentes
expresiones de Cre-recombinaseexpresando: El MxCre inducible por
IFN,
el
SclCre
inducible
por
tamoxifeno, Y la cepa VavCre
expresada constitutivamente. En
todos estos ratones, La expresin
mutante JAK2-V617F es impulsada
por
la
expresin
endgena
Promotor
de
JAK2.
La
cre-

otros parmetros de RBC, pero las

plaquetas
y
los
neutrfilos
permanecieron
elevados.
Se
observ un fenotipo PV an ms
pronunciado cuando SclCre; de
indujeron
ratones
doblemente
transgnicos FF1 con tamoxifeno.
Despus
Estadio,
tambin
se
observ una tendencia a valores
ms bajos de hemoglobina en
SclCre; ratones FF1. Sin embargo,
una observacin ms larga no fue
posible Debido a una supervivencia
acentuadamente acortada de estos
ratones (Figura 1A). La causa de la
muerte en la mayora de los casos
permaneci en algunos animales, el
sangrado en la cavidad abdominal
en Autopsia (no se muestra). Como
se ha descrito anteriormente, los

recombinasa
se
requiere
nicamente
para
mover
las
secuencias que codifican el dominio
quinasa en una zona activa.
Confirmamos
nuestro
hallazgo
anterior
de
que
los
ratones
transgnicos para MxCre y JAK2V617F (MxCre; FF1) muestran un
Fenotipo PV, que fue detectable
dentro de 4 semanas despus de la
induccin por PIpC (Figura 1A).
Alrededor de 26 semanas despus
de la administracin de pIPC, una
disminucin en la hemoglobina y

ratones VavCre, FF1 Mostraron

niveles normales de hemoglobina,
pero muy altos recuentos de
plaquetas Neutrofilia suave que se
asemeja a un fenotipo ET puro
(Figura 1A). Su supervivencia fue
prolongada en comparacin con
SclCre; FF1 O MxCre; ratones FF1.
Los
pesos
de
bazo
fueron
notablemente elevados en todos los
3 lneas doble-transgnicas en
comparacin con los controles de
tipo
salvaje
(suplemental
Figura 1A

Resultados

Figura 1. Comparacin de hematopoyesis y supervivencia de ratones

transgnicos JAK2-V617F activados por 3 transgenes Cre diferentes. (A)
Recuento
sanguneo
y
supervivencia
despus
de
Induccin con pIpC o tamoxifeno. (B) Relacin entre JAK2-V617F humano y Jak2
de ratn en el BM de ratones transgnicos JAK2-V617F a las 10 y 34 semanas.
(C)
Recuentos
de
sangre
y
Supervivencia despus del trasplante de 2? 106 clulas BM recogidas de

donantes de ratn JAK2-V617F en receptores irradiados letalmente. (D)

Relacin entre el JAK2-V617F humano y Ratn Jak2 en el BM de huspedes
transplantados con clulas JAK2-V617F BM. Las muestras de BM se recogieron
35 semanas despus del trasplante. Mx indica MxCre, ratones FF1 (rojo
Smbolos); Scl, SclCre; ratones FF1 (smbolos verdes); Vav, VavCre; ratones FF1
(smbolos azules); Y WT, controles de tipo salvaje (smbolos negros). Tenga en
cuenta que todos los ratones SclCre; FF1 murieron dentro de 30 semanas
despus de la induccin de tamoxifeno y, por lo tanto, no hubo recuentos
sanguneos disponibles ms all de este punto de tiempo. La supervivencia se
muestra como curvas de Kaplan-Meier. (E-F) Nmeros de Progenitores
hematopoyticos evaluados mediante ensayos de colonias en metilcelulosa o
medio a base de colgeno. BFU-E indica la unidad formadora de rfagas
eritroides; Y Tpo, trombopoyetina. BM de 3 ratones por grupo se analizaron en
placas duplicadas. (G-H) Porcentajes de clulas LSK dentro del linaje? La
poblacin de clulas BM de ratones no transplantados inducida por pIpC O
tamoxifeno (G) y en los hospedantes irradiados letalmente trasplantados con
las clulas BM de ratones JAK2 - V617F (H). (I) Recuentos sanguneos y
supervivencia de SclCre; Ratones FF1 con Jak2fl / \ o Jak2fl / fl genotipos
despus de la induccin con tamoxifeno. (J) Relacin entre JAK2-V617F humano
y Jak2 de ratn en el BM de SclCre; Ratones FF1 con los ratones Jak fl /+ beta,
Jak2fl
/
\
alpha,
o
Jak2fl
/
fl
genotipos. Las barras de error representan SEM. ANOVA de una va se muestra
para las comparaciones entre ratones de tipo salvaje y transgnicos. Ns indica
que no es significativo. *P 0,05; **P 0.01; ***P0.001.

El PV y ET fenotipos en nuestros
ratones se correlacionaron con el
Relacin entre el ARNm de JAK2V617F humano mutante y el
Salvaje tipo ratn Jak2.7 Por lo
tanto, hemos examinado si JAK2Los niveles de expresin de V617F
se
correlacionaron
con
la
Valores de hemoglobina. Durante la
fase PV temprana (10 semanas), la
MxCre: FF1 y SclCre; Los ratones
FF1 mostraron una relacin de
aproximadamente
1:
1
De mutante y de tipo salvaje JAK2
mRNA, mientras que la proporcin
en
VavCre; FF1 ratones con ET fue
aproximadamente 1: 2 (Figura 1B).
A
En etapas posteriores (35 semanas),
la relacin de expresin disminuy

en
MxCre;
FF1 a niveles de 1: 2 que eran
comparables a VavCre; FF1, pero
La relacin de expresin se mantuvo
en 1: 1 en SclCre; FF1 ratones
(Figura
1B). El nmero de copias del
transgn en ratones MxCre; FF1
disminuy
De 9 a 6 copias y el nmero de
copias
en
el
La configuracin tambin disminuy
de 7 a 5 (figura complementaria 2),
Lo ms probable es reflejar la
excisin continua inducida por
endgenos
Produccin de IFN. Por el contrario,
ninguna reduccin en la relacin de
expresin
o
Transgene nmero de copias se
observ en SclCre, FF1 ratones
(Figura

1B y complementario de la Figura
2). Esto sugiere fuertemente que la
En la Hb es independiente de la
dosificacin
gnica.
Los receptores primarios de clulas
BM (2 \ geq 106) de MxCre, FF1,
VavCre, FF1 y SclCre; donantes FF1
tomados 6-10 semanas despus
Induccin con pIpC o tamoxifeno,
respectivamente, mostr una MPN
Fenotipo similar al observado en
ratones
no
transplantados
(Figura 1C), incluyendo un aumento
significativo en el tamao del bazo
(suplemental
Figura 1B). La supervivencia de los
receptores
transplantados
de
SclCre;
FF1
Las
clulas
BM
mejoraron
sustancialmente
en
comparacin
con
SclCre no transplantado, ratones
FF1 y ya no era significativamente
Diferente de los ratones que
recibieron MxCre; FF1 BM (Figura 1C
derecha
panel). Por lo tanto, el aumento de
la
mortalidad
en
los
no
transplantados
SclCre: FF1 parece estar relacionado
con
la
expresin
de
JAK2-V617F
en
tejidos
no
hematopoyticos.
Porque
la
expresin
Cre
En ratones transgnicos SclCreER
tambin se ha descrito en clulas
endoteliales
, 13 examinamos mRNA de clulas
endoteliales
purificadas
y
Encontr que la expresin de JAK2V617F era detectable a niveles
bajos
(Figura 3A suplementaria). Sin

embargo,
no
hubo
Diferencia entre SclCre, FF1 y
MxCre, ratones FF1. ARNm cre
Tambin fue detectable en varios
tejidos
no
hematopoyticos
(suplemental
Figura
3B).
Se encontr un aumento de
eritroides,
megacariocitos
y
mieloides
Clulas formadoras de colonias en
BM a partir de clulas transgnicas
JAK2-V617F
Ratones (Figura 1E). Los ratones
SclCre; FF1 mostraron el mayor
Nmero de colonias eritroides y
mieloides, mientras que el VavCre;
FF1 ratones mostr el mayor
nmero
de
megakaryocytic
Colonias
El
crecimiento
independiente de la trombopoyetina
estaba presente en todos los
3, pero el crecimiento independiente
de EPO fue el ms destacado en
SclCre; FF1 y MxCre; ratones FF1. El
porcentaje
de
linaje
?,
Sca - 1 \ alpha, c - kit? (LSK) en el
BM se elev en MxCre, FF1
Ratones y una tendencia hacia
niveles ms altos tambin se
observ
en
SclCre,
FF1
Ratones, pero la mayor proporcin
de clulas LSK estaba presente en
VavCre; ratones FF1 (Figura 1G).
Resultados similares para colonia
Se obtuvieron clulas y clulas LSK
en la BM de clulas transplantadas
Receptores
(Figura
1F
y
H).
Para examinar la influencia del tipo
salvaje
Jak2
en
la
MPN

Fenotipo, hemos cruzado la SclCre,

FF1
ratones
con
un
condicional
Knockout del ratn Jak2

gene.10
Despus
de
la
induccin de tamoxifeno, el
SclCre; FF1; Jak2fl / fl y
SclCre; FF1; Jak2fl /? Los

ratones se mostraron ms
altos
Nmeros de RBC y recuentos
de reticulocitos que SclCre;
FF1; Jak2 \ alpha / \
(Figura 1I). Inicialmente, el
Jak2
heterozigtico
y
homocigoto
Knockouts mostraron valores
ms altos de hemoglobina
que los controles, pero al
Ms tarde, los valores de
hemoglobina
en
los
3
genotipos
se
Indistinguibles,
aunque
el
nmero
de
eritrocitos
permaneci
mayor.
Microcitosis
con
disminucin
del
volumen
corpuscular medio Se observ
a las 12 semanas despus de
la induccin. Los ratones
SclCre;
FF1
en
una
Heterocigotos y homocigotos
Jak2-knockout antecedentes
tambin
Haba reducido drsticamente
la supervivencia. La causa de
muerte en la mayora de los
Ratones no est claro. Los
ratones no parecan estar
visiblemente
enfermos
Antes de morir y no haba
signos
de
transformacin
leucmica.
Los recuentos de plaquetas y
neutrfilos
no
fueron
afectados
por
La reduccin heterocigtica o
homocigtica del tipo salvaje
Jak2
(Figura 1I). La proporcin de
JAK2 mutante a tipo salvaje
aument
en
Ratones
heterocigotos
y
homocigotos para Jak2fl / fl
(Figura
1J].

Para
caracterizar
ms
adelante
las
etapas
posteriores
cuando
los
valores
de
hemoglobina
Disminucin, se realiz el
anlisis histopatolgico de BM
trephine
Secciones de los diferentes
genotipos (Figura 2 y Tabla 1].
los
3 cepas que expresan JAK2V617F en presencia de 2 de
tipo
salvaje
Copias
de
ratn
Jak2
demostrado hipercelularidad
con
trilineaje
Hiperplasia.
El
aumento
marcado del nmero de
megacariocitos
atpicos
(Ncleos
hipercromticos,
hiperlobulados,
anmalos
nucleares
Configuracin)
estaban
presentes, muchos de ellos en
conglomerados.
Reticulina
Mancha (Gomori) revel
una densa red de fibras de
reticulina
Algunas
veces
en
combinacin
con
fibras
colgenas. La mayora de
Los ratones JAK2-V617F ms
antiguos
tambin
demostraron
osteosclerosis
(Tabla
1). Los bazos mostraron
destruccin de la arquitectura
normal
por
Infiltrados de hematopoyesis
altamente
atpica.
Megacariocitos
fueron
La
poblacin
celular
dominante, con la misma
morfologa
atpica
Como en el BM. El hgado
mostr tracto portal pero
tambin
sinusoidal

Infiltrados de hematopoyesis
atpica (Figura 2). SclCre; FF1;
Jak2fl
/
fl
Los
ratones
mostraron
hipercelularidad
con
hiperplasia
de
trilineo
incluyendo
Atpicos,
megacariocitos
agrupados. No hubo o slo un
leve
Aumento de las fibras de
reticulina.
Los
bazos
mostraron
infiltrados
de
Hematopoyesis atpica, pero
los hgados (y los riones)
No
afectados
por
estos
cambios (Figura 2 y Tabla 1).
Por
lo
tanto,
Histopatologa sugiere que la
mielofibrosis
podra
estar
vinculada
a
la
Disminucin
de
la
hemoglobina
en
etapas
posteriores de la enfermedad
en
MxCre;
FF1
Y SclCre; ratones FF1. Cuando
trasplantamos clulas BM de
SclCre; Ratones FF1 con
mielofibrosis en receptores
irradiados
letalmente,
El fenotipo PV reapareci en
los ratones trasplantados,
adems
Apoyando la hiptesis de que
la
disminucin
de
la
hemoglobina
fue
Principalmente
por
mielofibrosis
(datos
no
mostrados).
Realizamos
ensayos
de
trasplante competitivos para
establecer
una
Preclnico para probar los
inhibidores de Jak2 u otros
frmacos
utilizados
Tratamiento
de
pacientes
MPN y para seguir los efectos

en
la
sangre
Y la carga de alelo JAK2V617F (Figura 3). clulas BM
De la cepa transgnica UBCGFP que expresa la protena
GFP
En
todos
los
linajes
hematopoyticos se utilizaron
como
competidores.
BM transgnico UBC-GFP con
clulas de las 2 cepas que
Mostraron un fenotipo PV
(MxCre; FF1 o SclCre; FF1) en
una proporcin de 1: 1
Y trasplantado un total de 2 \
106 clulas BM en irradiacin
letal
Receptores (C57BL / 6, Figura
3A). Inicialmente, el MxCre;
FF1y
SclCre;
Los
ratones
receptores reconstituidos con
FF1 mostraron un fenotipo PV,
Con valores de hemoglobina
que regresan al rango normal
despus
de
18 semanas. El nmero de
plaquetas y neutrfilos en
MxCre;
FF1
Receptores
aumentaron
despus de 16-18 semanas,
mientras
que
en
SclCre; FF1 BM, las plaquetas
y los neutrfilos se elevaron a
Puntos de tiempo anteriores.
El quimerismo, medido como
el
porcentaje
de
GFP? En la sangre perifrica,
alcanz casi el 100% en
Eritrocitos, con ratones MxCre
y FF1 que muestran un ligero
Plaquetarias y neutrfilos en
comparacin
con
SclCre,
ratones
FF1
(Figura
3B).
El
aparente
rpido
aumento
inicial
del
quimerismo

En el compartimiento RBC es
en
parte
debido
a
la
persistencia
de
Eritrocitos del receptor. Los
controles que reciben BM de
tipo
salvaje
1: 1 mezclado con clulas
UBC-GFP BM se mantuvo en
aproximadamente
50% de GFP? Clulas durante
todo
el
tiempo
de
observacin. El sobreviviente
Veces en los 3 grupos de
ratones
trasplantados
no
fueron
significativamente
Diferente (Figura 3C] y la
relacin de mutantes de tipo
salvaje
JAK2
Se
mantuvo
aproximadamente 1: 1 en
ratones
MxCre:
FF1trasplantados
en
35 semanas (Figura 3D). En
etapas posteriores, el anlisis
histolgico
revel
Mielofibrosis en receptores de
MxCre, FF1 y SclCre, FF1 BM
(datos no mostrados). El
quimerismo en el BM y el
bazo
de
MxCre;
FF1-trasplantados
ratones fue de cerca del
100% en todos los linajes
(Figura 3E) y tambin en
clulas
LSK
(Figura
3F).
Porque
en
Estos
experimentos
el
quimerismo
se
estim
indirectamente
como
el
Disminucin de la GFP?
Clulas, tambin realizamos
el
trasplante
de
BM
Clulas de MxCre, los ratones
FF1 que se cruzaron con el
UBC-GFP
Ratones y GFP coexpresados
con
JAK2-V617F.
En
los

receptores
de
BM de MxCre; FF1; GFP
donantes, hemos confirmado
que
la
expresin
JAK2-V617F proporciona una
ventaja
competitiva
Figura 4). Tambin realizamos
un experimento de trasplante
en
CD45.1 y la contribucin de la
reconstitucin
autloga
Con clulas CD45.1 fue \ 1%
en todos los linajes, excepto
en
las
clulas
T
(datos no mostrados). Por lo
tanto,
la
reconstitucin
autloga fue insignificante
En
estos
experimentos.
Para la prueba de drogas, se
seleccion el intervalo de 4-8
semanas
despus
Trasplante,
cuando
los
receptores de MxCre; FF1 BM
ya
Mostr un fenotipo de tipo PV.
Examinamos los efectos de
INC424, un inhibidor Jak1 /
Jak2
dual,
y
de
HU,
actualmente
un
estndar
En
el
tratamiento
de
pacientes con MPN (Figura 4).
INC424
Tratamiento
no
alter
significativamente el peso
corporal,
aunque
Se observ una tendencia
hacia la prdida de peso,
particularmente
a
(Figura 4A). Se observ una
disminucin ms pronunciada
del
peso
corporal
Encontrados
en
ratones
tratados
con
HU,
que
alcanzaron
casi
el
10%
21 das a 200 mg / kg de BID.
Los pesos de bazo fueron
significativamente

Despus del tratamiento con

INC424, mientras que el
tratamiento con HU (200 mg /
kg) no tuvo ningn efecto, ni
siquiera aument ligeramente
los
pesos
del
bazo
(100 mg / kg, figura 4B).
INC424
normaliz
la
hemoglobina
Valores en ambas dosis
probadas, mientras que el
tratamiento con HU result en
Anemia
que
fue
particularmente pronunciada
en
la
dosis
ms
alta
(200 mg / kg, figura 4C panel
superior). Esta reduccin en
la
hemoglobina
No alter la carga del alelo
mutante, como lo indica el
alto
Porcentaje de GFP? Ter119?
Eritrocitos
en
la
sangre
perifrica
(Figura 4C panel inferior).
Curiosamente,
los
reticulocitos
fueron
Elevados en ratones tratados
con HU a 100 mg / kg,
mientras
que
los
Dosis (200 mg / kg) dio como
resultado una disminucin del
nmero
de
reticulocitos
Por debajo del rango normal
(Figura 4D). Los niveles de
plaquetas
no
Afectados por el tratamiento
INC424 en comparacin con
el
control
del
vehculo,
Mientras que HU en ambas
dosis redujo el recuento de
plaquetas por debajo de la
(Figura 4C panel superior).
Una disminucin de la luz en
el
mutante
En las plaquetas se observ
con ambos frmacos, con una

Disminucin mxima del 21%

en el grupo tratado con HU
(200
mg
/
kg)
(Figura 4C panel inferior). Los
nmeros de neutrfilos se
redujeron
Tanto INC424 como HU. La
carga del alelo mutante en los
neutrfilos
fue
Reducido
en
la
cohorte
INC424 (90 mg / kg) en un
13%,
y
en
la
HU
Cohorte en un 14% y un 26%
a 100 mg / kg y 200 mg / kg,
respectivamente
(Figura 4C panel inferior). El
quimerismo en BM y bazo
No
mostr
diferencias
significativas entre el vehculo
y
INC424
Para
el
Ter119?
Clulas
eritroides, mientras que un
ligero,
no
significativo
Disminucin se observ en el
Gr1?
Compartimiento
mieloide
en
el
Dosis de INC424 (Figura 4E).
Los ratones tratados con HU
mostraron
En la carga del alelo mutante
en la BM en ambos erythroid
Y
los
linajes
mieloides,
mientras que en el bazo no
hay diferencias significativas
(Figura 4E).
Evaluar los efectos de INC424 y HU
en
aguas
abajo
Sealizacin vas, se analiz la
fosforilacin
de
STAT5
Y protenas STAT3 2 horas despus
de la ltima dosis. En este
momento,
el
Los niveles de INC424 en la sangre
completa fueron 2,44? 0,64 \ mu
mol
/
l
para
el
Ratones que recibieron 30 mg / kg

(n \ theta 8) y 8,91 \ 1,70 \ mu mol /

L
para
Los ratones que recibieron 90 mg /
kg. Lamentablemente, no pudimos
Determinar los niveles sanguneos
de HU. Los niveles de fosforilados
La protena STAT5 (pSTAT5) se
redujo claramente en las secciones
del
bazo
De los ratones tratados con INC424,
segn
se
evalu
mediante
inmunohistoqumica,
Anlisis de imagen cuantitativo,
Western blotting y Meso Scale
Discovery (MSD) (Figura 5A-D). En
contraste,
el
bazo
Secciones de ratones tratados con
HU mostraron un aumento de
pSTAT5
En comparacin con los controles
tratados
con
vehculo.
Estos
hallazgos
fueron
Confirmado
por
inmunotransferencia y anlisis de
MSD
de
lisados
de
bazo
(Figura 5C-D). Las seales para
pSTAT3 en lisados de bazo fueron
dbiles
pero
Disminuy ligeramente en los
ratones que recibieron la dosis ms
alta
de
INC424 (Figura 5C). El sorprendente
aumento
de
los
niveles
de
STAT5 (pero no STAT3) fosforilacin
despus
de
tratamiento
HU,
Superior a los niveles observados en
el transplantado, vehculo tratado
Grupo
control,
nos
indujo
a
investigar si los niveles elevados
De EPO podra ser responsable de
este efecto. Concentraciones de
EPO
en
Los lisados de bazo de ratones
tratados con vehculo e INC424
fueron
Comparables,
pero
las
concentraciones de EPO en ratones

tratados
con
HU
fueron
Hasta 4 veces elevado (Figura 5E).
Este
hallazgo
es
Consecuencia de la anemia inducida
en los grupos tratados con HU.
La celularidad BM se increment en
ratones tratados con vehculo, pero
Normal en animales tratados con la
dosis de BID de 30 mg / kg de
INC424,
Mientras que la hipocelularidad se
observ con el INC424 90 mg / kg
Dosis
de
BID
(figura
5
suplementaria). Una disminucin en
el
nmero
de
Megacariocitos
se
observ
en
ambos grupos tratados con INC424.
BM
De los animales tratados con HU
mostraron hipocelularidad severa
Figura 5). En los bazos, las regiones
de color blanco y rojo Pulpa fueron
evidentes en todos los grupos de
tratamiento. Sin embargo, en los
bazos
De animales tratados con vehculos,
una mayor proliferacin de clulas
eritroides
(Figura 6). Bazo de INC424Los animales tratados mostraron
una hematopoyesis extramedular
reducida
Y, posteriormente, atrofia esplnica.
Los ratones tratados con HU en
200 mg / kg BID tambin mostraron
una
proliferacin
reducida
de
eritroides
(Figura
6
suplementaria).
Para explorar una gama ms amplia
de concentraciones de HU y
Mejorar el entorno experimental
para la prueba de drogas, hemos
repetido
el
Estudio utilizando receptores que
recibieron BM de un SclCre, FF1,
GFP
Donante 6 semanas despus de la

induccin del tamoxifeno. En este

ajuste,
GFP
es
Coexpresado con JAK2-V617F en las
mismas
celdas y permite
la
Monitorizacin de la carga del alelo
mutante. Todos los beneficiarios
Fenotipo PV con alta hemoglobina y
neutrofilia
y
agrandamiento
Bazo (Figura 6). Los efectos de
INC424 (90 mg / kg de BID) y HU
(100 mg / kg BID) sobre el peso de
la hemoglobina y el bazo y la
histologa
Fueron
comparables
con
el
experimento anterior (Figura 6 y
Figuras suplementarias 7 y 8). Sin
embargo,
INC424
no
pudo
Normalizar los neutrfilos y hubo un
efecto
paradoxal
sobre
las
plaquetas
Que despus de 21 das de
tratamiento fueron ms altos que en
el
Controles del vehculo. HU a 50 mg /
kg BID todava controlaba la sangre
, Pero 10 mg / kg de BID estaba por
debajo de una dosis efectiva (Figura
6).
En este contexto, GFP permiti la
supervisin directa del porcentaje
de
JAK2-V617F? Clulas. Una vez ms,
prcticamente
no
hubo
Quimerismo detectable con INC424
y solo HU a 100 mg / kg BID
La carga
del
alelo
mutante,
principalmente en las plaquetas y
Compartimiento
de
neutrfilos
(Figura 6D). Otra manera de evaluar
la
Efecto sobre la carga tumoral total
es tener en cuenta la reduccin
De la masa tumoral reduciendo el
tamao del bazo. En el segundo
Experimento, INC424 redujo el
tamao del bazo en comparacin
con
el
vehculo

Control de aproximadamente 250

mg, mientras que HU no tuvo
ningn
efecto.
los
Porcentaje de GFP? En el bazo fue
de 77% en el INC424- De ratones
tratados, 85% en el grupo HU, y
91% en el grupo de vehculos.
Por esta estimacin, INC424 tuvo un
mayor impacto en la carga del
tumor
Que HU. Similar al experimento
anterior, el aumento de los niveles
de
Se observaron pSTAT5 en los bazos
y muestras de BM de ratones
Tratados con HU a 100 mg / kg de
BID, que se correlacionaron con
Concentraciones aumentadas de
EPO (figura 9 suplementaria).
Discusin
Para que nuestros ratones JAK2V617F transgnicos inducibles se
utilicen
como
Un modelo animal preclnico para la
prueba de frmacos con efectos
MPNs, primero realizamos una
caracterizacin detallada de la
Variaciones fenotpicas y examin la
capacidad de los transgnicos
Las clulas BM para trasplantar el
fenotipo.
Anteriormente
se
Modelo de ratn transgnico que
una proporcin de JAK2-V617F
humano
a
El ratn de tipo salvaje Jak2 de
aproximadamente 1: 2 dio como
resultado
trombocitosis
Y neutrofilia con hemoglobina
normal
muy
parecida
ET, mientras que una proporcin de
aproximadamente 1: 1 entre el
JAK2V617F y de tipo salvaje ratn Jak2
se
asoci
con
un
PV
En el presente estudio, hemos
reproducido
estos
hallazgos

Utilizando el transgn condicional

JAK2-V617F en los cruces con
2 cepas Cre previamente estudiadas
y con el inducible de tamoxifeno
SclCreER que no hemos examinado
antes
(Figura
1].
los
VavCre; FF1 doble transgnicos
mostraron
un
ET
fenotipo
y
Una baja proporcin de JAK2-V617F
a Jak2 de tipo salvaje, mientras que
la
MxCre; FF1 y el SclCre; FF1 ratones
mostraron
un
fenotipo
PV
y
Una alta proporcin de JAK2-V617F a
tipo salvaje Jak2 (Figura 1A-B).
Sorprendentemente, los ratones
SclCre;
FF1
tuvieron
una
supervivencia
significativamente
ms
corta
Tiempo que las otras 2 cepas de
ratn. La supervivencia mejor
cuando
SclCre; FF1 BM se trasplant en
receptores de tipo salvaje irradiados
(Figura 1C], lo que sugiere que no
hematopoietic
expresin
de
JAK2-V617F puede desempear un
papel. Por el contrario, no se
La supervivencia se observ en
MxCre trasplantado, FF1 y VavCre,
FF1
ratones. Por lo tanto, el efecto
beneficioso en SclCre; FF1 ratones
no
Parecen estar relacionados con una
atenuacin general del fenotipo de
la
enfermedad
en
Receptores de trasplante, como se
ha
descrito
previamente
por
otros.16,17
Utilizando un gen reportero LacZ, la
expresin de la recombinasa Cre en
Tamoxifeno tratados con ratones
SclCreER se encontr en las clulas
hematopoyticas
Y las clulas endoteliales de varios
rganos adultos.13 Aunque nuestro

El anlisis de la expresin de JAK2V617F en clulas endoteliales no

Revelan diferencias importantes en
la expresin entre MxCre, FF1 y
SclCre;
FF1
ratones
(complementario de la Figura 3], no
podemos
excluir
que
Expresin localizada en algunas
partes del sistema vascular podra
Ms fuerte en SclCre que en ratones
MxCre.
En un seguimiento ms largo, se
observ la normalizacin de la
hemoglobina
Niveles en MxCre, FF1 y SclCre,
ratones FF1 a aproximadamente
18-26 semanas despus de la
induccin.
Examen
histolgico
revelado
Mielofibrosis con grados variables
de
osteosclerosis
como
Causa de la hemoglobina reducida
(Figura
2
y
Tabla
1).
Consistente con esto como una
consecuencia de la mielofibrosis,
una
Fenotipo PV resurgido cuando BM de
ratones
mayores
con
grado
2-3 mielofibrosis se trasplant en
receptores de tipo salvaje (datos
no mostrada). En MxCre; FF1
ratones, una disminucin de la JAK2V617F
Expresin
(Figura
1B)
puede,
adems
de
la
mielofibrosis,
Contribuyen a normalizar los niveles
de hemoglobina. Sospechamos que
Esta disminucin en la expresin
JAK2-V617F es la consecuencia de
Endgena que podra activar la
expresin
de
MxCre
En ausencia de pIpC y conducir a la
disminucin en la copia transgnica
Nmero (figura 2A suplementaria).
SclCre;
FF1
no
mostraron
Tal disminucin en la expresin
JAK2-V617F o el nmero de copias.

Los efectos de JAK2-V617F sobre la

eritropoyesis fueron potenciados
Al disminuir los alelos Jak2 de ratn
de tipo salvaje (Figura 1I).
Aunque los nmeros de RBC y
reticulocitos fueron fuertemente
Elevadas en estos ratones, los
eritrocitos
se
Microcticos,
previniendo
un
aumento
adicional
de
la
hemoglobina
y
Valores
de
hematocrito.
La
microcitosis
podra
ser
una
consecuencia
de
Hemorragia gastrointestinal debido
a que las heces de estos ratones
Con frecuencia Hemoccult ?, pero
tambin
puede
reflejar
el
desequilibrio
del
hierro
Utilizacin
en
eritropoyesis
masivamente
aumentada.
El
sobreviviente
Tiempos de SclCre; ratones FF1 con
prdida
heterozigtica
o
homocigtica
De Jak2 fueron drsticamente ms
cortos que los de ratones con tipo
salvaje
Jak2. En general, estos resultados
refuerzan an ms el vnculo
JAK2-V617F y Jak2 de tipo salvaje
para la capacidad de respuesta de
Eritropoyesis al mutante JAK2. La
megacarioctica
y
Los
linajes
granulocticos parecen ser en gran
parte no afectados por la prdida de
El
tipo
salvaje
Jak2.
La correlacin entre los niveles de
expresin del mutante JAK2 y
El PV o ET fenotipos se ha
observado en algunos, pero no en
todos,
Ratn
JAK2-V617F
modelos.
Adems, las diferencias en el
fenotipo
Tambin puede ser debido al uso de

ratn
frente
a
JAK2V617F (revisado en Van Etten et al5
y
Li
et
al6).
Principios
Todos los modelos retrovirales
usaron el ratn Jak2-V617F y
obtuvieron
Altos niveles de expresin de Jak2V617F con un fenotipo PV.1,16,1820
La expresin retroviral del JAK2V617F humano tambin produjo una
Fenotipo PV con niveles normales de
plaquetas.7
En
contraste,
los
transgnicos
Ratones que expresaron el ratn
Jak2-V617F
bajo
la
H-2Kb
Promotor mostr un fenotipo ET en
una lnea o ocasionalmente un
Fenotipo PV leve con trombocitosis
en
otra
lnea.21
Transgnicos
Ratones que expresan el JAK2-V617F
humano
bajo
el
Vav
Promotor result en un fenotipo
ET.22 Sin embargo, la expresin
Niveles de mutantes y de tipo
salvaje Jak2 no se han estudiado en
En estos ratones transgnicos. Un
modelo de knock-in que utiliz el
Humano JAK2-V617F mostr un
fenotipo ET moderado.17 Otros
Knock-in
mouse
modelos
que
utilizan el ratn Jak2-V617F result
En un fenotipo PV con en la mayora
de los casos una relacin 1: 1 del
mutante
a
la
Wild-type Jak2.23-25 Estos modelos
knock-in
no
contradicen
el
Conclusiones de nuestros estudios
porque a una relacin de expresin
1:
1,
Tambin observ un fenotipo PV. El
fenotipo ET en nuestro modelo fue
Encontrado cuando los niveles de
expresin
del
mutante
Jak2
disminuido
a
Aproximadamente 1: 2. Esto no se
puede modelar en los knock-ins,

Porque la expresin es fija y no se

puede modificar. Por lo tanto,
Nuestros
ratones
MxCre;
FF1
representan actualmente el nico
modelo
que
Permite la modulacin de la relacin
de expresin aplicando diferentes
Dosis de induccin de pIpC en
ratones genticamente idnticos.7
Recientemente, factores adicionales
que influyen en la manifestacin de
ET
Y los fenotipos PV (por ejemplo, la
actividad
de
Stat1
Sealizacin o expresin de TNF \
alpha
26,27).
Transplante competitivo de BM de
MxCre;
FF1
o
SclCre;
FF1 ratones mezclados con clulas
de UBC-GFP-ratones transgnicos en
un
De 1: 1 dio como resultado un
fenotipo PV. Primero utilizamos el
MxCre; ensayo de repoblacin FF1.
INC424 y HU fueron elegidos
Debido a que una gran cantidad de
datos estn disponibles de estudios
en
humanos.28
En general, el modelo de ratn
recapitula fielmente los efectos
conocidos
De
estos
frmacos
en
el
hemograma y el bazo (Figura 4). UN
Una ligera tendencia a disminuir la
carga del alelo mutante en la
Los ratones tratados con HU,
particularmente
en
el
linaje
granuloctico
en
sangre
Y en BM (Figura 4C y E). Debido a
que la dosis de 200 mg / kg
HU llev a la prdida de peso y la
anemia,
tambin
repiti
el
experimento
Con dosis ms bajas de HU.
Adems,
para
permitir
una
Monitorizacin de la carga del alelo
mutante,
se
utiliz
BM
de

SclCre; FF1; GFP donantes para este

experimento. HU a dosis ms bajas
(50 mg / kg BID) normaliz el
recuento sanguneo y una ligera
reduccin
De la carga del alelo mutante se
observ (Figura 6D]. Resultados en
Los efectos de HU sobre la carga de
alelo mutante JAK2 en estudios
clnicos
El aumento de la carga del alelo
JAK2-V617F
fue
Descritos en algunos estudios
retrospectivos de pacientes MPN
tratados
Con HU.29-32 Sin embargo, otros
estudios
no
confirmaron
esto
.33-35 Un estudio encontr que la
carga
del
alelo
JAK2-V617F
Disminuy slo en los pacientes que
recibieron HU como un tratamiento
de
novo,
Mientras que los pacientes que
haban estado en HU durante un
perodo
prolongado
de
Tiempo mostr una carga de alelo
mutante notablemente estable36.
Nuestro ensayo competitivo de
repoblacin muestra una importante
proliferacin
Ventaja del clon JAK2-V617, el
aumento de la sensibilidad del
Mutante clon a HU podra estar
relacionado con la proliferacin de
clulas
de
alta.
Similar a los ensayos clnicos,
INC424 mostr poco efecto en la
Mutante en nuestro modelo de ratn
(Figuras 4 y 6). En Contraste con los
estudios en humanos, las plaquetas
no fueron bajadas por INC424
En nuestros experimentos con
ratones (Figuras 4 y 6). La razn de
esto
La diferencia en la capacidad de
respuesta
es
actualmente
desconocida,
pero
observamos

El mismo resultado con otros

inhibidores de Jak2 (datos no
mostrados).
Sospechamos que la falta de
respuesta en el ratn representa
una
Diferencia entre especies en la
regulacin de la trombopoyesis.
El tratamiento con INC424 redujo
significativamente la fosforilacin de
Stat5 en el bazo y las clulas BM
(Figura 5 y complementario de la
Figura
9].
En contraste, los ratones tratados
con HU mostraron un fuerte
aumento
en
Stat5
Fosforilacin que dependa de la
dosis.
Stat3
fosforilacin
Fue menos afectada (Figura 5].
Debido a que el grupo tratado con
HU
tambin
Anemia y elevacin de los niveles
de EPO, sospechamos que la
Los niveles elevados de pStat5 son
impulsados
por
niveles
de
citoquinas
aumentados.
Tambin pueden estar involucradas
citocinas distintas de la EPO.
Hiperactivo
Se
ha
demostrado
que
la
sealizacin Jak2 / Stat tiene efectos
no
deseados
en
Las dosis de HU utilizadas en
nuestro estudio oscilaron entre
Inferior a la dosis efectiva (10 mg /
kg de BID) a una dosis que indujo
Citopenia (200 mg / kg de BID).
Utilizando un mtodo de conversin
de
dosis
que
Se basa en la superficie corporal, 38
la dosis de 100 mg / kg de BID en la
Ratn correspondera a 16,2 mg / kg
/ d en seres humanos (es decir,
aproximadamente
1 000 mg / d para una persona de
60 kg), que es una dosis frecuente
Utilizados para el mantenimiento en

pacientes MPN. Por lo tanto, la

activacin
de
La va Stat por HU es un efecto
adverso
que
debe
evitarse
En el tratamiento de pacientes con
NPM.
Varios estudios han probado los
efectos de los inhibidores de Jak y
Otros compuestos en modelos
animales
de
JAK2-V617F.
Inicialmente,
Modelos retrovirales que expresan
JAK2-V617F
se
utilizaron
para
Compuestos imatinib, dasatinib,
AG490 y TG101348.20, 39 Otros
Estudios
usaron
ratones
transplantados con clulas BaF3 que
fueron
diseadas
Para expresar JAK2-V617F para
probar los efectos de TG101209,
INCB16562,
INCB08424,
NVPBSK805
y
SB1518.40-44
Ms
Recientemente, se utilizaron los
ratones knock-in y transgnicos
Jak2-V617F
Para
evaluar
los
efectos
de
TG101348, R723 y G6.21,24 Estos
modelos
Permiti el seguimiento de los
recuentos sanguneos y el tamao
del
bazo,
pero
no
Cambios en la carga del alelo
mutante.
Recientemente,
un
transgnico
Modelo mostr que el inhibidor de
Jak2 G6 tambin fue capaz de
reducir
el
Mutante en el BM.45 En estos
ratones, todas las clulas llevan el
Transgn humano JAK2-V617F bajo
el
control
del
Vavpromoter,
22, pero aparentemente no todas
las clulas tambin expresan el
transgn.
Cmo pueden usarse los niveles de
expresin de mRNA del transgn
para

Definir los cambios en la carga del

alelo no se ha descrito en detalle
Para este modelo de ratn. Nuestro
ensayo competitivo de repoblacin
ofrece
La ventaja de que las clulas que
expresan JAK2-V617F en los 3 linajes
Relevantes para el fenotipo de la
enfermedad MPN, RBC, plaquetas y
Neutrfilos,
pueden
ser
monitorizados
directamente
en
sangre
perifrica

Como en BM y otros rganos. Este

sistema nos permitir evaluar
No slo los efectos de los
compuestos
individuales,
sino
tambin
para
Combinaciones de frmacos para la
terapia de MPNs.