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COMPARACION DE METODOS PARA LA RECUPERACION

DE ADN A PARTIR DE GELES DE AGAROSA


Jorge Contreras

', Mara Orfa Rojas ', Gladys Pinilla ' , Moiss Wasserman

Se ensayaron cuatro mtodos para la recuperacin de ADN separado por electroforesis en gel de agarosa. Se usaron diferentes cantidades y tamaos de ADN.
Se discuten las condiciones especiales, los cuidados de cada mtodo y la
recuperacin segn el tamao y las cantidades iniciales utilizadas.

La frecuente necesidad de recuperar y purificar fragmentos de ADN separados sobre geles


de agarosa y poliacrilamida ha llevado al desarrollo de gran variedad de mtodos (1-9). Teniendo en cuenta que ninguno ha mostrado ser plenamente satisfactorio, se han realizado modificaciones a cada uno de ellos con el fin de
hacerlos ms eficientes.
Uno de los mtodos utilizados es la electroforesis y recuperacin sobre un papel de DEAE-ce
lulosa. Es una tcnica simple que se puede
aplicar a varias muestras simultneamente. El
ADN obtenido es de alta pureza. El mtodo fue
inicialmente desarrollado por Girvitz quien utiliz
membranas de dilisis (1). Posteriormente es
modificado introducindose las membranas de
DEAE-celulosa que tienen la ventaja de no liberar fibras, presenta una matriz de mayor densidad y estr cargadas positivamente por la introduccin de grupos amino (2, 3). El mtodo se
basa en la unin del ADN a las membranas por
interacciones electrostticas, entre las cargas
positivas en la membrana y las cargas negativas
del ADN. La elucin del ADN se hace con un
buffer de alta fuerza inica.

La electroelucin (EE) fue usada por primera


vez por McDonell en 1977 (4). El mtodo consiste
en cortar el fragmento de gel que contiene el
ADN que se quiere purificar, introducirlo en una
bolsa de dilisis con un buffer, someter la bolsa
a un campo elctrico para sacar el ADN de la
agarosa, purificarlo mediante extracciones
orgnicas y concentrarlo por precipitacin
etanlica
Otro procedimiento es hacer electroforesis
empleando agarosa de bajo punto de fusin
(LMPA) y cortar el fragmento de gel que contiene
el ADN que sedesea purificar, fundirlo y, mediante extracciones orgnicas, retirar la agarosa. El
ADN queda en la fase acuosa (9).
La utilizacin de matriz de slica fue descrita
por Vogelstein en 1979 (7). Se basa en la unin
del ADN de cadena sencilla y doble a la matriz a
travs de interacciones polares dbiles. La elucin
del ADN se hace con un solvente polar (H,O).

Se probaron los cuatro mtodos mencionados. Se separaron fragmentos de ADN de tres


tamaos y de cada uno tres cantidades diferentes (tabla 1).

n s t t u t o Nacona de Salud. Universidad Nacional de Colombia


2 Facultad de C e n c a s . Universdad Nacional de Colombia. Santalb, de Bogot

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COMPARACION DE METODOS PARA LA RECUPERACION DE AON

TABLA 1. Separacin de DNA de fago lambda cortado


con HlND 111.

TAMANO ( ~ b )

CANTIDAD (ug)

(*) Este fragmento corresponde a las bandas de 2 y 2.3 kb


del ADN lambda Hlnd 1 1 .

Se realizaron cuatro electroforesis en agarosa


de bajo punto de fusin. El gel fue de un tamao
de 6,5xlOxl cm. Las electroforesis se realizaron
a 1 voltiolcm. En cada una se separaron tres
muestras, as: 10. 2 y 0,5 iig de ADN de fago
Lambda cortado con la enzima de restriccin
Hind III. Se hizo ourificacin del ADN de las
v, 2.300
(se
bandas de 2.400. 2.000
- , - - tomaron
~- - - con...nrarrenre 1500 30.-as oanoas oe ADh se
v S-a zaron nieo aiire r nc on s-merq enco e qei
en una solucin de bromuro de etidio 0,5 iigiml
durante 10 minutos e iluminando con una Imoara de luz ultravioleta de 302 nm. Se corlaron'las
bandas de inters para purificar el ADN.
~

La purificacin por extracciones orgnicas de


l a agarosa de bajo punto de fusin de hizo de la
siguiente forma (5.6,9):
1. Se fundi la agarosa por calentamiento a
65C y se agreg un volumen igual de TE
(Tris pH:7,5 10 mM, EDTA pH:8,0 1 mM).

5.

Se hizo precipitacin etanlica llevando la


concentracin salina de la solucin a 0,3 M
con NaAc y agregando dos volmenes de
etanol absoluto. Se incub 30 minutos a
-20C. Se centrifug20 minutos a 15.000 g.
El precipitado se resuspendi en buffer TE.
Se hizo cuantificacin espectrofotomtrica
y porelectroforesis en gel de agarosa (AGE)
del DNA.

La electroelucin (EE) se hizo de la siguiente


forma (4,5,6):
Se introdujo el trozo de gel en una
de
dilisis que contiene 500 111de TE. Se coloc la bolsa en una cmara de electroforesis
ante un campo eltricode 1 voltiolcm durante 5 minutos. El ADN sali del ael
v, se oea
a las paredes de la bolsa.
2. Se cambi la oolaridad del camoo elctrico

o ~ r a n r e 3 0 s c g ~ i i o opara
s
oerar a ADN oe
a oolsa y oear o o s..e ro en e TE.
3. Se saca el TE de la bolsa y se hace:

a. Extraccin con fenol.


b. Extraccin con fenol: cloroformo: alcohol
isoamlico.
c. Extraccin con cloroformo.
d. Extraccin con isobutanol.
e. Precipitacin etanlica.
4. Se resuspendi el ADN precipitado en TE y
se cuantific.

2. Se hizo extraccin orgnica agregando un


volumen de fenol, igual al volumen final
obtenido despus de agregar el TE. Se
mezcl por 5 minutos. Se centrifug a 5.000
g, 3 minutos para separacin de fases y se
descart la fase orgnica.

La recuperacin sobre una membrana de


nylon cargada positivamente se hizo de la siguiente forma (3,5,6):

3. A la fase acuosa se le hizo extraccin con


fenol: cloroformo: alcohol isoamlico en proporcin 25:24:1 respectivamente, la extrac.
cin fue similar a la anterior. De igual forma
se hizo una extraccin con cloroformo.

1. Se trataron las membranas sumerginlas 5


minutos en unasolucin 10mM de EDTA pH
8,O; se lavaron con agua destilada; se sumergieron en unasolucin 0,5 N de NaOH y se
lavaron y almacenaron con agua estril.

4. Se retir el bromuro de etidio haciendo


extraccin con isobutanol saturado con
agua.

2. Se insertaron fragmentos de membrana de


nylon (tratados) inmediatamente por debajo
de las bandas de ADN de inters.

J. CONTRERAS. M O. ROJAS. G P N L L A M. WASSERMAN

3. Secontinu laelectroforesisdurante el tiempo

de una solucin con concentracin conocida de


ADN para una cuantificacin rpida con bromuro
de etidio (6).

necesario para que el ADN pasara a la


membrana.
4. Se lav la membrana con un buffer de baja
concentracin salina (150 mM de NaCI).

RESULTADOS Y DISCUSION
Algunas fracciones de ADN obtenidas por
mtodos que utilizan extraccin con solventes
orgnicos, al hacer la valoracin espectrofotomtrica presentaron un espectro con un desplazamiento del mximo de absorcin de 260 nm
(para cidos nucleicos) a 270 nm indicando contaminacin con fenol (figura 1). Es importante
buscar la manera de eliminar completamente
cualquier traza de este solvente de las soluciones de ADN debido a que su presencia interfiere
en la mayora de reacciones enzimticas.

5. Se eluy el ADN en un buffer de alta concentracin salina (1 M de NaCI).Se hizo una


segunda elucin.
6. Con el eludo se realiz:

a. Extraccin fenlica.
b. Extraccin con fenol: cloroformo:
alcohol isoamlico.
c. Extraccin con cloroformo.

De igual f o r m a el A D N extrado por


GENECLEAN queda con trazas de Nal. Al
hacer la valoracin espectrofotomtrica, en algunas muestras, l a presencia de Nal impide la
valoracin del ADN (datos no mostrados). Los
lavados e incluso una precipitacin etanlica a
la solucin de ADN son insuficientes
para la
completa del Nal, sin embargo, la
presencia de Nal no afecta significativamente
las reacciones en las cuales se utiliza el ADN.
El GENECLEAN tiene la ventaja de no utilizar
extracciones orgnicas evitando la contaminacin con fenol y evita l a precipitacin etanlica
dando rapidez al proceso.

d. Extraccin con isobutanol.


e. Precipitacin etanlica.
7. Se resuspendi el ADN en TE y se cuantific.
El procedimiento de purificacin con matriz
de slica (GENECLEANTIffl)se realiz de la siguiente manera (7,E):

1. A los fragmentos de gel que contenan el ADN


de inters se agregaron 2.5 volmenes de una
solucin de Nal. Se incub 5 minutos a 55 "C.
2. Se adicion 5 IIL de la suspensin de silica
(GLASSMILVM).Se incub 15 minutos a 4 C.
3. Se centrifug 5 minutos a 5.000 rpm

ESPECTROS PRODUCIDOS POR ADN Y FENOL

4. Se agreg al precipitado 400 kiL de etanol al

Abaa,banoia

50%. 10 mM de Tris aH:7.5. 0.1 M de NaCl


y 1 mM de EDTA' (NEWWASHT'.'). Se
centrifug 5 minutos a 5.000 g. Este procedimiento se repiti tres veces.
5. Para eluir el ADN se agregaron 50 ;iL de TE
y se incub 3 minutos a 55C.

"~,,

0.3

P\\,

\\

\,

\,

O.,

220

240

260
L

-~i",.

\.

-u'

cuantific el ADN en sobrenadante.

\
280

~le
Onda
~
.( n m ~

FENOL

',

i
1

6. Se centrifug 3 minutos a 5.000 g y se

La valoracin del ADN recuperado por los


diferentes mtodos se hizo por electroforesis,
espectrofotmetroy se hicieron dilucionesseriadas

--

AUN

300

320

COMPARACION DE METODOS PARA LA RECUPERACION DE ADN

Para obviar los roblem mas anteriores. las cifras obtenidas para calcular el porcentaje de
recuperacin (figura2) de cada una de las muestras con relacin al terico esperado fue realizado por cuantificacin rpida con bromuro de
etidio (figura 3) y una evaluacin cualitativa y
cuantitativa por AGE de cada una de las muestras obtenidas (figura 4). Un hecho importante
fue la visualizacin de bandas por electroforesis
de muestras en las cuales por coloracin con
bromuro de etidio no fue posible detectar la
presencia de ADN.

Uno de los problemas de la recuperacin de


ADN de geles de agarosa es la cantidad. Entre
menor es la cantidad de ADN, disminuye proporcionalmente la recuperacin. Por ninguno de los
PORCENTAJE DE RECUPERACION DEL ADN
COMPARACION DE LOS CUATRO METODOS

10 ug DE LAMBDA HlND 111

0.5 Y 2 ug DE LAMBDA HlND 11


,m

,m.

Figura 4: Control de recuperacion del DNA puificado por


electroforesis en agarosa. (1) marcador lambda Hind 111.(2 y
3) fragmento de 2kb y (4) fragmento de 0.5 kb,

mtodos fue posible recuperar ADN cuanoo se


parta de cantidades inferiores a 180 ng.

Figura 2: Se compara e porcentaje de recuperacin de los


4 mtodos: agarosa de bajo punto de fusin (LMPA).
GENECLEAN (GC). electroelucin (EE) y unin a membranas de nylon (MN).
"

,.

Figura 3: Cuantificacon de DNA con bromuro de etidio. Se


hicieron diluciones seriadas de un ADN comercial de concentracin conocda (A) desde 25 ng/!iL hasta 0.2 ng/!iL
(1-8). s e hacen diluciones seriadas de cada una de las
muestras: 24kb 16).2kb (C) y 0.5kb (D). por ~acomparacin
de la intensidad de sena en a s muestras con el patrn se
establece la concentracn.

Se puede afirmar queel mtodo que da mayor


eficiencia de purificacin, independiente del tamao y de la cantidad de ADN, fue la utilizacin
de LMPA.
Las cifras de recuoeracin Dara los fraamentos de 500 y 2000 pb por la LMPAY de GC fueron
similares. Para los fragmentos de 24.000 pb la
recuperacin por GC fue sensiblemente menor.
Este problema est descrito en la literatura para
los mtodos que utilizan la unin a matriz slida
(5). Con molculas de ADN de gran tamaiio, el
nmero de interacciones por molcula con la
matriz es mayor, dificultando la elucin. Una
caracterstica que llama la atencin para la utilizacin de GENECLEAN es la rapidez, sencillez
y bajo costo; el procesamiento de una muestra
emplea 30 minutos.
Por los mtodos de EE y recuperacin sobre
la membrana de nylon prcticamente
hubo
recuperacin para todos 10s tamaiios Y cantidades de ADN probados. La afinidad de los cidos
nuclicos es muy grande por la membrana de
nylon cargada dificultando su elucin.

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La reaccin en cadena de la
polimerasa
permite
a
estudiantes e investigadores
producir millones de copias de
una
secuencia
de
ADN
especfico en unas pocas horas.
Una reaccin de PCR inicia con
el paso de desnaturalizacin,
para ello la muestra es
calentada entre 94 y 96C
durante unos 30 a 60 segundos
para desnaturalizar la doble
hebra (separar la cadena de
ADN), a continuacin la
temperatura es bajada a un
rango entre 50 y 65C, esto
permite a los Primers o
Cebadores ubicarse en su
secuencia complementaria para
que el ADN sea amplificado,
posteriormente la temperatura
es elevada a 72C para permitir
a la Taq Polimerasa terminar el
trabajo
de
ubicacin
y
alargamiento de la nueva hebra
sintetizada, posteriormente la
temperatura
es
elevada
nuevamente a 94C para iniciar
un nuevo ciclo de sntesis,
ubicacin,
alargamiento
y
supervisin de la nueva hebra
de ADN, al final del Ciclo 30 se
obtienen as un nmero de mil
millones
de
copias
del
fragmento de inters, que podr
ser usado para diagnstico,
investigacin o para insercin
en otro organismo. El equipo
que realiza los cambios y
controles de temperatura se
conoce como termociclador. Los
otros equipos necesarios para el
anlisis de resultados de la PCR
son la cubeta de electroforesis
con su fuente de energa y el
transiluminador, en el primero
se separan las molculas por
medio de sus pesos y el segundo
permite observar el ADN
amplificado por medio de la
reflexin de luz visible.

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