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/SNV/2021

Dpartement de Biologie Vgtale et Ecologie

MEMOIRE
Prsente par : BENZIDANE CHAHRAZED
Pour obtenir le diplme de Magister
Option : Biodiversit et gestion des cosystmes

THEME :

Effet toxique des rsidus des pesticides utiliss

sur la flore de la rgion de Stif
Soutenu publiquement le 13/11/2012

Devant le jury

Prsident :

M. KAABECHE

Pr.

UFA- Stif

Rapporteur :

S. DAHAMNA

Pr.

UFA- Stif

Pr.

UFA-Stif

Examinateur :
Examinateur :

H. BOUZERZOUR
M. BOUNECHADA

M.C.A. UFA- Stif

Anne universitaire 2011-2012

Remerciements
La russite dune thse doit beaucoup lenvironnement scientifique et humain dans
laquelle elle se droule.
La rdaction de ces pages clt une aventure de trois annes qui na pas toujours t facile
et je tiens exprimer ma reconnaissance tous ceux et celles qui, par leur soutien, leur aide
et/ou leurs encouragements, ont contribu, de prs ou de loin, la concrtisation de ce travail.
Jexprime toute ma reconnaissance et ma profonde gratitude ma directrice de thse, M

DAHAMNA pour le temps quelle ma consacr, son aide constante et ses conseils aviss.
Jai beaucoup apprci de travailler vos cts, pour votre dynamisme, votre franchise, votre
rigueur, votre soutien et disponibilit au quotidien et pour toutes les conversations changes.
e

Mes remerciements les plus sincres sadressent tout particulirement M r KAABECHE,

qui ma fait lhonneur daccepter de prsider le jury de cette thse, veuillez trouver ici
lexpression de ma profonde gratitude. Vous mavez paule lors de mes recherches et mes
moments de doute. Je vous prie de trouver le tmoignage de mon plus profond remerciement.
ers

Ma gratitude va aussi M BOUZERZOUR et BOUNECHADA, je suis honore de vous

compter parmi les membres de mon jury malgr votre emploi du temps charg. Merci pour
votre disponibilit, votre aide et votre soutien moral et davoir accept dvaluer ce travail.
e

Je souhaiterais remercier galement M r BOUHARATHI, pour son aide prcieuse au dbut

des recherches bibliographiques, ses conseils scientifiques sa gentillesse et sa patience. Ses
commentaires et critiques ont permis lamlioration du manuscrit final.
Je remercie profondment Pr. TOUABTI pour son soutien, sa prcieuse aide. Merci de
mavoir aid mener bien ce travail avec tant de bienveillance.
Je noublierai pas de remercier Dr. ABDELLOUCHE, Directeur du laboratoire
dAnatomie-Pathologique pour mavoir si bien accueillie au sein de son laboratoire mais
galement pour sa sympathie et son encouragement. Merci pour tout ce que jai appris vos
cts.
Je rserve une mention particulire toutes les personnes qui mont apport leur soutien et
leur aide et tout particulirement ma tante Malika et mon beau frre Nacir.
Mes remerciements sadressent galement Sonia, Nadia et Karima ainsi qua toutes les
autres personnes que je nai pas cites. Merci pour votre gentillesse et votre amabilit, Cette
thse marque la fin de 2 annes au sein de lcosystme que forme le laboratoire de biologie
animale.

Je ddie ce travail la mmoire de ma chre et regrette maman, cest pour toi que jai fait
ce parcours et je regrette que tu ne sois pas parmi nous en ce moment tant attendu. Tu es dans
mon cur et mon esprit en toute circonstance.
Merci mon pre ador, ma sur, mes frres et tout le reste de la famille. Je ddie
galement ce travail mon cher poux Halim et ma tendre fille Srine auxquels je suis
redevable pour leur soutien inconditionnel et leurs sacrifices. Ce travail naurait jamais pu tre
men bien sans leur encouragement et comprhension. Srine, ton amour me donne des ailes
pour avancer dans la vie. Je ne crois pas avoir besoin den dire plus je taime trs fort.
A ma frangine Nadia: Aujourdhui tu es prsente pour moi, demain ce sera mon tour de
faire partie de ton auditoire, avec autant de fiert. Jespre que tu tpanouiras toujours dans ta
vie, notamment au travers dune belle carrire qui tattend. On a partag beaucoup de bons
moments, et cest loin dtre fini.

Liste des abrviations

ACh

Actylcholine

AChE

Actylcholinestrase

AFSSA

Agence Franaise de Scurit Sanitaire des Aliments

AMM

Autorisation de mise sur le march

ANOVA

Analyse de variance

AU

Acide urique

CCM

Chromatographie sur Couche Mince

CEC

Commission of the European Communities

Chol T

Cholestrol total

Crt

Cratine

CPF

Chlorpyrifos

CPO

Chlorpyrifos-oxon (mtabolite actif du CPF)

CYP

Cytochrome

Poussire ou poudre

DDT

(Dichloro-Diphnyl-Trichlorothane),

DEP

Dithylphosphate

DES

Dose sans effet

DF

Pte granule

DJA

DJA Dose journalire administr,

DL50

Dose ltal

E ou E C

Concentr mulsifiable

EDTA

Ethylne-diamine-ttra-actate

Suspension concentre

FAO

Food and Agriculture Organization

FNS

Formule numrique sanguine

Glu

Glucose

GR

Granul

HCT

Hmatocrite

HGB

Hmoglobine

HPLC

Chromatographie Liquide Haute Performance

IBS

Inhibiteurs de la synthse des strols

Potassium

LMR

Limite Maximale de Rsidus

MCH

Teneur corpusculaire en Hmoglobine

MCHC ou CCMH

Concentration corpusculaire moyenne en Hmoglobine

MCV ou VGM

Volume globulaire moyen

mEq/L

Milliquivalent par litre

MPV

Volume plaquettaire moyen

Na

Sodium

NOAEL

Non Observable Adverse Effect Level)

O.M.S

Organisation mondiale de sant

OP

Insecticides organophosphores

ORP

Observatoire des rsidus des pesticides

Pastille

PAL

Phosphatase alcaline

PLT

Plaquette

POPs

Polluants Organiques Persistants

PPP

produits phytopharmaceutiques

REACH

Registration, evaluation and authorization of chemicals

RBC

Red Blood Cells ou globules rouges

SC

Concentr pulvrisable

SEM

Erreur standard de la moyenne

SN

Solution

SP

Poudre soluble

TCPY

Trichloro-2-pyridinol

TG T

Triglycrides totaux

TGO

Transaminase Glutamate Oxolo-actate

TGP

Transaminase Glutamate Pyruvate

UI/L

Unit internationale par litre

WBC

White Blood Cells ou Globules blancs

WDG

Granul soluble

WP

Poudre mouillable

WS

Concentr soluble dans l'eau

ERROR: undefinedresource
OFFENDING COMMAND: findresource
STACK:
/4
/CSA
/4
/CSA
-mark-

CHAPITRE II
MATRIELS ET MTHODES

Chapitre II

Matriels et mthodes

II. 1. Mthodes et dosage des pesticides

La recherche et le dosage de rsidus de pesticides dans les aliments et notamment dans les
lgumes et fruits ncessitent des techniques d'extraction, de sparation et de dtection trs
performantes afin de traiter rapidement un grand nombre d'chantillons susceptibles de
contenir plusieurs substances actives.

Les mthodes chromatographiques sont parmi les techniques les plus utilises, les
techniques mises en uvre: chromatographie en phase liquide ou en phase gazeuse sont
associes aux mthodes de dtection courantes ou bien la spectromtrie de masse pour
atteindre des limites de dtection de plus en plus basses garantissant ainsi la qualit des
produits de consommation.

II.1. 1. Chromatographie Liquide Haute Performance (HPLC)

Elle permet le dosage des composs thermolabiles et ioniques. La colonne la plus utilise
est celle qui contient une phase stationnaire greffe en C18. Le dtecteur UV est trs sollicit
dans les dosages de routine cependant le dtecteur barrette diode (DAD) offre de grandes
possibilits didentification des composes grce sa banque de spectres de rfrence. Cun et
al. (2002) ont mis en place une mthode danalyse de 14 pesticides de la famille des
carbamates avec une HPLC/UV-DAD.
Le couplage de la HPLC et la SM permet le dosage dun ventail de produits et surtout
dliminer les interfrences de la matrice. Beaucoup de travaux sont de plus en plus cits qui
utilisent ce couplage (Ramos et al. 1999, Jeannot et al. 2000 et Zambonin et al. 2002).

II.1. 2. Dosage par HPLC

La Chromatographie Liquide Haute Performance permet de sparer et de doser diffrents
composs dune solution qui absorbe dans lUV. Pour des conditions opratoires prcises,
chaque compose prsente un pic avec un temps de rtention bien dfini. La hauteur des pics
ou lintgration de la surface de ces pics permet dobtenir la concentration des produits.

II. 2. Matriel
II.2.1. Matriel chimique
Le pesticide : chlorpyrifos test est choisi parmi ceux communment utiliss pour les
traitements phytosanitaires des lgumes et fruits dans la rgion de Stif. Les pesticides
- 28 -

Chapitre II

Matriels et mthodes

peuvent tre tests en mlange en fonction de leur nature chimique, de leurs modes daction
ou de leurs cibles selon lindex phytosanitaire ACTA, 2005). Pour l'analyse chimique
lactonitrile eau extra pure. Tous les solvants utiliss sont de puret chromatographique
(Fluka, HPLC grade).

II.2. 2. Choix du pesticide

Pour notre tude nous avons choisi dans un premier temps de dterminer les pesticides les
plus utiliss sur les fruits et lgumes en Algrie et particulirement dans la rgion de Stif.
Ensuite, nous avons tabli une liste afin de dterminer les pesticides les plus frquemment
utiliss. Cette dmarche nous a conduit dfinir le pesticide tester. Les lgumes ont t
rcolts en juillet 2011 aux environs de Mezloug et Guellal zones situes respectivement au
Nord de Stif. Quant aux fruits ils proviennent de Cheikh El-Aifa situ Ain Roua.

II.2. 3. Matriel biologique

Nous avons utilis dans le cadre de cette tude des rats mles et femelles albino Wistar
ayant un poids variant entre 150 et 350 g et provenant de linstitut Pasteur dAlger. Ils sont
hbergs dans des cages en plastique transparentes dune longueur de 55 cm, dune largeur de
33 cm et dune hauteur de 19 cm. Chaque cage est marque dun numro de lot qui lui
correspond. Les animaux ont t disposs dune alimentation standard (Croquettes, Ets
ONAB El Kseur, Bjaia) et soumis des conditions de temprature et dclairement
contrls. La litire utilise est la sciure renouvele trois fois par semaine pour assurer le bon
tat hyginique des animaux. Les animaux sont acclimats aux conditions de lanimalerie du
dpartement de Biologie- Stif pendant une quinzaine de jours avant lexprimentation.
(Figure 5).

Figure 5 : Conditionnement des rats dans lanimalerie de luniversit.

- 29 -

Chapitre II

Matriels et mthodes

II. 3. Mthodes
La mthode d'extraction mise en uvre est celle propose par Steinwandier ; 1985 Cest
une extraction simple de rsidus par de lactone suivie dun partage actone eau
dichloromthane (2 :1: 1.5) pour avoir la phase organique contenant les rsidus qui seront
concentrs 1ml.

II.3. 1. Prparation de l'chantillon et procdure d'extraction

a. Prparation de lchantillon
Pour lextraction des rsidus dans les vgtaux nous devons respecter 3 points dintrt
essentiel.
Le rapport actone eau doit tre deux volumes dactone pour un volume deau c'est-dire que 200 ml dactone sont rajouts pour lextraction dun volume eau + chantillon gal
100 ml. 30 grammes de chlorure de sodium (NACL) sont utiliss pour sparer les rsidus de
pesticides dans la phase organique, 150 ml de dichloromthane sont ajouts pour enlever
leau de la phase organique.

b. Prparation de la solution aqueuse

La teneur en eau des chantillons sur lesquels nous avons travaill pour dterminer les
rsidus de pesticides est suprieure 70%. Chaque chantillon (salade, concombre, courgette,
poivron, tomate, pomme et poire) doit peser 100 g.
Une quantit deau est additionne chaque chantillon afin dobtenir un total de 100 g
selon la formule 100-TE o TE reprsente la teneur en eau de lchantillon. Pour tout ce qui
est concombre, courgette, poivron, pomme et poire, on ajoute 15ml deau distille. Pour la
salade et tomate lapport en eau distille est seulement 5ml.
.

c Extraction
Extraction liquide liquide
La mthode consiste extraire les pesticides hydrophobes se trouvant dans leau par un
solvant appropri et non miscible avec leau. Lextraction est effectue sur un volume
important de lchantillon dans une ampoule dcanter puis le solvant est vapor et le rsidu
est repris dans le milieu adquat pour tre analys. Boussahel, (2001) note lutilisation du
dichloromthane comme solvant dextraction et souligne que cette mthode est dj
homologue et

normalise pour le dosage de 15

- 30 -

pesticides organochlors

et

Chapitre II

21organophosphors. Lextrait obtenu est

Matriels et mthodes

inject directement en chromatographie

(Boussahel., 2001).

II.3. 2. Mode opratoire et technique dextraction

Les aliments sont dabord coups sparment en petits morceaux puis mixs dans un
robot. Nous rajoutons 200 ml dactone chaque chantillon. Le tout est mlang pendant
3 minutes laide dun mixeur grande vitesse et laiss au repos pendant 20 minutes
temprature ambiante. Les mlanges obtenus sont dfinitivement homogniss par agitation
durant 3 minutes. Partage actone / eau / dichloromthane (2 : 1: 1.5) :
Dans un entonnoir de Buchner dot dun papier filtr Wattman n1, nous filtrons
lhomognat prpar lors de lopration dextraction. Dans lampoule nous ajoutons 30 g de
chlorure de sodium (NaCl) 200 ml de filtrat; le tout est agit pendant 3 minutes.
Ensuite, 150 ml de dichloromthane sont ajouts la prparation et lensemble est agit
pendant 2 minutes.
Enfin, le mlange est laiss au repos une deuxime fois pendant 15 minutes et
temprature ambiante jusqu sparation des deux phases : la phase aqueuse et la phase
organique. Cette sparation permet de rserver la phase aqueuse afin de procder au schage
de la phase organique isolement avec 30 g de sulfate de sodium (Na2SO4) et ce durant 30
minutes. La phase organique est filtre dans un ballon de 500 ml dans un entonnoir contenant
une couche de sulfate de sodium. Lampoule dcanter est rince laide de 40 ml de
dichloromthane. La filtration de cette phase aqueuse est alors effectue. Une seconde et une
troisime concentration sont obtenues par addition de dichloromthane afin dvaporer tout
lactone et cela dans le but dobtenir un extrait gal 1 ml. Cet extrait mis dans un flocon de
5ml est alors prt tre analys.

- 31 -

Chapitre II

Matriels et mthodes

. Homognisation par agitation 3 min

Partage actone / eau / dichloromthane
Filtrer
+ 30 g de chlorure de sodium (NaCl)
+150 ml de dichloromthane
Agiter 2 min.
Repos 15 minutes, sparation
Schage de la phase organique avec 30g de (Na2SO4) pendant 30 min
Filtrer avec une couche de sulfate de sodium
.
2me et 3me concentration + dichloromthane
Evaporer tout lactone
1 ml dextrait dans un flacon de 5ml
Analyse

Figure 6 : Mthode dextraction des rsidus de pesticides

- 32 -

Chapitre II

Matriels et mthodes

II. 4. Evaluation de la toxicit aigu chez les rats

Les tests de toxicit aigu (DL50 orale, DL50 cutane et CL50) inhalatrice chez le rat,
permet destimer la dose ltale ainsi que les effets irritants ou sensibilisants dun produit qui
apparaissent dans un temps court entre 1 et 14 jours aprs ladministration dune substance
(pour notre tude le chlorpyrifos (CPF) administr par dose unique Les principaux effets
recherchs sont :
les signes cliniques.
les modifications pathologiques visibles lil nu.
La mortalit.

II. 4. 1. Toxicit aigu

La toxicit aigu dune substance chimique est estime par une srie de tests raliss sur
des animaux de laboratoire. La DL50 est la dose requise pour tuer la moiti dune population
d'animaux de laboratoire. Le pesticide tester est dilu dans de leau physiologique et est
administr une dose unique, par voie orale, raison dune dose pour tous les groupes. La
DL50 pour le chlorpyrifos se situe entre 82 et 270 milligrammes par kilogramme (mg / kg)
de poids corporel de rats.
Pour le rat femelle la dose ltale par voie orale : DL50 : 96 mg / kg (72-140)
Pour le rat male la dose ltale par voie orale : DL50 : 102 mg / kg (94-110)

II. 4. 2. Choix de la dose

La plupart des tudes entreprises en toxicologie s'effectuent la suite de ladministration
de la dose par voie orale. Cependant d'autres voies d'administration sont possibles : intra
veineuse, intramusculaire, sous-cutane, percutane et par inhalation. Daprs les valeurs
exprimentales des DL50, les rats males paraissent plus sensibles que les rats femelles, cette
sensibilit lie au sexe pourrait tre due aux diffrences physiologiques. Pour notre tude nous
choisissons les doses 1/5 pour la toxicit aigu et 1/20 pour la toxicit subaigu (Dahamna
2004).

Mode opratoire
Le produit tester est dilu dans de leau distill et administr une dose unique, par voie
orale. Ltude porte sur 60 rats adultes mles et femelles de la souche Wistar.
- 33 -

Chapitre II

Matriels et mthodes

Aprs une priode dhabituation, les rats sont pess, identifis par une marque sur la
queue. Les animaux, sont rpartis en 6 groupes de dix animaux (cinq males et cinq femelles)
Chacun, dont un, est le groupe tmoin, sont privs de nourriture 24 heures avant lessai. Le
chlorpyrifos est administr par voie orale aux animaux en une dose unique et par sonde
gastrique Les 5 lots ont reu la dose de 1/5 de la DL50. Le groupe tmoin a reu de leau
physiologique. Aprs ladministration du chlopyrifos, les animaux sont observs
individuellement chaque heure pendant le premier jour et chaque jour pendant 14 jours. Le
comportement et les symptmes cliniques des animaux sont nots pendant toute la dure de
lexprience.

II.4.3. Toxicit subaige

Ces preuves ont pour objet :
1/ De mettre en vidence les altrations fonctionnelles et/ou pathologiques conscutives
ladministration rpte des substances actives examines.
2/ Dtablir les conditions dapparition de ces altrations en fonction de la posologie.
Notons que les exprimentations durent de 2 6 semaines. (Manahan, 2003). Il est utile de
choisir la dose la plus leve de faon faire apparatre les effets nocifs tandis que les doses
infrieures permettent de situer la marge de tolrance du nouveau produit chez lanimal.
Lapprciation des effets toxiques est faite sur la base de lexamen du comportement, de la
croissance pondrale, de la formule sanguine. Nous prenons en compte de surcrot la base des
comptes rendus ncrosiques, accompagns des examens histologiques qui sy rattachent
(Diallo, 2005)

Les 30 rats sont repartis en deux lots : un lot tmoin de dix rats et un lot trait de vingt
rats (cinq par cage). Les rongeurs sont traits par voie orale avec du chlorpyrifos dissout dans
de leau distille. Une dose de 1/20 de DL 50 et qui correspond 22 mg/kg/semaine leur est
donnes au rythme dun jour sur sept pendant 6 semaines. On note un retard dans lapparition
des symptmes dintoxication (30 min), salivation, difficult de se mouvoir, ladministration
par voie orale du pesticide a provoqu une acclration du rythme respiratoire, une
vasodilatation au niveau des oreilles une excitation enregistre dans les lots aucune toxicit
nest apparue dans les conditions de la toxicit subaigu, les seuls signes cliniques observs
chez les rats traits, sont des diarrhes et une faiblesse (manque de vivacit), aprs chaque
opration, qui se droule une fois par semaine, on observe une lgre diminution de
- 34 -

Chapitre II

Matriels et mthodes

croissance pondrale les 15 premiers jours. Cette diminution pourrait tre explique par une
rduction de la consommation des aliments, une diminution de lactivit motrice. Nous pesons
les rats chaque semaine. Au terme de 42 jours nous sacrifions les rats. Nous prlevons les
organes tels que les reins, la rate, le foie, les testicules, les poumons et le cur que nous
observons macroscopiquement. Les organes prlevs sont dbarrasss de l'excs de graisse.
Ils sont alors schs avec du papier filtre pralablement pess. Nous conservons les organes
dans du formol 10% pour des tudes anatomopathologiques.
II. 5. Dosage de quelques paramtres hmatologiques et biochimiques
II.5.1. Prlvement sanguin
Le prlvement du sang est effectu laide dun tube capillaire dhmatocrite travers le
sinus rtro-orbital au niveau de la veine orbitale des rats anesthsis au dpart par lther par
voie ophtalmique. Nous recueillons le sang dans un tube EDTA pour la FNS, et dans un tube
hparine pour le bilan rnal. Nous centrifugeons les tubes hparines 4000 g/5min. 4C. Le
srum obtenu est aliquot et conserv une temprature de 20C jusquau moment des
analyses biochimiques.

II. 5. 2. Examens Biochimiques

Le dosage des paramtres sriques : Glucose (Glu), Ure, Cratinine (Crat), Acide
urique (AU), Sodium (Na), Potassium (K), Cholestrol total (Chol T), Triglycrides totaux
(TG T), Transaminase Glutamate Oxolo-actate (TGO), Transaminase Glutamate Pyruvate
(TGP), Phosphatase alcaline (PAL) sont mesurs par des mthodes enzymatiques raliss au
niveau du Laboratoire Central (CHU) de Stif laide dun Beckman coulter Synchro CX-9
clinical system ALX.

II. 5. 3. Examens hmatologiques

Dans la formule numrique sanguine (FNS) on trouve les paramtres suivants :
Red Blood Cells ou globules rouges (RBC), volume globulaire moyen (MCV) ou (VGM),
hmatocrites (HCT), plaquette (PLT), volume plaquettaire moyen (MPV), white Blood Cells
ou globules blancs (WBC), hmoglobine (HGB), teneur corpusculaire en hmoglobine
(MCH), concentration corpusculaire moyenne en hmoglobine (MCHC). Les analyses des
paramtres hmatologiques

sont effectues laide dun Beckman coulter Mdonic au

laboratoire central de Stif.

- 35 -

Chapitre II

Matriels et mthodes

II. 5. 4. Technique histologique

Pour lexamen anatomo-histo-pathologique, les organes fixs dans du formol 10 %, sont
dposs dans des cassettes en plastique, puis sont dshydrats (par immersion dans des bains
successifs dalcool, l'alcool est limin par des solvants (xylne)) avant dtre coul dans des
moules contenant de la paraffine fondue par chauffage (paraffine liquide). Aprs
refroidissement, le bloc solide de paraffine contenant le tissu est coup laide dun
microtome permettant de raliser des coupes de 5 m dpaisseur.

Les coupes obtenues sont tales et colles sur des lames, puis sches dans une tuve
pendant une nuit. Elles sont ensuite colores par une solution d'hmatoxyline-osine. Aprs
coloration, le montage se fait laide de leukitt plac entre lame et lamelle. La prparation
est sche l'air. Ces coupes histologiques sont ralises au laboratoire d'anatomopathologie
de CHU de Stif.

II. 6. Analyses statistiques

Les rsultats exprimentaux sont exprims sous forme de moyennes arithmtiques,
accompagnes de lerreur standard (m SEM). La comparaison des moyennes est ralise
laide du test t de Student, grce au logiciel GraphPad et ANOVA uni-varie suivie du test
de Dunnett pour les comparaisons multiples et la dtermination des taux de signification. Les
valeurs de p < 0.05 sont considres statistiquement significatives.

- 36 -

CHAPITRE III
RSULTATS

Chapitre III

Rsultats

III.1. Extraction
Lextraction liquide-liquide du chlorpyrifos partir des lgumes et fruits a permis
d'obtenir des extraits de couleur jaune et orange avec un rendement d'extraction de
5mg /100g de lgume.

III.2. Chromatographie sur couche mince (CCM)

a. Principe de la technique
Lorsque la plaque sur laquelle est dpos lchantillon est place dans la cuve, lluant
monte travers la phase stationnaire, essentiellement par capillarit. En outre, chaque
composant de lchantillon se dplace sa propre vitesse derrire le front du solvant. Cette
vitesse dpend dune part des forces lectrostatiques retenant le composant sur la plaque
stationnaire et, dautre part, de sa solubilit dans la phase mobile. Les composs se dplacent
donc alternativement de la phase stationnaire la phase mobile, laction de rtention de la
phase stationnaire tant principalement contrle par des phnomnes dadsorption.
Gnralement, en chromatographie sur couche mince, les substances de faible polarit
migrent plus rapidement que les composants polaires.

b. Rvlation.
Lorsque les composants de lchantillon analys sont colors, leur sparation est
facilement observable sur la plaque ; dans le cas contraire, on doit rendre les taches visibles
par un procd de rvlation. Les taches sont ensuite cercles au crayon. Les mthodes
usuelles de rvlation sont les suivantes : radiations UV, fluorescence, iode, atomisation. Si
un indicateur fluorescent est incorpor ladsorbant, la plaque entire devient fluorescente
lorsquelle est soumise une radiation UV ; les composs y sont rvls sous forme de taches
sombres.

III.2.1. Conditions chromatographiques

Les extraits ont t analyss en utilisant une srie 1100 HPLC (Agilent Co., Sunnyvale,
CA) muni d'un dtecteur UV / Vis (UV 230 nm). Un Phenomenex (Torrance, CA) Prodigy
ODS / 3, C18, 5mm, 4,6 mm Identifiant 250 mm analytique colonne a t utilis, avec une
colonne Phenomenex garde Security Guard (4mm 2 mm, C18). Les extraits ont t
chromatographis avec un pr-mlang phase mobile compose de 75% acetonitrile/25%
1mM PO4 (pH 4,5) temprature ambiante.
-37-

Chapitre III

Rsultats

Mthode
L'injection de 25 ml un dbit de 1 ml/min pendant 25 min.

III.2.2. Analyse qualitative

La chromatographie sur couche mince de lextrait a permis de sparer deux substances
qui sont apparues sous forme de tches colores aprs rvlation, un spot en bas de la plaque
CCM situ un niveau inferieur que celui de chlorpyrifos (tmoin), et qui correspond celui
dun de lextrait de concombre. Les 2 spots correspondent donc au chlopyrifos.

Figure 7 : Sparation par chromatographie sur couche mince du chlopyrifos

Model : Phase mobile : actonitrile/eau: 20/80V.

III.3. Dosage par HPLC

La Chromatographie Liquide Haute Performance permet de sparer et de doser diffrents
composs dune solution qui absorbent dans lUV. Pour des conditions opratoires prcises,
chaque compos prsente un pic avec un temps de rtention bien dfini. La hauteur des pics
ou lintgration de la surface de ces pics permet dobtenir la concentration des produits.

III.3.1. Rsultats de lanalyse par HPLC

La figure (8) montre le chromatogramme standard.
Le temps de rtention pour chlopyrifos est respectivement 10,81min.

-38-

Chapitre III

Rsultats

Figure 8 : Chromatogramme en HPLC du chlorpyrifos.

Index

Nom

Inconnu N

Temps
[min]
2,38

Inconnu N

2,68

50,58

4,5

0,714

50,580

Inconnu N

3,20

13,85

1,0

0,196

13,853

Inconnu N

3,30

4,63

0,8

0,065

4,628

Inconnu N

3,39

8,18

0,7

0,116

8,184

Inconnu N

4,21

0,08

0,0

0,001

0,084

Inconnu N

4,89

1,00

0,1

0,014

0,998

Inconnu N

5,73

0,59

0,1

0,008

0,591

Inconnu N

8,29

0,97

0,1

0,014

0,966

10

Inconnu N

9,24

2,45

0,1

0,035

2,448

11

Chlorpyrifos

10,81

9,22

0,4

0,130

9,221

100,00

8,1

1,412

100,000

Total

Quantit
[% Surface]
8,45

Hauteur
[mAU]
0,4

Surface
[mAU.min]
0,119

Surface
[%]
8,447

Tableau 2 : Rvlation du temps de rtention en HPLC du chlorpyrifos

Le Chromatogramme en HPLC du chlorpyrifos dans le poivre rouge L'identification du
compos de lextrait des lgumes et fruits se fait par comparaison de leurs temps de rtention
avec celui obtenu pour le mme compos standard. Cette comparaison, nous a permis de
confirmer la prsence du chlorpyrifos dans le poivre rouge, avec un temps de rtention 11,12
min, la figure 9 est illustre ci aprs.

-39-

Chapitre III

Rsultats

Figure 9 : chromatogramme en HPLC du chlorpyrifos dans le poivre

rouge

Index

Nom

Time
[min]

Quantit
[% Surface]

Hauteur
[mAU]

Surface
[mAU.Min]

Surface [%]

58,548
43,528

21,705

16,14

265,8
265,3

3,19

14,34

215,8

38,678

14,339

Inconnu N

3,41

9,33

169,0

25,162

9,328

Inconnu N

3,65

9,54

212,5

25,722

9,535

Inconnu N

3,92

1,56

59,4

4,216

1,563

Inconnu N

4,12

1,75

56,9

4,720

1,750

Inconnu N

4,45

6,67

82,4

17,988

6,669

Inconnu N

4,71

5,54

74,2

14,940

5,539

10

Inconnu N

4,92

4,39

99,5

11,834

4,387

11

Inconnu N

5,04

7,58

57,6

20,445

7,580

12

Inconnu N

7,62

1,20

4,9

3,245

1,203

13

Inconnu N

9,05

0,21

1,6

0,575

0,213

14

Chlorpyrifos

11,12

0,05

0,5

0,143

0,053

100,00

1565,4

269,746

100,000

Inconnu N

21,70

Inconnu N

2,61
2,83

Inconnu N

Total

16,137

Tableau 3 : Rvlation du temps de rtention en HPLC du chlorpyrifos dans le poivre rouge

-40-

Chapitre III

Rsultats

Les temps de rtention du

chlorpyrifos sont prsents dans les tableaux 2 et 3

respectivement. Ils sont dtermins sur les chromatogrammes donns dans les figures 8 et 9
respectivement. Les temps de retentions du produit CPF identifi partir de leur
chromatogramme est de 10,81 et 11,12 minutes.

La droite d'talonnage exprime la variation de l'absorbance en fonction de la concentration

en Chlorpyrifos. Elle est reprsente par la figure 10. Cette droite nous servira de base dans
l'analyse quantitative de nos rsidus. Les droites dtalonnage sont ralises pour chacun des
composs avec des solutions talons, les quations des droites (y=ax) ou hauteur en fonction
des concentrations permettent ensuite de remonter des concentrations inconnues. La
corrlation est bonne avec R2 > 0,999 Les phases luantes sont prpares avec de l'eau ultra
pure et de lactonitrile (qualit HPLC), elles sont filtres et dgazes avant utilisation.

Chlorpyrifos
0,2
y = 0,1748 x
R = 0,999

0,15
0,1
0,05
0
0

0,2

0,4

0,6

0,8

Concentration en g/ml

Figure 10 : Droite dtalonnage de chlorpyrifos

-41-

1,2

Chapitre III

Rsultats

Les rsultats danalyse des concentrations sont reprsents sur le tableau 4.

Tableau 4 : Rsultats des concentrations en Chlorpyrifos dans les chantillons vgtaux
Concentration g/ml
Echantillons
1

Poivre vert

ND

ND

Poivre rouge

0,5378 0.043

0,5092 0,041

Concombre

ND

0,8524 0,065

Courgettes

ND

-------

Pommes

0,9124 0,057

0,5187 0,028

Poires

ND

-------

Laitues

ND

-------

Tomates

ND

1,4817 0,107

ND= Non Dtectable

DL = 0.1 g/ml

-42-

Chapitre III

Rsultats

III.4. Interprtation des rsidus

Linterprtation des rsultats tant fonction de la connaissance des facteurs susceptibles de
modifier la rponse.
Pour examiner la quantit de rsidus de pesticides dans les fruits et lgumes un total
de 50 chantillons ; 4 fruits et 6 lgumes diffrents ont t recueillis en 2011. Nos rsultats
ont rvl les concentrations en rsidus de chlorpyrifos dans les pommes qui nous
proviennent de la Nouvelle-Zlande, les tomates provenant du Mexique, poivre vert et rouge
cultivs au pays et le concombre comme suit : Linsecticide chlopyrifos est prsent raison de
0,5378 g/ml dans poivre rouge, 1,4817 g/ml dans les tomates, 0,9124 g/ml dans les
pommes et 0,8524 g/ml dans le concombre. Dans la courgette, poires et la laitue nous
navons pas trouv de traces de rsidus,

le chlorpyrifos na pas t dtect dans ces

chantillons.

Les rsultats danalyses en rsidus de pesticides dans nos chantillons de fruits et lgumes
frais sont les suivants : Plus de 67% des chantillons taient sans rsidus dtectables, (6,5 %)
des chantillons contenaient des rsidus de pesticides infrieurs ou gaux la LMR et (6,5%)
des chantillons nettement suprieur la LMR. Les taux gaux ou infrieurs la LMR ont t
trouvs le plus souvent dans les pommes, les tomates, suivis par les poivres rouges, les
poivres verts et le concombre. Au niveau des fruits les dpassements concernent
essentiellement les pommes nos rsultats montrent que 61% des chantillons analyss en
Italie prsentent des valeurs de rsidus de pesticides qui sont largement suprieures la limite
maximale de rsidus.

III.4.1. Test de la DL50

Le test de la DL50 a t effectu sur des rats ayant reu diffrentes doses 1/5, 1/10, 1/20
respectivement.

III.4 .2. Comportement des rats aprs traitement

Rats inject 9h 05min a tendance boire juste aprs. Aprs 20 minutes on a remarqu
les signes cliniques suivants :
Rythme cardiaque acclr; difficult respiratoire, perte dquilibre, agitation suivie dune
diminution de la mobilit, poils piqus, paralysie des membres postrieurs puis des membres

-43-

Chapitre III

Rsultats

antrieurs, enfin une exophtalmie des yeux suivie de la mort aprs 40 min.

III.4.3. Observation du comportement et tableau clinique des animaux

Les symptmes observs chez les rats mles et femelles traits par une dose unique de 1/5
de la DL50 au chlopyrifos prsentent les symptmes ci-aprs :
De fortes convulsions et agitation, acclration du rythme cardiaque et une difficult
respiratoire. Une lgre irritation de l'iris est observe. Lactivit des animaux est rduite, leur
dmarche devient lente jusqu ce quils se couchent sur le ventre avec pattes postrieures

cartes et cyanoses, et enfin ils se rangent les uns ct des autres. Au bout de la 40 me min.

me

La mort intervient de la 24 me la 72

heure. Au-del du 4 me jour, les rats ayant survcu,

redeviennent normaux avec disparition de tous signes.

Ltude biochimique comme paramtre de la fonction hpatique montre une

augmentation de lactivit denzyme srique dALP, et une diminution de lactivit de LDH,
AST, ALT. Les enzymes transaminases sont considres comme indicateurs de dommage des
tissus, les modifications dans les tissus hpatiques peuvent tre expliques par la diminution
des taux des paramtres lALT, AST. Cette diminution de l'activit enzymatique du foie a t
accompagne par une diminution du

glucose. D'autre part, les donnes montrent une

augmentation significative (P 0,05) des concentrations sriques de triglycrides, du

cholestrol, de la cratinine et de la bilirubine chez le rat trait avec une dose unique de
chlorpyrifos par rapport au tmoin. Les animaux traits par le pesticide ont eu une
hypoglycmie lgre. Leffet du CPF fut accompagn d'une diminution du gain de poids
corporel qui a conduit une perte de poids corporel la fin de l'exprience.

III.4.4. Effets du chlorpyrifos chez les rats in vivo

a. Toxicit aigue
Les signes dintoxication chez les rats taient compatibles avec linhibition du
cholinestrase et inclus l'inactivit, la salivation accrue, une posture vote, paralysie flasque,
diarrhe, vomissements, exophtalmie, respiration laborieuse,

tremblements, coloration

oculaire et larmoiement. Lactivit de cholinestrase crbrale tait inhibe. Une Rduction

du poids corporel et de la consommation de nourriture a t observe chez les animaux.

-44-

Chapitre III

Rsultats

b. Poids corporel
Le suivi de la variation de la masse corporelle des animaux au cours de lexprience de
toxicit subaigu a dmontr quil y a une diminution significative du poids comparativement
aux tmoins.

300
250
200
150

Srie1

100
50
0
0

Figure 11 : Variation du poids corporel des rats traits dans les conditions de toxicit subaigu avec
la dose de 24mg/kg.
c. Le poids absolu des organes
Lexamen des organes des rats rvle une augmentation du poids absolu du foie, du rein
des testicules comparativement aux tmoins nanmoins on note une diminution du poids des
ovaires par rapport aux tmoins.

d. Masse relative des diffrents organes

La variation de la masse relative des diffrents organes chez les rats tmoins et traits
avec la dose 1/5de la DL50, montre une augmentation significative de la masse relative des
reins, poumons, foie. On a enregistr aussi une augmentation significative de la masse relative
des testicules. Cependant, une diminution significative au niveau des ovaires, cur et cerveau
a t constate.

e.

Masse relative du foie :

Augmentation de la masse relative du foie chez les femelles plus que chez les mles
comparativement aux tmoins.

-45-

Chapitre III

f.

Rsultats

Masse relative du cerveau :

Diminution significative de la masse relative du cerveau

chez les rats traits

comparativement aux tmoins.

g. Masse relative des testicules :

Augmentation significative de la masse relative des testicules par rapport aux tmoins.

h. Masse relative des ovaires :

Diminution significative de la masse relative des ovaires

chez les rats traits

comparativement aux tmoins.

i. Masse relative reins :

Augmentation significative de la masse relative des reins par rapport aux tmoins.

j. Masse relative poumons :

Augmentation significative de la masse relative des poumons par rapport aux tmoins.

k. Masse relative de la rate :

Lgre augmentation de la masse relative de la rate chez les femelles comparativement
aux tmoins.
l. Masse relative du cur :
Diminution significative de la masse relative du cur chez les rats traits
comparativement aux tmoins.

Les paragraphes (e f g h i j k l) Correspondent aux figures ABCDEFGH ci aprs :

-46-

Chapitre III

Rsultats

1.0

15

0.8
10

0.6
0.4

5
0.2
0.0

Dose (mg/k g)

Dose (mg/kg)

1.5

2.0

1.0
1.5
1.0

0.5

0.5

0.0

0.0

Dose (mg/kg)

2.0

Dose (mg/kg)

2.0

1.5

1.5
1.0

1.0

0.5

0.5

0.0

0.0

Dose (mg/kg)

Dose (mg/k g)

-47-

Chapitre III

0.20

Rsultats

G
4

0.15

0.10

0.05

0.00

Dose (mg/kg)

Dose (mg/k g)

Figure 12 : Variations des valeurs de la masse relative des organes pour la dose1/5de la DL50 au
cours du traitement aigu avec le chlorpyrifos. Les valeurs sont les moyennes SEM. Selon le test
dANOVA ; (P0.05). Groupes : A (masse relative de la rate), B (masse relative du foie), C (masse
relative des reins) D (masse relative du cur), E (masse relative des poumons), F (masse relative du
cerveau) G (masse relative des ovaires), (masse relative des testicules). La dose D : tmoin ; D les
groupes traits avec la dose : 96 mg/kg de chlorpyrifos.
0

III.4.5. Effets sur les paramtres biochimiques

Les tudes sriques effectues sur les rats traits par chlorpyrifos

montrent une

diminution significative des taux des paramtres suivants : Ure,des transaminases (ALAT,
ASAT) glycmie, AURI ALB/GLOB et HDL par rapport aux groupes tmoins D0. Toutefois,
les rsultats des rats traits prsentent une lvation significative des taux des paramtres
suivants : ALB2, BILTS, cholestrol, cratine, triglycride, LDL, Une augmentation
significative de lactivit phosphatase alcaline (ALP) et des taux (TP) total protines a t
observe comparativement au groupe tmoin D0.

On trouvera dans les figures et tableau 5 dessous les principales constantes biochimiques
ainsi que les rsultats issus de la variabilit des constantes sanguines.

-48-

Chapitre III

Rsultats

Tableau 5 : Analyses biochimiques des rats aprs traitement aigue par le chlorpyrifos et avec les
doses D (0 mg/kg), D (96 mg/kg). Les donnes sont exprimes par moyenne S.E.M. (P0.05).
0

Tests biochimiques

D0

D1

AURI mg/l

16 5,52

8,5 3,33

ALAT U/L

38,75 14,11

30,92 7,04

ALB2 g/L

48,8 2,23

49,58 7,99

ALB/GLOB g/L

1,88 0,19

1,66 0,47

ALP2L U/L

103,86 24,8

137,8 45,48

ASAT U/L

100,8 25,84

91 14,90

BILTS mg/l

0,58 0,26

0,81 0,28

CHOL g/l

0,88 0,11

0,90 0,19

CREJ2 mg/l

7,4 0,8

7,46 1,69

GLUC3 g/L

1,94 0,38

1,92 0,51

HDLC3 g/l

0,61 0,09

0,53 0,12

LDL-C g/l

0,04 0,01

0,05 0,02

TP2 g/L

75,44 5,96

79,3 13,93

TRIGL g/l

0,48 0,14

0,82 0,33

Figure 13 : Effet du chlorpyrifos (CPF) sur la concentration de lacide urique et la cratine chez les
rats Wistar.

-49-

Chapitre III

Rsultats

Figure 14 : Effet du chlorpyrifos (CPF) sur les paramtres biochimiques chez les rats Wistar.

Figure 15 : Effet du chlorpyrifos (CPF) sur la phosphatase alcaline et lalbumine chez les rats
Wistar.

Figure 16 : Effet du chlorpyrifos (CPF) sur LDL chez les rats Wistar.

-50-

Chapitre III

Rsultats

Figure 17 : Effet du chlorpyrifos (CPF) sur les activits de protines sriques totales, de l'aspartate
aminotransfrase (ASAT), la phosphatase alcaline (ALP) chez les rat Wistar.

III.5. Effets sur les paramtres hmatologiques

Un tube hmatocrite est enfonce dans langle postrieur ou antrieur de lil, perfore la
paroi du sinus caverneux; le sang monte par capillarit dans le tube ainsi le sang est rcupr
au moment de leuthanasie des rats

aprs 6 semaines de traitement par gavage au

chlorpyrifos. Les rsultats hmatologiques obtenus sont illustrs dans le tableau 6 et rvlent
les observations ci-aprs :
Une augmentation significative du volume globulaire moyen (MCV), hmoglobine,
(HGB) de la teneur corpusculaire en hmoglobine (MCH) et de la concentration globulaire
moyenne en hmoglobine (MCHC) est observe. On a enregistr aussi une diminution
significative des taux des globules rouges : RBC, des hmatocrites : HCT, des plaquettes :
PLT, et des taux des globules blanc WBC (Wight Blood Cells). Cependant la concentration
du volume plaquettaire moyen (MPV) ne montre pas de diffrence significative par rapport
aux tmoins. D'autre part, les rsultats montrent une augmentation significative (P 0,05) des
concentrations sriques des triglycrides, du cholestrol, de la cratinine et de la bilirubine
chez les rats traits avec une dose unique de chlorpyrifos par rapport au tmoin.

-51-

Chapitre III

Rsultats

Tableau 6 : Paramtres hmatologiques des rats traits dans les conditions de la toxicit aigu par
chlorpyriphos et avec les doses D (0 mg/kg), D (96 mg/kg). Les donnes sont exprimes par
moyenne S.E.M. (P0.05)
0

Tests hmatologiques

D0

D1

RBC (106/mm3)

8, 09 0, 46

7, 88 1, 09

MCV (3m)

51, 48 1, 47

52, 58 5, 47

HCT (%)

41,64 2,45

40,91 3,99

PLT (103/mm)

859, 4 410, 96

747, 05 205, 52

MPV (3m)

7 0, 23

7, 09 0, 29

WBC (10 3/mm3)

7, 02 1, 29

7, 6 1, 56

HGB (g/dl)

13,86 0,93

14,02 1,00

MCH (p g)

17,14 0, 93

18, 21 3, 21

MCHC (g/dl)

33, 32 1, 02

34, 49 1, 93

Figure 18 : Effet du chlorpyrifos (CPF) sur les paramtres hmatologiques chez le rat Wistar.

-52-

Chapitre III

Rsultats

Figure 19 : Effet du chlorpyrifos (CPF) sur les paramtres; hmatocrites : HCT, MCV (volume
globulaire moyen), MCHC (concentration globulaire moyenne en hmoglobine) chez le rat Wistar.

Figure 20 : Effet du chlorpyrifos (CPF) sur les plaquettes PLT chez le rat Wistar.

IV. Toxicit subaigu

Dans les conditions de la toxicit subaigu induite par le chlorpyrifos (CPF), les seuls
signes cliniques observs chez les rats traits, sont des diarrhes et une faiblesse (manque de
vivacit), On a not une baisse du poids corporel des rats mles traits au cours de la
cinquime semaine, cette diminution pourrait tre explique par une rduction de la
consommation des aliments, mais aussi une diminution de la quantit de nourriture
absorbe.
Les chantillons de srum ont t valus pour les concentrations de glucose, protines
totales (TP), l'albumine, les lectrolytes (Na +, K +, Cl ), l'ure, la cratine et les activits de

-53-

Chapitre III

Rsultats

l'aspartate aminotransfrase (AST), alanine aminotransfrase (ALT), la phosphatase alcaline

(ALP).

Leffet du chlorpyrifos (CPF) sur la concentration srique des lectrolytes est comme
suit :
Une lgre diminution (p> 0,05) de la concentration en ions sodium Na + dans le groupe
trait comparativement au groupe tmoin. Toutefois, la concentration en ions potassium K +
a lgrement augment dans le groupe trait comparativement au groupe tmoin. Cependant,
une baisse de la concentration en ions Cl a t observe dans le groupe trait par rapport au
groupe tmoin.

Figure 21 : Effet du chlorpyrifos (CPF) sur la concentration d'lectrolytes srique chez les rats
Wistar.
Leffet du chlorpyrifos (CPF) sur la concentration srique de glucose se manifeste par
une diminution significative (p <0,01) de la concentration du glucose srique a t observe
dans le groupe trait par rapport au groupe tmoin.

Figure 22: Effet du chlorpyrifos (CPF) sur la concentration de glucose srique chez les rats Wistar.

-54-

Chapitre III

Rsultats

Leffet du chlorpyrifos (CPF) sur la concentration srique des protines :

Aucun changement significatif (p> 0,05) sur la concentration srique en protine total na t
constat chez les rats trait. Nanmoins une diminution significative (p> 0,05) de la
concentration srique en albumine a t observe dans le groupe trait par rapport aux
tmoins.

Figure 23 : Effet du chlorpyrifos (CPF) sur les protines sriques totales, l'albumine chez les rat
Wistar.

Leffet du chlorpyrifos (CPF) sur la concentration d'ure srique :

Augmentation significative (p <0,05) de la concentration d'ure srique dans le groupe trait
par rapport au groupe tmoin.

Figure 24 : Effet de chlorpyrifos (CPF) sur la concentration d'ure srique chez les rats Wistar.

Leffet du chlorpyrifos (CPF) sur la concentration de cratinine srique :

Augmentation significative (p> 0,05) de la concentration de cratinine srique dans le groupe
trait par rapport au groupe tmoin.

-55-

Chapitre III

Rsultats

Figure 25 : Effet de chlorpyrifos (CPF) sur la concentration de cratinine srique chez les rats Wistar

Augmentation significative (p> 0,05) dALT dans le groupe trait par rapport aux
tmoins.
Augmentation significative (p> 0,05) de l'activit ALP dans le groupe trait par rapport
aux tmoins.

V. Histopathologie
Les procds histologiques ont t raliss selon Martoga et Martoga P.M. 1967.

LHistopathologie du foie:
Lobservation des coupes histologiques du tissu hpatique des rats traits au chlopyrifos a
rvl que les principales diffrences rsident au niveau dune prolifration ductulaire des
canaux biliaires. On trouv jusqu 6 canicules biliaires autour de lespace porte de Kiernan
qui tmoigne de la toxicit aigu. Un infiltrat inflammatoire autour de la veine
centrolobulaire, Figure (26.). Alors que dans le tissu hpatique des rats tmoins on a observ
de 2 4 canaux biliaires autour de lespace porte de Kiernan.

-56-

Chapitre III

Rsultats

Figure 26 : Coupe histologique du tissu hpatique des rats traits avec la dose D1 (96 mg/kg) par
chlorpyrifos. Coloration osine hmatoxyline/Grossissement (X200).

Figure 27: Coupe histologique du tissu hpatique des rats tmoins traits avec la dose D0 (0
mg/kg) Coloration osine hmatoxyline/Grossissement (X200).
-57-

Chapitre III

Rsultats

Lexamen histologique rvle aussi dans plusieurs coupes et dans plusieurs secteurs du
tissu hpatique des foyers inflammatoires et une statose (vacuole charg de gras ; amas
graisseux) observs sur les coupes des rats traits avec la dose 96 mg/kg dans les conditions
de toxicit aigue comparativement aux tmoins.

Figure 28: Coupe histologique du tissu hpatique des rats traits avec la dose D1 (96 mg/kg)
Coloration osine hmatoxyline/Grossissement (X400).
LHistopathologie du rein
Lexamen du tissu rnal a rvl la prsence de vacuoles (vacuolisation), intracytoplasmiques linstallation dun dme entre les traves hpatocytaires comparativement
aux groupes tmoins qui nont montr aucune modification de la structure du tissu rnal
(Figure29).

Figure29 : Coupe histologique du tissu rnal : prsence de vacuoles (vacuolisation), intracytoplasmiques. Coloration osine hmatoxyline/Grossissement (X630)
-58-

Chapitre III

Rsultats

Figure 30: Coupe histologique du tissu rnal : Architecture normale, absence de vacuoles
cytoplasmiques. Coloration osine hmatoxyline/Grossissement (X630)
Les OP sont parmi les pesticides synthtiques les plus largement utiliss. Cette utilisation
a stimul des recherches sur les effets toxiques sur la reproduction (Joshi et al. 2007). Le
traitement par CPF modifie les fonctions testiculaires ventuellement par induction de stress
et l'inhibition de l'activit des enzymes, ce qui perturbe la reproduction.
Les rsultats des interprtations des coupes histologiques des testicules de rats aprs
exposition aigu par voie orale au chlorpyrifos des groupes traits et tmoins sont prsents
dans les figures 31, 32,33 et 34 respectivement.

LHistopathologie des testicules:

Lhistologie a rvl une maturit normale des tubes sminifres avec une srie complte
de spermatognse et une concentration leve des spermatozodes dans la lumire (figure
31). Les figures 32 et 33 ont rvl une dgnrescence et une atrophie des tubules, les tubes
sminifres narrivent pas maturit et trs peu de spermatozodes dans la lumire des tubes.

-59-

Chapitre III

Rsultats

Figure 31 : Testicule de rat du groupe tmoin montrant la structure histologique normale : maturit
des tubes sminifres avec srie spermatogense. (X 400)

Figure 32 : Testicule de rat administr chlorpyrifos. La dgnrescence progressive et une atrophie

due aux dysfonctionnements des tubes sminifres. (X 630).
-60-

Chapitre III

Rsultats

.
Figure 33 : Testicule de rat administr au chlorpyrifos montrant un arrt de la spermatognse terrain
dsertique (X 630).

Figure 34 : Testicule de rat administr chlorpyrifos montrant un fonctionnement normal maturit

sminifres tubules (X 400).
-61-

Chapitre III

Rsultats

LHistologie du cerveau
La neurotoxicit est dfinie comme un changement structural ou une altration
fonctionnelle du systme nerveux, qui trouve son origine dans lexposition des agents
physiques, biologiques ou chimiques (Philbert et al. 2000). Les effets neurotoxiques
impliquent lentre de lagent dans lorganisme. Chez les adultes, la neurotoxicit touche plus
facilement le systme nerveux priphrique car le systme nerveux central est protg grce
une srie dagents chimiques par la barrire hmatomeninge (Costa et al. 2004). Cependant,
certaines substances trs petites ou lipophiles, telles que les OP sont susceptibles de passer
cette barrire et datteindre le systme nerveux central (Costa et al. 2008).

La littrature souligne que le CPF produit une augmentation du niveau danxit chez les
femelles uniquement. Par contre, le CPF diminue lactivit locomotrice spontane des mles
et non des femelles partir de doses inferieures.
Lobservation des coupes histologiques du cerveau des rats tmoins a permis de constater
la conservation de larchitecture cellulaire; vaisseaux normaux et absence dhalo clair
autour des vaisseaux figures 35 et 36.

Figure 35: Coupe histologique du cerveau montrant la prsence de vaisseaux normaux (X100)

-62-

Chapitre III

Rsultats

Figure 36 : Coupe histologique du cerveau montrant des vaisseaux normaux et absence dhalo clair.

Lexamen du cerveau des rats traits a rvl la prsence ddmes (figure 37, 38)

Figure 37 : Coupe histologique du cerveau montrant la prsence dhalo clair privasculaire (X200)
-63-

Chapitre III

Rsultats

Dans la figure 38 prsence d halo clair autour des vaisseaux halo pri-vasculaire.

Figure 38 : Coupe histologique du cerveau montrant la prsence dhalo clair privasculaire (X200).

Figure 39 : Coupe histologique du cerveau montrant la prsence dhalo clair en Y (X400).

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Chapitre III

Rsultats

LHistologie du cur
La coupe histologique du cur du rat trait montrant la prsence dune congestion
vasculaire. Comparativement celle dun rat tmoin qui prsente une structure normale.
Figures 40 et 41 ci-aprs :

Figure 40: Coupe histologique du cur dun rat normal (X200)

Figure 41: Coupe histologique du cur dun rat trait montrant la prsence dune congestion
vasculaire (X100)
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CHAPITRE IV
DISCUSSION DES RSULTATS

Chapitre IV

Discussion des rsultats

DISCUSSION
Avec lutilisation massive des pesticides sont apparus des signes vidents de toxicit et
deffets nfastes pour lenvironnement et pour lHomme (Eriksson et al. 1990; Eriksson et
al.1992; Snedeker, 2001; Den Hond et al. 2006; Schoeters et al. 2006; Bonde et al. 2008).
Pour faire face ce problme, le parlement Europen a instaur le projet REACH
(Registration, evaluation and authorization of chemicals) dans lequel les industriels doivent et
devront faire la preuve scientifique de la non-toxicit de leurs substances en fonction de
normes officielles.

Beaucoup dtudes ont pu mettre en vidence la prsence permanente et proccupante de

rsidus et multi-rsidus contaminant les denres alimentaires. Lanalyse de ces rsidus est trs
complexe cause de leurs proprits physico-chimiques telles que la solubilit dans leau par
exemple. Cette analyse est mene par des instituts de recherche, des universits, des
laboratoires privs et des agences gouvernementales. Elle permet non seulement la protection
des consommateurs et des plantes, mais aussi un contrle rigoureux de la pollution de
lenvironnement. Dans les pays dvelopps, les laboratoires danalyse des pesticides sont
facilement accessibles, mais leurs cots ne cessent daugmenter.

Les organochlors et les biphnyls polychlors sont trs stables, liposolubles, et peuvent
saccumuler et persister longtemps dans le sol, les tissus vgtaux et adipeux. Ils sont
neurotoxiques. Ainsi, vingt ans aprs sa restriction aux Etats-Unis, le dichloro diphnyl
trichlorothane (DDT) continue dtre dtect dans le lait maternel dans 19% des chantillons
des concentrations allant jusqu 2 ppm. Le dieldrin (2% des chantillons ; 0,071 ppm) et le
lindane se retrouvent aussi dans le lait. Ce dernier a t utilis comme substitut du DDT
cause de sa rmanence infrieure, et ses rsidus sont toujours trouvs en moindre quantit
(0,12 ppm) (Mattison et al. 1992 ; National Research Council, 1993).

Le dicofol, fortement hydrophobe, saccumule dans les tissus adipeux des bovins nourris
par des pures de pommes contamines (Archer, 1973). Des rsidus de fenvalrate, ont t
aussi dtects dans les rations base de fruits des vaches laitires ; cet acaricide tant souvent
pulvris sur pomme, la moiti de ses rsidus est excrte dans le lait (Spittler et al. 1982).

-66-

Chapitre IV

Discussion des rsultats

Des tudes ont mis en vidence que les bbs nourris au sein avaient accumul des
quantits dorganochlors (pesticides base de chlore) dans leur organisme, dont du DDE et
de la dieldrine (deux pesticides persistants). Ces enfants dveloppaient 10 15 fois plus
dotites que les enfants du sud du Qubec (Dewailly, E. et al. 2000).
Les pesticides se trouvent souvent la surface des lgumes et fruits. Une tude a montr
que le lavage coupl avec le frottement du vgtal peut rduire plus significativement la
prsence de rsidus (Barooah et Yein, 1996).

Etant donn que certains pesticides sont

lipophiles, ils peuvent pntrer au cur de la plante. Il est vident que le fait de laver et peler
les fruits et lgumes ne signifie pas quon peut rduire, ni liminer ces rsidus dfinitivement.
En effet, une autre tude a pu montrer la prsence de ces rsidus mme dans les concombres
traits et pels (Sheikhorgan et al. 1994).

Afin dviter la contamination de ces denres qui sont lorigine dintoxication chez
lhomme et les animaux, il est donc recommand de respecter les dlais demploi des
pesticides avant la rcolte.
Pluygers et al. (1994). J.F.Viel, (1992) ont remarqu que les utilisateurs de pesticides sont
plus souvent atteints par certains cancers (estomac, prostate, vessie, cerveau, lvres, LNH,
leucmies),
Keetles M.A et al. (1997) ont montr dans une rgion aux USA fortement contamine par
des herbicides organochlors et triazines, une augmentation significative du risque de cancer
du sein.
Dautres tudes montrent que les effets neurocognitifs des pesticides organophosphors
sur les populations exposes professionnellement sont : troubles de la mmoire, anxit,
irritabilit et dpression G.A.Jamal (1997).
Actuellement, la dtermination du taux des

rsidus de pesticides dans les denres

alimentaires peut tre effectue par HPLC (chromatographie liquide haute performance).
Celle-ci a t applique dans les oranges. Il existe galement une autre technique qui est
utilise pour valuer le taux des rsidus : la chromatographie en phase gazeuse (CG).

-67-

Chapitre IV

Discussion des rsultats

Notre travail consiste tudier la toxicit des pesticides et plus particulirement le

chlorpyrifos (CPF) au niveau des lgumes et fruits. Cet insecticide organophosphor, chlor
est l'un des insecticides les plus largement utiliss l'chelle mondiale (Aly et al. 2010) et trs
utilis dans la rgion de Stif au Nord Est de lAlgrie. Ce produit toxique produit des mfaits
chez lhomme, ainsi que chez les animaux comme les rongeurs.

La mthode par HPLC (chromatographie liquide haute performance) est simple, robuste
et fiable, pour la dtermination de Chlorpyrifos dans les denres alimentaires Pour la plupart,
l'analyse du chlorpyrifos est gnralement ralise l'aide de gaz chromatographie (GC) avec
dtection photomtrique de flamme ou de phosphore d'azote de dtection Serrano et al.
(1997), Zeumer et al. (1987).
La mthode que nous avons adopte est celle de Gaurdino et al. (2005) qui a utilis la
chromatographie liquide haute performance (HPLC) pour la dtermination du chlorpyrifos
dans les oranges. Les denres alimentaires que nous avons choisies sont trs rpandues, et
pour la plus part trs consommes.

Pour examiner la quantit de rsidus de pesticides dans les fruits et lgumes un total de
50 chantillons ; 4 fruits et 6 lgumes diffrents ont t recueillis en 2011. Nos rsultats ont
rvl les concentrations en rsidus de chlorpyrifos dans les pommes qui nous proviennent de
la Nouvelle-Zlande, les tomates provenant du Mexique, poivre vert et rouge cultivs au pays
et le concombre comme suit : Linsecticide chlopyrifos est prsent raison de 0,5378 g/ml
dans poivre rouge, 1,4817 g/ml dans les tomates, 0,9124 g/ml dans les pommes et 0,8524
g/ml dans le concombre. Courgettes, poires et laitues taient sans rsidus dtectables.

Nos rsultats ont montr quil y a absence de rsidus dans plus de 67% des chantillons.
Par contre, certains chantillons (6,5 %) prsentaient

un taux des rsidus de pesticides

infrieur ou gal la LMR et dans dautres (6,5%), ce taux est nettement suprieur la LMR.
Les taux gaux ou infrieurs la LMR ont t trouvs le plus souvent dans les pommes, les
poivres rouges, les poivres verts et le concombre. En ce qui concerne les pommes, nos
rsultats montrent que 61% des chantillons analyss en Italie prsentent des valeurs de
rsidus de pesticides qui sont largement suprieures la limite maximale de rsidus.

-68-

Chapitre IV

Discussion des rsultats

Le chlorpyrifos persiste sur les pommes mme aprs 14 jours du dernier traitement. Il est
aussi prsent dans les compotes et les jus de fruits.

Par ailleurs, Fitzell et Peak (1992) reportent la diminution des rsidus, aprs un dlai avant
rcolte de sept jours et suite des applications adquates. Aussi, des rsidus de cyhxatin sont
retrouvs dans les pommes des teneurs ne dpassant pas 2 ppm, la limite maximale admise
pour ce rsidu (Anderson et al. 1998) ; or cet acaricide est le plus slectif et le plus utilis
parmi sept autres tolrs pour la lutte contre les acariens sur pomme, (Welty et al. 1991.
Certains pesticides appliqus disparaissent la cueillette, bien sr avec respect du dlai de
pulvrisation pr-rcolte pour chacun, dautre par contre persistent des semaines (Cabras et
Angioni, 2000).
Appliqu au champ, ce pesticide est faiblement dgrad durant lentreposage rfrigr et
prsente dans ces conditions un temps de demi-vie de 122 jours pour les pommes
(Athanasopoulos et Pappas, 1999).

Dans le cas des poires, labsence de rsidus est un rsultat que nous avons obtenu et qui a
t confirm par Cabras et al.1995; Sala et al. 1996, qui ont constat une diminution rapide
de ces rsidus sur les poires durant les 7 jours qui suivent la rcolte.

Par ailleurs, Le mancozbe, fongicide de contact, est capable de pntrer dans la pulpe de
pomme quelques millimtres sous la peau (Sharma et al. 2001). Des rsidus dazinphosmthyle, chlorpyrifos, esfenvalrate, mthomyl, fnarimol, myclobutanil, thiabendazole,
penconazole, bnomyl, et fenvalrate dpassaient les normes dans le fruit frais (Spittler et al.
1982 ; Arauz et al. 1990 ; Jones et Ehret, 1993 ; Zabik et al. 2000).

Pour la tomate nous avons enregistr des dpassements, les tomates sont issues de cultures
classiques (sans traitement post-rcolte), sont contamines par des pesticides et contiennent
des rsidus de chlorpyrifos. Nos rsultats concordent bien avec ceux trouvs par plusieurs
auteurs ; Edder et al. (2004) qui ont constat plusieurs non conformits et Ortelli et al. (2005)
ont remarqu que des fruits issus de culture sans traitement post-rcolte sont contamins et
contiennent des rsidus de chlorpyrifos dpassant leur LMR.

-69-

Chapitre IV

Discussion des rsultats

Une tude a montr que des rsidus dpassent la limite maximale de rsidus sur des
lgumes et fruits tels que le poivre vert et le poivre rouge, mme si on ralise les bonnes
pratiques culturales (Lipowska et al. 1998).

Enfin les doses rsiduelles trouves, en accord ou non avec les normes, crent un risque
certain pour le consommateur. Un contrle permanent et rgulier des rsidus savre
indispensable, ainsi que des tudes de toxicit et gnotoxicit de ces molcules chimiques trs
stables faisant partie de notre alimentation quotidienne.

Des doses du chlopyrifos qui dpassent les normes au niveau des denres alimentaires
peuvent devenir trs nfastes pour la sant. Des travaux effectus sur les rats in vivo ont
montr que le chlopyrifos entraine des perturbations de la mmoire, des altrations au niveau
de lactivit, des modifications du niveau danxit, ainsi que la dpression chez les animaux
comme les rongeurs. Dautre part, des troubles comportementaux ont t dcrits partir de
diffrentes priodes dexposition, et des doses sous le seuil de toxicit de ce produit.

Les rsultats que nous avons obtenus ont pu mettre en vidence des effets toxiques. On a
constat que ladministration du chlorpyrifos a entrain des troubles comportementaux tels
que la salivation, la lacrymation, la dilatation pupillaire et les vomissements. Ce pesticide a
galement entrain des troubles cardiaques (rythme cardiaque acclr) et respiratoires, ainsi
que des convulsions et coma menant parfois la mort. Nos rsultats concordent avec ceux
trouvs par Keifer et Mahurin (1997) et Lotti (1995).

Le traitement subaigu au CPF (in vivo) des rats avec les doses 1/20 de la DL50 qui
correspond 24mg / kg de poids pendant 42 jours, a permis de rvler quune dose de CPF
plus faible, produisait une augmentation du niveau danxit plus importante que celle dune
dose de 1/5

mg/kg de la DL50 chez la rats femelles. Leffet dune dose unique de

chlorpyrifos administre aux rats, a montr une diminution significative du poids. Cette perte
de poids corporel des rats est due leffet du CPF sur la production d'immunoglobulines. Nos
rsultats concordent avec ceux obtenus par Rizk, G.A et al. (1990) et Seleim, Z.M.
(1988). Des rsultats similaires ont t galement trouvs par Gupta et al. (1992), Esia Amel
et Selium (1992) Baron D.N, (1984) et Kadota et al (1976). De plus, le CPF diminue lactivit

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Chapitre IV

Discussion des rsultats

locomotrice spontane (test dactomtrie et vidotracking) des rats mles et non des femelles.
Leffet des doses diffre chez les mles et femelles.

Les rsultats de la masse relative du foie (chapitre rsultats figure 12) ont montr une
augmentation significative (P 0,05) comparativement au groupe tmoin. Le poids du foie
augmente considrablement aprs traitement au pesticide. Daprs les rsultats, le foie est
lorgane cible de leffet du pesticide. Cette augmentation du poids du foie peut tre attribue
laugmentation des demandes accrues de dtoxification des composs toxiques (Kadota et al.
1976). En outre, il dsigne l'augmentation de la masse cellulaire ou de la densit cellulaire
(Abston P.A et al. 1976). Une autre littrature a indiqu que l'largissement du foie peut tre
li au maintien de la capacit fonctionnelle du foie normale (Robinson, K.M. et al. 1978). Une
augmentation

du poids du foie ainsi quune apparition dune tumeur du foie ont t

observes chez les souris mles. (Quest, J.A.et al. 1990 ; Chang, J.C.et al. 1991).

Dun autre ct, nous avons test lactivit de ce produit toxique in vivo sur des rats. Le
dosage des paramtres sriques biochimiques, hmatologiques et lvaluation de ltat
anatomo-histo-pathologique nous a rvl que les taux anormaux des paramtres sanguins et
des transaminases sont lis la ncrose des hpatocytes.

Nous avons constat que ladministration du chlorpyrifos engendre chez les rats dune
part, une diminution du taux dhmatocrites, du nombre de globules rouges, des globules
blancs ainsi que celui des plaquettes. Ce qui explique lanmie hmolytique consquente. Les
rsultats hmatologiques obtenus ont rvl galement une augmentation significative de
lhmoglobine, MCV, MCH et MCHC. Cependant la concentration de MPV ne montre pas
une diffrence significative. Dautre part, nos rsultats ont pu montrer une diminution
significative du taux de lure,la glycmie, les transaminases (ALAT, ASAT), AURI
ALB/GLOB et HDL. Par contre, nous avons observ une augmentation significative du taux
des paramtres suivants : ALB2, BILTS, LDL, le cholestrol, la cratine, les triglycrides, les
protines totales et le TP ainsi quune augmentation significative de lactivit phosphatase
alcaline (ALP).

Leffet du CPF sur certains paramtres sanguins et les transaminases tant considr
comme indicateur de dommage des tissus,

nos rsultats ont montr une augmentation

-71-

Chapitre IV

Discussion des rsultats

significative (P 0,05) des concentrations sriques des triglycrides, du cholestrol, de la

cratinine et de la bilirubine du srum chez les rats traits avec une dose unique de
chlorpyrifos par rapport au tmoin. Nos rsultats concordent avec ceux trouvs par Terada et
al. (1998). Un traitement prolong de 6 semaines subaigu des rats par CPF provoque des
modifications dans les tissus hpatiques peuvent tre expliques par la diminution des taux
des paramtres lALT, AST. Cette diminution de l'activit enzymatique du foie a t
accompagne par une diminution du glucose.

D'autre part, les rsultats prouvent que le mme traitement provoque une lgre
hypoglycmie. Nos rsultats sont similaires ceux trouvs par de nombreux auteurs qui
travaillent sur diffrents insecticides. Baron, D.N (1984). Lobservation des coupes
histologiques du foie des rats traits a rvl une prolifration ductulaire des canaux biliaires.
Nous avons pu trouver jusqu 6 canicules biliaires autour de lespace porte de Kiernan qui
tmoigne de la toxicit aigu. Un infiltrat inflammatoire autour de la veine centrolobulaire.
Dans plusieurs coupes et dans plusieurs secteurs du tissu hpatique, des foyers inflammatoires
et une statose. Le rein a rvl la prsence de vacuoles (vacuolisation), intra-cytoplasmiques
et linstallation dun dme entre les traves hpatocytaires. Lexamen du testicule a montr
une dgnrescence progressive et une atrophie due aux dysfonctionnements des tubes
sminifres.
Les figures 32 et 33(chapitre rsultats montrent une dgnrescence et une atrophie des
tubules ce qui conduit labsence de maturit des tubes et une oligospermie. Ces rsultats
sont compatibles avec ceux trouvs par Joshi et al. (2007) qui a conclu une dgnrescence
ainsi quune rupture du processus de spermatogense. Des rsultats similaires ont t
enregistrs par Sujatha et al. (2001) et Luc Multigner et Alejandro Oliva (2001) qui ont
montr que lexposition aux pesticides et certains solvants est associe des concentrations
en spermatozodes bien en dessous de la limite de la fertilit.
Nos rsultats ont rvl que chez tous les groupes de rats traits par le chlorpyrifos, il y a
une diminution de l'activit de produits alcalins, de la phosphatase acide et de la lactate
dshydrognase (LDH) ce qui a provoqu une perturbation de la spermatognse qui peut
souvent conduire une infertilit. Nos rsultats sont similaires ceux trouvs par Sinha et
Al. (1997) qui a trouv chez les rats traits par le chlorpyrifos, une inhibition de l'activit de

-72-

Chapitre IV

Discussion des rsultats

LDH au niveau des testicules. Lactivit de ces enzymes est considre comme un indicateur
du bon fonctionnement de la spermatogense (Johnson et al. 1970).

Yousef et al. (2001) ont galement confirm que lactivit de la lactate dshydrognase
(HDL) est associe la maturation de la couche germinale de l'pithlium des tubules
sminifres et au bon droulement de la division miotique. Une telle diminution de lactivit
de ces enzymes engendre galement une augmentation de lactivit de lenzyme (ALP).

-73-

CONCLUSION ET PRSPECTIVES

Conclusion et perspectives

CONCLUSION ET PERSPECTIVES

La prsente tude a montr que l'exposition rpte de bas niveau pour le PCF a entran
la dtrioration des paramtres biochimiques de rats illustrant des changements pathologiques
dans certains tissus tels que le rein, le foie, le cerveau, et les appareils gnitaux.

Les pesticides forment un groupe important de substances chimiques qui peuvent

contaminer lcosystme aboutissant lexposition. Douze millions denfants, rien quaux
Etats-Unis, souffrent de troubles de lapprentissage, daltrations neuro-dveloppementales et
comportementales lies une exposition environnementale diffrents produits chimiques
dont certains insecticides.

Malgr les efforts dploys pour dvelopper des mthodes alternatives, les pesticides sont
toujours le moyen de lutte prdominant et leurs rsidus constituent une menace potentielle. Il
est donc impratif dtudier la toxicit des pesticides car ils ont t trs cits pour leur
cytotoxicit et gnotoxicit dans les tudes toxicologiques.

Cette tude reprsente une contribution importante lvaluation correcte de lampleur du

risque sanitaire d lexposition aux rsidus de pesticides, particulirement le chlorpyrifos.
Il est important de vrifier si la toxicit est due la matire active elle-mme ou la
dgradation de celle-ci et

confirmer ces rsultats par lune des analyses biochimiques

hmatologiques.

Ce sujet suscite un grand intrt actuellement et mrite de raliser plus de recherches en

vue de mieux comprendre leffet du chlorpyrifos sur la sant humaine. Il serait galement
intressant dtudier les taux de ces rsidus dans le temps et long terme. Il serait aussi
indispensable de tester leur bioaccumulation et bioconcentration chez les animaux pour mieux
tudier leurs mfaits sur la sant.

Une attention particulire devrait tre accorde aux effets possibles de divers substances
toxiques prsentes dans l'environnement; en particulier ceux avec une faible toxicit qui sont
prsents dans les aliments et leau.

-74-

Conclusion et perspectives

Il serait judicieux de procder des exprimentations ultrieures en utilisant des solvants

diffrents dans le but dobtenir de meilleurs rsultats et faciliter ou amliorer leur
caractrisation.
Le but ultime est de pouvoir contrler leur utilisation surtout quon assiste un mauvais usage
des pesticides et au non respect de la rglementation comme mthode alternative pour rduire
notamment leur ampleur.

Ltude de la toxicit des insecticides organophosphors serait donc dun grand intrt,
tant pour la sante publique que pour aider valuer le rel rendement conomique de ces
substances.

-75-

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