2.

REQUERIMIENTOS NUTRICIONALES
Podemos clasificar los nutrientes en las siguientes categoras:

universales: agua, CO2, fosfatos y sales minerales;

particulares

2.1. Nutrientes Universales

El agua
Las bacterias necesitan grandes cantidades de agua. De hecho, salvo excepciones, se
pueden considerar como organismos acuticos. Requieren cierto grado de humedad
para crecer. Desde el punto de vista de sus posibles papeles, el agua es:
el principal constituyente del protoplasto bacteriano;
el medio universal donde ocurren las reacciones biolgicas;
un reactante en exceso (es decir, un producto resultante de algunas

reacciones bioqumicas).
Las fuentes de agua pueden ser:
endgena: procedente de procesos de oxido-reduccin;
exgena (la ms importante): procedente del medio, y que difunde a travs

de las membranas.
El CO2
El anhdrido carbnico es requerido por todo tipo de bacterias:
Las autotrofas lo requieren como fuente de carbono, y lo reducen usando

como fuente de energa la luz (en el caso de las fotoautotrofas) u

oxidaciones
de
determinadas
sustancias
inorgnicas
(los
quimioautolitotrofos).
Las arqueobacterias metanognicas pueden usar el CO 2 como aceptor de

los electrones procedentes de la oxidacin del H2, proceso por el que

obtienen su energa:
CO2 + 4H2 ---------> CH4 + 2H2O (D G'0<0)
Los heterotrofos, aunque no usan el CO2 como fuente de C ni como

aceptor de electrones, necesitan pequeas cantidades para las

carboxilaciones en determinadas rutas anablicas y catablicas.

El origen del CO2 puede ser:

endgeno: procedente de descarboxilaciones que ocurren al degradar la

fuente orgnica de carbono;

exgeno: el CO2 de la atmsfera o disuelto en las soluciones acuosas.

Fsforo
Suele requerirse en forma de fosfatos, sea orgnicos o inorgnicos. Las bacterias que
pueden usar los fosfatos orgnicos (merced a la posesin de fosfatasas) no dependen
absolutamente de ellos, ya que pueden recurrir igualmente a los fosfatos inorgnicos.
Los fosfatos orgnicos son hidrolizados por fosfatasas extracelulares o (en las Gramnegativas) periplsmicas (p.ej., la fosfatasa alcalina).

Sales minerales
Las sales minerales son la fuente de aniones (p. ej. el Cl --) y de cationes para la clula.
Los siguientes cationes, concretamente, se necesitan en cantidades relativamente
grandes: K+, Mg++, Ca++, Fe++.
El in potasio (K+):
interviene en la activacin de una variedad de enzimas, incluyendo las que

participan en la sntesis de protenas.

En Gram-positivas est asociado con los cidos teicoicos de la pared.

El in magnesio (Mg++):
estabiliza ribosomas, membranas y cidos nucleicos;
como cofactor en muchas reacciones, especialmente las que implican

transferencia de grupos fosfato. Por ejemplo, en las reacciones que

requieren ATP, el Mg++ puede unir la enzima al sustrato durante el
mecanismo de accin de la primera.
Participa de las clorofilas y bacterioclorofilas de bacterias fotosintticas.

2.2. Nutrientes Particulares

Se trata de elementos que pueden ser cubiertos de modo muy distinto, dependiendo del
tipo de bacteria que consideremos. Concretamente, los elementos N y S (que requieren
todos los seres vivos) pueden ser captados por las bacterias de modos muy distintos,
dependiendo de sus capacidades biosintticas.
Tanto el N como el S se encuentran en la clula en estado reducido:
el radical -NH2 forma parte de los aminocidos (que a su vez son los

sillares de las protenas) y de las bases nitrogenadas (que participan en

los cidos nucleicos y en algunas coenzimas);
el radical -SH interviene en determinados aminocidos y en coenzimas

como la CoA.

2.2.1. Fijacin De Nitrgeno

La atmsfera contiene enormes cantidades de nitrgeno no combinado (libre) en
estado gaseoso: el nitrgeno molecular o dinitrgeno (N 2), que procede de
microorganismos desnitrificantes . Sin embargo, esta gran reserva slo puede
servir de fuente de nitrgeno a ciertos procariotas, las llamadas bacterias
fijadoras de nitrgeno o diazotrofos. Esta notable capacidad bioqumica no ha
evolucionado en eucariotas. (Lo ms a que ha llegado la evolucin es a
seleccionar ciertos tipos de asociaciones simbiticas entre procariotas diazotrofos
y ciertos eucariotas).
La fijacin del N2 es un proceso de reduccin que convierte el nitrgeno molecular
en amoniaco, segn la siguiente ecuacin:
N2 + 8H+ + 8e + 18 ATP -->2NH3 + H2 + 18 (ADP + Pi)
Esta
reaccin
est
catalizada
por
un
complejo
enzimtico
denominado nitrogenasa o dinitrogenasa, que consta de dos componentes:

Componente I o nitrogenasa propiamente dicha; posee un cofactor

de hierro y molibdeno (FeMoCo) que forma parte del centro activo.
Por ello, a este componente tambin se le conoce como
molibdoferroprotena. (En realidad existen dos copias del cofactor,
cuya estequiometra es MoFe7S9-homocitrato)

Componente II o nitrogenasa-reductasa, que posee tomos de Fe

acomplejados con S de determinadas cistenas (por lo que este
componente se denomina a veces ferroprotena).

3. FACTORES DEL MEDIO

Los requisitos para el crecimiento microbiano incluyen factores fsicos y qumicos. Entre
los factores fsicos tenemos la temperatura, el pH y la presin osmtica. Los factores
qumicos necesarios para el crecimiento bacteriano son diversos elementos constitutivos
de las clulas.

3.1. Factores Fsicos

Temperatura
El patrn de crecimiento bacteriano se ve profundamente influenciado por la
temperatura. La temperatura a crecimiento ptimo permite el crecimiento ms rpido de
las bacterias durante un perodo de tiempo, usualmente entre 12 y 14 horas. La
temperatura mnima de crecimiento es aquella temperatura menor a la cual la especie
puede crecer. La Temperatura de crecimiento mximo es la temperatura mayor en la
cual el crecimiento es posible. Los microorganismos se dividen en 3 grandes grupos en
base a su preferencia de rango de temperatura.
Sicrfilos son capaces de crecer a 0C menos, pero crecen mejor a una temperatura
mayor. Estas bacterias son capaces de crecer a 0C, pero tienen una temperatura
ptima de 15C menos y una mxima de aproximadamente 20C. Los sicrfilos
estrictos mueren si se exponen a la temperatura de saln. Un ejemplo de sicrfilos
estrictos son las bacterias que crecen en la Antrtica. An a una temperatura ptima
estas bacterias se tardan en crecer de 2 a 3 semanas. Los sicrfilos facultativos o
sicrotrofos son aquellos organismos que pueden crecer a 0C, pero crecen mejor a una
temperatura de entre 20 a 30C. Los mesfilos crecen mejor a temperaturas que
fluctan de entre 25C a 40C. Aqu encontramos los patgenos de humanos y animales
de sangre caliente, stos crecen mejor a 37C. Los termfilos son bacterias que crecen
a una temperatura ptima sobre los 45C. La regin de crecimiento de muchos
termfilos se extiende a la regin de los mesfilos. Estas se conocen como termfilos
facultativos. La temperatura ptima de crecimiento para estos ltimos microorganismos
es entre 50 a 60C. Los termfilos extremos crecen a una temperatura mayor de 90C.
Es muy importante sealar que una bacteria no manifiesta las mismas caractersticas de
cultivo
cuando se crece a diferentes temperaturas, un ejemplo lo observamos en
Serratia marcescens, esta bacteria produce un pigmento rojo solamente a cierta
temperatura de cultivo.
Ph
En la mayora de las bacterias el crecimiento ptimo es entre 6.5 y 7.5. Muy pocas
bacterias crecen a un pH menor de 4.0. Sin embargo, las bacterias clasificadas como
acidfilos son tolerantes a la acidez, un ejemplo es Thiobacillus thiodans que crece a un
pH ptimo de entre 2.0 a 3.5.

Presin osmtica
Los microorganismos requieren agua para su crecimiento, adems para obtener
nutrientes de sta. Una presin osmtica alta causa prdida de agua y plasmlisis de la
clula, por lo que se utiliza este fenmeno para conservar los alimentos ya sea
aadiendo sal o azcar, lo que previene el crecimiento bacteriano. Sin embargo algunas
bacterias se han adaptado a altas concentraciones de sal, a stas se les conoce como
halfilos extremos. Por otro lado, los halfilos facultativos no requieren una alta
concentracin de sal, pero pueden crecer hasta una concentracin de 2%. Otras
bacterias pueden tolerar hasta un 15% de sal.

3.2. Factores Qumicos

Carbono
(C) todos los organismos requieren C para sintetizar los componentes celulares.
Nitrgeno, azufre.y fsforo.
Estos elementos se requieren para la sntesis de DNA, RNA, protenas y ATP. Las
bacterias pueden obtener nitrgeno (N) ya sea fijndolo directamente de la atmsfera,
como por ejemplo el gnero bacteriano Rhizobium. Tambin pueden obtener este
elemento de compuestos inorgnicos que contengan N como nitritos, nitratos, sales de
amonia o amino cidos. Las bacterias pueden obtener azufre de iones de sulfato, sulfito
de hidrgeno y amino cidos con azufre. El fsforo es esencial para la sntesis de cidos
nucleicos y membranas celulares. Una fuente para obtener fsforo son los iones de
fosfato y el ATP.
Elementos trazas.
Otros elementos como hierro, cobre, molibdeno y zinc son requeridos por los
microorganismos en pequeas cantidades. Usualmente tienen funcin de cofactores.
Oxgeno
No todos los microorganismos necesitan 02, sin embargo, muchas formas de vida
requieren oxgeno para llevar a cabo respiracin aerbica. Los microorganismos que
utilizan oxgeno molecular son llamados aerbicos. Estos se clasifican en aerbicos
obligados que son los que requieren oxgenos molecular para vivir, y los aerbicos
facultativos los cuales utilizan el oxgeno molecular cuando est presente, pero en su
ausencia continan su crecimiento por la va de fermentacin o respiracin anaerbica,
un ejemplo es Escherichia coli. Por otro lado tenemos los anaerbico obligados que
necesitan ausencia de oxgeno molecular para crecer y donde este generalmente es
txico, un ejemplo es el gnero Clostridium. Estos microorganismos obtienen el tomo

de oxgeno molecular del agua. Tambin se observan microorganismos anaerbicos

aerotolerantes los cuales no utilizan el oxgeno molecular para su crecimiento, pero
pueden tolerarlo. Los microaeroflicos slo pueden crecer en concentraciones de
oxgeno molecular menor a las encontradas en el aire.
Factores orgnicos de crecimiento
Estos son compuestos orgnicos esenciales que el organismo no puede sintetizar, aqu
se incluyen las vitaminas, los amino cidos, las purinas y las pirimidinas. Factores del
medio
Los requisitos para el crecimiento microbiano incluyen factores fsicos y qumicos. Entre
los factores fsicos tenemos la temperatura, el pH y la presin osmtica. Los factores
qumicos necesarios para el crecimiento bacteriano son diversos elementos constitutivos
de las clulas.

4. CRECIMIENTO BACTERIANO
El crecimiento bacteriano es la divisin de una bacteria en dos clulas hijas en un proceso
llamado fisin binaria. Previniendo que no se produzca ningn caso de mutacin las
clulas hijas resultantes sern genticamente idnticas a la clula original. De este modo
tiene lugar la "duplicacin local" de la poblacin bacteriana. Las dos clulas hijas creadas
tras la divisin no sobreviven necesariamente. Sin embargo, si el nmero de
supervivientes supera la unidad, en promedio, la poblacin bacteriana experimenta un
crecimiento exponencial. La medicin de una curva del crecimiento exponencial de las
bacterias en un cultivo ha sido tradicionalmente una parte de la formacin de todos
los microbilogos.
4.1FASES
A. Durante la fase de adaptacin, las bacterias
se adaptan a las condiciones de crecimiento.
Es el perodo en el que las bacterias
individuales estn madurando y no tienen an
la posibilidad de dividirse. Durante la fase de
adaptacin del ciclo de crecimiento de las
bacterias,

se

produce

la

sntesis

de ARN, enzimas y otras molculas. As que

en esta fase los microorganismos no estn
latentes.
B.

La

fase

exponencial

es

un

perodo

caracterizado por la duplicacin celular. El nmero de nuevas bacterias que aparecen por
unidad de tiempo es proporcional a la poblacin actual. Si el crecimiento no se limita, la
duplicacin continuar a un ritmo constante, por lo tanto el nmero de clulas de la poblacin
se duplica con cada perodo de tiempo consecutivo. Para este tipo de crecimiento
exponencial, la representacin grfica del logaritmo del nmero de clulas frente al tiempo
genera una lnea recta. La pendiente de la recta en la figura depende de la base del logaritmo
utilizada, y dependiendo de esa base, en la literatura se han asignado diferentes nombres a la
pendiente y se han aplicado diferentes frmulas para su estudio. Tambin afectan a la
pendiente las condiciones de crecimiento, que afecta a la frecuencia de los eventos de divisin
celular y a la probabilidad de que ambas clulas hijas sobrevivan. Bajo condiciones
controladas, las cianobacterias pueden duplicar su poblacin cuatro veces al da. El
crecimiento exponencial no puede continuar indefinidamente, sin embargo, porque el medio
llega pronto al agotamiento de nutrientes mientras se acumulan los desechos.

C. Durante la fase estacionaria, la tasa de crecimiento disminuye como consecuencia del

agotamiento de nutrientes y la acumulacin de productos txicos. Esta fase se alcanza
cuando las bacterias empiezan a agotar los recursos que estn disponibles para ellas. Esta
fase se caracteriza por un valor constante del nmero de bacterias a medida que la tasa de
crecimiento de las bacterias se iguala con la tasa de muerte bacteriana.
D. En la fase de declive o muerte, las bacterias se quedan sin nutrientes y mueren.
Esta modelo de crecimiento del cultivo bsico en lotes se mantiene y pone su nfasis en los
aspectos de la proliferacin de bacterias que pueden diferir de las del crecimiento de la
macrofauna. Se hace hincapi en clonalidad, divisin asexual binaria, el breve tiempo de
desarrollo en relacin con la replicacin en s, la tasa de mortalidad aparentemente baja, la
necesidad de pasar de un estado inactivo a un estado reproductivo y, por ltimo, la tendencia
de cepas adaptadas de laboratorio para agotar sus nutrientes.

4.2MTODOS DE EVALUACIN DEL CRECIMIENTO

1. Determinacin del n de microorganismos
Mtodos directos: recuento total
Recuento microscpico directo (cmara de Neubauer)
Conteo electrnico (citometra de flujo)
Mtodos indirectos: recuento de viables
Recuento en placa
Filtracin por membrana e incubacin
Nmero ms probable (NMP), en medio lquido
2. Determinacin de la masa celular
Mtodos directos
Medida de la masa
Medida del volumen
Mtodos indirectos
Determinacin del contenido de N, C, P, etc
Turbidimetra
Determinacin de la actividad celular Actividad enzimtica y Concentracin de
un metabolito)

5. MEDIOS DE CULTIVO

DEFINICIN
Un medio de cultivo es un sustrato o una solucin de nutrientes que permite el
desarrollo de microorganismos. En las condiciones de laboratorio para realizar
un cultivo, se debe sembrar sobre el medio de cultivo elegido las muestras en
las que los microorganismos van a crecer y multiplicarse para dar colonias.

CLASIFICACIN :
SEGN SU ESTADO FSICO (CONSISTENCIA).
1. Medios lquidos:
Son los que se presentan en este estado, denominndose por esta razn
caldos. El medio lquido ms utilizado es el llamado caldo nutritivo, compuesto
principalmente de extracto de carne, peptona y agua. Se utiliza
fundamentalmente cuando se pretende la obtencin de una suspensin
bacteriana de una determinada concentracin.
2. Medios slidos:
Se preparan a partir de los medios lquidos, agregndoles un agente
gelificante. Los ms utilizados son la gelatina y el agar.
Gelatina: Es una protena animal obtenida de los huesos. Tiene el
inconveniente de que es hidrolizada por muchas bacterias, y adems su
uso est muy limitado porque su punto de fusin es bajo (lica a
temperatura ambiente) razn por la que no puede utilizarse para
cultivos a 37C, que es la tempera ptima de crecimiento para muchos
microorganismos.
Agar-agar:Es un polmero de azcares obtenido de algas marinas. Se
trata de una molcula insoluble enagua pero soluble en agua
caliente.Tiene el inconveniente de que introduce compuestos orgnicos
indefinidos que pueden falsear los resultados de las necesidades
nutritivas de un microorganismo.
3. Medios semislidos:
Se preparan a partir de los medios lquidos, agregando a stos un agente
solidificante en una proporcin menor que para preparar medios slidos. Uno
de sus usos es la investigacin de la movilidad de las bacterias

SEGN SU UTILIZACIN.

1.

Medios comunes:
Son aquellos que poseen los componentes mnimos para que pueda producirse
el crecimiento de bacterias que no necesiten requerimientos especiales. El
medio ms conocido de este grupo es el agar nutritivo o agar comn, que
resulta de la adicin de agar al caldo nutritivo. Otros representantes de este
grupo son el agar tripticase de soja, el agar Columbia, etc.

2.

Medios de enriquecimiento:
Son aquellos que, adems de las sustancias nutritivas normales, incorporan
una serie de factores indispensables para el crecimiento de microorganismos
exigentes. Este enriquecimiento se hace por adicin de sangre u otros
productos biolgicos (sangre, suero, leche, huevo, bilis, etc.) que aportan
dichos factores. En ocasiones es posible aadir suplementos artificiales a los
medios para producir un enriquecimiento del mismo (p. ej. Polivitex, Isovitalex,
etc)El gonococo, por ejemplo, necesita cistina y cistena para su crecimiento.
Estas sustancias son aportadas por la sangre calentada adicionada al medio de
cultivo (agar chocolate).

3. Medios selectivos:
Son medios utilizados para favorecer el crecimiento de ciertas bacterias
contenidas en una poblacin polimicrobiana. El fundamento de estos medios
consiste en facilitar nutricionalmente el crecimiento de una poblacin
microbiana especfica. Un ejemplo de medio selectivo es el caldo selenito, que
se utiliza para favorecer el crecimiento de salmonellas y frenar el del resto de
enterobacterias.
4. Medios inhibidores:
Cuando las sustancias aadidas a un medio selectivo impiden totalmente el
crecimiento de una poblacin microbiana, se denomina inhibidor. Los medios
inhibidores podran considerarse como una variante ms restrictiva de los
medios selectivos. Los medios inhibidores se consiguen habitualmente por
adicin de sustancias antimicrobianas o de cualquier otra que inhiba
completamente el desarrollo de una poblacin determinada. Un medio
inhibidor es el MacConkey que permite el crecimiento de los grmenes Gram
negativos e impide el crecimiento de los Gram positivos.
5. Medios diferenciales:
Se utilizan para poner en evidencia caractersticas bioqumicas que ayuden a
diferenciar gneros o especies. La adicin de un azcar fermentable o un
sustrato metabolizable se utilizan para este fin. El medio MacConkey es un
medio diferencial porque permite distinguir los grmenes que fermentan la

lactosa de aquellos que no lo hacen. Tambin lo son el C.L.E.D. (lactosa

+/lactosa -), el agar sangre (tipo de hemlisis).
6.

Medios de identificacin:
Son los destinados a comprobar alguna cualidad especfica que puede
servirnos para reconocer la identidad de un microorganismo. Estos medios han
de poseer los elementos necesarios para asegurar el crecimiento de los
microorganismos, el sustrato especfico que vaya a ser metabolizado y el
indicador que nos muestre el resultado. El agar Kligler, el medio de Simmons y
en general, cualquier medio al que se le haya aadido un elemento diferencial
de un microorganismo, son medios utilizados en identificacin.

7.

Medios de multiplicacin:
Sirven para obtener una gran cantidad de clulas a partir de un
microorganismo ya aislado. Se emplean en la obtencin de vacunas, en la
investigacin y en la industria. Los medios ms adecuados para la
multiplicacin suelen ser lquidos. El caldo-infusin cerebro-corazn (BHI), es
un ejemplo tpico de estos medios.

8. Medios de conservacin:
Se utilizan para conservar una cepa que, por diversas razones nos interese
mantener. Fundamentalmente se utilizan como controles de calidad de las
pruebas y reactivos utilizados en elLaboratorio de Microbiologa. En el
laboratorio se pueden conservar las cepas de tres formas:
a. haciendo pases peridicos de placa a placa,
b. mediante liofilizacin de una suspensin bacteriana, y
c. congelando las cepas en leche descremada estril al 0,1%.
9. Medios de transporte:
Se usan para el transporte de muestras clnicas que no pueden sembrarse
inmediatamente. Suutilizacin debe hacerse introduciendo la torunda con la
que se obtuvo la muestra en el interior delmedio (generalmente en un tubo).
Son ejemplos tpicos de este grupo los medios de Stuart-Amies,Cary-Blair, etc.

SEGN SU COMPOSICIN.
Segn las sustancias que entren a formar parte en su composicin, los medios
de cultivo pueden ser clasificados en:
1.

Medios complejos:
Fueron los primeros utilizados, y los ms empleados se preparan a partir de
tejidos animales, y ms raramente de vegetales. Su composicin no es
exactamente definida, y por consiguiente no es rigurosamente constante. Esto

puede tener ciertos inconvenientes en condiciones experimentales, donde la

reproductibilidad no podr ser exacta. En la prctica corriente estos medios
dan excelentes resultados y son los ms empleados.
2. Medios sintticos:
Son aquellos que contienen en su composicin exclusivamente sustancias
qumicas conocidas y disueltas en agua destilada en proporciones
determinadas, resultando un medio de composicin perfectamente definida.
3.

Medios semisintticos:
El gran nmero de factores de crecimiento exigidos para ciertos grmenes
hace que la fabricacin de un medio sinttico para estos grmenes sea
imposible o demasiado cara. En este caso se aportan los factores de
crecimiento bajo la forma de un extracto orgnico complejo (extracto de
levadura, extracto de tejidos, etc.).Ciertos grmenes no crecen en ningn
medio por muy enriquecido que est ste, hacindolo exclusivamente en
clulas vivas con unas caractersticas determinadas. Ejemplos de este tipo son,
aparte de los virus, las Chlamydias, Rickettsias.

SEGN SU ORIGEN:
1. NATURALES:
son los preparados a partir de sustancias naturales de origen animal o vegetal
como ser
extractos de tejidos o infusiones y cuya composicin qumica no se conoce
exactamente.
2. SINTTICOS:
son los medios que contienen una composicin qumica definida cuali y
cuantitativamente. Se utilizan para obtener resultados reproducibles.
3. SEMISINTTICOS
son los sintticos a los que se les aaden factores de crecimiento bajo una
formade un extracto orgnico complejo, como por ejemplo extracto de
levadura.