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LE DIAGNOSTIC

DES BACTRIOSES
Marie-France MICHEL

Les maladies bactriennes ou bactrioses sont relativement rares chez les espces forestires.
Elles se manifestent par diffrents symptmes dont l'observation prcise constitue la premire
tape du diagnostic . Chez le Peuplier, on observe un chancre du tronc d Xanthomonas
populi, des ncroses sur les rameaux dues Xanthomonas campestris . Chez le Frne, Pseudomonas savastonoi fraxini est l'agent d'un chancre tandis que le dprissement du Saule est
caus par Erwinia salicis . Rcemment en rgion parisienne, Sharma et Cousin (1986) ont signal
des mycoplasmoses, qui conduisent rapidement la mort de l'arbre, chez des peupliers noirs et
des peupliers blancs . Le feu bactrien des Pomaces d Erwinia amylivora ne peut tre
considr ce jour comme une bactriose forestire . Diverses espces de Sorbus ont cependant t reconnues comme htes potentiels de cet agent pathogne (Bradbury, 1980) . Les
conifres sont rarement attaqus par les bactries . On connat pourtant les tumeurs globuleuses
des rameaux dues Corynebacterium halepensoides . Agrobacterium tumefaciens, agent de la
galle du collet peut infecter un grand nombre d'espces forestires, et dernirement les hybrides
de peupliers de la section Leuce se sont rvls particulirement sensibles cette maladie.
L'identification de la bactriose peut s'effectuer par l'tude fine des symptmes dans le cas
d'une maladie reconnue, sinon le diagnostic doit obligatoirement suivre le postulat de Koch qui
tablit les conditions qu'un organisme doit satisfaire pour tre nomm agent causal d'une
maladie :
sa prsence doit tre dmontre dans chaque cas de la maladie en question ;
des cultures d'une grande puret doivent pouvoir tre ralises ;
la r-inoculation d'un chantillon d'une telle culture la plante doit provoquer la maladie
chez cette plante ;
l'agent pathogne doit tre isol de nouveau et cultiv un degr de puret satisfaisant.
Au point de vue diagnostic, ces rgles ne sont appliques que si les symptmes observs sont
nouveaux ou observs chez de nouvelles plantes htes.
Le diagnostic d'une bactriose devra obligatoirement tre effectu en laboratoire mme si les
symptmes de la maladie ne prtent aucune confusion pour l'tablissement du diagnostic . Il
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Photo 1
(en haut, gauche)
MYCOPLASMOSES CHEZ LE
PEUPLIER . APPARITION DES
BALAIS DE SORCIRE ET
DPRISSEMENT DE L'ARBRE
Photo Cousin

Photo 2 (en haut, droite)


CHANCRE DO XANTHOMONAS
POPULI CHEZ LE PEUPLIER
Photo Pinon

Photo 3 (ci-contre)
TUMEURS GLOBULEUSES DUES
CORYNEBACTERIUM
HALEPENSOIDES CHEZ LE PIN
D'ALEP
Photo Soustrenon

est souvent ncessaire d'obtenir des renseignements plus approfondis sur l'agent pathogne
afin d'valuer les risques de propagation de la maladie et les modifications de l'agent pathogne
lui-mme (apparition de nouvelles souches plus agressives par exemple).
Il est opportun, en outre, de fournir, au laboratoire charg de diagnostiquer la bactrie pathogne, des prcisions quant la nature du sol, des traitements effectus de l'organe attaqu . ..
Ces donnes facilitent souvent l'tablissement du diagnostic et sont indispensables si l'on
envisage ultrieurement une tude pidmiologique de la maladie (cf . tableau, d'aprs Cardan et
Luisetti) .
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Modle de fiche descriptive des symptmes


joindre avec les chantillons devant tre analyss

Expditeur

__ . .

Dpartement :

____

____ . . .

__

Date de prlvement

Commune :

_.
___ ..

NOM DU PROPRITAIRE : ...


Plante attaque

Espce : _ .. .

Varits :

Age

NATURE DU SOL : Profond, superficiel, sableux, caillouteux, rocheux, bourbeux, calcaire, siliceux . argileux :
. . .. . . . . . . . . . . . .. . . . . . . . . . . .. . . . . . . . . . . . .. . . . . . . . . . . .. . . . . . . . . . . . .. . . . . . . . . . . .. . . . . . . . . . . . .. . . . . . . . . . . . .. . . . . . . . . . . . . . .. . . . . . . . . . . .. . . . . . . . . . . . . . . .. . . . . . . . . . . . . . .. . . . . . . . . . . . .. . .. . . . . . ..
Altitude :

Pente

Exposition :

Evnements anormaux, climatiques, biologiques des dernires annes : scheresse, gele. incendie, attaques
de maladies ou ravageurs :
Conditions de vgtation de l'anne
Nature des cultures prcdentes (en cas d'assolement ou de reconversion) :

Traitements phytosanitaires appliqus : .. .

Dates :

MALADIE
Localisation sur la plante : racine, tige, branche, feuilles, fleurs, fruit :

tat de la plante attaque ou malade : sur pied, coupe . entrepose, mise en oeuvre :
Description dtaille des dgts au moment du prlvement

Date d'apparition des dgts

Importance des dgts : Intensit - dans l'exploitation :


- dans la rgion :
tendue - dans l'exploitation :
- dans la rgion :
La rgion a-t-elle connu des attaques semblables : oui, non : si oui, quand
Observations diverses :

Des chantillons ont-ils t envoys un autre laboratoire ? oui, non ;


Si oui, lequel 2

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. . .. . .. . . .. . .. . ...

. .. . .. . .. . . .. . .. . . ..

Le diagnostic des bactrioses

Au laboratoire, les chantillons peuvent tre soumis diffrents examens selon l'objectif
atteindre et les moyens de diagnostic disponibles . Selon les cas, plusieurs techniques peuvent
tre employes :
techniques bactriologiques classiques bases sur l'tude de la
mtabolisme bactrien ;

morphologie et du

profil de rsistance aux antibiotiques ;


techniques immunologiques ;
-

profil d'acides gras.

TECHNIQUES BACTRIOLOGIQUES
L'identification de l'agent pathogne se droule toujours selon le mme processus . Cette
technique sera toujours employe ; elle est la base de tout diagnostic bactrien.
La premire phase consiste isoler l'agent pathogne partir du matriel suspect ou de
l'chantillon de sol analyser . Trs souvent, on utilise des milieux slectifs bass la fois sur
l'inhibition de la croissance de la flore accompagnatrice par des substances antiseptiques
(berberine, slnite de sodium . . .), des antibiotiques (actidione, bacitracine . . .) et sur la stimulation
de la croissance de l'agent pathogne en utilisant des substances nutritives appropries . Les
colonies ainsi obtenues sont repiques sur un milieu riche base trs souvent de peptone,
glucose et extrait de levure afin de vrifier la puret de la bactrie isole ou isolat analyser.
Le travail d'identification de l'agent pathogne peut alors commencer . Les tests sont bass :
sur l'tude morphologique de la bactrie : forme, structure de la paroi (coloration de
Gram), mobilit (prsence ou absence de flagelles), prsence ou non de capsules, de spores . ..
sur l'tude du mtabolisme bactrien : type respiratoire (arobie stricte, anarobie facultative, anarobie stricte), voie d'utilisation du glucose (oxydative, fermentative . . .), prsence de
systmes enzymatiques particuliers (oxydase, catalase, jt-galactosidase, nitrate reductase, amylase, gelatinase . . .), sources carbones et azotes utilises . Selon l'espce laquelle appartient
l'agent pathogne recherch, on privilgiera tels ou tels tests et trs souvent pour un travail de
routine 4 5 tests suffisent pour l'identification de l'agent pathogne.
Des mthodes miniaturises, bases sur l'tude du mtabolisme bactrien, sont actuellement
proposes sur le march . Les bases de donnes affrentes ont t mises au point initialement
pour le diagnostic en sant humaine et vtrinaire et sont encore peu adaptes au diagnostic
dans le domaine agronomique et forestier . Cependant, ces techniques peuvent rendre des
services apprciables cause de la rapidit d'obtention des rsultats (48 heures maximum
contre une, voire trois semaines avec les moyens classiques).

RSISTANCE AUX ANTIBIOTIQUES


La recherche du profil de rsistance des bactries aux antibiotiques dcoule directement des
tudes menes en milieu hospitalier . partir de telles tudes pidmiologiques, des systmes
de diagnostic ont t mis au point, systmes bass sur l'analyse de bases de donnes ; ces
systmes ont pour rfrence la rsistance de tel groupe bactrien telle ou telle famille
d'antibiotiques . Cependant, ces techniques commencent tre utilises en phytobactriologie
des fins d'enqutes pidmiologiques (Beynon et al., 1980 ; Kingsley et al., 1983 ; Nesme et al .,
1987) .
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IDENTIFICATION DES BACTRIES PAR PROFILS D'ACIDES GRAS
Cette technique est rcente et vient d'tre commercialise par Hewlet-Packard . Les bactries
contiennent dans leur paroi des acides gras dont la nature et la quantit sont stables pour un
organisme donn . Les acides gras peuvent tre extraits des cellules bactriennes et analyss en
chromatographie gazeuse . Le chromatogramme ainsi obtenu est compar avec des profils de
rfrence contenus dans une base de donnes.

TECHNIQUES IMMUNOLOGIQUES
Lorsqu'une molcule trangre (ou antigne) pntre dans l'organisme, celui-ci se dfend, entre
autres, par des ractions spcifiques faisant intervenir les anticorps ou immunoglobulines.
Les immunoglobulines sont des molcules de structure protique . Elles sont synthtises par les
lymphocytes (3 et se retrouvent dans le srum o elles circulent pendant un temps variable . Les
anticorps ont la proprit de reconnatre l'antigne l'origine de leur synthse et de s'y lier
spcifiquement . Cette proprit a permis la mise au point de techniques immunologiques,
permettant l'tude de tout systme antigne-anticorps.
Au cours des dix dernires annes, ces techniques immunologiques ont connu un rapide essor
cause de la rapidit et de l'amlioration des techniques d'identification . Les changes internationaux de plants (graines, boutures . . .), plus intensifs, ont augment la demande de cration de
techniques de routine trs rapides pour tester l'tat sanitaire de matriels vgtaux pouvant
introduire des maladies nouvelles dans le pays d'importation.
En rgle gnrale, les techniques de dpistage utilisent des anticorps marqus l'aide d'un
fluorochrome (mthodes d'immunofluorescence) ou d'une enzyme (mthodes immunoenzymatiques ou ELISA = Enzyme Linked-Immuno-Sorbent Assay).

Mthodes d'immunofluorescence
La technique mise au point par Coons et al . (1941) allie les mthodes cytologiques et immunologiques : l'immunofluorescence consiste conjuguer une globuline une substance fluorescente :
l'isothiocyanate de fluorescine et la mettre en prsence de l'antigne (Riggs et al ., 1958).
L ' immunoglobuline reconnat l'antigne et s'y lie . Le complexe antigne-anticorps est alors
dtect de faon prcise.
En 1964, Paton adapte l'immunofluorescence la dtection des bactries dans les tissus
vgtaux . Depuis, l'utilisation des techniques d'immunofluorescence a connu un rapide essor
pour tester l'tat sanitaire des semences, pour dtecter des agents pathognes dans la sve, le
sol et les tissus vgtaux et pour effectuer des tudes pidmiologiques sur un grand nombre
de bactries phytopathognes.
En matire forestire, les premires tudes pidmiologiques utilisant l'immunofluorescence ont
dbut en 1983 par les recherches sur la structure d'une population d'Agrobacterium tumefaciens prsente sur galles de peupliers grisards (Nesme et al ., 1987) . Depuis ces tudes se sont
tendues d'autres ppinires afin de suivre les risques de propagation de la galle du collet
d'une ppinire l'autre (Tourne, 1987).
Des essais mthodologiques ont t entrepris afin de quantifier la population d'Agrobacterium
prsente dans un sol par immunofluorescence (Parcollet, 1986).
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Le diagnostic des bactrioses

Photos 4 et 5
(ci-contre, droite)
GALLE DU COLLET DUE A
AGROBACTERIUM TUMEFACIENS
CHEZ LE PEUPLIER
Photos Pman-Michel

Photo 6 (ci-dessous)
AGROBACTERIUM TUMEFACIENS
Gx40000
Photo Depierreux

Mthodes immunoenzymatiques
Les techniques immunoenzymatiques furent dveloppes par Van Weemen et Schuurs (1971) et
Engvall et Perlman (1971, 1972) . Voiler et al. (1976) et Clark et Adams (1977) les utilisent pour
dtecter les bactries phytopathognes . Depuis, ces techniques sont largement utilises lors de
tests de dpistage de routine cause de leur grande sensibilit.

Problmes lis aux mthodes immunologiques


Spcificit
Les techniques srologiques sont connues pour tre spcifiques . Cependant diffrentes familles
d'anticorps sont prsentes dans le srum d'un animal immunis et diffrent souvent dans leur
capacit se lier ou former des complexes plus ou moins stables avec les dterminants
bactriens antigniques .
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La spcificit des anticorps obtenus ne peut tre dfinie qu'en relation avec les mthodes
employes . Ainsi, en immunofluorescence, on observe une spcificit leve des anticorps
obtenus partir des Agrobacterium du biotype I, tandis que de nombreuses ractions croises
sont observes avec les bactries du biotype Il (chez Agrobacterium, le biotype I n'est diffrenci du biotype Il que par quelques caractristiques mtaboliques telles que la production de
3 ctolactose, l'alcalinisation du lait tournesol ou l'utilisation du mlzitose et l'thanol chez le
biotype I et non chez le biotype Il).
Par contre, en utilisant les mmes anticorps et les mmes suspensions bactriennes, des
ractions croises se rvlent aussi bien pour les biotypes I que pour les biotypes II lors de
l'emploi des techniques immunoenzymatiques (Tourne, 1987) . Cet exemple dmontre qu'il est
ncessaire d'effectuer des recherches sur la structure des composants antigniques bactriens
afin d'obtenir des anticorps hautement spcifiques.
Sensibilit
La sensibilit des tests srologiques peut tre exprime en terme d'unit d'anticorps prsents
dans un volume donn (dfinition mdicale) ou la plus petite quantit d'antignes bactriens
dtectables dans un volume donn . La dernire dfinition est particulirement intressante pour
la dtection des phytobactries dans les conditions naturelles.
Les premiers rsultats obtenus dans notre laboratoire sembleraient indiquer que les techniques
immunoenzymatiques sont plus sensibles que les techniques d'immunofluorescence (Tourne,
1987).
Fiabilit et prcision
ct des problmes de sensibilit et spcificit rencontrs dans tout test srologique, on doit
considrer les problmes statistiques inhrents toute tude pidmiologique.

PERSPECTIVES
Si les mthodes classiques d'analyses bactriologiques sont et seront encore largement utilises, de nouvelles mthodes de diagnostic mises au point dans le secteur de la sant humaine
ou le secteur vtrinaire sont en train d'apparatre . La plupart de ces techniques font appel aux
mthodes immunologiques d'identification en utilisant soit des anticorps polyclonaux (immunoglobulines produites chez un animal) ou monoclonaux (immunoglobulines produites par une
ligne cellulaire spcifique particulire ou hybridome) plus rcemment . En effet, la technique des
hybridomes permet de produire en quantit industrielle des anticorps monoclonaux dont les
caractristiques de spcificit et d'homognit sont adaptes aux exigences du diagnostic
rapide . Les mthodes immunoenzymatiques permettent d'tudier rapidement un grand nombre
d'chantillons et on a vu l'apparition sur le march d'un grand nombre de kits de diagnostics.
Cependant l'volution des techniques est telle que les anticorps monoclonaux risquent moyen
terme d'tre remplacs par les sondes nucliques qui permettent l'identification de squences
gntiques spcifiques . Ces sondes sont des squences d'acide dsoxyribonuclique ou d'acide
ribonuclique simple brin capables, sous certaines conditions exprimentales, de retrouver leurs
squences complmentaires et de s'hybrider avec elles . La premire gnration de sondes fut
des sondes dites chaudes >, car radioactives . Rcemment des sondes dites froides ont t
dveloppes . La mthode de dtection du complexe form s'effectue alors l'aide de ractions
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Le diagnostic des bactrioses

enzymatiques (les enzymes utilises tant identiques celles employes dans la mthode
ELISA : peroxydase et phosphatase alcaline) . Il semblerait que pour le diagnostic des espces
bactriennes, les sondes nucliques soient plus efficaces que les anticorps monoclonaux.
Ces techniques sont videmment mettre au point dans le domaine agronomique.
Cependant, il ne faut pas sous-estimer tous les avantages que peuvent apporter les mthodes
bactriologiques classiques qui resteront irremplaables lors du diagnostic d'agents encore
inconnus .

Marie-France MICHEL
Station d'Amlioration des Arbres forestiers
CENTRE DE RECHERCHES FORESTIRES (INRA)
ARDON 45160 OLIVET

BIBLIOGRAPHIE
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