ETAPAS EN LA FERMENTACIÓN

 Aspectos microbiológicos
 Cultivo y propagación
 Recirculación de levadura
 Recirculación de vinaza
 Número de fermentadores
 Factores que afectan

1
 ASPECTOS MICROBIOLÓGICOS

 MORFOLOGÍA DE LOS MICROORGANISMOS

 MORFOLOGÍA DE LA LEVADURA
 ¿QUÉ PAPEL JUEGA LA LEVADURA?
 MICROORGANISMOS CONTAMINANTES
 PRODUCTOS INDESEADOS
 CONCEPTOS FUNDAMENTALES

2
CLASIFICACIÓN DE LOS MICROORGANISMOS

MICROORGANISMOS

PROCARIOTOS EUCARIOTOS

Bacterias

Hongos Algas Protozoos

3
MORFOLOGÍA DE LOS MICROORGANISMOS

4
 PAPEL DE LA LEVADURA

invertasa
C12 H22 O11 + H2O C6H12 O6 + C6H12 O6
Sacarosa Agua Glucosa Fructosa

(342 g) (18 g) (180 g) (180 g)

levadura
C6H12 O6 2C2H5OH + 2CO2
glucosa etanol dióxido de carbono
(180) (92) (88)

 Biocatalizador en el proceso de fermentación

 Inversión de sacarosa a glucosa/fructosa
 Convertir glucosa y fructosa a etanol

5
 MORFOLOGÍA DE LA LEVADURA

• Forma oval
• Hongo unicelular
• Células más grandes
que las bacterianas
• Tamaño: 5 - 10 µ m
• pH adecuado de trabajo
3.5 - 4.8
• Temperatura entre 15°C
- 35 °C

6
 MORFOLOGÍA DE LA LEVADURA

• Reproducción asexual por

división celular (gemación)
• Posibles duplicaciones: 4 - 20
veces Saccharomyces cerevisiae
• Microorganismo facultativo
• No posee flagelos ni órganos de
locomoción
• Existen más de 500 clases de
levaduras (levaduras salvajes)

7
 MEDIOS DE CULTIVO

Medio de cultivo
(sustrato)

Fuente de
Micronutrientes
Energía

Carbono Fuente de Elementos Vitaminas,

Proteínas esenciales Mg,Zn,Ca,Fe

Nitrógeno P,K,O,Na
8
 PRESERVACIÓN DEL MEDIO DE CULTIVO

 Preservado en un slant
 Temperatura de 4 °C
 Cada vez que se use refrigerarlo y evitar
que se contamine
 Solo manipulación por personal encargado
 Cada inoculo se debe tomar frente a un
mechero y con un asa totalmente estéril o en
cámara de flujo laminar
 EQUIPOS
- microscopio
- cámara de flujo laminar
- autoclave (esterilización)
- vidrieria, shakers
- camara de new_beauer

9
 PROCEDIMIENTOS EN EL LABORATORIO

 Uso de recipientes totalmente estériles

 El agua para los medios de cultivos debe ser destilada
 Indumentaria adecuada (bata,zapatones,cofia y tapabocas)
 En el laboratorio limitar el flujo de personal
 El lugar de trabajo totalmente aséptico (cámara de flujo laminar)
 Aplicar todas las BPL y asepsia en el laboratorio

10
 BACTERIAS ACIDO-LÁCTICAS

 Son facultativas
 Compiten por los nutrientes de la levadura.
 Operan a bajo pH
 Producto final de fermentación ácido láctico
 Tolerantes a altas concentraciones de sales y azucares .
 Ejemplos :
Lactobacillus lactis
Streptococcus lactis

11
 BACTERIAS ACIDO-ACÉTICAS

 Predominantes en la fermentación
 Opera a bajo pH
 Convierte el alcohol en Acido Acético
 Raramente se observa en melazas.
 Ejemplos:
Acetobacter spp

12
 CLOSTRIDIUM & BACILLUS SPP

 Se encuentra en la flora normal del aire y del suelo

 Opera a altas concentraciones de azúcar y de sales
 Propiedades de formación de esporas
 Sobrevive a bajo pH
 Resistentes al calor - por esporas-
 Sintetizan sus propias vitaminas
 Los clostridios producen ácido butírico, acetona y
butano

13
 PRODUCTOS INDESEADOS

 Glicerol
Formado del Glicerol 3 –fosfáto en la ruta metabólica del etanol
 Acetaldehido
Formado a partir del Piruvato
 Acido acético
Viene de las mieles o se forma por oxidación a partir del etanol por acción de
bacterias o levaduras
 Acetato de Etilo
Formado por la reacción entre el etanol y el ácido acético
 Metanol
Producto del metabolismod de la levadura cuando consume azucares tipo
pentosas
 Fusel oils (Pentanol, Butanol, Propanol)
Producto de la acción de la levadura al consumir aminoacidos
 Ácidos Propiónico y Butírico
Formado por bacterias que consumen el azúcar
14
 CONCEPTOS FUNDAMENTALES

 Población
Numero de células presentes (PRAJ recomienda como mínimo una población de 300 x 106 cell/ml)

 Viabilidad
Número de células con actividad metabólica (es deseable una viabilidad superior al 90%)

 Unidades Formadoras de Colonias(UFC)

Miles de millones de células presentes visibles al ojo humano. Usualmente se realizan cultivos en una caja Petri para establecer la población de bacterias

 Velocidad específica de crecimiento

Masa levadura fresca/masa levadura inicial/hora

 Productividad específica
Volumen alcohol/masa levadura/hora

 Productividad volumétrica
Volumen alcohol/volumen reactor/hora

15
CINÉTICA DE CRECIMIENTO

Estacionaria

Crecimiento

Adaptación

16
 FASES EN EL FERMENTADOR

 ADAPTACIÓN (lag)
Se caracteriza por la síntesis y degradación de material celular y adaptación al nuevo
medio ambiente. Se detiene la actividad metabolica

 CRECIMIENTO
Caracterizada por la reproducción y multiplicación celular a máxima velocidad. Máxima
actividad metabólica

 ESTACIONARIA
Se detiene el crecimiento celular. El sustrato está agotado y comienza para la célula un
estado de inanición y de degradación

17
 CULTIVO DE TRABAJO

Prueba cualitativa

Propagación
Levadura Activación de
GR - X la levadura
Incubación condiciones
controladas

18
 PROPAGACIÓN DE LA LEVADURA

Slant

L1
T1 T2
L3
L2

Fermentador
PF T4 T3

19
PROPAGACIÓN DE LA LEVADURA

20
 LEVADURA FLOCULANTE

Ca++
C6H12 O6 Ca++
Ca++
CC ++
6 12 O6
H
a
C6H12 O6 Ca++
C6H12 O6
C6H12 O6
Ca++
Ca++
Mg++ Ca++ Mg++
Ca++
Mg++
Ca++ Mg++
Ca++ Ca++
Mg++ Ca++
MG++
Ca++

21
 LEVADURA FLOCULANTE

mosto
Vino a destilación

DECANTADOR

TANQUE DE
ACTIVACIÓN

Crema de levadura

Levadura a fermentación

22
 LEVADURA FLOCULANTE

Ventajas
 no requiere separadores mecánicos de
alta velocidad
 ahorra electricidad
 ahorra requerimientos de mantenimiento
 se evita la compra de repuestos
 evita la recirculación de lodos al
fermentador

23
 RECIRCULACIÓN DE LEVADURA

 Alta densidad celular: alta

concentración de biocatalizador
en el fermentador

 Reduce tiempo de residencia

 Incrementa la eficiencia de
fermentación

 Reducción de costos

24
 RECIRCULACIÓN DE VINAZA

 Reducción en el consumo de agua de proceso

 Reducción en la generacion de efluentes
 Recirculación de nutrientes
 Reducción de costos
La cantidad de vinaza recirculada depende de:

 Concentración de sólidos en mosto función de F/N (máx. 16-18 % p/p)

 Nivel de acidez volátil en mosto función de acidez volátil en la alimentación (máx. 2500 ppm)

25
 TIEMPO DE RESIDENCIA

Az u ca re s fe rm e n ta bl e s - 4 5 %w/w, Ac Vo l a ti l -9 6 5 2
ppm , Le v. Re ci rcu l a bl e 7 0 %

40
residencia (hr)

30
Tiempo de

20
10
0
0 8 9 10
Alcohol e n vino (%v/v)

26
 VELOCIDAD DE CRECIMIENTO

KG
0.12
P.S /kg

0.11
p.s/h
fresca p.s/

0.1
INICIAL

0.09
levadura FRESCA

0.08
inicial

0.07
LEVADURA

0.06
0.05
kgLEVADURA
levadura

0.04
0.03
0.02
0.01
0
KG

3 4 5 6 7 8 9
% ALCOHOL EN VINO

Al
Alpasar
pasarde
de44aa77%%enenelelcontenido
contenidode
dealcohol
alcoholse
sepierde
pierdeun
un%
%62
62de
develocidad
velocidadde
de
generación
generaciónde
decélulas
células
27
 PRODUCTIVIDAD ESPECÍFICA

1.4
1.3
1.2
LITROS ALCOHOL/KG
kg levadura

1.1
P.S

1
0.9
LEVADURA

0.8
0.7
p.s/h

0.6
0.5
Lt alcohol/

0.4
0.3
0.2
0.1
0
3 4 5 6 7 8 9
% ALCOHOL EN VINO

Al
Alpasar
pasarde
de44aa77%
%en
enelelcontenido
contenidode
dealcohol
alcoholse
sepierde
pierdeun
un%
%50
50de
deproductividad
productividad
28
 UTILIZANDO UN SOLO FERMENTADOR

Alcohol conc.(%v/v) 0-5.5 0-6.5 0-7.5 0-8.0

Productividad 1.07 0.84 0.73 0.49
Tiempo de retención (h) 11.4 22 32 35
Concentración
celular 4.5

FERMENTADORES EN SERIE

Alcohol conc.(% v/v) 5.5 6.5 7 7.5

Productividad 1.07 0.84 0.73 0.49
Tiempo de residencia (h) 11.4 2.6 1.5 2.3
Concentración celular 4.5 4.5 4.5 4.5
T RTotal(h) 17.9

Utilizando
Utilizandofermentadores
fermentadoresen
enserie
seriese
sedisminuye
disminuyeeleltiempo
tiempode
deresidencia
residenciahasta
hastaen
en
un
un50
50%% 29
 FERMENTADORES EN SERIE
Productividad
levadura

Tiempo de
residencia
F1 F2 F3 F4

5.5- 6.0% 6.0- 6.5% 6.5-7% 7-7.5%

Conc. Alcohol

30
 FACTORES QUE AFECTAN LA FERMENTACIÓN
 MATERIA PRIMA
 AZUCARES FERMENTABLES
 CONTENIDO TOTAL DE MATERIA
ORGÁNICA
 CONTENIDO TOTAL DE MATERIA
INORGÁNICA Y CENIZAS
 SÓLIDOS SEDIMENTABLES
 PH
 TEMPERATURA
 ACIDEZ VOLÁTIL ORGÁNICA
 CONTENIDO DE CARAMELOS
 SODIO
 CONTENIDO DE BACTERIAS
 RELACIÓN C/N
 CONTENIDO CELULAR
 TIEMPO DE RESIDENCIA
 AGITACIÓN
 CONCENTRACIÓN DE ETANOL
 OTROS
31
 AZÚCARES FERMENTABLES

 Sacarosa, glucosa y fructosa

 Altas concentraciones reducen residuos

 Fermentación continua se pueden tener entre 15% p/p y

19% p/p de azúcares fermentables

 Fermentación discontinua alrededor de 23% p/p.

CONTENIDO TOTAL DE MATERIA ORGÁNICA
 Proteínas, almidones, dextranas, ácidos, azúcares infermentables,
xilosa, arabinosa, polímeros

 Depende de la variedad de la caña. Varía entre 0.7 y 2.7 %.

Mientras más bajo sea este valor, más eficiente será la fermentación
32
CONTENIDO TOTAL DE MATERIA INORGÁNICA Y CENIZAS

 Iones de calcio, potasio, sílice, hierro, manganeso, óxidos,

nitratos, compuestos clorados

 Incrementa la presión osmótica del medio de cultivo y por

ende de la levadura

 Las mieles con alta relación azúcares fermentables a azúcares

infermentables poseen bajo contenido de cenizas

CONTENIDO DE SÓLIDO SEDIMENTABLES

 Sulfatos de calcio y magnesio, algunas proteínas y células

muertas.

 Destilación y concentración de Vinaza

33
 pH

 Los microorganismos tienen un pH ideal en el que incrementan

su actividad metabólica

 Se requiere un pH entre 4.0 y 4.7 para obtener una actividad

adecuada de la levadura.

 Afecta:
• El crecimiento celular
• La velocidad de fermentación
• La formación de subproductos

34
 pH

120

100
Velocidad específica de crecimiento o

80
productividad específica

60

40

20

0
3 3.5 4 4.5 5 5.5 6

pH
R elative Sp. Grow th R ate R elative Sp. Produc tivity

35
 pH

E ff e c t o f p H o n B ac te rial A c tivity
6

5
pH

3
50 70 90 110
% B ac te rial A c tivity

36
 TEMPERATURA

 Todos los microorganismos tienen una temperatura ideal

 Varía dependiendo de la levadura entre 30°C y 35°C

 Afecta:
• Actividad enzimática
• La velocidad de fermentación
• Desarrollo de bacterias mesófilas

37
 TEMPERATURA

productividad específica, en porcentaje

Velocidad específica de crecimiento o

120

100

80
Productividad
60 específica

40
Velocidad esp.
20 de crecimiento

0
25 30 35 40
Temperatura, °C

38
 TEMPERATURA

E f f e c t o f T e m p e r a t u r e o n B a c t e r ia l A c t iv it y

41

36
Temperature, in
Centigrade
degree

31

26
30 50 70 90 110

% B a c t e r ia l A c t iv it y

39
 ACIDÉZ VOLÁTIL ORGÁNICA

 Presencia principalmente de:

• ácido acético
• ácido propiónico
• ácido valérico
• ácido isovalérico
• ácido butírico
• ácido isobutírico

 Los ácidos representan venenos para la levadura

 Causan baja velocidad de reproducción de la levadura

 La acidez empieza desde el momento en que se corta la caña (se

recomienda que el tiempo máximo desde el corte hasta la
molienda no sea mayor a 18 horas)
40
 ACIDÉZ VOLÁTIL ORGÁNICA

Velocidad específica de crecimiento

Productividad Específica %

120

100

80

60

40

20

0
0 1000 2000 3000 4000 5000 6000 7000
Acidez Volatil ppm

Relative Sp. Growth Rate

Relative Sp. Productivity

Contenido
Contenidomáximo
máximorecomendado
recomendado2500
2500ppm
ppm 41
 EFECTOS DE LA ÁCIDEZ VOLÁTIL
Acidez Volatil (ppm)

Melaza-B Mosto Eficiencia Costo Variable Millones/año

fermentación Alcohol pérdida

4000 2590 89.5% $667.8/litro $0

5000 2730 88.8 $670.8/litro $ 157.5

6500 2940 87.4 $676.7/litro $ 467.2

Base : 150,000 litros/dia Alcohol Carburante

350 dias de operación / año
Recirculación de vinaza
15.3 % p/p Sólidos en fermentación
7 % v/v Etanol en fermentación
Melaza –B , Jugo Clarificado , Meladura
42
Costo variable Alcohol incluye 3 % gasolina
 CONTENIDO DE CARAMELOS
EFECTO DEL CARAMELO
Alcohol kg de levadura)
Productividad (lit de

1.2
1
0.8
0.6
0.4
0.2
0
0 0.2 0.4 0.6 0.8
Caramelo @375 Nm 0.01 %


Por
Porexceso
excesode
detemperatura
temperaturaseseforma
formaelelfurfural
furfuralyyelelhidroximetilfurfural
hidroximetilfurfural
Contenido
Contenidomáximo
máximorecomendado
recomendado0.15
0.15(productividad
(productividadde
de0.95)
0.95)
43
 CONTENIDO DE SODIO

 Produce cambios en la morfología de la levadura tornándola más ovalada.

 Genera cambios genéticos negativos

RELACIÓN DE CARBONO-NITRÓGENO

 Relación Carbohidratos/ Proteínas

 De acuerdo a las necesidades se ajustará la necesidad de nitrógeno en la

planta con difosfáto de amonio o urea

 Usualmente se requiere de una relación mayor a 1.2

 Cuando C/N es baja se asocia con una presión osmótica alta

44
 CONTENIDO CELULAR

 Sistema sin recirculación es del orden de 80 - 100 x 106

cell/ml
 Sistemas con recirculación del orden de 250 - 400 x 106
cell/ml. Disminuyendo el tiempo de fermentación.
CONTENIDO DE BACTERIAS
 Son aceptables valores entre 100 –1000 UFC al inicio de la fermentación

 Cuando la población bacteriana es del orden de 100x106 UFC se recomienda

iniciar un nuevo cultivo

45
 CONTENIDO DE BACTERIAS

PJ: Jugo primario Sy: Meladura

SJ: Jugo secundario A-mol: Miel A
MJ: Jugo mezclado B-mol: Miel B
CIJ: Jugo Clarificado C-mol: miel C
FItJ: Jugo filtrado 46
 CONCENTRACIÓN DE ETANOL

RELACION ENTRE CONC. ALCOHOL & V ELOCIDAD SP. DE

CRECIMIENTO

0.12
KG OF FRESH DRY YEAST / KG OF

0.11
0.1
0.09
VITAL DRY YEAST

0.08
0.07
0.06
0.05
0.04
0.03
0.02
0.01
0
3 4 5 6 7 8 9
VOLUME % ALCOHOL IN MASH

47
 AZÚCARES RESIDUALES

E f fe c t o f R e s id u a l F e r m e n ta b le S u g a r s o n B a c t

120
100
80
% Bacterial Activity

60
40
20
0
1 1 .5 2 2 .5 3 3 .5 4 4 .5 5
P e r c e n t a g e R e s id u a l F e r m e n t a b le S u g a r s

48
 FACTORES DEL CAMPO Y LA COSECHA

 Herbicidas para control de malezas:

• Ametrina, Diuron, 2-4 D amina

 Fertilizantes: Nitrógeno, Potasio, Fosfóro

 Madurantes: Etefon, Glifosáto, Fusilad

 Composición del Suelo

 Condiciones climáticas

 Microorganismos como Colletotrichum Falcatum y/o Fusarium

 Tiempo de cosecha y permanencia

49
 FACTORES DE FÁBRICA
 Cal
• afecta el pH e inhibe el grado de inversión de la sacarosa
 Azufre
• actúa como biocida
 Floculantes: polielectrolitos, siliconas, poliacrilamidas
• promueven la sedimentación de la levadura en los fermentadores
 Blanqueadores
• atacan la pared celular de la levadura
 Biocidas: aminas cuaternarias, tiosulfato de amonio
• en exceso pueden disminuir drásticamente la población
 Manejo y almacenamiento de mieles y jugos
• pueden aportar carga microbiológica perjudicial
 Anti-incrustantes
 Fibras/Bagacillo
• en exceso aumentan la presión osmótica
 Caramelos
• disminuye le productividad de la levadura

50
 OTROS FACTORES

Parámetro C oncentración Efecto

F/N 0.85 a 1.45 en Alta relación favorece la
Fermentables/ nomiel final fermentación
Fermentables 1.15 en A mayor valor, permite la
meladuras recirculación de no
fermentables sin afectar el
proceso y por lo tanto favorece
la recirculación de vinaza
Sólidos no M áximo 17% No se debe superar este valor
fermentables w/w porque la eficiencia de la
fermentación disminuye
N itrógeno 200-3000 ppm El N es requerido como fuente
en mieles de proteína de las levaduras en
requerido entrela fermentación
600 a 800 ppm

51
 OTROS FACTORES

Parámetro Concentración Efecto

Sólidos totales 75-80% w/w Afecta la viscosidad y por lo
tanto las propiedades de flujo
Cenizas 7-14% w/w A mayores concentraciones
inorgánicas pueden ocasionar toxicidad a
totales las levaduras
Ca como sulfato 0.5-4% w/w Causa incrustaciones. Valores
alrededor de 2% se consideran
normales
Sólidos orgánicos 1.5–4% w/w Incrementa la presencia de
precipitables infección bacterial,afectan la
presión osmótica
Capacidad buffer 4.8-8 Si es muy alto, incrementa los
pH requerimientos de ácido para
el proceso
Características Prueba Si alto, se incrementa el uso de
espumantes cualitativa antiespumantes que pueden
inhibir la actividad de la
levadura
Caramelo 0.1-7.0 Inhiben severamente las
levaduras, afectan eficiencias y
producción de alcohol

52
 OTROS FACTORES

Parámetro Concentración Efecto

Bacterias y 1x108 UFC Inhiben la levadura,
levaduras competencia en la
salvajes fermentación, disminuyen
eficiencia
Ácidos volátiles 4000 -15000 Retarda el crecimiento de la
ppm debe levadura, la productividad y
mantenerse en reduce el rendimiento
2000 ppm en el
fermentador
Trazas de Se requiere el uso de biocidas.
sustancias El amonio cuaternario usado
inhibidoras en los medios hasta
concentraciones de 10 ppm no
representa problemas
Existen biocidas que no son
biodegradables con la
temperatura pero pueden llegar
a las mieles o meladuras e
impiden la fermentación
Referencia notas de clase, PRAJ, MATRIX marzo 10 de 2005 .
53
 OTROS FACTORES

Contenido de azúcar
La levadura puede llegar
Acido Láctico 38% w/v depende de la levadura
> 0.8% w/v
Muerte Bacterias
pH
3-4 FACTORES DE STRESS
QUE AFECTAN LA
Sulfitos
(Depende de la
LEVADURA
variedad )

Sodio (ion)
>500 mg/L muerte Sólidos disueltos
Temperatura Acido Acético > 20 % w/w
35°C max. > 2400 ppm inhibe 54