AISLAMIENTO DE BACTERIAS FIJADORAS DE NITROGENO A PARTIR DE

SUELOS DE ZONAS PRODUCTORAS DE QUINUA

Isabel Morales-Belpaire1, Guillermina Miranda-Torres2, Virginia Mendez-Pinaya1, Carolina Morales-Arias2

RESUMEN
La fuerte demanda de quinua ha llevado a una intensificacin del cultivo y, entre otros, al
empobrecimiento de los suelos por extraccin de nutrientes. El abonado mediante estircol
aparenta ser insuficiente, mayormente en lo que respecta al nitrgeno, por lo que se
requiere investigar alternativas como ser la utilizacin de microorganismos de vida libre
fijadores de nitrgeno. Se ha realizado un trabajo inicial de aislamiento de fijadores de
nitrgeno a partir de muestras de suelo provenientes de Santiago de Quillacas y Pampa
Ullagas (Oruro). Algunas de las cepas obtenidas probablemente pertenecen a los gneros
Azotobacter, Azomonas y Azospirillum. Se han aislado, adems, cianobacterias.

INTRODUCCIN
El creciente desarrollo de un mercado internacional para la quinua ha llevado a una
fuerte presin sobre los suelos de las zonas productoras. Se ha empezado a cultivar en
reas que tradicionalmente estaban destinadas al pastoreo y se han reducido los
tiempos de descanso. Esta presin ha llevado, entre otros, a un empobrecimiento de
los suelos y a una prdida de fertilidad por extraccin de nutrientes. A pesar de que la
quinua ha sido domesticada y cultivada desde hace unos 7000 aos en las tierras
altas bolivianas, ha ingresado al mercado internacional recin en los ltimos 15 aos.
Es por esto que el conocimiento disponible sobre los requerimientos agronmicos de
este cultivo es todava escaso (Del Castillo et al, 2008). Trabajos llevados a cabo por
varios investigadores han mostrado que las variedades de quinua del altiplano sur
presentan tolerancia a sequa (Dominguez-Escoda et al. 2005), heladas, radiacin y
suelos salinos. Este cultivo tolera una amplia gama de valores de pH del suelo (Mujica,
1979).
Si bien la quinua puede crecer y producir en suelos ridos con muy poco contenido en
nutrientes, en esas condiciones los rendimientos son bajos (alrededor 650 kg.ha -1
segn Del Castillo et al. 2008). El nutriente que ha mostrado tener mayor influencia
sobre los rendimientos es el nitrgeno, sin embargo varias investigaciones han
mostrado que la respuesta de la quinua al nitrgeno depende tambin de la
precipitacin de la zona y de la rotacin de los cultivos. En diferentes ensayos de
fertilizacin de quinua, con humedad apropiada, se ha calculado que por cada Kg de
nitrgeno por hectrea, hasta en un nivel de 120 Kg/ha, la produccin se eleva en 16
Kg/ha (Rivero, 1985). Se ha observado adems, en cuanto a la influencia de los
diferentes nutrientes en la produccin de quinua, que, con una precipitacin mayor de
600 mm, la quinua responde en forma significativa a niveles de 80 a 120 Kg de N, 60 a
80 Kg de P y 80 Kg/ha de K. Se ha encontrado asimismo que existe una buena
respuesta al desdoblamiento del N aplicado mitad a la siembra y mitad al aporque (a
los 50 dias de emergencia) Estudios mas recientes realizados por Alegria et al. (1999)
y Schulte aufm Erley et al. (2005) confirman tambin la influencia positiva y
significativa del aumento de la disponibilidad en nitrgeno sobre el rendimiento de
quinua.

1. Instituto de Biologa Molecular y Biotecnologa. Carrera de Biologa- UMSA. Campus Universitario Calle 27 s/n Cota Cota. La Paz
2. Instituto de Ecologa. Carrera de Biologa- UMSA. Campus Universitario Calle 27 s/n Cota Cota. La Paz

En sistemas tradicionales, el requerimiento de nitrgeno y otros nutrientes para los

cultivos poda ser compensado mediante abonado con estircol de camlido al inicio
de la rotacin agrcola. Sin embargo el aumento de las reas de produccin ha llevado
a la reduccin de las reas de los pastizales y a una menor disponibilidad de abono
(Del Castillo et al., 2008). Es por tanto necesario establecer alternativas de produccin
de abonos orgnicos ricos en nitrgeno, de fcil uso para el agricultor, que lleven a una
mejora en los rendimientos y a la conservacin de la fertilidad de los suelos.
Una alternativa para aumentar el contenido en nitrgeno del suelo es la utilizacin de
biofertilizantes formados a partir de microorganismos fijadores de nitrgeno. El rol de
los microorganismos fijadores en la mejora de la fertilidad del suelo es conocido desde
hace mas de una centuria (Bashan, 1998). Este autor indica que desde hace muchos
aos, se han utilizado, y producido de forma comercial, inculos basados en las
bacterias simbiticas Rhizobium sp. Estas bacterias, mediante simbiosis, contribuyen a
los rendimientos de leguminosas y pueden tener un efecto residual en el suelo una vez
que las leguminosas han sido cosechadas. Para cultivos distintos a leguminosas, se ha
investigado ms recientemente el efecto de microorganismos diazotrficos no
simbiticos como ser Azotobacter y Azospirillum (Bashan, 1998). La inoculacin de
cultivos de arroz con bacterias fijadoras de nitrgeno no simbiticas ha mostrado un
aumento de hasta 26% en el rendimiento de granos para arroz (Jha et al., 2009). Otra
opcin muy promisoria son las cianobacterias, siendo que pueden fijar nitrgeno
adems de ser fotosintticas, por lo cual podran ser cultivadas en reactores sencillos
dando lugar a una biomasa crtica que permite aumentar el tenor en materia orgnica
del suelo. Por ejemplo, Karthikeyan et al. (2007) observaron que la inoculacin de
cultivos de trigo con cianobacterias podra disminuir en un 60% el requerimiento de
fertilizacin qumica. Para el caso de la quinua, no se conocen estudios que impliquen
el uso de biofertilizantes a base de microorganismos diazotrficos.
La conservacin del equilibrio en el ecosistema implica que se evite la introduccin de
especies exticas incluso a nivel de microorganismos. Por otra parte, el usar
biofertilizantes importados podra implicar costos excesivos y tal vez resultados pobres
al tratarse de microorganismos que no se adaptaran a las condiciones extremas de los
ecosistemas donde se cultiva la quinua. Por esto es necesario producir biofertilizantes
a partir de microorganismos endgenos, aislados de los suelos donde habitualmente
se cultiva quinua.
En este contexto, se est realizando un trabajo de investigacin con el objetivo general
de consolidar una tecnologa microbiana, accesible para los agricultores, que permita la
preparacin de un fertilizante orgnico de tenor elevado en nitrgeno. En el presente
trabajo se describe un fase inicial que responde al objetivo especfico de aislar
microorganismos de vida libre capaces de fijar el nitrgeno atmosfrico a partir de
muestras de suelo de la zona de estudio, dado que el paso inicial para la produccin de
biofertilizantes requiere el aislamiento de microorganismos fijadores de nitrgeno
mediante medios de cultivo especficos (Jha et al., 2009, Karthikeyan et al. 2007) y su
caracterizacin.
LOCALIZACIN DEL TRABAJO
Las muestras de suelo fueron tomadas a partir de parcelas situadas en las cercanas
de las comunidades de Santiago de Quillacas, Bengal Vinto y Pampa Aullagas. Estas
comunidades se ubican en el Altiplano Central y pertenecen a la provincia Eduardo
Abaroa del Departamento de Oruro (LS 1838 y LO 6743 a una altitud 3700m.s.n.m.).
Se ubican al sur de la cuenca endorreica entre las cordilleras oriental y occidental de

los Andes. Resalta en el rea de estudio la cercana a una extensa formacin salina, el
salar de Coipasa (Crdenas y Choque, 2008).
El rea de estudio est gobernada, a nivel macroclimtico, por la Alta de Bolivia
durante los meses de diciembre, enero y febrero, con algunas incursiones de frentes
fros provenientes del sur. En el invierno se tienen precipitaciones slidas producto de
frentes fros. A nivel mesoclimatico, la zona se ve influenciada por el salar de Uyuni
que se constituye en centro de subsidencia. Esta influencia implica que durante gran
parte del ao se tengan cielos totalmente despejados lo que en el invierno coadyuva a
bajar las temperaturas. A nivel microclimtico, la geomorfologa del lugar define los
flujos de aire y la temperatura. Segn la clasificacin de Thornthwaite, el rea de
estudio responde a un clima microtrmico semirido
En cuanto a geologa, se puede indicar que el altiplano se form por deposiciones
lacustres y fluviolacustres en el Oligoceno Superior, entre el arco magmtico de la
cordillera Occidental y la cordillera Oriental. Su estructura es muy compleja, presenta
fajas plegadas y corridas, zonas de transcurrencia y cuencas pequeas intramontaas
(Sempere et al., 1991). La actual geomorfologa del altiplano es producto del ltimo
episodio orognico - fase quechua, de 27 0 Ma, (Noble et.al, 1996; citado por
Argollo, 2006). El rea de estudio corresponde a penillanura con contados cerros
donde estn asentadas las poblaciones.
De acuerdo a la clasificacin de la FAO, los suelos de la zona de estudio son
regosoles, desarrollados sobre materiales no consolidados y que presentan una
escasa evolucin, con fuertes procesos erosivos que provocan un continuo
rejuvenecimiento de los suelos. Los suelos son heterogneos debido a su origen fluvio
lacustre, aluvial y coluvial. En colinas, serranas y lugares escarpados son poco
profundos y poco desarrollados. Aquellos situados cerca de los ros, lagunas y pie de
colinas se encuentran mayor nivel de evolucin. En zonas aledaas a los salares
presentan una delgada capa de sal de 6-8 mm sobre sedimentos arcillosos o arenosos
(CORDEOR, 1993).
Segn Orsag (2009), los suelos estn en procesos de
degradacin, pues acumulan sales y/o sodio que provocan la disminucin de la
cobertura vegetal.
MATERIALES Y MTODOS
Muestreo
El muestreo de suelos fue realizado en parcelas bajo cultivo de quinua o en parcelas
en descanso que fueron cultivadas con quinua en campaas anteriores. El muestreo
se realiz a partir de la capa arable (0-15 cm) mediante barreno, segn un esquema en
zigzag, de tal forma que cada muestra estaba formada por 20 submuestras. Las
submuestras fueron mezcladas y cuarteadas y una cantidad final de 1 Kg fue llevada a
laboratorio en una bolsa hermticamente cerrada y correctamente etiquetada. Las
muestras fueron mantenidas en frio (0-4C) durante el transporte y hasta el momento
de anlisis.
Aislamiento de microorganismos fijadores de nitrgeno, de vida libre, en el suelo
muestreado.
El aislamiento de microorganismos fijadores de nitrgeno, de vida libre, se realiz
mediante la inoculacin de suspensiones preparadas con las muestras de suelo a
medios de cultivo especficos. Estos medios de cultivo tienen como caracterstica
comn el carecer de fuente de nitrgeno, por lo que son selectivos para aquellos
microorganismos que pueden aprovechar el nitrgeno atmosfrico. Para la preparacin
de las suspensiones de suelo, se ha agregado 1g de cada muestra a 100 mL de agua

destilada estril y luego de una agitacin vigorosa, se han realizado diluciones 10 -4, 106
, 10-8 que fueron inoculadas a los distintos medios de cultivo.
Para el aislamiento de Azotobacter sp y Azomonas sp, se ha utilizado una versin
modificada del medio LGI descrito por Jha et al. (2009) al cul no se han agregado
vitaminas. El medio de cultivo fue plaqueado en cajas Petri y luego de su gelificacin
se coloc 100 L de las diferentes suspensiones de suelo. Las cajas fueron incubadas
a 37C por una semana. Las colonias fueron luego repicadas hacia cajas Petri con
medio fresco.
Para el aislamiento de Azospirillum sp, se utiliz el procedimiento descrito por
Dobereiner (1994). Para esto se realiz inicialmente un sembrado en medio semislido NFb. Aproximadamente 3 mL de este medio fue colocado en tubos de ensayo
estriles. Luego del enfriamiento del medio, se llev a cabo la inoculacin mediante
colocado de 100 L de las diferentes diluciones obtenidas a partir de las muestras de
suelo. Las muestras fueron incubadas una semana a 37C . Al finalizar este tiempo de
incubacin, se repicaron los microorganismos que se haban desarrollado hacia cajas
Petri que contenan medio NFb al cul se agreg extracto de levadura. Luego de una
nueva incubacin durante una semana, se volvi a transferir las colonias hacia tubos
de ensayo con medio semi-slido NFb. Finalmente, los microorganismos que dieron
lugar a la formacin de velos o pelculas fueron sembrados en medio papa-dextrosa
agar contenido en cajas Petri.
En el caso de cianobacterias, se ha utilizado el medio liquido de Bristol descrito en
Oran (1995). Aproximadamente 3 mL de este medio lquido se ha colocado en tubos en
ensayo. Los tubos de ensayo fueron luego inoculados con 100L de las diferentes
diluciones obtenidas de la suspensin de suelo. La incubacin se ha llevado a cabo por
cuatro semanas a temperatura ambiente y en cercanas de una ventana como fuente
de luz.
Para la conservacin de los microorganismos aislados se realiza refrigeracin a 4C,
con repiques cada 1-2 meses.
RESULTADOS Y DISCUSIN
La inoculacin de suspensiones de muestras de suelo en el medio selectivo LGI dio
lugar nmeros variables de colonias de microorganismos fijadores de nitrgeno. La
observacin macroscpica de estas colonias mostr que podan ser clasificadas en
cuatro grupos segn su aspecto (ver Fig.1). Se clasificaron por tanto las colonias como
sigue:
a) Colonias redondas sin coloracin (transparentes) y de aspecto mucilaginoso, sin
variacin del color del medio de cultivo (no causan acidificacin del medio)
b) Colonias blanquecinas lechosas de contorno redondeado, sin variacin del color
del medio de cultivo (no causan acidificacin del medio)
c) Colonias blancas ovaladas de tamao pequeo (puntitos ovalados) (dimetro
menor a 1 mm), no causan variacin del medio de cultivo
d) Colonias que causan acidificacin del medio, llevndolo de azul a amarillento.
El aspecto mucilaginoso y el color lechoso o transparente son los que se espera
observar para colonias de Azotobacter segn Motsara y Roy (2008). Es por tanto
probable que estas colonias correspondan a ese gnero de microorganismos. Sin
embargo son necesarias mayores observaciones a nivel microscpico y a nivel de

caractersticas metablicas para tener mayor seguridad sobre la asignacin del gnero,
sobre todo para diferenciar entre Azotobacter y Azomonas. Estos gneros difieren
mayormente en cuanto a la capacidad de enquistamieto (Dobereiner, 1995). Por otro
lado, la presencia de colonias con caractersticas bastante distintas a las esperadas
(colonias de tipo punto y colonias formadoras de acido) muestra que el medio
utilizado no es muy selectivo. Esto se ha observado tambin en otros trabajos donde
se ha utilizado medios muy similares. Por ejemplo Khan et al., 2008 han aislado cepas
pertenecientes a Enterobacter spp., Klebsiella spp., Bacillus spp. y Azospirillum spp. a
partir de raices de cultivo de arroz. Por otro lado, al trabajar con un medio muy similar y
mediante confirmacin con tcnicas moleculares, Jha et al. (2009) aislaron una gran
diversidad de bacterias endofticas tambin a partir de arroz. La mayora pertenecan al
filum proteobacteria pero algunas cepas no podan ser clasificadas en este filum. En
cuanto a las -proteobacterias se obtuvo, una minora de Azospirillum sp.,
Gluconoacetobacter sp. y, llamativamente, un nmero elevado de cepas que podan
ser consideradas como Rhizobiacea. Jha et al. (2009) aislaron tambin las proteobacterias Herbaspirillum sp. y Burkholderia sp.
y Pseudomonas sp (proteobacterias).
Para el caso de las inoculaciones realizadas en el medio semislido NFb, se observ,
para una mayora de las muestras, la presencia una formacin en velo o pelcula
situada aproximadamente a 5 mm de la superficie (ver Fig.2). Esta es una formacin
que caracteriza a Azospirillum, dado que las bacterias de este gnero tienden a
desarrollarse en un lugar donde la cantidad de oxgeno que difunde desde la superficie
exterior del medio es suficiente para las necesidades de las clulas pero no causa
inhibicin de la fijacin del nitrgeno (Dobereiner, 1995).

Fig. 1. En las cajas Petri se pueden observar dos tipos de colonias obtenidas a partir de las
muestras de suelo. Se observan colonias blanquecinas (izquierda) y colonias que causan
variaciones en el color del medio (derecha).

Fig. 2.
Formacin en velo
caracterstica de Azospirillum obtenida
por inoculacin de suspensiones de
suelo a medio semi-solido NFb. En la
foto de la derecha se puede observar
tambin la formacin de grumos

En algunos casos se observ adicionalmente la presencia de formaciones en grumos.

Al transferir los microorganismos presentes en los velos hacia medio slido, se
observ el crecimiento de colonias blanquecinas (ver Fig.3. izquierda). Al realizar la
prueba confirmatoria, colocando nuevamente colonias de medio slido a medio
semislido, se volvi a observar la formacin de velos.
Finalmente la transferencia hacia medio papa permiti un desarrollo acrecentado de las
bacterias que fueron finalmente conservadas en medio semi-slido en tubos
eppendorfs. Al inocular los microorganismos a medios slidos, la mayora de las
colonias mostraron un aspecto lechoso y mucilaginoso (ver Fig.3). Segn Motsara y
Roy (2008), este es el aspecto que se espera para las colonias de Azospirillum sp., sin
embargo se debern realizar observaciones microscpicas y nuevas pruebas
confirmadoras para la asignacin de este gnero. Aquellas colonias con aspecto
demasiado diferentes a las esperadas y que aparentemente eran contaminantes fueron
descartadas.
En los medios lquidos selectivos para cianobacterias, la formacin de pelculas
transparentes en las paredes y el fondo de los tubos de ensayo pudo observarse con
claridad al cabo de cuatro semanas. Este tiempo de incubacin y la observacin de las
pelculas coincide con lo descrito por Oran (1995). El traspaso hacia nuevos medios de
cultivos especficos y la observacin microscpica permitir confirmar la presencia de
cianobacterias.

Fig. 3. Desarrollo de los microorganismos provenientes de la formacin en

velo en medio slido NFb adicionado de extracto de levadura (izquierda) y
desarrollo de los microorganismos en medio papa-dextrosa agar (derecha)

CONCLUSIONES
La inoculacin de suspensiones de muestras de suelos a diferentes medios de cultivo
desprovistos de nitrgeno permiti el aislamiento de microorganismos diazotrficos.
Mediante la utilizacin del medio de cultivo recomendado para el aislado de
Azotobacter sp. y Azomonas sp., se observaron cuatro tipos de colonias, el aspecto de
dos de ellas coincide con el aspecto esperado para Azotobacter. Se aislaron asimismo
cepas que aparentemente corresponden a Azospirillum y a cianobacterias. Las cepas
sern sometidas a observacin bajo microscopio y pruebas adicionales para
determinar el gnero al que pertenecen. Se realizarn posteriormente pruebas de
laboratorio que permitan establecer su efecto sobre el crecimiento de plantas de
quinua. Aquellas cepas que muestren mayor potencial de fertilizacin para el cultivo de
quinua sern identificadas con mayor precisin mediante mtodos moleculares.

AGRADECIMIENTOS
El presente proyecto se lleva a cabo gracias a un financiamiento del Programa de
Investigacin Estratgica de Bolivia (PIEB) correspondiente a la convocatoria
Propuestas para la produccin Sostenible de Quinua en los Departamentos de Oruro y
Potos. Las autoras agradecen a las autoridades de la Carrera de Biologa y de la
Facultad de Ciencias Puras y Naturales de la UMSA por el apoyo para la realizacin
del proyecto.
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