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CROMATOGRAFIA
DE
PERMEAO EM GEL
Ricardo Cunha Michel
LAFIQ
sala J-210
3938-7228
rmichel@ima.ufrj.br
IMA CT / UFRJ
Ricardo C. Michel
v. 2015
ou
CROMATOGRAFIA DE
EXCLUSO POR TAMANHO
O experimento de GPC / SEC
O princpio da tcnica
Determinao relativa de Massa Molar
Preciso e Exatido da tcnica
O problema da relao entre massa molar e volume hidrodinmico
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Ricardo C. Michel
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Cromatografia
Separar Reduzir a entropia
Mtodos cromatogrficos, de uma forma geral,
- permitem a separao, quantificao e identificao de espcies qumicas;
- separam os componentes de uma mistura pela distribuio destes
componentes em duas fases que se encontram em contato, uma fase mvel e
outra fase estacionria;
- durante a passagem da fase mvel pela estacionria, os componentes da
mistura so seletivamente retidos pela fase estacionria, o que resulta em
migraes diferenciais destes componentes.
- a reteno seletiva pode operar por mecanismos entrpicos ou entlpicos.
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Cromatografia
Permeao em Gel ou Excluso por Tamanho
A Cromatografia de Permeao em Gel
uma tcnica na qual existe um suporte fixo,
um gel,
que NO a fase estacionria, mas que a contm.
Alm disto,
espera-se que no haja interaes
entre os componentes da amostra a separar e o suporte fixo,
de modo que todo o processo cromatogrfico
deve se dar apenas
devido ao tamanho dos componentes da mistura.
Este aspecto desta tcnica cromatogrfica justifica
seu outro nome:
Cromatografia de Excluso por Tamanho
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v. 2015
IMA CT / UFRJ
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Esta imagem pode ter Direitos Autorais
'loop'
detector
coluna
bomba isocrtica
ou de gradiente
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Estas imagens podem ter Direitos Autorais
injetor
descarte
ou reuso
'loop'
detector
coluna
bomba isocrtica
ou de gradiente
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injetor
descarte
ou reuso
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Estas imagens podem ter Direitos Autorais
Concentrao (g/mL)
Mx =
Ci Mi
Ci M i
n1
n=2 : Mz
n=3 : Mz+1
PD = Mw/Mn
Massa Molar (g/mol)
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n=1 : Mw
tempo (minutos)
ou
volume (mL)
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tempo (minutos)
ou
volume (mL)
n=0 : Mn
Concentrao (g/mL)
Mx =
tempo (minutos)
ou
volume (mL)
Ci M i
i
C i M i n1
i
n=1 : Mw
n=2 : Mz
n=3 : Mz+1
PD = Mw/Mn
Massa Molar (g/mol)
Curva de Calibrao
Injeo de padres
M1, V1
M2, V2
volume de eluio em ml
volume de eluio em ml
M3, V3
volume de eluio em ml
M4, V4
volume de eluio em ml
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Curva de Calibrao
Bsica: volume de eluio versus massa
M1, V1
log M i =ab.V e
volume de eluio em ml
log (Mw)
M2, V2
volume de eluio em ml
M3, V3
volume de eluio em ml
M4, V4
volume de eluio em ml
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volume de eluio em ml
M i =10
ab.V e
Curva de Calibrao
Tempo de Eluio versus Volume de Eluio
Se medimos, de fato,
o TEMPO de eluio,
por qu fazemos as contas usando
o VOLUME de eluio?
Porque a curva passa a ser
independente da vazo empregada!
Vei vazo. t ei
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Concentrao (g/mL)
O que falta?
Falta obter Ci
OK!
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Sensores de Concentrao
Matriz de Foto-diodos
alquota proveniente da coluna
Clula de fluxo
Grade de difrao
Fonte de UV
O sinal em cada foto-diodo funo
da absoro da amostra na faixa de
Matriz de Foto-diodos
comprimentos de onda detectados
por este foto-diodo especfico.
PC
ADC
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Sensores de Concentrao
Refratmetro Diferencial
A deflexo do feixe de luz
funo da diferena entre
o ndice de refrao da amostra
e o ndice de refrao do
solvente empregado.
Detectores
alquota
proveniente
da coluna
Fonte de luz
de comprimento de onda conhecido
(branca, em alguns modelos)
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Concentrao necessria
ou um valor proporcional a concentrao
Estes sensores de concentrao geram um sinal eltrico, em Volts,
cujo valor proporcional concentrao da alquota:
Sinal (V) C ou seja:
C = k.Sinal (V)
C i = .si
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n
C
M
i i
Ci M
n 1
i
n
n
.
s
M
.
s
M
i i i i
Mx
n 1
n 1
.
s
M
.
s
M
i i
i i
n
s
M
i i
n 1
s
M
i i
Medida em SEC
Resumo
1) As colunas separam a amostra de acordo com os volumes
hidrodinmicos das molculas presentes;
2) A amostra separada passa pelo detector de concentrao, o qual gera um
sinal de tenso proporcional a concentrao da amostra;
3) Da curva obtida de
sinal proporcional concentrao versus volume de eluio
converte-se os valores de volume de eluio em valores de Massa Molar,
utilizando a curva de calibrao previamente obtida;
4) Com a nova curva de
sinal proporcional concentrao versus massa molar
so calculados os valores de
Massa Molar Mdia Numrica,
Massa Molar Mdia Ponderal e
dispersidade
de acordo com as equaes mostradas.
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Tipicamente,
utiliza-se uma
reta para fazer
este ajuste.
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Concentrao (g/mL)
Mx =
C i M in
i
C i M i n1
i
n=1 : Mw
n=2 : Mz
n=3 : Mz+1
PD = Mw/Mn
n=0 : Mn
Clculo Automatizado
Exemplo em BASIC - primeira parte
INI:
DEFDBL A-Z
CLS
rem A curva de calibracao
INPUT "Entre com a inclinacao (b) ";R8
PRINT
INPUT "Entre com a intersecao (a) ";R9
PRINT
INPUT "Entre com intervalo de volume ";nit
rem nit eh constante para simplificar o trabalho do usuario - os valores de volume de eluicao nao precisariam ser
igualmente espacados
PRINT
PRINT
VE:
rem os valores da rotina estatistica sao calculados durante a leitura dos dados a partir do teclado
Q=0:R3=0#:R5=0#:R6=0#:R7=0#:N=0
PRINT"Press. <ENTER>":LINE INPUT S$:CLS
INPUT "Entre com o volume de eluicao Ve para o primeiro valor de intensidade Hi <-1 p/ novas incl e interc> ", R7
IF R7=-1 then GOTO INI
PRINT : PRINT
PRINT "Entre com os valores de Hi, seguidos de <RETURN>.<-1 indica fim dos dados>"
rem os valores de hi ja tiveram a linha de base subtraida
PRINT
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Clculo Automatizado
Exemplo em BASIC - segunda parte
entr:
N = N + 1: INPUT X: PRINT "
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Preciso e Exatido
na tcnica de GPC
..
preciso:
(repetitividade)
melhor do que 5%
exatido ou acurcia:
(concordncia com o valor verdadeiro)
em torno de 10%
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Esta imagem pode ter Direitos Autorais
O problema da calibrao
Relao entre massa molar e volume hidrodinmico
M1, V1
volume de eluio em ml
M2, V2
ln (Mw)
volume de eluio em ml
M3, V3
volume de eluio em ml
M4, V4
volume de eluio em ml
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volume de eluio em ml
MASSA MOLAR
E
VOLUME HIDRODINMICO
Massa Molar versus Volume Hidrodinmico
Fatores que afetam o Volume Hidrodinmico
Conformao e Configurao
(Rigidez, Ramificaes etc.)
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cadeia mais
fechada,
menor Vh
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Curvas de Calibrao
Calibrao com Padres de Distribuio Estreita de Massa Molar
Calibrao com Amostras de Distribuio Larga de Massa Molar
Calibrao Universal
Quando cada tipo de calibrao mais eficaz
Tcnicas Absolutas em GPC
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M2, V2
volume de eluio em ml
volume de eluio em ml
M3, V3
volume de eluio em ml
M4, V4
volume de eluio em ml
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Curva de Calibrao
Bsica: volume de eluio versus massa
M1, V1
log M i =ab.V e
volume de eluio em ml
log (Mw)
M2, V2
volume de eluio em ml
M3, V3
volume de eluio em ml
M4, V4
volume de eluio em ml
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volume de eluio em ml
M i =10
ab.V e
Curva de Calibrao
Relao entre Massa Molar e Volume de Eluio
Ajuste Polinomial
log (Mi)
linear
log M i =ab.V e
Curva de Calibrao
Limites de Excluso
Ve V0 KVP
Ve = volume de eluio
V0 = volume intersticial
Vp = volume dos poros
K = coeficiente de
distribuio do soluto
O pico em (A) indica algum
tipo de repulso entre as
molculas do polmero
(excluso inica).
V0
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Esta imagem pode ter Direitos Autorais
VP
V0+VP
-O pico em (C)
indica adsoro
do polmero
pelo material
da coluna.
-O modo como
este polmero
elui poderia ser
representado
pela curva
indicada em
(B) (interaes
hidrofbicas ou
hidroflicas).
Curva de Calibrao
Alguns Exemplos
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Estas imagens podem ter Direitos Autorais
Curva de Calibrao
Ateno aos limites da curva! No extrapolar!
Sempre observar com ateno os picos em torno
de Vo e de Vo+Vp !
Uma amostra com molculas que ultrapassem os
limites de eluio da coluna poder se apresentar
da seguinte forma:
Parece bimodal, no?
Mas no ! Vejam:
Curva de Calibrao
Padres Comuns
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Calibrao Universal
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Calibrao Universal
em duas formas diferentes
Existem duas formas de realizar a Calibrao Universal:
A primeira delas a calibrao universal clssica, para a qual se utiliza um
viscosmetro em linha com o sistema de GPC. Em um mesmo volume de
eluio, as amostras problema e padro apresentaro um mesmo volume
hidrodinmico e, portanto, um mesmo valor para o produto [].M. Uma vez
dispondo deste produto para o padro, basta medir a [] da amostra problema
em cada alquota e calcular seu valor de M.
Caso o equipamento no disponha de um viscosmetro em linha, pode
ser usada a segunda forma de construo da calibrao universal. Esta
forma combina os princpios da calibrao universal com a equao de
Mark-Houwink-Sakurada. Neste caso, obtm-se M da amostra-problema em
relao a uma curva construda com padres de distribuio estreita. Este
valor de M , ento, corrigido, usando-se para tal os valores de K e de a da
amostra problema e do padro.
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Calibrao Universal
Para sistemas com viscosmetro em linha
- Polmeros com o mesmo volume hidrodinmico (VH) eluiro no mesmo volume de
eluio;
- A interao do polmero com o solvente ir se refletir no valor de viscosidade
intrnseca, [];
- Segundo Einstein
VH . M V
Assim,
[]1.M1 = []2.M2
Calibrao Universal
log([].M)
volume de eluio
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Calibrao Universal
Para sistemas sem viscosmetro em linha
Do princpio de calibrao universal:
[ 1 ]. M 1=[ 2 ]. M 2
[ ]=K.M a
1a1
K1 . M 1
1a 2
=K 2 . M 2
1
2 1 a1
K
M 1i =
K1
.M
1 a 2
1 a 1
2i
log([].M)
volume de eluio
log([])
Mark-Houwink
log k
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a
log (M)
a a inclinao e
log(K) a interseo
da curva mostrada
Osmometria
de Membrana
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Mi
RTci
i
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As Colunas
Recheios
Definio de termos
Escolha das colunas
Eficincia, seletividade e resoluo
Contribuies para o alargamento dos picos
Condies timas de anlise
Contaminao, entupimento, controle de presso
Proteo das colunas
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Colunas de GPC
Recheios
Caractersticas desejadas:
Inrcia qumica, estabilidade nas condies desejadas de pH e temperatura,
reduzida interao com a amostra etc.
Recheios comuns de colunas para gua:
Gis de dextrana (ex.: Sephadex da Pharmacia)
Gis de poliacrilamida (ex.: Bio-Gel da Bio-Rad)
Glicose-Divinilbenzeno
Gis de gar, agarose, Sepharose etc. (para GPC em baixa presso)
Recheios comuns de colunas para solventes orgnicos:
Divinilbenzeno
Divinilbenzeno sulfonado
Poliestireno-Divinil benzeno
Poli(meta acrilato de metila)
Os recheios podem ser melhor escolhidos se for conhecida a aplicao
especfica que se deseja para o equipamento.
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Curva de Calibrao
Alguns Exemplos
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Esta imagem pode ter Direitos Autorais
Seletividade
O que ?
Seletividade a habilidade de separar os picos entre si.
Em GPC uma boa seletividade significa que a coluna capaz de levar a uma
grande mudana no volume de eluio para pequenas mudanas no raio
hidrodinmico das amostras.
baixa seletividade
grande seletividade
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Seletividade
Como medir?
A seletividade pode ser medida pela separao relativa entre os picos de
interesse:
t R1 t 0
t R 2 t0
Eficincia
O que ?
Eficincia est relacionada com a faixa de valores de volume de eluio que
correspondem a um mesmo valor de volume hidrodinmico, isto , eficincia
est relacionada ao alargamento dos picos.
Grande eficincia significa que os picos so estreitos.
Uma medida de eficincia o nmero de pratos tericos de uma dada coluna,
que relaciona a largura do pico com o tempo que a amostra ficou retida na
coluna.
alta
eficincia
baixa
eficincia
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Verificando a Eficincia
Nmero de Pratos Tericos
2
t R1
N =5,54 .
w 1 /2
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Eficincia de Separao
Alargamento de Bandas Fora da Coluna
Todos os tubos, clulas de fluxo e conectores pelos quais as fraes eludas
passaro contribuem para o alargamento das bandas!
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eficincia
boa
eficincia
ruim
OK!
OK!
OK!
NO!
seletividade
boa
seletividade
ruim
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Alargamento da Curva
Difuso
Difuso ao longo do
comprimento da
coluna.
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Alargamento da Curva
em funo da Vazo
Transferncia de massa
para dentro e para fora
dos poros do recheio.
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Alargamento da Curva
Os Efeitos Principais
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Alargamento da Curva
Efeitos Combinados - Condies timas de anlise
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Alargamento da Curva
Efeitos Combinados - em funo do tamanho molecular
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importante notar que algumas das figuras ou tabelas utilizadas neste material podem ter
restries para uso no acadmico, por questes de copyright, de deciso de seus proprietrios,
sendo usadas aqui de acordo com as condies de "fair use".
O material, figuras e tabelas de minha autoria podem ser usados para finalidades didticas,
usando a seguinte forma de citao:
Ricardo Cunha Michel; Mtodos Fsicos Aplicados a Polmeros (MMP-712); Anotaes de
aula; Instituto de Macromolculas Professora Eloisa Mano, IMA/UFRJ, Rio de Janeiro, 2015.
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FIM
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