I.

DISEO METODOLGICO
Para la ejecucin de este estudio se necesito seguir una metodologa la cual se detalla a
continuacin.
o PROCESAMIENTO DEL MATERIAL VEGETAL.
Se separaron las hojas, flores y tallos de la planta, luego se lavaron con agua corriente
para despus poner a secar al ambiente por 24 horas y luego a la estufa a 105C igual
por 24 horas.
Se molieron las partes botnicas secas, ya mencionadas, hasta obtener partculas lo ms
pequeas posible tratando de obtener casi polvo de las mismas.
o PREPARACIN DE EXTRACTOS ORGNICOS
Solvente.- se pueden utilizar diversos solventes de tipo orgnico, pero en esta
investigacin se uso metanol como el solvente ms polar, y hexano como el menos
polar.
Mtodo de extraccin.- los metabolitos secundarios pueden ser extrados aplicando
diversos mtodos, dependiendo del solvente, en este caso se utilizaron el mtodo de
maceracin pues se extrajeron con solventes orgnicos.
Proporcin.- material vegetal: solvente 1:10
Tiempo de extraccin.- 24 horas. Para mayor eficiencia se renov el solvente cada 24
horas, hasta observar agotamiento total.
o TAMIZAJE FITOQUMICO (MARCANO y HASEGAWA, 2002) (MIRANDA,
2002)
Se realiz la deteccin de las familias de metabolitos secundarios presentes en Lippia
citriodora (cedrn), segn la siguiente metodologa:

Ensayo para identificacin de alcaloides

Prueba de Dragendorff
Utilizado para detectar la presencia de alcaloides se tom en cuenta si el extracto estaba
disuelto en solvente orgnico, este se

evaporo en bao de agua y su residuo se

redisolvio en 1 mL de cido clorhdrico al 1 % en agua. Para el ensayo a la solucin

acuosa cida se adicion 3 gotas del reactivo de Dragendorff y se observ:
-

Opalescencia: (+)
Turbidez definida: (++)
Precipitado: (+++)

Prueba de Wagner
Se parti de la solucin cida de igual forma que en los casos anteriores. A esta
solucin se le adiciona 2 3 gotas del reactivo de Wagner y se reporta los resultados de
igual forma que la reaccin anterior.
Prueba de Mayer
Se parte de la solucin cida de igual forma que en los casos anteriores. A esta solucin
se le adiciona 2 o 3 gotas del reactivo de Mayer y se reporta los resultados de igual
forma que en la reaccin anterior.

Ensayo de identificacin de glicsidos cianognicos y cardiotnicos

Para detectar glicsidos cianogenicos, al material fresco macerado se le aadirn unas

gotas de cloroformo y se calentara entre 50 y 70 C en un tubo de ensayo cerrado, los
vapores sern puestos en contacto con un papel filtro impregnado en una solucin al 1%
de cido pcrico en carbonato de sodio al 10%. Los compuestos cianognicos se pueden
identificar por la aparicin de una mancha roja sobre el papel.
Prueba de Kedde
Los glicsidos cardiotnicos por la reaccin con una mezcla 1:1 recin preparada, de
cido 3,5-dinitrobenzoico (2%) y KOH (0,5 mol * L 1). La presencia de glicsidos
cardiotnicos ser detectada por la aparicin de un color rojo violeta.

Ensayo para identificacin de triterpenos y/o esteroides

Prueba de Lieberman-Buchard
Permite reconocer en un extracto la presencia de triterpenos y/o esteroides en ambos
tipos de productos debe poseer un ncleo del androstano, generalmente insaturado en el
anillo B y la posicin 5-6. Para ello si la alcuota no se encuentra en cloroformo debe
evaporarse el solvente en bao de agua y el residuo redisolverse en 1 mL de cloroformo.
Se adiciona 1mL de anhdrido actico y se mezcla bien. Por la pared del tubo de ensayo
se dejan resbalar 2-3 gotas de cido sulfrico concentrado sin agitar. Un ensayo positivo
se tiene por un cambio rpido de coloracin:
-

Rosado-azul muy rpido

Verde intenso-visible aunque rpido
Verde oscuro-negro-final de la reaccin.

El tercer cambio generalmente ocurre cuando el material evaluado tiene cantidades

importantes de estos compuestos. Para realizar este ensayo no puede haber agua en el
medio de reaccin pues sta con el cido sulfrico reacciona de forma violenta y puede
ocurrir un accidente.
La reaccin de Liebermann-Buchard es tambin utilizada para diferenciar las estructuras
esteroidales de los triterpenoides, las primeras producen coloraciones azul o azul
verdoso, mientras que para las segundas se observa rojo rosado o prpura. Estas
coloraciones pueden variar por interferencias producidas por carotenos, xantofilas, y
esteroides saturados que puedan estar presentes.

Ensayo para identificacin de flavonoides

Ensayo de Shinoda
A un ml del extracto, se le agregara 0,5 g de virutas de Mg y, HCl concentrado gota a
gota, hasta que termine el desprendimiento de hidrogeno y durante 10 minutos se
observara los cambios de color en la solucin. La aparicin de una coloracin amarilla a
roja es indicativo de flavonas y flavonoles; rojo a magenta de flavanonoles; rojo
magenta, violeta y azul de flavanonas.

Ensayo para identificacin de quinonas

Prueba de Borntrager
Es til para detectar la presencia de quinonas. Si la alcuota no est en cloroformo debe
evaporarse el solvente en bao de agua y el residuo redisolverse en 1mL de cloroformo.
Se adiciona 1 mL de hidrxido de sodio, hidrxido de potasio o amonio al 5% en agua.
Se agita mezclando las fases y se deja en reposo hasta su ulterior separacin.
El ensayo es positivo cuando la fase acuosa alcalina (superior) se colorea de rosado, en
este caso se reporta (++) o rojo para lo cual se reporta (+++).

Ensayo para identificacin de compuestos lactnicos (cumarinas)

Prueba de Baljet
Es til para reconocer la presencia de compuestos con agrupamiento lactnico en
particular cumarinas, aunque otros compuestos lactnicos pueden dar resultado positivo.
Si la alcuota de la muestra a probar no est en alcohol debe evaporarse el solvente en
bao de agua y redisolverse en 1 mL de alcohol. Seguidamente se aade 1 mL de
reactivo. La prueba es positiva cuando aparece una coloracin o precipitado de color
rojo.

Ensayo para identificacin de compuestos grasos

Prueba de Sudan III

Permite conocer en un extracto la presencia de compuestos grasos para ello, cuando un
extracto etreo se evapora a sequedad en presencia de una solucin de Sudn III al 0,6%
en glicerina-agua (1:1) La aparicin de gotas oleosas de color rojo-oscuro, indica la
presencia de lpidos y/o aceites esenciales.

Ensayo para identificacin de catequinas.

Prueba de catequinas
Para ello, tomar de la solucin alcohlica obtenida, una gota con la ayuda de un capilar
y aplique la solucin sobre papel filtro. Sobre la mancha aplique solucin de carbonato
de sodio. La aparicin de una mancha verde carmelita a la luz UV indica positiva la
prueba.

Ensayo para identificacin de resinas

Prueba de resinas
Para detectar este tipo de compuesto adicione a 2 mL de la solucin alcohlica, 10 mL
de agua destilada. La aparicin de un precipitado indica un ensayo positivo.

Ensayo para identificacin de saponinas

Prueba de espuma
Permite reconocer en un extracto la presencia de saponinas, tanto del tipo esteroidal
como triterpnica. De modo que si la alcuota se encuentra en alcohol, se diluye con 5
veces su volumen en agua y se agita la mezcla fuertemente durante 5-10 minutos.
El ensayo se considera positivo si aparece espuma en la superficie del lquido de ms de
2 mm de altura y persistente por ms de 2 minutos.

Ensayo para identificacin de fenilpropanoides

Prueba del reactivo de Arnow

Una pequea cantidad del extracto crudo se disolver en etanol y se aadir 1 ml de la
solucin del extracto etanlico en tres tubos de ensayo. El primero servir como patrn
de comparacin, al segundo se le aadirn 2 ml de HCl 0.5 mol * L -1, 2 ml de la
solucin acuosa de nitrito de sodio al 10 % (reactivo de Arnow) y 2 ml de la solucin
acuosa de NaOH 2 mol * L-1, y, en el tercer tubo, se adicionaran todos los reactivos sin
la muestra que tambin servir como testigo. El reactivo de Arnow, en presencia de
fenilpropanoides, presentara una coloracin naranja y despus de la adicin de NaOH se
cambiar a rosado prpura.

Ensayo para identificacin de compuestos fenlicos y/o taninos

Prueba de cloruro de Fe (III)

Permite reconocer la presencia de compuestos fenlicos y/o taninos en un extracto
vegetal. Si el extracto de la planta se realiza con alcohol, el ensayo determina tanto
fenoles como taninos. A una alcuota del extracto alcohlico se aade 3 gotas de una
solucin de cloruro de Fe (III) al 5% en solucin salina fisiolgica (cloruro de sodio al

0.9% en agua). Si el extracto es acuoso el ensayo determina fundamentalmente taninos.

A una alcuota de extracto se aade acetato de sodio para neutralizar y tres gotas de una
solucin de cloruro de Fe (III) al 5% en solucin salina fisiolgica, un ensayo positivo
puede dar la siguiente informacin general:
-

Desarrollo de una coloracin rojo-vino, compuestos fenlicos en general.

Desarrollo de una coloracin verde-intensa, taninos del tipo pirocateclicos.

Desarrollo de una coloracin azul, taninos del tipo pirogalnicos.

Ensayo para identificacin de muclagos

Permite reconocer en los extractos de vegetales la presencia de esta estructura tipo

polisacrido, que forma un coloide hidrfilo de alto ndice de masa que aumenta la
densidad del agua donde se extrae. Para ello una alcuota del extracto en agua se enfra a
0-5C, si la solucin toma una consistencia gelatinosa el ensayo es positivo.

o PARAMETROS FISICO-QUIMICOS (MIRANDA, 2002)

Determinacin del contenido de humedad

De la muestra pulverizada se pesan 2 g con deviacin permisible de 0.5 mg y se

transfieren a una capsula de porcelana tarada y desecada a 105C hasta masa constante;
seguidamente se deseca a 105C durante 3 horas. La capsula se coloca en la desecadora
donde se deja enfriar a temperatura ambiente y se pesa, colocndose nuevamente en la
estufa durante 1 h, volvindose a pesar, hasta obtener una masa constate. Para los
clculos se utiliza la siguiente formula:

Hg=

M 2 M 1
100
M 2M

Donde:
Hg: prdida en peso por desecacin (%).
M: masa de capsula vaca (g)
M1: masa de la cpsula con la muestra de ensayo desecada (g)

M2: masa de la capsula con la muestra de ensayo (g)

100: factor matemtico para los clculos

Determinacin de sustancias solubles

De la muestra de ensayo previamente pulverizada y tamizada se pesa 5g y se transfiere a

un frasco cnico con tapa con capacidad de 250mL. Se le aade 100mL.de agua y se
agita constantemente durante 6 horas. Dejar en reposo 24 horas, luego se agitan 30
minutos y se filtra por papel. Se toma una alcuota de 20mL., se transfiere a una cpsula
de porcelana previamente tarada, evaporar sobre bao de agua, se deseca en estufa a
105C, durante 3 horas, se enfra en un desecador y se pesa. El ensayo se realiza por
triplicado. Para los clculos se utiliza la siguiente formula:

%Ss=

R500100
100
M(100H )

Donde:
%Ss: sustancias solubles en base hidratada (%).
H: humedad
R: residuo de la muestra (%)
M: masa de la muestra de ensayo (g)
100: factor matemtico para los clculos
500: factor matemtico para los clculos

Determinacin de cenizas totales

Se emplea el mtodo gravimtrico, que consiste en pesar 2 g +/- 0,5 mg de la droga

vegetal pulverizada y tamizada en un crisol de porcelana previamente tarado con una
balanza analtica. Calentar suavemente la muestra con un mechero aumentando la
temperatura hasta carbonizar y posteriormente e incinerarla en un horno mufla a una
temperatura de 700 C, durante 2 horas. Posteriormente se enfra el crisol en una

desecadora y se pesa, repitindose el proceso alcanzar una masa constante, para ello, se
necesita intervalo de 30 minutos entre calentamiento y pesada. Al final el residuo es de
color blanco o casi blanco. Para los clculos se utiliza la siguiente formula:
C=

M 2M
100
M 1M

Donde:
C: porcentaje de cenizas totales en base hidratada.
M: masa del crisol vaco (g)
M1: masa del crisol con la porcin de ensayo (g)
M2: masa del crisol con la ceniza (g)
100: factor matemtico para los clculos
o ACTIVIDAD BIOLGICA (MARCANO y HASEGAWA, 2002)

Actividad antibacteriana

Se determinar la actividad antibacteriana para lo cual se emplear la tcnica de difusin

en agar, llamada antibiograma, la cual radica en empapar discos estriles de papel de filtro
Whatman N 3 de 5 10 mm de dimetro con 10 o 25 l de una solucin (preparada con
40 mg del extracto a probar en 1 ml de un solvente adecuado) y colocarlos en una placa de
agar Mller-Hinton, previamente inoculada con una suspensin bacteriana de
concentracin conocida (108 clulas/ml). Posteriormente, se preincubarn a 5C por 12
horas, y luego se incubarn a 37C por 24 h. La accin antibacteriana se medir tomando el
dimetro (mm) del crecimiento bacteriano alrededor del disco.

Actividad antifngica

Se determinar la actividad antifngica para lo cual se emplear la tcnica de difusin en

agar, llamada antibiograma, la cual radica en empapar discos estriles de papel de filtro
Whatman N 3 de 5 10 mm de dimetro con 10 o 25 l de una solucin (preparada con

40 mg del extracto a probar en 1 ml de un solvente adecuado) y colocarlos en una placa de

agar PDA, previamente inoculada con una solucin esporangial de concentracin conocida
(108 clulas/ml). Posteriormente, se incubaran a temperatura ambiente por 48 horas. La
accin antifngica se medir tomando el dimetro (mm) del crecimiento fngico alrededor
del disco.

Actividad txica o letal

Se determinar la actividad letal del extracto crudo de las hojas, flores y tallos de las
planta de estudio, contra larvas del crustceo A. salina, ser evaluada mediante la
ejecucin de un bioensayo en el cual ser preparada una solucin de 10 000 g/ml del
extracto, en una mezcla H2O/DMSO segn la solubilidad del extracto y, a partir de sta,
se prepararn soluciones de 1 000; 100; 10 y 1 g/ml mediante diluciones sucesivas
con agua de mar filtrada, en viales que contendrn entre 10 y 15 nauplios de A. salina,
eclosionados con 24 horas de anticipacin. Por cada concentracin, se realizarn tres
rplicas y un control con igual nmero de rplicas. La cuantificacin de la mortalidad de
los nauplios se llevar a cabo pasadas las 24 horas y analizadas usando diversos
mtodos estadsticos diseados para determinar la concentracin letal media (CL 50)
(MEYER et al., 1982).