Libro Microscopia Electrónica

INTRODUCCIN A LA
MICROSCOPIA ELECTRNICA
PRINCIPIOS - APLICACIONES
TERCERA EDICIN
Yasuji J. Amano PhD
Linda Daz Cevallos MD, Msc
INTRODUCCIN A LA
PRINCIPIOS - APLICACIONES
Tercera Edicin
Yasuji J. Amano, Ph.D
Asesor Cientfico INSPI
Linda Daz Cevallos, MD, MSc

Lder del Laboratorio de Microscopia Electrnica
Plataforma Cientfica Compartida MEC
INSTITUTO NACIONAL DE INVESTIGACIN

EN SALUD PBLICA INSPI
2015
R E F A C I O
Tengo el honor de destacar como autores de esta obra al Dr. Yasuji Amano,
cientfico japons, en la edicin del presente trabajo de investigacin en
Microscopia Electrnica; el mismo que recopila sus innumerables trabajos
de investigacin durante varias dcadas y nos proporciona aportes cientficos
de enorme valor a travs de sus acciones en las diferentes reas del Instituto
Nacional de Investigacin en Salud Pblica INSPI.
Cabe destacar, que el Dr. Amano es uno de los pioneros en el Ecuador del
desarrollo e implementacin en el campo de la Microscopia Electrnica, y
siguiendo los pasos de la tecnologa moderna, ha permitido diagnosticar una
enfermedad infecciosa en personas, plantas o animales y una cantidad de
espcimen no visible en el transcurso de su trayectoria investigativa.
Con sus constantes enseanzas, durante 17 aos ha capacitado en Microscopa
Electrnica a la Dra. Linda Daz. Cabe destacar que siendo su pupila ha
formado parte de las dos ediciones anteriores y actual, en este arduo trabajo,
relacionado con esta especialidad, al que exalto mis congratulaciones, en
beneficio de la investigacin aplicada junto a este gran maestro.
Esta publicacin servir como referencia para todos y cada uno de los
interesados para continuar en un futuro prximo con los principios y
aplicaciones emitidos en esta edicin; por lo cual me siento profundamente
orgulloso en destacar esta obra de tan distinguidos profesionales.
Ing. Santiago Apunte Castillo

DIRECTOR EJECUTIVO DEL INSPI
P REFA CIO D E L OS AUTOR E S

La primera edicin de Introduccin a la Microscopia Electrnica fue
publicada en el 2004. La segunda edicin fue publicada en el 2012, los libros
casi se han agotado.
Adicionamos, nuevas tecnologas relacionadas a la microscopia, tales como
el Microscopio Confocal de Lser de Scanning y el Microscopio de efecto
Tnel, que hicieron grandes avances en la ltima dcada. Estos microscopios
desarrollados exhiben un alto poder de resolucin.
En este documento se ha incluido una introduccin a los nuevos tipos de
microscopios. En adicin se adjunta Breve historia del microscopio para
ayudar a quienes se interesen en la herencia humana. Afortunadamente,
tambin fue posible agregar nuevos ejemplos de aplicacin tales
como: fotografas del virus de Influenza aislado en Ecuador, as
como Microsporidia, Parapoxvirus, Primer reporte en Ecuador del
Angioestrongylus Cantonensis a nivel de espcula copulatrz
por microscopia electrnica, Cenizas de Volcn, etc.
Siguiendo el desarrollo de la tecnologa moderna, fue posible diagnosticar
una enfermedad infecciosa, en plantas o animales, inclusive con una cantidad
no visible de espcimen. Sin embargo, VER ES CREER sigue siendo
nuestro sentimiento.
Finalmente, deseamos expresarles nuestra profunda gratitud al Ing.
Santiago Apunte Castilllo, Director Ejecutivo del Instituto Nacional de
Investigacin en Salud Pblica, al Blgo. Gabriel Morey, responsable de
Plataformas Cientficas Compartidas del INSPI, por darnos su respaldo para
publicar este documento.
Tambin queremos agradecer a quienes nos proporcionaron especmenes
para nuestro estudio y colaboradores del laboratorio.
Julio 2015
Yasuji J. Amano
Linda Daz Cevallos
D R. YA S U J I A MA N O KONN O , PH. D.
Graduado en Miyagi Teachers College en el ao 1945. Culmin
exitosamente un PhD. en Microbiologa en la Universidad Tohoku
University School of Medicine en Japn en el ao 1960. Maestro
destacado en la Escuela de Medicina de Japn en la Universidad
de Tohoku. Investigador Asociado de la Universidad de Michigan,
Estados Unidos.
Miembro de las Sociedades Japonesas de Microbiologa Electrnica
y Bacteriologa. Presidente Honorario de la Sociedad de Microscopia
Electrnica del Ecuador. Form parte del Proyecto Hydeyo Noguchi
en el Instituto Nacional de Higiene y Medicina Tropical Leopoldo
Izquieta Prez en el ao 1977. Fue Asesor Cientfico permanente en
el INHMT LIP.
Como docente ha colaborado conjuntamente con la Dra. Linda Daz
Cevallos impartiendo tcnicas especiales de Microscopia Electrnica
de Transmisin y de Scanning. Colaboracin en Tesis de III y IV Nivel
con la Universidad San Francisco de Quito, Universidad Central del
Ecuador, Pontificia Universidad Catlica del Ecuador, Universidad
de Guayaquil, Escuela de Agronoma de la Universidad Catlica de
Santiago de Guayaquil. Brinda apoyo constante en investigaciones
con Instituciones pblicas como CENAIM-ESPOL sobre el Virus de
la Mancha Blanca, Microspiridia en la Enfermedad Muscular del
camarn y con el INIAP en Virosis en plantas como arroz, maz,
palma de aceite africano, caa de azcar, meln papaya, sandia, etc.
Actualmente contina con aportes de Investigacin Cientfica en el
Instituto Nacional de Investigacin en Salud Pblica.
D RA . LIN DA D A Z CE VAL L OS , MGS

Doctora en Medicina y Ciruga, graduada en el ao 1991, en la Facultad
de Ciencias Mdicas de la Universidad de Guayaquil. Magster en
Salud Pblica, ao 2011. Especialista en Anatoma Patolgica en el
ao 1997, Anatoma Patolgica Homologada en el ao 2008, obtuvo
Diplomado en Gerencia de Salud en el ao 2010, Diplomado de
Epidemiologa en el ao 2011, acreedora del Certificado de Anatoma
Patolgica en JAPN Hospital Universitario de Akita, Japn ao
2006.
Ha sido expositora a nivel internacional y ha participado en
Congresos de Microscopia Electrnica en la Habana Cuba, Saporo
Japn y Ro de Janeiro Brasil. Form parte de las exposiciones en
la Primera Feria Cientfica YACHAY 2015 de Ciencia, Tecnologia e
Innovacin. Profesora de la Ctedra de Anatoma Patolgica en la
UEES y en la Universidad de Guayaquil.
Miembro del Instituto de Planificacin, Investigacin y Educacin
Mdica IPIEM desde el Ao 2004.
Ganadora del Concurso en Microscopia Electrnica INHMT LIP
en el ao 2004 y de Anatoma Patolgica del Hospital Luis Vernaza
en el perodo 1993 1996.
Actualmente responsable de la Plataforma Cientfica de Microscopia
Electrnica y Confocal del Instituto Nacional de Investigacin en
Salud Pblica INSPI.
CONTENIDO
CAPTULO I: PRINCIPIOS DE MICROSCOPIA ELECTRONICA
Definicin de Microscopio
Los Electrones
Rayo de Electrones
Onda de Electrones
Comparacin de Luz y Emisin Electrnica
Lente Convexo
Lente Magntico
Principios del Microscopio Electrnico de Transmisin
Comparacin del Microscopio de Luz y Electrnico
Microscopio Electrnico Antiguo
Actual Microscopio Electrnico de Transmisin
Esquema de Secciones del TEM, JEM-1010
Contraste de la Imagen en TEM
Resolucin de TEM
Microscopio Electrnico de Transmisin JEOL, 1000KV
Caractersticas del TEM
Preparacin del Espcimen
Procedimiento, Preparacin de la Pelcula de Soporte
Mtodo de Sombreado
Mquina de Sombreado
Tcnica de Tincin Negativa
Principios del Corte Fino
Ultra micrtomos
Procedimiento de Corte Cuchilla de Vidrio
Tincin Electrnica
Comentario sobre la Tincin Electrnica
Operacin del TEM
Conservacin de Imagen
Cmara CCD
Conceptos Importantes
Ejemplos de Astigmatismo
Enfoque
Contaminacin del Espcimen
Bombardeo de Electrones
Profundidad de Observacin Focal
2
3
4
6
7
8
12
13
14
15
16
17
18
19
20
21
22
24
26
27
29
31
32
34
35
36
37
38
40
40
40
Ejemplos de Bombardeo de Electrones

Interpretacin de la Micrografa
Ejemplo Moir
Moir encontrado en Rotavirus
Superimposicin de Estructuras
Ejemplo del Par Estereo
Microscopa Electrnica de Barrido (SEM)
Principios del Microscopio Electrnico de Barrido
Cintillador y Fotomultiplicadora
Partes Constituyentes del SEM
Espcimen para SEM
Principio de Secadora de Punto Crtico
Secado Por Congelacin
Recubrimiento con Metal
Equipo Recubridor de Oro
Microscopio Electrnico de Scanning de Bajo Vacio
Diagrama Esquemtico del Sistema de Bajo Vacio, LV SEM
Operacin del SEM
La Resolucin en SEM
Contraste de Imagen
Ejemplos de Tres tipos del Efecto de Borde
Conceptos Importantes
Astigmatismo
Voltaje de Aceleracin
Espcimen Daado por Rayos de Electrones
Contaminacin
Resumen de los Efectos de Voltaje de Aceleracin
41
42
42
43
44
45
46
47
48
49
50
51
52
54
55
56
57
58
60
61
62
65
65
66
68
69
70
CAPTULO 2: APLICACIN EN BIOLOGIA

Ejemplos de aplicacin
1. Reoviridae74
1.Virus del arroz diminuto (rdv)
1.1 Estudio de los reovirus
Tcnica de integracin rotacional
1-2. Rotavirus en diarrea infantil
1-3.Estudio del virus del arroz diminuto
2. Virus del herpes, herpesviridae
3. Coxsakievirus (a16), picornaviridae
4. Influenzavirus, myxoviridae
73
74
75
76
78
80
82
84
86
5. Virus influenza, orthomyxoviridae

6. Paramixovirus, tipo 1,paramixoviridae
Un estudio de virus parainfluenza typo 1
7. Virus de la rabia, rabdoviridae
8. Virus de inmunodeficiencia humana (vih-1)
9. Coronavirus, coronaviridae
10. Parapoxvirus, poxviridae
11. Virus del sindrome de la mancha blanca
12. Virus de multi nuclear polihedros (mnpv)
13. Virus en orqudea
Dip test
Resultado de dip test
14. Virus del mosaico de la caa de azucar scmv
Identificacion del virus
15. Virus estriado del banano
(Banana streak virus bsv)
16. Virus de raya necrosis del arroz
(Rice streak necrosis virus, rsnv)
Inmuno absorbencia por microscopa electrnica (isem)
Virosis en plantas
17. Comentarios sobre la infeccin con poty virus
17-1 Infeccin de poty virus en sanda
17-2 Poty virus en meln
17-3 Palma de aceite africana con poty virus
17 - 4 Arachis hypogeo (familia del man)
17 - 5 Papaya con poty virus signo anillo en cscara
17- 6 Caso del maz con poty virus
18. Rickettsia
19.Bartonella bacilliformis
20 Bacteriofago en b. Bacilliformis
21. Plesiomonas shigelloides
22. Grnulos de metacromatina en plesiomonas shigelloides
23. Neisseria meningitides
24. Estafilococos
25. Estreptococos
26. Genero vibrio
27. Campylobacter jejuni
28. Leptospira interrogans
29. Filamento axial de l. Interrogans
30. Histoplasma capsulatum
88
90
92
94
96
98
102
04
108
112
113
114
116
119
120
122
124
126
127
129
130
131
133
134
136
138
142
144
148
150
152
154
156
158
162
164
166
31 Ceniza de volcan tungurahua

32. Angyostrongylus cantonensis, espcula copulatrz
170
173
CAPTULO 3: BREVE HISTORIA DEL MICROSCOPIO

Breve historia del microscopio
Importantes invenciones del microscopio
Desarrollo del microscopio electronico
El primer microscopio comercial
178
183
186
187
CAPTULO 4: NUEVOS TIPOS DE MICROSCOPIOS

Nuevos tipos de microscopios
Microscopio de scanning de lser
Principio del microscopio
Confocal de laser de escanning
Microscopio de sonda de scanning
Microscopio de efecto tunel (stm)
Principio del microscopio de efectro tunel (stm)
Microscopio de fuerza atomica (afm)
Principio del microscopio de fuerza atomica (afm)
Cromosomas humanos observados por afm
Inventores del stm y afm
189
189
190
193
193
193
195
195
195
197
Captulo 1
PRINCIPIOS DE
Microscopia Electrnica
DE F I N I C I N
El MICROSCOPIO: es un instrumento que se utiliza para magnificar
la imagen de un objeto diminuto.
Si la imagen es formada por luz, se llama microscopia de luz.
Si la imagen es formada por
electrnica.
electrones, se llama microscopia
Existen dos tipos de Microscopios Electrnicos que se usan

comnmente.
El de Transmisin y el de Barrido.
EL MICROSCOPIO ELECTRNICO DE TRANSMISIN
(TEM) es anlogo al microscopio de luz, por el principio de la
formacin de imagen.
EL MICROSCOPIO ELECTRNICO DE BARRIDO (SEM)
su exploracin tiene alguna semejanza al de tipo radar.
LOS ELECTRONES
1. Los electrones, su fuente convencional en el Microscopio
Electrnico se obtiene, mediante altas temperaturas (emisin

trmica) del filamento de tungsteno que hace las veces de
ctodo. En algunos casos, se usa como fuente de electrones el
cristal Hexaboride de Lanthanum (LaB6). Este ctodo tiene alto
rendimiento y larga vida de emisin. Otro tipo de ctodo, Field
emission electron gun, no requiere calentamiento, sin embargo
estos requieren un alto vaco, apreciablemente mayor que en un
microscopio convencional.
2. Los Electrones son partculas con carga negativa, que atrados por
una carga positiva (nodo), forman una onda de electrones.
3. La onda de electrones puede ser desviada por el campo
electromagntico (lente de electrones), dicho movimiento es
anlogo al de la corriente de luz en un lente convexo.
4. La aceleracin de la corriente de electrones tiene una efectiva
longitud de onda (), dada en nm:
1.23
V
V : aceleracin de voltaje
La emisin de la corriente de electrones, estar dentro de una

columna, con un vaco necesario para que se desplacen los
electrones sin chocar con los gases.
COMPARACIN DE LUZ
Y DE EMISIN ELECTRNICA
A: La onda de luz emitida del filamento permanece en vaco, da la
forma al enfoque despus de pasar a travs del lente convexo.
B: Los electrones son emitidos desde el filamento, permanecen en vaco,
necesitan del voltaje de aceleracin del nodo para formar la onda
de electrones.
El trabajo del grid est en la concentracin de electrones.
C: Los electrones acelerados, por el voltaje de aceleracin, pasando a travs
de un campo magntico (lente magntico), hacen el
enfoque, igual que la onda de luz y lente convexo.
La fotografa muestra un tipo de filamento usado en el Microscopio
Electrnico comercial.
PRINCIPIOS DEL MICROSCOPIO

ELECTRNICO DE TRANSMISIN
Actualmente, la mayora de los Microscopios Electrnicos se construyen con
lente magntico para facilitar su operacin.
Al usar el lente magntico, la longitud focal cambia continuamente debido al
cambio de la corriente electrnica sobre el carrete del lente.
La fuerza del campo magntico es relativa al nmero de turno del carrete y la
corriente elctrica aplicada.
En el microscopio electrnico es posible cambiar continuamente la
ampliacin.
Los Microscopios Electrnicos en etapa de inicio, consistieron en sistema
de dos lentes: Objetivo y Proyector. Sin embargo, ms adelante, consistieron
en sistema de tres lentes: Objetivo, Intermedio y Proyector. Como resultado
de ello, aument la flexibilidad de ampliacin.
Microscopio de luz, usado en los primeros aos del siglo XX
COMPARACIN DEL MICROSCOPIO

DE LUZ Y ELECTRNICO
En los primeros aos del desarrollo del Microscopio Electrnico,
este fue simple, como se ilustra en la fotografa de abajo. Sin embargo,
despus de algunos aos al Microscopio Electrnico se le agreg
Doble Condensador y Lente Intermedio. (referido JEM 1010)
MICROSCOPIO ELECTRNICO
ANTIGUO (1)
Este es un Microscopio Electrnico de Transmisin fabricado por

Hitachi. No fue fcil mantener un buen funcionamiento y su aplicacin
se us mayormente para investigacin en la Microscopia Electrnica.
ANTIGUO (2)
Este es uno de los Microscopios Electrnicos populares fabricados

por JEOL. El can de electrones y el cable de alto voltaje fueron
recubiertos por un metal, con el fin de proteger al operador de una
descarga elctrica. Para tomar fotografas se utiliz comnmente un
plato de vidrio fotogrfico.
9
ANTIGUO (3)
Periodo de 1.960s.
El Autor y su Microscopio Electrnico de Transmisin.

Modelo HU-10 (Hitachi). El sistema fotogrfico fue cambiado a hojas
de pelcula, en vez de plato de vidrio. Sin embargo, fueron usados
grandes tubos de vaco y viejas partes de tipo electrnico para el circuito
electrnico. Ntese: algunos botones utilizados para el alineamiento
ptico electrnico.
10
ANTIGUO (4)
JEOL JEM 100C, instalado en el INHMT, en el ao 1.978.
Este modelo de Microscopio Electrnico de Transmisin fue muy

popular en aquel tiempo. Todo el circuito electrnico fue reconstruido
con cambio de estos tubos de vaco a semiconductores.
11
ACTUAL MICROSCOPIO ELECTRNICO DE

TRANSMISIN
JEOL JEM1010, instalado en el INHMT en el ao 1.998.
La mayor parte de su manejo est controlado por computadora y en

caso de falla, cuenta con un sistema libre.
Ntese que este modelo tiene pocos botones visibles.
12
ESQUEMA DE SECCIONES
DEL TEM JEOL JEM1010
Este TEM tiene Dos Lentes Condensadores, Dos Lentes Objetivos,

Dos Lentes Intermedios y Dos Lentes Proyectores.
Dos cajas para pelculas de fotografa, en donde por cada caja son aceptadas,
acepta hasta 50 hojas de negativos.
13
CONTRASTE DE LA IMAGEN EN MICROSCOPIA

ELECTRNICA DE TRANSMISIN
Cualquier imagen se reconocer como nica por el contraste, tal como
oscuro y brillante y/o diferencia de color.
La imagen en el Microscopio Electrnico es formada por grados de
brillantez (oscuro y brillante).
Cuando los rayos de electrones pasan muy cerca de un ncleo atmico
o de un tomo en el espcimen, ellos se desvan mediante ngulos
relativamente grandes, sin la prdida de energa, a este fenmeno se lo
llama Esparcin Elstica.
El nmero de electrones desviados aumenta de acuerdo al espesor del
espcimen y es tambin proporcional al nmero atmico del elemento
(masa y espesor).
Si una parada fsica de apertura angular relativamente pequea se
pone detrs del espcimen, el electrn disperso se quitar desde la onda
y la imagen ser menos intensa en regiones que corresponden al espesor
masivo de un espcimen.
Esta relacin entre la intensidad de imagen y el espesor masivo se
conoce como Contraste de Amplitud.
Cuando los rayos de los electrones, encuentran a los electrones
orbitales en tomos de especmenes delgados, hay un encuentro
entre dos cuerpos de masa igual. Esto resulta en energa impartida de
los electrones orbitales, al gasto de los electrones del rayo.
El proceso es conocido como Esparcion Inelstica, y
esparcimiento inelstico corresponde al Contraste de Fase.
el
El contraste de una imagen en el microscopio electrnico ser compuesto

por el Contraste de amplitud y el Contraste de fase.
Sin embargo, en general, la amplitud de contraste es dominante en
especmenes con estructuras grandes, y el contraste de fase es efectivo
en estructuras finas.
14
RESOLUCIN
En microscopa, el trmino Resolucin tiene un concepto y

significado importante, es: la distancia mnima entre dos puntos,
reconocidos como dos puntos separados.
Un Microscopio Electrnico tiene el alcance de un gran poder de
ampliacin; sin embargo ser de poco uso, si el poder de resolucin
es pobre.
Bsicamente, resolucin conexa directamente la longitud de onda usada
para formar la imagen y es conocido como Lmite de Difraccin.
La resolucin d es dada por:
d=
0.61
n sin
longitud de onda
sin : 1/2 ngulo de apertura de lente objetivo
n: el ndice de refraccin.
En un microscopio de luz usando 500 nm de luz, la resolucin terica
ser de 200 nm, pero, para el propsito prctico es:
d=
La misma frmula puede aplicarse para el Microscopio Electrnico,

y es obvio, que el microscopio electrnico posee notable poder de
resolucin, a causa de la longitud de onda de los rayos de electrones.
15
Al usar un acelerador de voltaje de 80 KV, la longitud de onda de electrones,

ser superior a 0,0043nm y tericamente, la Resolucin ser inferior
a 0.0021nm. De manera similar al usar una aceleracin de voltaje de 100
KV, la longitud de onda es 0.0038nm y la resolucin terica ser menor
de 0.0019nm. Es evidente, que usando acelerador de voltaje ms
alto, tal como 200KV, 300KV o 1.000KV, es de esperar mejor poder de
resolucin. Sin embargo esto, puede traer consigo algunos problemas
tcnicos como: aislamiento elctrico, adems de otros problemas como la
reduccin del contraste de imagen y el probado de la tcnica de preparacin.
Microscopio Electrnico de Transmisin JEOL 1000KV

Nota: Una parte, de lo Gigantesco del can de electrones
16
CARACTERSTICAS DEL MICROSCOPIO

ELECTRNICO DE TRANSMISIN
1. El alto vaco es esencial para el funcionamiento del microscopio
electrnico. En otras palabras, los especmenes voltiles no
pueden estudiarse por tcnicas ordinarias.
2. El impacto de los electrones sobre un espcimen ocasionar efectos
sobre el mismo, tales como: contaminacin, calefaccin, sobrecarga
elctrica, etc. Por lo cual no se puede usar especmenes lbiles
por calentamiento, con tcnicas ordinarias.
3. El contraste de la imagen depende de la masa y espesor del
especmen.
4. El Microscopio Electrnico tiene gran poder de ampliacin.
Sin embargo lo ms importante es su poder de resolucin.
5. Los especmenes para el estudio deben ser delgados y pequeos.
17
PREPARACIN DEL ESPCIMEN

I.
Soporte del espcimen en Microscopia Electrnica de

Transmisin.
En Microscopia de Luz el espcimen tiene como soporte una placa de
vidrio transparente.
En la Microscopia Electrnica el espcimen se apoya sobre una
pelcula delgada de colodion (nitrocelulosa), polivinyl formol (formval),
pelculas de carbn, etc., que son transparentes al rayo de electrones.
Estas pelculas a su vez se apoyan sobre una rejilla (o malla fina)
de metal (MESH).
Ejemplo del Tpico Mesh
Mtodo de Preparacin de la Pelcula de Soporte

A. En un vaso beaker con agua, aplicar una gota de solucin de
Colodium (2% en acetato de amylo), lo que formar una pelcula.
B. Poner el mesh sobre la superficie de dicha pelcula.
C. Introducir verticalmente una placa de vidrio de microscopia de
luz, en dicha pelcula.
D. Sacar en la placa de vidrio la pelcula con mesh.
E. Mesh con pelcula de colodion. Listo par usar.
18
PROCEDIMIENTO DE PREPARACIN
DE LA PELCULA
19
II. En el Caso de Objetos Pequeos.

Las partculas finas o las fibras delgadas (bacterias,
pueden aplicarse directamente sobre el espcimen
la pelcula, sin embargo la mayora de los especmenes
no dan suficiente contraste, por lo cual es necesario un
adicional.
virus, etc.)
que apoya
biolgicos
tratamiento
(1) Mtodo de Sombreado

Es el mtodo usado para aumentar el contraste de objetos
pequeos.
PRINCIPIOS DEL SOMBREADO
20
MQUINA DE SOMBREADO
La jarra con alto vaco. Aplicacin de la corriente elctrica al prender
el calentador por evaporacin de metal, como Pt-Pd, Cr. etc.
Evaporacin del metal en alto vaco.
21
(2) Tcnica de Tincin Negativa

Esta tcnica es anloga a la tcnica Tincin de tinta de India que se
usa en la microscopa de luz, para ver espiroquetas y otras bacterias.
Un material biolgico que no muestra el contraste suficiente por
Microscopa Electrnica, puede usarse con el material opaco de
electrones.
Entonces, ser posible observar el perfil del objeto como una sombra
en un molde opaco de electrones.
La sustancia comnmente usada como material opaco de
electrones
es el PTA al 2% (cido fosfotngstico en agua
neutralizado con
KOH). El compuesto de uranio, tal como el acetato de uranilo, es
tambin comnmente usado.
PROCEDIMIENTO DE TINCIN NEGATIVA
1. Aplicar una gota de PTA en el mesh.

2. Mezclar poca muestra con PTA.
3. Secar el PTA con un pedazo de papel filtro
4. Secar rpidamente.
El mtodo de Tincin Negativa fue reportado por Brenner,S. y Horne,
R.W., on B.B.A.,(1.959)
22
EJEMPLOS DE SOMBREADO
Y TINCIN NEGATIVA
Ejemplo: Campylobacter Jejuni
A: Sombreado
B: Tincin Negativa
23
(3) Cortes Finos

Es necesario hacer cortes delgados del espcimen, para observar
en los tejidos las estructuras finas como: citoplasma de bacterias,
protozoarios, etc.
III En Caso de Especmenes de Tamao Grande
(1) Es necesario cortarlos en fragmentos pequeos.
Dependiendo del material y del propsito de la investigacin.
Se debe realizar un procedimiento similar al indicado, como en el caso
de los especmenes pequeos.
(2) Cortes en secciones delgadas (Ultra microtoma), como II-3.
IV Principios del Corte Fino
El principio de cortar material biolgico en cortes ultrafinos es
anlogo al procedimiento de microtoma en la Microscopia de luz. En
la Microscopia Electrnica sin embargo, los procedimientos son ms
estrictos y precisos en comparacin con los mtodos ordinarios de la
Microscopia de luz.
(1) Fijacin: Para conservacin de estructuras finas de material
biolgico como especmenes vivos, se usan generalmente fijadores de
Glutaraldehdo (2.5-3%), y Tetraxido de Osmio (1%). (Ambos en
una solucin buffer).

(2) Deshidratacin: Despus de enjuagar con agua, el espcimen
fijado, debe deshidratarse para realizar el Embebimiento en la resina
que es insoluble al agua, tal como EPON.
En la mayora de los casos se usa una serie de alcoholes para deshidratar
los tejidos biolgicos. (Algn componente, tal como sustancia
soluble de alcohol, puede ser perdido por este proceso).
24
En casos especiales, sin embargo, la resina soluble en agua es

tambin disponible.
(3) Embebimiento
Despus del proceso de deshidratacin, el espcimen deber
Incluirse en Oxido de Propileno, (miscible con el alcohol y la
resina) entonces es incluido en resina Spurr.
La polimerizacin de la resina puede ser acelerada por la
calefaccin o por irradiacin de luz ultravioleta (UV).
(4) Cortes
Se ha diseado especialmente para su uso el Micrtomo
(Ultra- micrtomo) .
Actualmente se usa la cuchilla de diamante para un mejor corte,
sin embargo, la cuchilla de vidrio es ms usada por razones
econmicas.
El espesor del corte debe ser lo ms fino posible, para una mejor
observacin, siendo ideal el de 50 a 100 nm.
Cuchillas para Corte y Espcimen Embebido
25
ULTRAMICROTOMO
Sorvall Porte-Blum MTII (Instalado en INHMT en 1978)
Leica Ultra Cut (Instalado en INHMT en 1998 )
26
PROCEDIMIENTO DE CORTE
CUCHILLA DE VIDRIO
El corte de cuchilla de vidrio es una tcnica que consiste en:
1. Marcar la barra de vidrio (25 x 25 x 6 mm), con cuchilla de filo de
plata.
2. Se marca con el filo en una diagonal.
3. La clave es marcar el vidrio para dividirlos en dos tringulos.
Mquina para Cortar Cuchillas de Vidrio (Knife maker)
27
DETALLES DEL CORTE
Bloque y cuchillo instalado. El movimiento del bloque es vertical,
La muestra cortada est flotando en la superficie del agua.
Los cortes sobre el Mesh
28
V. Tincin Electrnica
Para aumentar el contraste de imagen, los materiales biolgicos deben
de ser cortados finos, y se los trata con soluciones compuestas de
metal pesado, como el uranio y/o el plomo. A esto se llama tincin
electrnica. La tincin electrnica puede aplicarse sobre un espcimen
antes de embeberlo en el bloque (esta tincin del corte fino es muy
usada).
METODO DE TINCIN
A:
B:
en
C:
D:
Caja de Petri.
Papel filtro con agua (para prevenir la evaporacin
la solucin de tincin)
Parafilm
Mesh con corte en solucin de Tincin
29
EFECTOS DE TINCIN
A: No Teido
B:Teido.
30
(Tejido renal)
COMENTARIO SOBRE LA
TINCIN ELECTRNICA
En la mayora de casos la Tincin se usa para incrementar el contraste
sobre una imagen. Actualmente se usan compuestos de uranio y citrato
de plomo. El contraste en la Microscopia Electrnica de Transmisin
depende del grosor de la densidad de sustancias compuestas en
el espcimen. Para esta tincin es usado un material de componente
metlico. Este proceso con especificidad de tincin no es constante.
Slo es posible el mtodo de Tincin especfica usada en el presente,
con el mtodo inmunolgico en la Inmuno Electro Microscopia.
Originalmente la Inmuno Electro Microscopia fue reportada
a principios del ao 1950, la inmuno globulina purificada tiene
conjugacin con las molculas de ferritina ( tiene ferroglobulina ), esta ferro-globulina reacciona con el antgeno en los
tejidos. El mecanismo es muy similar a la tcnica de anticuerpo
de Fluorescencia en Microscopia de luz.
Adems la molcula de ferritina posee una forma de gran
molcula ( tiene 11 nm de dimetro ) y la penetracin de ferroglobulina es un problema sobre su aplicacin en los tejidos. La
tcnica de ferro-globulina, tiene variaciones sobre el anticuerpo
conjugado con la enzima (peroxidasa), sobre oro coloidal.
La tcnica de auto-radiografa tiene buena aplicacin en los
cortes ultrafinos para Microscopia Electrnica de Transmisin.
En Microscopia Electrnica de Barrido `(SEM) el mtodo
inmunolgico se inicia a partir de los aos 60s. En la primera aplicacin
de la Tcnica inmunolgica en SEM, PSL (ltex polystyrene) tiene
conjugacin con la inmunoglobulina y es efectiva en muchos casos.
Recientemente es usado el oro coloidal, a cambio del PSL.
31
OPERACIN DEL TEM(1)
32
OPERACIN DEL MET (2)
33
CONSERVACIN DE IMAGEN DEL

MICROSCOPIO ELECTRNICO DE
TRANSMISIN
Como se describe en una estructura bsica del microscopio electrnico
de transmisin (Pg. 21), la llamada cmara es situada al pie de
la columna. Sin embargo, es un tipo de sostenedor de filme
fotogrfico.
Una imagen del rayo electrnico es grabada directamente en la pelcula
fotogrfica, sin ningn sistema de lentes. Luego, la imagen grabada es
desarrollada por un proceso de reduccin de componentes de plata
en un cuarto oscuro.
Sin embargo, en aos recientes el mtodo de fotografa ha sido
modificado grandemente por la tecnologa digital. La ventaja de la
fotografa digital es simplemente de manejo.
Es posible ver la imagen grabada inmediatamente, sin ningn proceso
de desarrollo en un cuarto oscuro.
Un ejemplo de sistema de fotografa digital es mostrado
esquemticamente.
La imagen original es formada en una pantalla fluorescente, luego el
brillo de la imagen es introducido a un CCD (dispositivo acoplado de
carga), a travs de lentes pticos o fibra ptica, para cambiar el actual
elctrico. La imagen final puede ser vista en una pantalla de monitor y
puede ser guardada en un sistema de memoria.
En la pantalla de la computadora, se puede hacer cualquier mtodo de
procesamiento de imagen con un programa compatible. Sin embargo,
no se debera hacer cualquier modificacin artificial de la imagen.
En la fotografa, se muestra un sistema de cmara de CCD de insercin
lateral
Si se usa la parte inferior del sistema de montaje (bottom mounting
system) (ver Fig.) obtendr mejor calidad de imagen, puesto que el
tamao de la pantalla fluorescente es realmente grande, en comparacin
con el sistema de insercin lateral.
34
CCD CMARA
35
CONCEPTOS IMPORTANTES
1. Astigmatismo
Un lente de electrones se dice que posee astigmatismo, como lente
convexo de luz.
Se define como Astigmatismo: la luz (rayo de electrones) emitida
desde un punto, que no enfoca dicho punto en esa direccin, sino que
lo hace en puntos dispersos, despus de pasar a travs de un lente
convexo (magntico).
El astigmatismo en un Microscopio Electrnico es ocasionado por
varios factores, tales como: falla de fabricacin del lente mismo, o
contaminacin de la columna (en el paso de rayo de electrn).
Para verificar el astigmatismo, podemos utilizar un Mesh cubriendo
con cinta las perforaciones pequeas. Cuando existe el astigmatismo
en el lente objetivo, veremos que la imagen est enfocada slo en una
direccin.
Su procedimiento de correccin es fcil y esencial para la alta calidad
en la Microscopia Electrnica.
Si la falla se debe al proceso de fabricacin, sta no podr
ser corregida por el usuario. Pero si el astigmatismo es ocasionado
por falla adquirida, sta se corrige con un buen mantenimiento del
microscopio.
36
EJEMPLOS DE ASTIGMATISMO
(Espcimen: orificio pequeo del mesh, tapado con la cinta)
Fotografas A y C muestran Astigmatismo. B despus de correccin de
Astigmatismo.
FOTOGRAFAS DE VIRUS DE LA ORQUDEA

(Espcimen: virus de Orqudea)
Fotografa D no Astigmatismo, E Astigmatismo.

37
2. ENFOQUE
El enfoque es muy importante para una buena fotografa.
Su procedimiento en la microscopia electrnica incluye el ajuste entre
la distancia del foco del lente y del objetivo.
Para reducir la corriente electrnica sobre el lente objetivo, la distancia
debe ser mayor (Under focus).
Al aumentar la corriente elctrica, la longitud focal llega a ser ms corta
(Over focus).
Una fotografa tomada debajo del enfoque, aclara un poco la impresin.
Esa es la razn por la cual algunos Microscopios Electrnicos
convencionales instalaron un sistema de circuito electrnico como
foco ptimo que automticamente al reducir la corriente del lente
objetivo, acta al mismo tiempo de tomar las fotos.
38
EJEMPLOS DE ENFOQUE
Espcimen

A: Pequeo orificio tapado con la cinta,

correccin de astigmatismo
B: Fragmentos del virus de la Orqudea
(ORSV)
Over focus
exact focus
(Encima del enfoque) ( Enfoque exacto)
under focus
(debajo del enfoque)
La fotografa debajo del enfoque, muestra buen contraste.
39
3. Contaminacin del Espcimen

La estructura del Microscopio Electrnico consiste en una columna de
alto vaco, necesario para que se desplacen los electrones, sin embargo,
en la columna pueden existir muchos contaminantes en forma de gas,
que han sido involuntariamente llevados con los especmenes, o por el
gas originado desde la pelcula fotogrfica.
Estos contaminantes se depositan sobre el espcimen, con el
bombardeo de electrones, afectando el contraste y la resolucin de la
imagen, cuanto mayor sea la ampliacin.
4. Bombardeo de Electrones
El impacto de los electrones sobre el espcimen, provocar que dichos
electrones se desplacen sin chocar. Sin embargo, a su vez los electrones
producen efectos destructivos en el espcimen, tales como dislocacin
del ncleo atmico, ionizacin del espcimen y efectos trmicos.
Estos efectos se los llama Bombardeo de Electrones, y ser
menor por la disminucin de la intensidad de rayo de electrones.
5. Profundidad de Observacin Focal
Comparado con el Microscopio de luz, el Microscopio Electrnico
tiene mayor profundidad de observacin focal.
En otras palabras, la imagen
superior del espcimen y la
imagen de fondo del mismo espcimen nos muestra, que se
ve igualmente clara. Esto puede llevar en algunas ocasiones, a
confusin.
40
EJEMPLOS DE BOMBARDEO DE ELECTRONES

Ejemplo de una bacteria Plesiomonas shigelloides.
Procesamiento no como Tincin Negativa o recubrimiento por
sombreado.
Fotografa A: Antes del Bombardeo de Electrones
B: Despus del Bombardeo de Electrones.
Algunos componentes afectados en la evaporacin
La bacteria P. shigelloides produce grnulos llamados cuerpos

metacromticos, similares a los de Corynebacterium diphteriae
41
INTERPRETACIN DE LA
MICROFOTOGRAFA
Una fotografa debe ser un registro exacto de la imagen observada en
el Microscopio, sin embargo el registro exacto no significa registro
real. Algunas veces el Microscopio Electrnico produce pseudoestructuras a causa de la naturaleza del instrumento. Mirando en tres
dimensiones el objeto en una fotografa de Microscopio Electrnico, la
superficie y el fondo del objeto muestran la misma agudeza. (Sobre una
fotografa, a causa del Microscopio Electrnico, tiene gran tolerancia de
enfoque). Como resultado se ha visto frecuentemente la superposicin
de imgenes o Moir.
Otros conceptos importantes que debemos considerar en la
macrofotografa electrnica son: 1) El Astigmatismo, 2) El impulsar
del espcimen y 3) El enfoque.
Aunque tales efectos son producidos en su mayora debido a la alta
magnificacin y esto se lo reconoce con la experiencia.
EJEMPLO DE Moir
Dos mesh son sobrepuestos por diferentes ngulos. Esto da como
resultado, modelos diferentes.
42
Moir, ENCONTRANDO ROTAVIRUS

Note la estructura que se ha formado (flechas) sobrepuesta en las
partculas del virus. Dicha estructura no siendo propia, existe sobre las
partculas virales. Este fenmeno ha hecho que aparezca, encima de la
superficie y en el fondo del virin.
43
SUPER IMPOSICIN DE ESTRUCTURAS

La super imposicin de imgenes se ha visto frecuentemente. Las
fotografas de la siguiente pgina, se tomaron del estudio realizado en
camarn, con el Sndrome de la Mancha Blanca (WSSV).
Esta estructura de super imposicin da un resultado a la mirada algo
extraa, y es identificada claramente por las fotografas de estreo.
Un par de fotografas estreos tomadas con diferentes ngulos,
contrario a la direccin del rayo de electrones, como inclinacin
del espcimen.
Para ver este par estreo se han retenido las fotografas a una
distancia de 30 cms, desde nuestros ojos, tratando de mirarlas ambas
fotografas en el mismo momento. No es necesario tratar de hacerlo
por separado o en serie.
Simplemente se mira casi al mismo tiempo. Lo cual puede requerir de
un poco de prctica.
Inclinacin del Espcimen
44
EJEMPLO DEL PAR ESTREO

Virus del Sndrome de la Mancha Blanca (WSSV).
(Fotos 3D)
Grupo de partculas del virus en tejido y la direccin de un corte fino.
45
MICROSCOPIO ELECTRNICO DE BARRIDO

INSTALADO EN EL INHMT
Hitachi HS 430 (Instalado en 1978)
JEOL JSM 5310 (Instalado En 1998)
46
PRINCIPIOS DEL MICROSCOPIO

ELECTRNICO DE BARRIDO
El principio del Microscopio Electrnico de Barrido (SEM) es bastante
diferente comparado con el de Transmisin.
Ambos utilizan el rayo de electrones, sin embargo, trabajan con
mecanismos totalmente diferentes. En un SEM el rayo de electrones se
llama sonda, a causa de la intensidad del rayo de electrones que pasa
por la superficie del objeto.
Los electrones en la sonda cuando encuentran un objeto, sern desviados
por tomos en el objeto, llamndose a esto electrn disperso.
Sin embargo, a la vez algunos electrones en la sonda causan la emisin
de electrones secundarios cerca de la superficie y los rayos X
emitidos desde la sub-superficie del rea del objeto.
La mayora de SEM que es usado en reas biolgicas, tiene imgenes
formadas desde electrones secundarios. En general, los electrones
esparcidos y los rayos X proveen informacin til sobre el objeto,
como se lo resumir a continuacin.
1. Electrones secundarios: Observacin topogrfica de la superficie
2. Electrones esparcidos en la parte posterior: Componen la observacin
de superficie.
3. Rayos X: El anlisis elemental del espcimen.
La intensidad de electrones esparcida por el espcimen y los electrones
secundarios emitidos desde el espcimen, dependen de la composicin
elemental de la superficie topogrfica del objeto y de la energa, e
inciden en la sonda de electrones emitida.
47
Los electrones dispersos o los electrones secundarios pueden ser

tomados por un electrodo de carga positiva llamado colector o nodo.
El electrn cargado se refleja sobre la pantalla fluorescente (llamada
cintillador) y emite fluorescencia.
La fluorescencia emitida por el electrn cargado por el cintillador, es
convertida a corriente elctrica por un tubo fotomultiplicador (PMT).
La corriente elctrica amplificada por un circuito electrnico, se usa
para controlar la brillantez de un tubo de rayos catdico (CRT).
Las velocidades de rastreo de sonda y el rayo electrnico del CRT estn
sincronizadas, la topografa del espcimen puede ser reproducida sobre
la pantalla del CRT.
CINTILLADOR Y FOTOMULTIPLICADOR
48
PARTES CONSTITUYENTES DEL SEM
DETECTOR DE ELECTRONES SECUNDARIOS
49
ESPCIMEN PARA SEM

Las explicaciones siguientes se limitan a imgenes formadas a
partir de electrones secundarios, ya que la mayora son de aplicacin
en el campo biolgico.
La muestra a examinarse para SEM debe deshidratarse completamente.
La mayora de los materiales biolgicos sin embargo, tienen como
componente normal gran cantidad de agua. Por lo cual debern ser
tratados adecuadamente con el proceso de secado para evitar que
se produzca una severa deformacin del espcimen. Los pasos del
procedimiento son los siguientes:
1. Fijacin
Se insolubilizan componentes de protenas con reactivos qumicos.
El procesamiento y fijacin es igual al del TEM (Gluteraldehido 3%).
2. Deshidratacin
La deshidratacin tiene un procesamiento parecido al del TEM
3. Secado
Cuando un espcimen mojado es secado por la evaporacin normal,
ocurre una distorsin violenta.
Esta distorsin se debe al cambio de la fuerza de tensin de superficie,
de una fase lquida a la fase de vapor, tal es el caso del agua al vapor de
agua. La distorsin ser menor, si aplicamos la tcnica de Secadora
de Punto Crtico o de Secador por Congelacin
4. Secadora de Punto Crtico
Es un fenmeno fsico. Por ejemplo, en el caso del Dixido de Carbono
lquido, bajo una presin de 50 Kg/cm2, se mantiene en fase lquida,
pero si aumentamos esta presin (a 80 Kg/cm2), instantneamente
50
pasar de la fase lquida a la fase gaseosa. A este cambio de presin se

lo llama Punto Crtico.
Esta condicin de tensin cero de superficie es ideal para secar los
especmenes biolgicos.
1. Despus del proceso de deshidratacin el espcimen deber
empaparse en el fludo intermedio, que es miscible con el lquido
de Dixido de Carbono, tal es el caso de la acetona o iso-amyl
acetato.
2. El espcimen tratado con el fluido intermedio puesto en
una cmara pequea con el dixido de carbono lquido
completamente mezclado con el fluido intermedio.
3. Luego se calienta lentamente, para aumentar la presin dentro
de la cmara. A la Secadora de Punto Crtico, la fase lquida del
Dixido de carbono cambia a fase gaseosa.
4. La fase gaseosa de Dixido de Carbono se liberar lentamente
PRINCIPIO DE SECADORA DE PUNTO CRTICO
51
5. Secado por Congelacin

El secado por congelacin es tambin una tcnica para minimizar la
distorsin de especimenes, que puede ocurrir durante el proceso de
evaporacin del agua.
1. El espcimen Fijado y Lavado debe congelarse rpidamente
para evitar la formacin de cristales de hielo.
2. Lo traslado al aparato de Secado por Congelacin y lo guardo
por varias horas con la bomba ordinaria de vaco. El agua
sublimar desde el espcimen congelado, sin el efecto de tensin
de superficie.
El agua congela a 0 C, sin embargo, para hacer un congelado
rpido se pone una temperatura muy baja, tal como -180C,
(Nitrgeno lquido) o -78C, (hielo seco). En lugar de agua se
usa en este procedimiento el t-butanol se congela a 25C, y
aplicable para Congelado seco del espcimen en SEM.
Mtodo de Secado por Congelacin en t-butanol
1. Espcimen: Se lo fija y se lo lava con agua, como de costumbre.
2. Deshidratacin en, t-butanol: Se comienza con una concentracin
de 75% t-butanol en agua, y se va aumentando, hasta llegar a una
concentracin de t-butanol de 90% y 100%.
3. El espcimen en 100% t-butanol lo guardo en congelador para
que complete, en perodo muy corto la congelacin.
4. Transferir el espcimen congelado a la mquina de Secado por
Congelacin. Comienza secando, pero tomar varias horas para la
terminacin de este procedimiento (lo que depende del tamao
del espcimen y volumen de t-butanol).
5. Montaje del espcimen
Con el espcimen seco, se procede a montarlo sobre una barra de metal
y se lo pega a l con un cemento o pegamento.
52
UN TIPO DE SECADOR POR CONGELACIN
6.
53
6. Recubrimiento con Metal

Para aumentar la emisin secundaria de electrones, y para prevenir la
sobrecarga elctrica; se reviste el espcimen con una pelcula delgada de
metal pesado, como oro, paladium, etc.
Por supuesto tambin, en ciertos casos es posible observar el espcimen
sin recubrirlo. Sin embargo las fotografas de alta resolucin no
pueden ser observadas con nitidez.
Para el recubrimiento de metal se usa el Evaporador de Vaco. Aplicando
el Mtodo de Sombreado que se utiliza en TEM, que puede ser usado
con un dispositivo de rotacin de muestras. Actualmente esta tcnica
es usada ampliamente, lo que permite el recubrimiento uniforme con el
metal. Cuando una descarga del resplandor, se forma entre un ctodo
(oro, o aleacin de oro y palladium) y nodo, en un gas apropiado
como el argn (en el trabajo de rutina, el aire puede ser usado). El
bombardeo del in de gas, expulsar un tomo desde el material de
ctodo, a este fenmeno se lo llama destelleo a chorro (sputtering).
Los tomos expulsados del metal son depositados sobre la superficie
del espcimen, cuyo revestimiento depender: del espesor del material,
de la corriente o intensidad del in y del tiempo de bombardeo.
PRINCIPIO DEL EQUIPO MAGNETRON

DESTELLEO A CHORRO
(Magnetron sputtering device)
54
EQUIPO RECUBRIDOR DE ORO

DESTELLEO A CHORRO
(A MAGNETRON SPUTTER COATER)
Se utiliza el oro como ctodo, por 20 segundos de descarga, tiempo
suficiente para revestir la mayora de las muestras biolgicas.
Sin embargo, en casos especiales es necesario controlar el tiempo.
Descarga. (Glow discharge)
55
MICROSCOPIO ELECTRNICO DE SCANNING

DE BAJO VACO
En la pgina precedente, se explic acerca del sistema de microscopio
electrnico de Scanning popular, el cual trabaja con electrones
secundarios. Sin embargo, existe otro tipo de microscopio electrnico
de Scanning, el cual es conocido como SEM de bajo vaco (Low
Vacuum SEM), o SEM ambiental.
El punto es la presin de la cmara de espcimen (referido en la
ilustracin). El can de electrones es mantenido en alto vaco, como en
el SEM ordinario, sin embargo, la cmara del espcimen es controlado
a vaco un poco bajo con un sistema de vaco independiente.
En este sistema el electrn secundario no puede ser usado para
formar imagen, pero es posible hacer imgenes del electrn aislado
Cuando un espcimen es irradiado con el rayo electrnico en el sistema
de bajo vaco (low vacuum), las molculas de gas residual en la cmara
del espcimen, son colisionadas con rayo electrnico e ionizados. Estas
molculas de gas ionizadas neutralizan la carga de la superficie del
quiera con especmenes no conductivos.
Con LV SEM, los electrones retrodispersados detrs, son detectados
para usarlos como seales de imagen. La fuerza de estos electrones
(back scattered) depende del nmero atmico de la composicin
del espcimen, y es posible hacer anlisis elemental con electrones
retrodispersados
56
Diagrama Esquemtico del Sistema de Bajo Vacio LV SEM
57
OPERACIN DEL SEM
Para tomar fotografas en un SEM, se necesita un tiempo largo de

exposicin, sobre los 90 - 100 segundos por foto.
Por esta razn, este equipo debe mantenerse con buena estabilidad.
58
MANERA DE COLOCAR EL ESPCIMEN
Original del SEM. Sin embargo actualmente se utiliza cmara digital, en

lugar de films de pelcula. Adaptando programa en computadora.
59
LA RESOLUCIN EN SEM
La Resolucin en SEM es igual que la usada en la Microscopia
Electrnica de Transmisin. Sin embargo, su significado respecto al
electrn secundario es muy diferente. En primer lugar, la resolucin en
SEM depende del tamao de sonda (ver Principio de SEM). Por
esta razn para conseguir una imagen de alta resolucin es esencial la
alta intensidad y el menor tamao de la sonda.
En la mayora de los casos los especmenes biolgicos sern recubiertos
con un metal pesado, para aumentar la emisin del electrn secundario
y hacer limitacin de resolucin real en la aplicacin biolgica.
En los ltimos aos se ha hecho ms conocido el Microscopio
Electrnico de Barrido de bajo vaco, el espcimen no necesita
cubrirse con metales pesados para impedir la carga elctrica, sin
embargo, no se puede esperar una alta resolucin.
LA DIFUSIN DEL ELECTRN DE

INCIDENCIA
(Referido de Publicacin JEOL)
60
CONTRASTE DE IMAGEN
El contraste y la brillantez de la imagen en SEM, dependen de la
intensidad de los electrones secundarios, emitidos desde el espcimen.
La intensidad de electrones secundarios depende de la topografa del
espcimen y la energa de electrones de incidencia (sonda).
Generalmente las partes del espcimen que emiten ms electrones
secundarios son los bordes y las partes sobresalientes de la superficie,
que aparecen en la imagen como la parte ms brillante, no as, la
parte plana del espcimen. A este fenmeno se lo llama Efecto de
Borde
TRES TIPOS DEL EFECTO DE BORDE
(Referido de Publicacin JEOL)
61
EJEMPLOS DEL EFECTO DE BORDE:

Protuberancia
Espcimen: Compuesto de Ojo de Insecto
Voltaje de Aceleracin : 5.0 kV
Voltaje de Aceleracin: 10 kV
62
EJEMPLO DEL EFECTO DE BORDE:

Borde
Espcimen: mesh de TEM
Voltaje de Aceleracin: 5.0 kV
63
EJEMPLO DEL EFECTO DE BORDE:

Circunferencia
Espcimen: almidn de patata
64
CONCEPTOS IMPORTANTES
1. Astigmatismo
El astigmatismo en Microscopia Electrnica de Barrido es causado por
la forma de sonda.
Si una seccin de cruz de sonda tiene un crculo ideal e intensidad
homognea de electrones, el astigmatismo no puede ocurrir.
De otra manera siempre es necesaria la correccin del astigmatismo.
Antes de la correccin Astigmatismo (almidn de patata)
Despus de la correccin Astigmatismo
65
2. Voltaje de Aceleracin (1)

En general, mientras ms alto es el voltaje de aceleracin, se espera
mejor resolucin y contraste. Sin embargo, los electrones en la sonda
acelerada con un alto voltaje, penetrarn ms profundamente en el
espcimen, lo contrario suceder si el acelerador de voltaje es inferior,
en cuyo caso, no mostrar las estructuras finas que pueden existir sobre
la superficie del espcimen.
Espcimen: papel filtro
Voltaje de Aceleracin: 10 kV.
66
2. Voltaje de Aceleracin (2)

Otro factor importante del voltaje de aceleracin es el Fenmeno de
carga elctrica. Los electrones en la sonda ocasionan carga elctrica en
el espcimen. Sin embargo, la sobrecarga puede reducirse haciendo
mejor conductibilidad elctrica del espcimen.
Espcimen: almidn de patata
67
3. Espcimen Daado por los Rayos de Electrones

La prdida de la energa de electrones en el espcimen, ocurre en su
mayora en forma de generacin de calor al rea irradiada.
La temperatura aumentada debido a la irradiacin, es dependiente
de la aceleracin de voltaje, de la intensidad del rayo de electrones y
del tiempo de la irradiacin.
Nota: La fotografa muestra mayor deformacin de las partculas de al
midn.
Espcimen: almidn de patata.
68
4. Contaminacin
La naturaleza de contaminacin en SEM, es exactamente igual como
la que ocurre en el Microscopio Electrnico de Transmisin.
Cuando los rayos de electrones son irradiados sobre un espcimen
por largo tiempo, su imagen pierde agudeza y llega a ser oscura.
Esto es ocasionado por el depsito de gas residual en la vecindad del
espcimen.
Al revisar una muestra en el Microscopio Electrnico de Barrido, este
mismo espcimen traer consigo mucha contaminacin.
Para reducir tal contaminacin debemos de tomar las siguientes
medidas: usar un espcimen que tenga el menor tamao posible;
no usar excesiva cantidad de cemento para montar el espcimen y
finalmente secarlo bien.
Nota:. La parte central es oscura, a causa de la contaminacin
Espcimen: Mesh de TEM.
69
RESUMEN DE EFECTOS DE VOLTAJE DE

ACELERACIN POR IMAGEN DE SEM
70
Captulo 2
APLICACIN EN BIOLOGA
EJEMPLOS DE APLICACIN
En esta seccin se muestran algunos ejemplos de aplicacin de la
Microscopa Electrnica.
La mayora de las fotos fueron tomadas en el INHMT, ahora INSPI,
sin embargo, se han agregado algunas fotografas tomadas en otra
institucin, como resea histrica, para dar mayor variedad en este
libro.
1. En la explicacin de las fotografas, se indica el origen del espcimen,
y cuando haya sido ofrecida por otra persona.
2. En el caso de los virus, se indica el tipo de cido nucleico, como:
ADN de cadena doble = DNAds
ADN cadena nica = DNAss
ARN de cadena doble = RNAds
ARN cadena nica = RNAss
3. En algunos casos se presentan trabajos originales del autor, en el
que se indicar el nombre de la revista, el volumen y el ao de su
publicacin.
73
1. REOVIRIDAE
Los Reoviridaes tienen forma icosahdrica, y la cpside est construida
de un solo tipo de unidad estructural.
Solo los Reoviridaes poseen cadena doble de RNA, como virus
en animal que causan infecciones en los humanos, los cuales son
conocidos como Rotavirus. Tambin, la infeccin del reovirus es
conocida en humanos; sin embargo, la patogenicidad no est clara.
El Virus del arroz diminuto (Rice Dwarf Virus) RDV, causa el
sndrome de un arroz diminuto.
RNAds
74
1-1. ESTUDIO DE LOS REOVIRUS

(J. Virology, 8, 1971)
En una partcula del virus degradante, se exhibe muy buena informacin

sobre la arquitectura del cpside.
1.
2.
3.
4.
Mostrando la estructura interna de la cpsula, (flecha)

Cpsula interna y sus unidades estructurales (flechas)
Organizacin de unidades estructurales del virin.
Anlisis rotacional de las unidades estructurales
75
TCNICA DE INTEGRACIN ROTACIONAL. (1)

(Markham, R. y et al. Virologa 20,88. 1963)
Esta es una tcnica para mejorar y reforzar imgenes teniendo la

simetra radial.
Integrando detalles en la micrografa con simetra radial, el conjunto
de microfotografas con ampliadora de fotogrfica A (Ilustracin
referida), el centro exacto de la regin para ser estudiada, por el lente.
Proyecta la imagen sobre la mesa rotativa B, y alinea el centro rotatorio
de la mesa a la regin seleccionada de la microfotografa.
Adjunte papel fotogrfico a la mesa rotativa. Del tiempo necesario de
exposicin que corresponde a la fraccin, 1/n de 360 que est siendo
investigado.
La mesa rotativa vuelve mediante el ngulo de 360/n se hace otra
exposicin.
El mximo aumento del detalle ser dado por la periodicidad en el
objeto.
76
TCNICA DE INTEGRACION ROTACIONAL
Ejemplos de Integracin
77
1.2. ROTAVIRUS EN DIARREA INFANTIL

1.

(Am. J. Trop. Med. Hyg., 30, 1981)
Rotavirus en heces de diarrea infantil. En la investigacin

inicialmente la mayor parte de las partculas virales mostraban una
superficie rugosa, debido a la prdida de la cpsula externa durante
el procedimiento de purificacin.
2. Por estudios avanzados, se ha reconocido que el rotavirus posee

una estructura capsular externa y esta es llamada partcula de
doble envoltura.
3. El arreglo bidimensional de las unidades estructurales, son liberadas
por el virin roto.
Casos, infeccin de Rotavirus en Guayaquil 1978-9
78
79
1.3. ESTUDIO DEL VIRUS DEL ARROZ DIMINUTO

(RICE DWARF VIRUS, RDV)
1.
Virus de arroz diminuto purificado.
2. Arreglo bidimensional de la unidad estructural similar al rotavirus.

3. Anlisis de la estructura del cpside, mediante la tcnica de rotacin.
(A) Fotografa original
(B) Despus de la rotacin: n = 5
(C) Modelo del arreglo de las unidades estructurales.
80
81
2. HERPESVIRUS, HERPESVIRIDAE
DNAds
1. Envoltura del Herpesvirus.
Por el mtodo de tincin negativa del fluido de las vesculas de un
paciente Herptico.
Las partculas virales pueden ser observadas sin el proceso de
purificacin.
2. Las partculas virales crecen en clulas Hela, como medio de
cultivo. Las partculas virales no tienen envoltura.
En algunos de ellos se observa su estructura interna.
Se conoce que: Solo las partculas de virus con envoltura tiene
infectividad.
Nota: El Herpesvirus tiene forma icosahdrica, sin embargo, la
arquitectura de la partcula de virus difiere del reoviridae. Ya que
el reoviridae est constituido del tipo deunidad estructural.
El herpesviridae est constituido por dos tipos de capsmeros,
pentones y hexisones.
82
83
3. COXSAKIEVIRUS (A16), PICORNAVIRIDAE

(De Dr. T. Sudo, Japn)
RNAss
Es conocido como el agente patgeno de las enfermedades
de mano, pie y boca ( Hand Foot and Mouth Disease, HFMD)
en nios.
La fotografa muestra partculas purificadas del virus, crecidas en
clulas Vero (clula de rin de mono verde),
como medio de cultivo.
En general, el grupo Picornavirus es conocido por su forma
icosadrico, sin embargo no es fcil ver las evidencias de
capsmero de icosahedros
Sntomas en manos y pie
84
85
4. INFLUENZA VIRUS, MYXOVIRIDAE

El myxovirus es un virus comnmente conocido en humanos y
animales.
Tambin se conoce que el virus fue llevado al emigrar pjaros,
y patos, siendo por ello el que ocasiona epidemias en lugares
distantes del mundo.
RNAss
1. Virus de la Influenza Aislado de pato migratorio.
El virus muestra polimorfismo espigas de H (hemoaglutinante)
y N (neuraminidase) que se proyectan desde la superficie de
envoltura.
2. Un virin roto, mostrando envoltura espiral del
Nucleocpside formado por RNA de cadena nica y protena,
de 9 nm de dimetro que forma una super espiral sistemticamente
(marcado con flecha).
86
87
VIRUS DE INFLUENZA, Orthomyxoviridae

(Subp. Virologa, Biologa molecular-rea de Genmica)
Primer caso en Ecuador identificado en Mayo de 2009, en humano

A partir de hisopado nasal aislado va alantoideo en cultivos de
huevos embrionados de gallina.
Microscopa Electrnica: El virus muestra polimorfismo espigas
de H (hemoaglutinante) y N (neuraminidasa), desde la superficie de
envoltura. Dimetro: 100 nm.
88
Virus Influenza. Su propiedad aglutinante en los eritrocitos de pavo.
89
6 PARAMIXOVIRUS, Tipo 1. PARAMIXOVIRIDAE

Tambin conocido como Parainfluenzavirus o Virus de
SENDAI. Llamado as por haber sido encontrado por primera
vez en Sendai-Japn, proveniente de casos de neumona en recin
nacidos.
Posterior a ello, se han conocido virus comunes en animales y han
sido clasificados como Paramyxovirus Tipo 1.
El nucleocpside del Paramixovirus tiene una estructura similar con
el de Influenzavirus, sin embargo, el dimetro del nucleocpside es
de 18 nm, y no forma una espiral sistemticamente, como la que
vemos en el virus de influenza.
RNAss
1. Paramixovirus Tipo 1. Tincin negativa.
Muestra gran polimorfismo, y algunas partculas que se
desorganizaron, se rompieron durante el proceso de purificacin.
Nucleocpside en virin.
Paramyxovirus tambin tiene espculas(flecha).
2. Nucleocpside purificado.
90
91
UN ESTUDIO ANTIGUO DE PARAINFLUENZA Typo 1

(Virologa 16, 1962.)
El estudio se public en 1962, en ese entonces la Tincin Negativa

no era muy popular todava.
Por lo cual se utilizaba el Mtodo de Sombreado para observar las
partculas del virus.
El mtodo usado para el estudio consista: El virus se absorba de la
clula roja de sangre de pollo, de la clula entonces se hacan cortes
finos. Tambin se haca la Fijacin doble con gluteraldehdo y cido
smico, para luego ser incluido en Epon, ya que en ese entonces no se
haba desarrollado la resina todava.
En el estudio actual se us una simple fijacin de cido smico
incluida en resina de methacryl.
1. Virus de Sendai, absorbido en glbulo rojo de sangre de pollo.
Despus de la absorcin del virus, la clula roja, fue tratada por
hemlisis. Sombreado de Cromo.
2. Cortes finos del virus Sendai, absorbido de la
clula roja de sangre de pollo. Flecha: virin.
N; ncleo de la clula roja de pollo.
92
93
7. VIRUS DE LA RABIA, RABDOVIRIDAE.

(De Lab. Inmunoqumica., INHMT)
El virus de la rabia posee nucleocpside en espiral parecido al

myxovirus.
RNAss
1.
Virus de la rabia, en cerebro de ratn, infectado artificialmente.

La flecha indica el estadio del revelado del virin
2. Virus de la rabia purificado parcialmente.
3. Nucleocpside liberado desde el virin, durante la purificacin.

Puede verse de la fibra de ncleo protena, parcialmente

desenrollada (cabeza de flecha).
94
95
8. Virus de Inmunodeficiencia Humana (VIH-1)

Linfocitos infectados in Vitro
Rev. Ecua Higiene Med. Tropical. Vol. 42 2005

La lnea celular de linfocito K562 infectada con el virus de
inmunodeficiencia humana 1 (VIH 1), ha sido usada para el diagnstico
de la infeccin por este virus, con la tcnica de anticuerpos fluorescentes
(FA). Siendo posible detectar el antgeno viral en una clula blanco.
FITC Positivo en la mayora de los linfocitos,

marcando el anticuerpo Fluorescente.
Microscopia Electrnica de Linfocito no infectado

96
Partculas de HIV, vistas por fuera de la membrana citoplasmtica,

infectando al Linfocito.
Microfotografa Electrnica con magnificacin. Partculas de HIV,

cerca del borde de la membrana citoplasmtica del Linfocito
M: Mitocondria
N: Ncleo
97
9. CORONAVIRUS, CORONAVIRIDAE
(Archivo de Virol., 66, 1980, y Arch. 67, 1981)
Los Coronavirus para investigacin se aislaron de diarrea de ratones

infantes.
Los coronavirus infectaron clulas (cultivadas in Vitro), obtenindose
una clula gigante por medio de fusin celular.
RNAss
1. Una clula gigante teida con anticuerpo fluorescente para
Coronavirus. (Microscopio fluorescente).
2. Una clula gigante observada en Microscopio Electrnico de Barrido.
3. Igual que en la Fotografa 2, pero con clulas absorbidas de eritrocitos
de ratones.
98
99
4. Alta magnificacin de SEM, de anterior Fotografa 3.

5. Una vista de coronavirus en clula infectada.
Ntese: muchas partculas de virus que brotan desde la superficie
de la clula.
Las estructuras en forma de varillas son microvellosidades de la
clula principal.
6. Coronavirus purificado. Las proyecciones tpicas son claras, miradas
con semejanza de proyecciones como corona de sol.
100
101
10. PARAPOXVIRUS, POXVIRIDAE MOLUSCO

CONTAGIOSO
(De Dispensario Dermatolgico MSP)
Paciente present en piel, ppulas traslcidas, umbilicadas.
Dimetro 0.2 0.4 cm., color gris-pardusco, de consistencia dura.
Cuerpo de Molusco. Microscopa de luz. Tincin: HematoxilinaEosina.

Hiperplasia dermoepidrmica reactiva, masa confluente, en forma de
media luna, abierta al exterior: queratinocitos alterados, virus en matriz
proteica, dispuestos en gran inclusin citoplasmtica homognea, a
nivel de los estratos granuloso y crneo.
102
Parapoxvirus. Microscopa Electrnica de Transmisin.

Tcnica de Tincin negativa. Las partculas virales miden 300 x 250 um
hasta 400 x 290. Forma de ladrillo, ADN. Superficie externa en espiral,
con dimetro de 10 um.
103
11. VIRUS DEL SNDROME DE LA MANCHA BLANCA

(White Spot Syndrome Virus: WSSV)
(De Drs. J. Rodrguez y J. Melena, CENAIM, ESPOL)
(Journal of Fish Disease, 2003, 26, 439-450)
WSSV est clasificado como non-ocluido baculovirus como uno

miembro de BACULOVIRIDAE.
DNAds.
1.
Signos de enfermedad : manchas blancas
2.
Corte fino de tejido de las agallas de camarn infectado.

Gran cantidad de partculas virales son vistas en el ncleo.
Tambin, se observan partculas esparcidas en el citoplasma.
Partculas virales en el ncleo. Dispuestas en arreglo
de semi- cristales.
3.
104
105
4. Fase diferente de formacin del virin.

A. Un cpside cubierto con membrana
(envoltura viral) (corte fino).
B. Virin completo (Tincin negativa)
C. Virin parcialmente degradado.
D. Cpside parcialmente desnudo.
5. Cpside desnudo. Alta magnificacin.
Ntese: estructura como patrn geomtrico.
6. Cpside degradado. Nota: estructura igual al nucleosoma.
106
107
12. VIRUS DE MULTI NUCLEAR POLIHEDROS(MNPV)

(De N. Molina, Jardn Botnico de Guayaquil)
El MNPV pertenece al Bacloviridae, al igual que el WSSV.

DNAds
En este MNPV investigado, se infect nicamente la larva de Lepidptera,
y la larva parasit nicamente a la planta de la fruta pasionaria.
1. Lepidptera nymphalidae
2. Planta de pasionaria.
3. Colonia de larvas en la hoja de la planta de la fruta pasionaria.
4. Una larva
5. 6. Polihedros en un ncleo, en el intestino medio de una larva
infectada.
7. Alta magnificacin de un polihedro con partculas virales.
8. Polihedro formado con una sola entidad de partculas proteicas,
llamado polihedrin.
108
109
Polihedros en ncleo, localizado en intestino medio de larva infectada
110
Alta magnificacin, de un polihedro con partculas virales
Partculas del virus ocluido en un polihedron, con envoltura fuerte que

lo protege del medio ambiente
111
13. VIRUS EN ORQUDEA

En Orqudeas del Jardn Botnico de Guayaquil, se encontr Sndrome
de mosaico, en muestras proporcionadas por N. Molina.
1. El sndrome del mosaico en una flor.
2. El inicio de la necrosis en una hoja.
3. El mtodo de la prueba de sumersin (Dip test), es utilizado para
examen de virus en plantas.
Se realiza de la siguiente manera:
A. De una hoja sospechosa, se toma un pequeo pedazo del
espcimen.
B. Sobre el papel Parafilm que contiene gotas de PTA sumerja la
muestra de la hoja infectada.
C. Luego, tomar un Mesh ( cubierto con pelcula de apoyo) en la
gota de PTA y posteriormente secarlo completamente este Mesh.
112
3 Dip test
113
4. Un resultado de Dip test

Se ven partculas virales filamentosas.
En (A) un grupo de partculas miden 12 x 200 nm.
En (B) otro grupo de partculas tienen una medida de
18 x 300 nm.
114
5. Corte fino del tejido de hoja de orqudea.

Se ve gran cantidad de partculas del virus. Especialmente, las
partculas del grupo (B) de 18 x 300 nm, que se hayan colocadas
como en una serie de cristal, y las partculas del grupo (A) de 12 x
200nm que muestran ms flexibilidad. Supongamos que:
A: Pertenezca a la familia de Potexvirus.
B: Pertenezca a la familia de Tomabovirus.
115
14. VIRUS DEL MOSAICO DE LA CAA DE AZCAR

(SUGAR CANE MOSAIC VIRUS, SCMV)
(De Ing. Freddy Garcs O.,CINCAE)
SCMV es un tipo de Potyvirus y el sndrome principal es mosaico en

hoja de caa de azcar. El Potyvirus se lo encontr como Virus de la
patata Y, causante de enfermedad no slo en la patata, sino tambin,
en otras plantas. La infeccin es causada por un cido.
RNAss.
Este virus puede ser detectado por Dip Test (explicado en la seccin
de virus en orqudea), por lo cual, el corte fino del tejido infectado dar
mejor informacin.
Debido a que los Potyvirus producen una forma muy especfica de
inclusiones en el tejido infectado.
1. El sndrome del mosaico aparece en forma evidente en hojas tiernas
de la caa de azcar.
2. Un cuerpo de inclusin formado en el citoplasma.
116
117
3. Otra forma de cuerpo de inclusin.

Nota: Muchas lneas paralelas. Este es un corte transversal de estructura
estropeada.
4. Muchas partculas del virus son vistas en el citoplasma ( estructuras
de fibras con flecha ).
118
IDENTIFICACIN DEL VIRUS

Para la clasificacin exacta de un virus, no solo se necesita de su
identificacin morfolgica, sino de otros exmenes de ms especificidad,
tales como inmunolgicos, y/o anlisis del cido nucleico.
Sin embargo, es claro que en el estudio de las caractersticas
morfolgicas, la microscopa electrnica ofrecer mayor evidencia en
la determinacin de los virus.
Por ejemplo, la infeccin del virus en plantas, tal como Tomabovirus,
Potexvirus y Potyvirus, podr identificarse incluso desde el tamao y
la forma del virin.
119
15. VIRUS ESTRIADO DEL BANANO

(BANANA STREAK VIRUS, BSV)
(De Ing. R. Paz, INIAP)
El BSV se clasifica como un miembro de BADONAVIRUS , no tiene

envoltura, y sus partculas baciliformes tienen un tamao de 30 x 130150 nm. El vector es un insecto harinoso (Planococcus citricus).
DNAds.
1. Manifestaciones de los sntomas en hoja
2. Partculas del virus purificado. Tincin negativa. La cantidad de
produccin del virus en una planta de banano infectada es muy poca
comparada con otros virus en plantas y la purificacin es difcil.
3. El vector en una parte cercana a la raz.
4. Un insecto harinoso (SEM)
120
121
16. VIRUS DE RAYA NECROSIS DEL ARROZ

(RICE STRIPE NECROSIS VIRUS, RSNV)
(De Ing. R. Paz, INIAP)
El RSNV es un miembro del Furovirus, el vector es un hongo,

Polymixa graminia en tierra, causante de la severa enfermedad en la
planta del arroz, as como de su malformacin con el despojar y el
entorchamiento de sus hojas.
RNAss (Ver pgina siguiente)
1) Malformacin de la planta, ( flechas ).
2) Partcula del virus encontrada por Immuno Absorvencia en
Microscopa Electrnica. (Ver mtodo de ISEM)
122
En la actualidad el tipo de cido nucleico de RSNV, no est todava

claro. Una publicacin inclua una investigacin sobre doble cadena
de RNA y tejido infectado con RSNV; sin embargo, no se mencion
exactamente el tipo de cido nucleico viral.
En general, los virus conocidos tienen ncleo cpside en forma de una
estructura helicoidal, con cadena doble de RNA, no se han reportado
estos hallazgos en plantas o animales con el mismo tipo de virus.
123
INMUNO ABSORBENCIA POR MICROSCOPIA

ELECTRNICA
(IMMUNO SORBENT ELECTRON MICROSCOPY, ISEM)
Usando cualquier tcnica inmunolgica en microscopia electrnica,

puede llamrsele Inmuno Electron Microscopa (IEM). En la
categora pueden ser incluidos muchos mtodos.
1. Usando anticuerpo etiquetado (Refirase el comentario en
Tincin Electrnica).
2. Prueba la reaccin de Antgeno-Anticuerpo en microscopia
electrnica. (Micro aglutinacin del antgeno como partculas del virus.)
3. La preparacin del mesh con un anticuerpo, recibe el nombre
de Inmuno Absorbencia Electron Microscopa. (ISEM).
El principio de ISEM se ilustra en la siguiente pgina.
A: La gota de anticuerpo.
B: Absorber molcula del anticuerpo a la pelcula del Mesh.
C: El anticuerpo absorbido del Mesh, reacciona al antgeno
homlogo (virus).
D: El antgeno (virus) poner sobre la mesh.
Estar listo para ser observado en el microscopio electrnico, despus
de la tincin negativa.
124
125
17. Comentario sobre la infeccin con Potyvirus

Generalmente el virus que infecta a un tejido, no se lo hace en las plantas
o animales; y usualmente forma el llamado cuerpo de inclusin, que
nos orienta a informarnos de que existe una infeccin viral.
En el caso de la infeccin por el Potyvirus, se conocen cuatro tipos de
inclusin. Ver abajo.
Cuatro tipos de inclusiones
(Edwardson, et al, 1978,1984)
Quinto tipo de inclusiones encontradas en papaya
126
17-1. Infeccin de Potyvirus, en Sandia
Inclusiones tpicas existentes, que demuestran claramente Infeccin

con Potyvirus
127
En este caso, Potyvirus y Mycoplasma (M) se encuentran infectando

la misma clula. En este momento no existe el 100% de seguridad, sin
embargo, en plantas, un vector como Saltamontes, puede transferir el
virus y el Micoplasma en la misma ocasin.
128
17-2. Potyvirus en Meln (De INIAP)
129
17-3. Palma de Aceite Africana con Potyvirus
(De INIAP. Estacin Experimental de Santo Domingo

de los Tschilas)
Signos del Anillo Clortico en hojas
Corte fino de hoja con Inclusiones laminadas en el citoplasma.

130
17-4 Arachis hypogeo (familia del man)

Nombre Cientfico: Arachis Hipogaeae
Plantas populares en jardines
Plantas de Flor Amarilla en el Centro de Guayaquil.
Malecn 2000 de Guayaquil.

131
Los signos del mosaico son observados en las hojas

de Arachis Populares en jardines
Esta planta es popular en la Ciudad de Guayaquil, sirve como reservorio

de Potyvirus, infeccin de man.
132
17-5. Papaya infectada con Potyvirus.
Signo de anillo en cscara de papaya
Mtodo del Dip Test en Papaya. Se encontr gran concentracin de

Potyvirus.
Por el mtodo de cortes ultra finos se encontr un tipo muy especial
de inclusiones.
Debera ser el quinto cuerpo de inclusin de Potyvirus.
Reporte similar se encuentra en investigaciones de Orqudeas.
Observar la primera pgina de esta seccin.
133
17-6. Caso del Maz infectado con Potyvirus

(De INIAP)
Un ejemplo de Dip Test. Hoja de maz con dos tipos de infeccin;

Potyvirus (P) y (R) Virus del Rayado Fino del Maz (MRFV)
pertenece al mismo grupo de Poliovirus
134
Baja magnificacin en cortes de tejido.
Cloroplasto (Ch)
Alta magnificacin en la misma rea
Grupo de Potyvirus concentrados en la parte central, agregaciones de

partculas como estructuras filamentosas, MRFV.
135
18. RICKETTSIA
La Rickettsia es un parsito intracelular obligado. Morfolgicamente
muy similar al bacilo, la diferencia solamente es muy pequea con
relacin a la del bacilo ordinario.
1. Demostracin de una clula L de ratn (tejido conjuntivo subcutneo
del ratn) inoculado con
Orienta tsutsugamushi
(anteriormente llamada Rickettsia tsutsugamushi.)
2. Alta magnificacin del rea (1) de Rickettsia brotando de la superficie
de la clula. (SEM)
3. Rickettsia en citoplasma (corte fino).
136
137
19. BARTONELLA BACCILIFORMIS

(Am. J. Trop. Med. Hyg., 57, 1997)
Bartonella pertenece al Orden de Rickettsiales, con otros tipos tales

como B. doshiae, B. grahamii y otros.
La B. bacilliformes es el patgeno de bartonellosis (o Fiebre de
Oroya), que es endmico de los Andes en las reas montaosas de
Per y Ecuador. Tambin, se conoce que se encuentran casos leves, en
reas de la costa del Ecuador (Guayas y Manab).
La bartonellosis presenta dos fases de manifestaciones clnicas, la fase
aguda y la fase crnica. La fase aguda se caracteriza por presentar
fiebre alta, dolor de cabeza, dolor de huesos, dolores musculares
y anemia.
Despus de algn periodo, le sigue la fase crnica que se manifiesta con
erupciones de verrugas en el cuerpo. Sin embargo, en el rea de la
costa del Ecuador, los sntomas son de alguna manera moderados,
comparados con los casos que se presentan en el Per o en
Zamora Chinchipe de Ecuador.
138
Un caso leve encontrado en Guayaquil.
Un caso severo de verruga, antes del tratamiento
139
Un caso severo de verruga, antes del tratamiento
140
B. bacilliformis con Tcnica de Tincin Negativa
B. bacilliformis en verruga, tejido obtenido por biopsia.
141
20. BACTERIFAGO en B. bacilliformis

(Microbiol. Immunol., 36, 1992)
En un estudio sobre B. bacilliformis, se encontr un bacterifago.

1. Algunas partculas del fago adheridas a la B. bacilliformis. (Tincin
negativa).
2. Partculas de fago en citoplasma de B. bacilliformis (corte fino). Dentro
del citoplasma los fagos no poseen cola estructurada.
3. Partculas de fago expuestas, despus de romperse. B. baciliformes.
(Tincin negativa)
4. Dibujo esquemtico de fago de B. bacilliformis.
142
143
21. Plesiomonas shigelloides, GNERO: Plesiomonas

Son bacterias Gram negativa. Se encuentran en agua dulce de
reas tropicales y subtropicales.
Causantes de diarrea
Poseen varios flagelos en la parte terminal baciliforme.
1. Apariencia en forma de natacin (los flagelos estn abultados
en un fajo).
2. Observado en un TEM, similar al visto B. baciliformes.
3. Cerca del origen del flagelo.
Plesiomonas shigelloides, Tcnica de Tincin Negativa
144
Magnificada cerca del origen de flagelos
145
4. Cerca al origen del flagelo (algunos flagelos saliendo, muestran

agujeros).
146
5. Demostracin detallada del origen de los flagelos.

Exhibicin tpica de la estructura de los flagelos de las bacterias
Gram negativas.
147
22. GRNULOS DE METACROMATINA

En Plesiomonas shigelloides
(Microbiol. Immunol. ,31, 1987)
Los P. shigelloides producen grnulos de metacromatina dentro

del citoplasma, como el Corynebacterium diftheriae.
1. El P. shigelloides. A las 4 horas de cultivado
Ntese: el pequeo tamao de grnulos de metacromatina. Sin
tincin, TEM.
2. A las 24 horas de cultivado el P. shigelloides, el tamao de los
grnulos de metacromatina es ms grande que a las 4 horas de
cultivado.
Sin tincin, TEM.
3. Resultados del anlisis de la Radiografa del grnulo de
metacromatina.
TEM con analizador de Rayos X.
Como resultado de grnulos de metacromatina vemos la alta
concentracin de la entidad de fosfato.
148
149
23. NEISSERIA MENINGITIDIS

(De Lab. Bacteriologa, INHMT)
El gnero Neisseria es conocida como diplococo capsular.

1. N. meingitidis. SEM
2. N. meingitidis. Tincin negativa TEM
En ambas fotografas las clulas bacterianas muestran superficie
irregular y esto es evidencia de la existencia de cpsula.
.
150
151
24. ESTAFILOCOCOS
Los estafilococos y estreptococos son las bacterias ms comunes

alrededor de nuestra vida.
Estafilococos aureus cultivado en agar nutritivo a 37C.

1. Sombreado con aleacin de platino y paladium.
La forma del sombreado nos indica si es esfrica tpica, o
ligeramente aplanada.
Algunos cuerpos esfricos tienen lneas atravesadas de la esfera y
esto nos indica una completa de la divisin de clula.
2. Al igual que 1, pero en este caso la fotografa muestra que se us al
mtodo de tincin negativa.
Ntese alguna bacteria separada por la membrana celular, pero
todava adherida al igual como una esfera.
152
153
25. ESTREPTOCOCOS
Estreptococos hemolticos cultivados en agar sangre, a 37C.

1. Mtodo de Sombreado con aleacin de platino y paladium.
Ntese el tpico arreglo esfrico de las bacterias.
2. Al igual que 1, pero la fotografa revela que se utiliz el mtodo de
tincin negativa.
Ntese la direccin de divisiones de las clulas. Ya que todas las
clulas se dividen siguiendo una misma direccin, para formar una
cadena.
Tal como se vio, en el estafilococo despus de la terminacin de
divisin de clula, dos clulas hijas estn todava adjuntas igual
como una sola clula
154
155
26. GNERO VIBRIO
Vibrio clera y Vibrio parahemoltico
Son bien conocidos como los causantes de gastroenteritis y diarrea.

1.
El Vibrio clera tiene la forma de una coma , y un flagelo polar,

es tambin llamado Clera coma.
Tincin negativa. TEM.

2.
Vibrio parahemolytico es muy parecido al V. clera y ocasiona

gastroenteritis por la ingesta de alimentos provenientes del mar,
con la diferencia de que no tiene forma de coma.
Puede cultivarse en altas concentraciones de sal al 3 %.

Mtodo de sombreado. TEM.
156
157
27.
Campylobacter jejuni, GENERO: Campylobacter.
Los animales domsticos y el pollo son los portadores de C. jejuni,

y puede ocasionar diarrea en el humano.
El Campylobacter crece bajo las siguientes condiciones :
Oxgeno: 5%
Dixido de carbono: 10%
Nitrgeno :85%.
Usualmente se usa Skirows, como medio para aislamiento de muestras
fecales, en una jarra conteniendo Gas Pack.
1. C. jejuni, TEM, Mtodo de Sombreado.
2. C. jejuni, despus de tratamiento con trypsine a baja concentracin.
Las estructuras de base del flagelo estn bien e TEM, Tincin
negativa. .
158
159
3. Igual que 2. con magnificacin a nivel de la base de los flagelos
4. Presentando discos estructurales en ambos extremos, al

bacteriana.
clula
5. Detalle de la estructura del disco.

A: Fotografa original.
B: Tratado con la tcnica de rotacin.
Ntese: La estructura del disco es similar al Gnero de Spiirillum.
160
161
28. Leptospira interrogans

Leptospira pertenece al orden de las Espiroquetas. Varios serotipos
son incluidos en el Gnero Leptospira, tales como icterohemorrgiae,
hebdomadis, canicola y otros.
1. L. interrogans serotipo icterohemorrgae.
Microscopia de Luz, Campo oscuro.
2. Igual que 1, sin embargo aqu usamos el mtodo de Sombreado

para TEM.
3. Igual que 2, pero aplicando la Tcnica de tincin negativa. TEM.
162
163
29. FILAMENTO AXIAL de L. interrogans

La Leptospira tiene un filamento axial en cada uno de los
extremos del cuerpo espiral.
El filamento axial es un rgano que le sirve realizar sus movimientos,
como lo es el de los flagelos de otras bacterias, sin embargo, el
mecanismo de su movimiento es muy misterioso.
Cada filamento axial originado cerca del extremo final del
espiral del citoplasma y cubierto con una membrana exterior.
1. El filamento axial de L. interrogans.
TEM, Tincin negativa,
2. Filamento axial y citoplasma. Es evidente el filamento axial
y citoplasma cubierto con la misma membrana exterior.
TEM, corte fino.
3. Dibujo esquemtico de Leptospira.
164
165
30. Histoplasma capsulatum
(Lab. Immunochimica, INHMT)
La histoplasmosis es una enfermedad mictica ocasionada por el

Histoplasma capsulatum.
El hongo es muy infeccioso y muchas personas jvenes que viven en
reas endmicas presentan enfermedad respiratoria leve, aunque en
algunos casos son asintomticas.
El Histoplasma. capsulatum tiene una fase de levadura en tejido
infectado y cultivado en agar sangre a 37C y otra fase de hongo
cultivado en el laboratorio a la temperatura ambiente del cuarto.
1. Colonias con aspecto de algodones blancos, crecidas a temperatura
ambiente del cuarto en Agar Sabourand.
2. Alta magnificacin. Mostrando macroconidias y microconidias
166
167
Histoplasma capsulatum
Cultivado en Agar Sangre a 37 C.
1.
Colonias de H. capsulatum.
Baja magnificacin. SEM.
2.
Alta magnificacin de 1.
Forma de levadura.
168
169
31. CENIZAS DEL VOLCN TUNGURAHUA

En Mayo 23 del 2010, se recogi polvo descendiente del aire, en el
centro de la ciudad de Guayaquil
.
Es seguro, que la mayor parte del polvo es originario del Tungurahua,
sin embargo algunas partes pertenecern a otros orgenes incluyendo
polvo csmico
Microfotografias electrnicas por SEM
170
Partcula sugestiva de origen volcnico.

La mayora de este tipo contiene trazas de Vanadio
171
Esta partcula es sospechosa como POLVO CSMICO,
Sin embargo nunca se encontraron elementos de Hierro
172
32. ANGYOSTRONGYLUS CANTONENSIS espcula copulatrz,

(De Y. Amano,Ph.D, Linda .Daz Cevallos ,MD.,
Mgs. L. Martnni,MD.Mgs)
Laboratorio de Microscopia Electrnica,
Instituto Nacional de Investigacin en Salud Pblica INSPI
Universidad Estatal, Guayaquil -Ecuador
En el Ecuador mediante el anlisis por Microscopia Electrnica de

Transmisin y de Barrido, se ha logrado evidenciar la caracterizacin
Morfolgica del parsito Angiongiostrongylus cantonensis, con
nfasis en el parsito macho a nivel de su Bursa Copulatriz y Espcula.
A
Fig. 1. Microscopia Electrnica de Scannig y Microscopia ptica

Angyostrongylus Cantonensis: Tpica Espcula copulatriz con puntas
libres.
173
Fig.2. Bursa y raz de espcula copulatrz. Las Espculas se juntan

formando una estructura tubular
Fig. 3 SEM. Angyostrongylus Cantonensis: Espcula copulatriz:

Cortes finos( siguientes fotos se vern por TEM) a diferentes niveles:
1. Vemos el primer corte, realizado a nivel de la punta terminal libre.
2 y 3. Cortes a nivel parte media de espcula. 4. A nivel de raices de
espculas juntas.
174
Fig. 4: TEM: Espcula copulatriz: Corte ultrafino corresponde a la

figura anterior ( 3 ), al primer corte en 1 a nivel de la punta terminal de
la espcula. Ntese que la espcula no es una estructura rectilnea, sino
que muestra estructuras curvas separadas en su centro, parecidas
como alas que se encuentran al final.
Fig. 5. TEM Espcula copulatriz: corte ultrafino, corresponde en la

figura anterior (3) al segundo corte en 2 despus de la punta de la
espcula. Se evidencian las races de dos espculas como estructuras
pareadas, existiendo entre ellas una apertura que conectara con rgano
testis
175
Fig. 6. TEM corte ultrafino, corresponde en la figura anterior (3) al

tercer corte, en la parte media. Se evidencian las races de dos espculas
como estructuras pareadas, existiendo entre ellas una apertura que
conectara con rgano testis
Fig. 6. TEM Espcula copulatriz: Cortes finos, corresponde al 4to corte

en la Fig. 3, a nivel de raz de espcula, cerca de Bursa . Muestra las races
de dos espculas pareadas y entre ellas existe apertura, que conecta
con rgano testis. reas de las espculas: En relacin con el corte 4:
Muestra las races de dos espculas. Entre las races de las dos espculas,
existe apertura, que conectara con rgano testis.
176
Captulo 3
BREVE HISTORIA DEL
MICROSCOPIO
BREVE HISTORIA DEL MICROSCOPIO

La palabra microscopio se refiere al instrumento utilizado para
ver objetos pequeos.
Histricamente se ha ido implementado un amplificador de lente simple
y microscopio compuesto. Dos o ms lentes son combinados para
magnificar un objeto, lo cual es conocido como microscopio
compuesto.
Amplificador de lente simple
Se ha especulado que algunos tipos de lentes magnificadores
fueron usados en la Edad Griego-Romana.
En lo que respecta al microscopio compuesto, es ampliamente conocido
que en el ao 1.595, Zaccharias Janssen y su hijo Han, dos holandeses
fabricantes de vidrio, fueron los que lo experimentaron.
Ellos instalaron lentes convexos en los extremos de un tubo de 45 cms
de largo. En 1.663, el fsico ingls Robert Hooke (1.635-1.703)
construy un microscopio compuesto en el cual hizo observaciones
de objetos pequeos con bonitos bocetos. Los resultados fueron
publicados como Micrograph en 1.665.
Se lo especula como dos lentes convexos atados a ambos extremos de
un tubo, que media 45 cm de largo. Abajo foto.
Microscopio de Zaccharias Janssen y su hijo (Imaginacin)

178
El microscopio de Robert Hooke y sus observaciones,

Publicado como Micrographia
HISTORIA:
Robert Hooke (1635-1703) e Isaac Newton (1642-1727), nacieron
en Inglaterra.
Cuando Hooke era el encargado de la Sociedad Real de Londres, tena
serias discusiones con Newton sobre sus investigaciones. Despus de
esto ambos se odiaban.
Hooke muri en 1703. Newton se convirti en Presidente de la
Sociedad Real de Londres en 1710 y destruy todo lo que quedaba de
Hooke, incluyendo su retrato.
No existe precedente del retrato real de Hooke. El microscopio de
Hooke fue reproducido de su libro Micrographia
179
Algunas fotos de Micrographia
180
Anton van Leewenhoke (1632-1723) se llev una gran impresin

del libro Micrographia y comenz la construccin de su propio
microscopio. Era un simple magnificador de lente (ver foto).
En 1674 encontr Animacles, que ahora se reconoce como
protozoarios y bacterias de agua lluvia. Ms tarde encontr criaturas
microscpicas en la boca y excremento.
En 1683 present sus observaciones como Animacles a la Sociedad
Real de Londres. Fue aceptado como miembro de la sociedad. En ese
tiempo, Robert Hooke era el encargado de la sociedad.
181
En la historia de la microbiologa, Anton von Leewenhoke ha sido

nombrado el primer descubridor de bacterias, por sus observaciones
de Animacles. Se deca que Anton von Leewenhoke era un mercader
de textiles y rutinariamente usaba su magnificador para chequear su
mercadera.
Como se observa en las fotos, el microscopio de Leewnhoke es un
magnificador de lente simple, sin embargo, el microscopio de Hooke es
un tipo de microscopio compuesto y los principios son muy similares a
los del microscopio moderno, usados en los presentes das.
Algunos historiadores evalan que el microscopio de Leewnhoke tena
un poder de magnificacin de X200, en cambio el microscopio de
Hooke tena un poder de magnificacin de X150, razn por la cual
consideran que el microscopio de Leewnhoke es superior al de
Hooke.
Sin embargo, los autores sealaron que el microscopio de Leewnhoke
no podra ser til para uso comn como instrumento cientfico, puesto
que es solamente un magnificador de lente que se sostiene en la mano.
En cambio, el microscopio de Hooke puede ser usado como lo hacemos
actualmente y puede ser considerado un prototipo del microscopio
compuesto moderno.
182
IMPORTANTES INVENCIONES DEL MICROSCOPIO

Alrededor del siglo XVIII, se produjeron importantes revoluciones en
microscopios pticos, realizadas por Ernst Abbe (1840-1905) y Carl
Zeiss (1816-1888)
Las invenciones de Abbe fueron el condensador de sub etapas y el
sistema de lente objetivo de emersin de aceite.
El condensador es un sistema de iluminacin para especmenes. Debido
a que es esencial tener un espcimen ms iluminado para obtener una
imagen clara en mayor magnificacin. As tambin el sistema de
lentes de objetivo de emersin de aceite puede eliminar la prdida de
iluminacin del espcimen. Como resultado, tuvieron xito en obtener
un poder de magnificacin de X1000.
Tambin abrieron libremente al pblico, sus invenciones en diseo de
microscopios.
La invencin del microscopio de Abbe, trajo un gran impacto en los
avances de la bacteriologa.
DESCUBRIMIENTOS DE BACTERIAS
PATOGNICAS: (INVESTIGADORES Y AO)
Mycobacterium tuberculosis
Vibrio comma

Corynebacterium diphtheriae
Clostridium tetani

Meningococcus

Pasteurella pestis
Shigella dysenteriae

Shigella flexneri

Treponema pallidum

Bordetella pertusis

183
Koch 1883
Koch 1883
Klebs 1883, Loeffler 1884
Klens 1883, Kitasato 1889
Weihselbaum 1887
Kitasato, Yersin 1894
Shiga 1898
Flexner 1900
Schaudinn, Hoffmann 1905
Bordet, Gengou 1906
El perodo de 1882 a 1910 es conocido como la Era dorada del

descubrimiento
AVANCES DEL MICROSCOPIO PTICO
Se dice que el Dr. Robert Koch (ver pgina siguiente) usaba un

microscopio muy similar al modelo de 1880 de Carl Zeiss. (ver foto
arriba).
184
Louis Pasteur
(1822-1895)
Louis Pasteur, cientfico francs (+). Desaprob la teora de la
Generacin espontnea, en el ao de 1860-1861. Realiz muchas
investigaciones incluyendo un mtodo de tratamiento en las
vctimas de rabia.
Robert Koch
(1843-1910)
Bacterilogo Alemn (+). Encontr muchas bacterias patgenas y fue
quien inici la bacteriologa moderna.
La postulacin de Koch es conocida como el principio de la
bacteriologa patgena
185
DESARROLLO DEL MICROSCOPIO ELECTRNICO

En 1931, Max Knoll y Ernest Ruska construyeron el primer
microscopio electrnico de transmisin. Se dice que la magnificacin
de poder era de X16. Max Knoll fue profesor de la Universidad
Tecnolgica de Berln y Ernest Ruska fue estudiante, Ph.D.
En 1932, Ruska sugiri la construccin de un nuevo microscopio
electrnico para hacer imgenes directas de especmenes para insertarlas
en la columna del microscopio, similar a los diseados en la mayora de
los microscopios de transmisin.
En 1933, Ruska tuvo xito al construir el primer microscopio
electrnico de transmisin, el cual tena una magnificacin ms alta
que la del microscopio ptico.
El primer microscopio electrnico de transmisin comercial
(TEM) fue producido por Simens en 1939, sin embargo, en el mismo
ao comenz la segunda guerra mundial y el desarrollo del TEM fue
disminuido hasta fines de la guerra en el ao 1945.
Despus de la guerra, la produccin del microscopio electrnico se
convirti en un nuevo negocio en muchos pases y lleg a ser un
instrumento cientfico popular en muchas reas.
En lo que respecta al Microscopio Electrnico de Scanning (SEM),
Manfred von Ardenne construy un Microscopio Electrnico de
Scanning Transmisin (TSEM) en 1938. Se dice que la magnificacin
era de X8000, su poder de resolucin era de 50 a 100nm y lo haca en
un tiempo de 20 minutos, la toma de una fotografa.
Luego de la Guerra Mundial, el Microscopio Electrnico de Scanning
tambin hizo un gran desarrollo con la nueva tecnologa electrnica.
En 1986, Ruska fue condecorado con el Premio Nobel de Fsica
por sus logros en ptica electrnica, y diseo del primer microscopio
electrnico, al mismo tiempo que Gerd Binnig y Heinrich Rohrer
por el diseo del Microscopio de efecto tnel (Scanning Tunneling
Microscopio.
186
EL PRIMER MICROSCOPIO ELECTRNICO DE

TRANSMISIN COMERCIAL
Manfred von Ardenne (1907-1997)

Fue un talentoso cientfico en electrnica (+). Trabaj un tiempo para
la Unin Sovitica, en la bomba atmica.
187
Captulo 4
NUEVOS TIPOS DE
MICROSCOP IOS
NUEVOS TIPOS DE MICROSCOPIOS

Con los significados tradicionalmente conocidos, el microscopio es un
instrumento que hace magnificar la imagen de un objeto, por medio de
los lentes convexos.
Sin embargo, en el caso del microscopio electrnico de Scanning, un
objeto es escaneado por un rayo fino de electrones, para detectar la
fuerza de electrones secundarios o electrones aislados del objeto y esa
informacin obtenida por escaneo es reconocida como la imagen del
objeto.
Si en el microscopio, en lugar del rayo electrnico, se usa un rayo
lser se lo reconocer como microscopio de Scanning de lser. De
tal manera que si se usa una sonda mecnica, se lo reconoce como
microscopio de Scanning con sonda de electrones.
Microscopio de Scanning de Lser

La mayora de los microscopios de Scanning de lser son llamados
Microscopio de Lser de Scanning Confocal, debido a que la luz
de lser, que ha pasado por un pequeo agujero, es enfocado en un
objeto y el brillo del punto iluminado en el objeto es determinado a
travs de los mismos lentes objetivos, siendo a su vez este, enfocado
en otro agujero situado en frente de un detector, tal como el tubo
fotomulplicador. (Ver la ilustracin).
El segundo agujero, situado en el frente del detector, trabaja para
eliminar la luz incidente indeseable y hace posible formar imgenes
muy claras.
El escaneo del rayo lser, se lo puede hacer moviendo el rayo lser y/o
cambiando el espcimen de la imagen.
El principio del sistema, usando los dos pequeos agujeros (pinhole)
para eliminar la luz incidente indeseable, fue inventado por Marvin
Minsky (1927-1961), quien ha trabajando en muchas reas y es
reconocido como el Padre de la inteligencia artificial.
190
PRINCIPIO DEL MICROSCOPIO CONFOCAL DE

LSER DE SCANNING
(Nikon catalogo)
191
(Olympus Co. Catlogo)
192
(Olympus Catlogo)
193
MICROSCOPIO DE SONDA DE SCANNING

Se conoce como Microscopio de Sonda de Scanning al instrumento
que usa puntas muy finas de sonda, que escanean la superficie del
espcimen y hace fotos topogrficas del espcimen.
En 1981, el microscopio de Efecto Tnel fue inventado como un tipo
de microscopio de sondeo de Scanning. Despus de esto, en 1986, se
invent el Microscopio de Fuerza Atmica y le siguieron muchas
variaciones. El poder de resolucin de los microscopios de sonda
de Scanning es muy alto, sin embargo, el tamao de los especmenes
es limitado, pequeo, aproximadamente pocas cuartas del metro,
debido al sistema de movimiento del espcimen, controlado por
Piezo electric
Microscopio de Efecto Tnel (STM)

Usando el sondeo electroconductivo en un espcimen, en proximidad
suficientemente continua-cerrada, algunos de los electrones pueden
socavar entre la punta y el espcimen sin tener un contacto. La estructura
de la superficie de la muestra es revelada escaneando la superficie
mientras se usa un crculo de retroalimentacin para mantener una
actual y constante persistencia en la muestra.
Ver la ilustracin. La distancia entre la sonda y el espcimen puede ser
mantenida por Piezo electric, instalado con la sonda.
La aplicacin de STM es limitada, y se la utiliza solo para
especmenes electrocondutivos, debido al principio.
El primer microscopio o tunneling de Scanning fue inventado por Gerd
Binning y Heinrich Rohrer, en 1983. Ellos recibieron el premio Nobel
en 1986, con Ernst Ruska, inventor del microscopio electrnico de
transmisin.
194
195
MICROSCOPIO DE FUERZA ATMICA (AFM)

El principio es mostrado en la Fig. 1
Una punta fina de la sonda, fijado al final del voladizo, escanea la
superficie del espcimen y el movimiento de la sonda que va de arriba
hacia abajo es detectado por la luz del lser reflejado, y el movimiento
es convertido para hacer la imagen como la topografa del espcimen.
Por una relacin entre la superficie del espcimen y la punta de la sonda,
existen algunos sistemas modificados, tales como modo contacto,
modo no contacto y otros por el estilo sucesivamente.
En comparacin con STM, AFM es aplicable a especmenes electro
conductivos y no-conductivos, incluso en algunos lquidos.
El Microscopio de Fuerza Atmica fue inventado por G. Binnig con
Calvin F. Quate y Christoph Gerber, en 1985.
Principio de AFM
Cromosomas Humanos en metafase observados por AFM
196
197
INVENTORES DEL STM Y AFM
198
ndice Analtico
A
Aceleracin de voltaje, 2, 15 , 64, 65, 68

Acetato de Uranilo,20,29
cido fosfotnstico 2%, 20
Agar Sabourand, 166
Alineamiento ptico electrnico,9
Almidn de patata, 62,65
Analizador de Rayos X, 145
nodo, 12, 3,52
Auto-radiografa,29
Astigmatismo, 34,40, 63
Bacterifago, 138
Baculoviridae, 101
Badonavirus, 117
Barra de vidrio, 25
Bartonella Bacciliformis, 134, 138
B. doshiae, 134
B. grahamii, 134
Bombardeo de Electrones, 38
Calefaccin, 16, 23
Campo electromagntico, 2
Campo oscuro, 161
Campylobacter jejuni, 21, 156
Can de electrones, 8, 15
Caso severo de verruga, 135
Cpside, 71, 77, 87, 103
Capsmeros, 79, 81
Ctodo 2, 52
Clulas Vero, 81
Ceniza volcnica, 170
Cintillador, 45, 46
Citrato de plomo, 29
Contaminacin, 16, 67
Contaminacin del Espcimen, 38

Contraste de fase, 13
Contraste de la imagen, 13, 27, 29, 59
Contraste de amplitud, 13
Coxsakievirus (AQ16), 81
Colector, 45
Collodion (nitroceluloso), 17
Condensador, 6, 26, 178
Coronavirus, 95
Clula gigante, 95
Corte fino del tejido de hoja, 112
Cortes fino, 22, 89
Corynebacterium diftheriae, 39, 145
Cuerpo de inclusin, 113, 115, 123, 130
Cuchilla de diamante, 23
Cuchilla de vidrio, 23,25
Dixido de carbono lquido, 40

Deshidratacin, 23, 48,49
Destello a chorro (sputtering), 52, 53
Difusin del electrn de incidencia, 58
Dip test, 109, 110, 129
DNAds, 70,79,
Doble envoltura, 75
Efecto borde, 59
Electrn, 2
Electrn aislado, 54
Electrones retrodispersados, 39
Electrones secundarios, 45, 59
Electrn disperso, 45
Embebimiento, 22, 23
Emisin trmica, 2
Enfoque, 13, 36, 40
Envoltura dse Herpesvirus,79
Enfermedades de mano, pie y boca
(Hand Foot and Mouth Disease,
199
HFMD), 81
Entorchamiento, 119
Esparcin Elstica, 13
Esparcin inelstica, 13
Espcimenes voltiles, 16
Espigas H y N,, 83, 85
Espesor, 16
Estafilococos, 150
Estreptocoss Estreptocos hemolyticos,
152
Estructura del Disco, 159
Evaporacin del metal en alto vaco, 20
Exact focus, 37
Fenmeno de carga elctrica, 80

Ferritina, 44
Fibra de Oroya, 151
Field emisin electron gun, 16
Fijacin, 37, 63
Filamento de tungsteno, 16
Formacin de virin , 120
Filamento axial, 181
Flagelo, 158, 160, 171, 181
Fluorescencia en Microscopia de Luz,
44, 109
Foco ptimo, 51
Formval, 31
Fotomultiplicador, 61
Fuerza de tensin de superficie
Furovirus, 136
Gnero Vibrio: Vibrio clera y Vibrio

parahemoltico, 171
Gluteraldehido , 37, 63, 105
Grnulos de metacromatina, 54, 162
Herpesvirus, 95
Hexaborido de Lanthanum (LaB6), 16
Hexiones, 95
Histoplasma Capsulatum, 184
Identificacin del virus, 133

Inmunolgico, 44, 133
Inmuno Absorbencia en Microscopia
Electrnica, (ISEM), 136, 138
Inmuno Electro Microscopa, 44
Inclusiones en el tejido infectado, 130
Integracin Rotacional, 89
Icosadrico, 97
Influenza virus, 99
Lente condesadores, 26
Lente de electrones, 16
Lente intermedio, 19, 20, 26
Lente magntico, 17, 19
Lente objetivo, 26
Lente proyectores, 26
Lepidoptera nymphalidae, 122
Leptospira interrogans
icterohemorrgica, 179
Lmite de difraccin, 28
Longitud focal, 51
Longitud de onda, 16, 27, 28
Macroconidias, 184
Manera de colocar el espcimen (SEM),
72
Masa y espesor, 27, 30, 116
Microscopio Efecto Tnel, 204
Microscopio Fuerza Atmica, 206
Microscopio Electrnico de Barrido, 15,
200
59, 69, 73, 82

Microscopio Electrnico de
Transmisin, 15, 19
Microscopio Scanning de Lser, 200
Microscopio de Sonda de Scanning, 204
Microconidias, 184
Mesh, 31, 35
Mtodo de Secado por Congelacin en
t-butanol, 65
Mtodo de Sombreado, 33, 67
Moir, 55
Montaje, 65
Myxoviridae, 99, 107
Neisseria Meningitidis, 165

Nucleocapside, 99, 103, 137
Nucleosoma, 120
Non ocluido baculovirus, 118
Objetivo, 19
Ojo de Insecto, 75
Onda de Electrones, 16
Opaco de electrones, 35
Orientia tsutsugamushi, 149
Orthomyxoviridae, 101
Origen del flagelo, 158, 160
Oro coloidal, 44
Over focus, 51
<xido de Propileno, 38
Pantalla Fluorescente (cintillador), 47,

60
Papel filtro, 35, 79
Papel parafilm, 126
Pentones, 95
Picornavirus, 97
Polimorfismo, 99, 101, 103

Paramixovirus, tipo I, 103
Planococcus citricus, 134
Planta de pasionaria, 122
Plato de vidrio fotogrfico, 22
Plesiomonas shigelloides, 54, 158
Polivinyl formol (formval), 31
Polihedrin, 122
Polihedros, 122
Polimerizacin, 38
Principio del Sombreado
Principio del Corte Fino
Polymixa graminia, 136
Profundidad de observacin Focal, 53
Protuberancia, 75
Proyector, 19
PSL (ltex polystyrene), 44
PTA, 35, 126
Potexvirus, 129
Potyvirus, 130, 140, 146
Punto crtico, 64
Rayos X, 60
Reaccin de Antgeno-Anticuerpo, 138
Recubrimiento con metal, 67
Resolucin , 28, 30
Resolucin (SEM), 73
Rickettsia, 149, 151
Rickettsia tsutsugamush, 149
RNAds, 86, 99
RNAss, 86, 103, 130, 136
Reoviridae, Reovirus, 89
Rotavirus, 87, 89
RDV, 89
Rotavirus en diarrea infantil, 93
Resina, 37
Resina de methacryl, 105
201
Virus del Sndrome de la Mancha

Blanca, 57, 118
White Spot Syndrome Virus, (RSNV),
136
Virus de Sendai, 103
Virus del Mosaico de la Caa de Azcar
(Shugar Cane Mosaic Virus, SCMV),
130
Virus de Multinuclear Polihedros
(MNPV), 122
Virus Estriado del Banano (Banana
Streack Virus,BSV), 134
Secado Secadora de Punto Crtico, 63

Secador por Congelacin, 63, 65
Sobrecarga elctrica, 67
Sombreado, 67
Sombreado de Cromo, 105
Sonda de Electrones, 60, 200
Sonda, 60
Sper imposicin de imgenes, 55
Sper imposicin de estructuras, 56
Tamao de sonda, 73
t-butanol, 65
Tcnica de Integracin Rotacional, 89
Tetraxido de Osmio, 37
Tincin Electrnica, 42
Tincin Negativa, 35
Tomabovirus, 129
Under focus, 51
Unidad Estructural, 87
Ultra-micrtomo, 37, 139
Vector, 134, 124

Vibrio clera, 171
Vibrio parahemoltico, 171
Virus del Arroz Diminuto (Rice Dwarf
Virus, RDV), 87, 91
Virus de la Inmunodeficiencia Humana,
109
Virus de la Rabia, 107
Virus de la Orqudea, 126
Virus de Raya Necrosis del Arroz
(RSNV), 136
Virus del Rayado Fino del Maz
(MRFV), 147
202
Tercera Edicin Ecuador: Agosto

2015
Impresin Autorizada Por:
Julin Coronel 905 y Esmeraldas

Guayaquil-Ecuador.
Revisin:
Dr. Manuel Gonzlez Gonzlez
Direccin General de Investigacin
y Docencia
Diseo y Diagramacin
Direccin de Comunicacin
Social del INSPI
203
204

Libro Microscopia Electrónica

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INTRODUCCIN A LA

Yasuji J. Amano PhD

Linda Daz Cevallos MD, Msc

Linda Daz Cevallos, MD, MSc

INSTITUTO NACIONAL DE INVESTIGACIN

Ing. Santiago Apunte Castillo

P REFA CIO D E L OS AUTOR E S

D RA . LIN DA D A Z CE VAL L OS , MGS

Ejemplos de Bombardeo de Electrones

CAPTULO 2: APLICACIN EN BIOLOGIA

5. Virus influenza, orthomyxoviridae

31 Ceniza de volcan tungurahua

CAPTULO 3: BREVE HISTORIA DEL MICROSCOPIO

CAPTULO 4: NUEVOS TIPOS DE MICROSCOPIOS

electrones, se llama microscopia

Existen dos tipos de Microscopios Electrnicos que se usan

Electrnico se obtiene, mediante altas temperaturas (emisin

La emisin de la corriente de electrones, estar dentro de una

PRINCIPIOS DEL MICROSCOPIO

Microscopio de luz, usado en los primeros aos del siglo XX

COMPARACIN DEL MICROSCOPIO

Este es un Microscopio Electrnico de Transmisin fabricado por

Este es uno de los Microscopios Electrnicos populares fabricados

El Autor y su Microscopio Electrnico de Transmisin.

JEOL JEM 100C, instalado en el INHMT, en el ao 1.978.

Este modelo de Microscopio Electrnico de Transmisin fue muy

ACTUAL MICROSCOPIO ELECTRNICO DE

JEOL JEM1010, instalado en el INHMT en el ao 1.998.

La mayor parte de su manejo est controlado por computadora y en

Este TEM tiene Dos Lentes Condensadores, Dos Lentes Objetivos,

CONTRASTE DE LA IMAGEN EN MICROSCOPIA

El contraste de una imagen en el microscopio electrnico ser compuesto

En microscopa, el trmino Resolucin tiene un concepto y

La misma frmula puede aplicarse para el Microscopio Electrnico,

Al usar un acelerador de voltaje de 80 KV, la longitud de onda de electrones,

Microscopio Electrnico de Transmisin JEOL 1000KV

CARACTERSTICAS DEL MICROSCOPIO

PREPARACIN DEL ESPCIMEN

Soporte del espcimen en Microscopia Electrnica de

Mtodo de Preparacin de la Pelcula de Soporte

II. En el Caso de Objetos Pequeos.

(1) Mtodo de Sombreado

PRINCIPIOS DEL SOMBREADO

Evaporacin del metal en alto vaco.

(2) Tcnica de Tincin Negativa

PROCEDIMIENTO DE TINCIN NEGATIVA

1. Aplicar una gota de PTA en el mesh.

(3) Cortes Finos

En casos especiales, sin embargo, la resina soluble en agua es

Leica Ultra Cut (Instalado en INHMT en 1998 )

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