perfiles Transcripcionales revelan bases moleculares y genticos, nuevos objetivos para mejorar la

resistencia a mltiples inhibidores de la fermentacin en Saccharomyces cerevisiae

Yingying Chen1 , Jiayuan Sheng2 , Tao Jiang3, Jos Stevens2, Xueyang Feng2 * y Na Wei1 *
abstracto
Antecedentes: biomasa lignocelulsica es una fuente prometedora de biocombustibles renovables.
Sin embargo, el pretratamiento de biomasa de lignocelulsica genera inhibidores de la fermentacin
que afectan adversamente el crecimiento de microorganismos industriales tales como
Saccharomyces cerevisiae y prevenir la produccin econmica de los biocombustibles
lignocelulsicos. Un desafo crtico sobre el desarrollo de S. cerevisiae con una mejor resistencia a
los inhibidores radica en la comprensin incompleta de base molecular para inhibidor de la
respuesta al estrs y la escasa informacin sobre los objetivos genticos eficaces para aumentar la
resistencia a la levadura a inhibidores mixta de la fermentacin. En este estudio, se aplic el anlisis
comparativo transcriptmica para determinar la base molecular para resistencia de cido actico
y/o furfural en S. cerevisiae.
Resultados: Se desarrollaron recientemente un YC1 cepa de levadura con una resistencia superior
al cido actico, furfural, y su mezcla a travs de ingeniera metablica inversa. En este estudio, se
determin primero transcripcional cambios a travs de ARN secuenciacin en YC1 frente a la cepa
de tipo salvaje S-C1 bajo tres condiciones diferentes inhibidores, incluyendo el cido actico solo,
furfural solo, y mezcla de cido actico y furfural. Los genes asociados con respuestas de estrs de
S. cerevisiae a los inhibidores individuales y mixtos fueron revelados. En concreto, se identificaron
184 genes de consenso que estaban diferencialmente reguladas en respuesta a la resistencia a los
inhibidores distinta entre YC1 y S-C1. El anlisis bioinformtico prxima revel principales factores
de transcripcin (TFS) que regulan estos genes consenso. Los principales TFS identificados, Sfp1p y
Ace2p, fueron experimentalmente probado como dianas para la optimizacin de la cepa de
sobreexpresin. La sobreexpresin del gen SFP1 mejor la productividad especfica de etanol por
casi cuatro veces, mientras que la sobreexpresin del gen de ACE2 reforzada por la tasa tres veces
en presencia de cido actico y furfural. La sobreexpresin del gen SFP1 en la cepa resistente YC1
ms dado lugar a aumento del 42% en la productividad de etanol en presencia de cido actico y
furfural, lo que sugiere el efecto de Sfp1p en la optimizacin de la cepa de levadura para mejorar la
tolerancia al inhibidor de la fermentacin mixta.
Conclusiones: la regulacin transcripcional de levadura subyacentes resistencia a cido actico y
furfural se determin.
Dos factores de transcripcin, Sfp1p y Ace2p, fueron descubiertos por primera vez por sus funciones
en la mejora de la levadura resistencia a los inhibidores de la fermentacin mixta. El estudio
demostr un marco de ingeniera metablica micas guiada, que podran desarrollarse como una
estrategia prometedora para mejorar fenotipos microbianas complejas.
Palabras clave: levadura, cido actico, furfural, RNA-seq, factores de transcripcin, Ingeniera
metablica Fondo

La biomasa lignocelulsica tiene el potencial de contribuir sustancialmente a las futuras demandas

mundiales de energa, ya que es de bajo costo, est disponible a gran escala, no compite con la
produccin de alimentos, y tiene un alto potencial para reducir las emisiones de gases de efecto
invernadero [1-4]. Sin embargo, ineficiente conversin de los materiales de la pared celular de las
plantas solubilizado en biocombustibles ha dificultado los procesos a escala comercial. Materiales
de biomasa lignocelulsica necesitan someterse a duras (fsico) tratamiento qumico diseado para
liberar el azcar compuestos [5, 6], pero al mismo tiempo, la hidrlisis pretratamiento genera
subproductos txicos tales como cidos dbiles, aldehdos, furanos y compuestos fenlicos
(denominados "inhibidores de la fermentacin") [7-9]. Un robusto inhibidor de la resistencia de
microorganismos de fermentacin es de vital importante para el desarrollo lignocelulsico
econmicamente viable biocombustibles, pero esto sigue siendo un gran tcnico barrera [9].
Dos grupos principales de inhibidores de fermentacin generados desde el pretratamiento de la
biomasa lignocelulsica son cidos dbiles (por ejemplo, cido actico y cido frmico) y furano
aldehdos [por ejemplo, furfural y 5-hidroxi metilfurfural (HMF)] [9, 10]. Particularmente, puesto
que la hemicelulosa en el pared celular vegetal es ubicua acetilado [11, 12], tpico pretratamiento
cido de biomasa lignocelulsica genera cantidades sustanciales de cido actico como un
inevitable inhibidor de la fermentacin en hidrolizados [7, 13] y actico cido es por lo general de la
concentracin ms alta entre la fermentacin inhibidores en hidrolizados celulsicos [7, 14-18].
El furfural y HMF se principales subproductos generados a partir de hidrlisis y deshidratacin de
pentosas y hexosas azcares [9, 10]. La levadura Saccharomyces cerevisiae es un prefiere y
ampliamente utilizado microorganismo plataforma en la fermentacin industrial, pero la naturaleza
txica de los hidrolizados celulsicos y baja tolerancia del microorganismo a prevenir eficiente la
produccin de bioetanol a partir de azcares celulsicos [19, 20].
La captacin de cidos dbiles reduce el pH intracelular, que desencadena la accin de la ATPasa de
la membrana plasmtica para bombear protones de la clula a los gastos de ATP la hidrlisis [21 a
24]. Adems, los cidos dbiles tambin causan la acumulacin intracelular de aniones, que
interfiere con reacciones enzimticas y causa toxicidad [25, 26]. El furano aldehdos inhiben enzimas
del metabolismo central de carbono [27-29] y la energa del metabolismo [30], y la causa de
agotamiento de NAD (P) H piscinas y el estrs oxidativo [10, 31 a 33].
El principal desafo de la ingeniera de levadura resistente a los inhibidores radica en que el fenotipo
de resistencia por lo general implica complejas regulaciones multi-gnicas entre el estrs dispares
respuestas.
Ha habido avances significativos en la determinacin inhibidor mecanismos de respuesta al estrs
para mejorar resistencia a los inhibidores de la levadura de fermentacin individuales [9, 34]. Por
ejemplo, la resistencia a aldehdos de furano podra ser realzado por genes que sobreexpresan
relacionados con aldehdo reduccin [35, 36], la sntesis de espermidina [37], pentosa va de fosfato
[38, 39], o la resistencia a mltiples frmacos y respuestas de estrs [9, 40]. En cuanto a la tolerancia
a los cidos dbiles tal como cido actico, el anlisis de la respuesta transcripcional de S. cerevisiae
al estrs cido actico mostr sobre regulacin de diversos genes implicados en la gluclisis, el ciclo
de Krebs y la sntesis de ATP [41-43] y el importante papel de la factor de transcripcin en la
regulacin de la Haa1p en toda la clula la adaptacin de la transcripcin a cido actico en la

levadura [42, 44,45]. Objetivos genticos relacionados con la resistencia a individuo inhibidores de
la fermentacin en S. cerevisiae fueron reportados en algunos estudios anteriores [46, 47].
Por ejemplo, estudios anteriores encontrado que la sobreexpresin de Msn2p [46] y Yap1p [48]
podra mejorar la resistencia furfural en la levadura. Mientras estudios previos se centran
principalmente en la caracterizacin de mecanismos genticos de la respuesta al estrs de la
levadura a individuo compuestos inhibidores, hidrolizados celulsicos contienen inhibidores de la
fermentacin mixta con toxicidad distinta mecanismos lugar de un nico inhibidor. Algunos reciente
trabajos reportaron una mejor resistencia a la levadura celulsico hidrolizados a travs de ingeniera
evolutiva [49-51], y se utiliz un anlisis sistemtico en estudios previos a entender base molecular
de resistencia a los inhibidores de levadura [51-56]. Se encontr que diferentes mecanismos podran
ser adoptado por la levadura para resistir inhibidores hidrolizados (por ejemplo, cido actico,
furfural y HMF) [51]. Sin embargo, hay sigue siendo escasa informacin sobre lo que la perturbacin
gentica objetivos podran ser provocados para mejorar la resistencia a la levadura inhibidores de
la fermentacin mixta. Por lo tanto, una mejor comprensin de las redes de regulacin gentica
que subyacen a la resistencia a los inhibidores de la fermentacin mixta en S. cerevisiae que se
necesita para desarrollar cepas con tolerancia mejorada a hidrolizados celulsicos.
Recientemente hemos desarrollado una cepa de levadura que tiene superiores resistencia a los
inhibidores travs metablica inversa ingeniera [57]. En el presente estudio, se realiz anlisis
transcriptmica comparada utilizando ARN profunda secuenciacin (RNA-Seq) para determinar
transcripcional respuesta en S. cerevisiae a cido actico y / o furfural, e identificar los factores de
transcripcin (TFS) que regulan tolerancia a los inhibidores mixtos en la levadura. Primero el en
todo el genoma transcripcional cambios en la resistencia cepa contra la cepa de control de tipo
salvaje fueron identificados por anlisis transcriptmica menores de tres aos inhibidor diferente
condiciones, incluyendo el cido actico solo, furfural solo, y mezcla de cido actico y furfural.
Entonces, la TFS que regulan los genes del ncleo con significativa cambios en la expresin bajo el
estrs de ambos inhibidores fueron identificados y superiores TFS fueron probados
experimentalmente como objetivos de sobreexpresin para la optimizacin de la tensin.

Nuestros resultados avanzan comprensin fundamental de la mecanismos reguladores genticos

que subyacen a la resistencia de levadura a los principales inhibidores de la fermentacin de celulosa
hidrolizados. Tambin informamos nuevos factores de transcripcin implicado en la regulacin
resistencia al inhibidor mixto estrs. La ingeniera metablica transcriptoma guiada demostrado
aqu podra ser una estrategia prometedora para mejorar fenotipos complejos en la levadura, en
particular en los casos en los que coordinan reprogramacin de una serie de los genes que se
necesita.
Materiales Cepas y plsmidos
Todas las cepas y plsmidos utilizados en este estudio se resumen en la Tabla 1. El S. cerevisiae cepas
SR8, SR8-trp, y SR8-4 fueron amablemente proporcionados por el laboratorio del Dr. Yong-Su Jin.
La cepa SR8-trp se transform con genmico de la levadura Biblioteca de ADN en un pRS424
plsmido multicopia y una levadura YC1 transformante con resistencia mejorada a la actico cido

y furfural se obtuvo a travs de la metablica inversa enfoque de ingeniera en nuestro trabajo

reciente [57]. Los Escherichia coli cepa TOP10 se utiliz para la clonacin de genes y la manipulacin.
Enzimas, imprimaciones, y productos qumicos Las enzimas de restriccin, enzimas de ADN
modificadores, y Reactivos de PCR se adquirieron de New England Biolabs (Beverly, MA, EE.UU.).
Las condiciones de reaccin eran la configuracin siguiendo las instrucciones del fabricante. Todo
en general productos qumicos y componentes de los medios se adquirieron de Sigma-Aldrich (St.
Louis, MO, EE.UU.) o Fisher Scientific (Pittsburgh, PA, EE.UU.). Los cebadores para PCR y tanto

Tabla 1 Plsmidos y cepas

la secuenciacin se sintetizaron por Integrated DNA Technologies (Coralville, IA, EE.UU.) y se
enumeran en la Tabla 2. Plsmido y la tensin de la construccin
Para construir plsmidos sobreexpresin con diferente identificado factores de transcripcin, la
apertura completa marcos de lectura de factores de transcripcin se amplificaron por PCR con los
primers que figuran en la Tabla 2. Los productos de la PCR posteriormente se digirieron y se lig a
su caso sitios de clonacin mltiple del plsmido pRS424GPD o pSR425GPD. Los vectores se
transformaron sobreexpresin, respectivamente, a la cepa SR8-trp utilizando levadura Kit EZtransformacin (BIO 101).
Medios y condiciones de cultivo
Cepas de Escherichia coli fueron cultivadas en Luria-Bertani Se aadi medio a 37 C, y 100 mg / ml
de ampicilina al medio cuando sea necesario. Las cepas de levadura fueron rutinariamente se
cultiv a 30 C en medio YP (10 g / L de levadura extraer y 20 g / L de peptona) o sinttico completo
(SC) medio (6,7 g / l de base nitrogenada de levadura, 0,6 g / L completa mezcla de complemento)
que contiene 20 g / L de d-glucosa.
Medios de SC que contena 20 g / L agar y glucosa, 20 mg / L histidina y uracilo sin triptfano y / o
leucina (100 mg / L si es necesario) la modificacin se utiliz para seleccionar transformantes
usando TRP1 y / o LEU2 como auxotrfico marcadores.
Experimentos de fermentacin por lotes
Clulas de levadura se pre-cultivaron en medio SC que contiene 20 g / L de glucosa hasta fase
estacionaria, y luego se centrifugaron, baada por agua esterilizada, y luego inocula en medios de
fermentacin que contiene glucosa (20 g / L), cido actico cido (2 g / L), y / o furfural (1 g / L). La
fermentacin por lotes experimentos en condiciones limitadas de oxgeno eran llevado a cabo en
matraces de 125 ml sin deflectores Erlenmeyer que contienen 20 ml de medio a 30 C y 100 rpm.
La clula inicial densidades se ajustaron a OD600 = 1 o 0,2. La inicial pH del medio se ajust a 4,0.
Muestras Cultura fueron tomados de experimentos de fermentacin para medir la OD600 y las
concentraciones de metabolitos. Todos de fermentacin experimentos se establecieron en marcha
por duplicado biolgico.
Preparacin de la muestra para la secuenciacin de ARN

Las clulas de levadura se cultivaron hasta la fase exponencial temprana bajo condiciones limitadas
de oxgeno en 50 ml SC + glucosa Frascos medio en 250 ml Erlenmeyer en biolgica por triplicado,
y fueron expuestos a diferentes inhibidores de 4 horas antes de muestras de clulas se recogieron
para el ARN-Seq anlisis. Cuatro condiciones inhibidores se aplicaron para comparativa
transcriptmica estudio: (1) cido actico (2 g / L), (2) furfural (1 g / L), (3) cido actico (2 g / L) +
furfural (1 g / L), y (4) el control en blanco sin ningn inhibidor. Muestras celulares tomado de cada
rplica incubaciones se recogieron en pre-enfriada tubos Falcon y se centrifugaron a 4 C durante
1 minuto. Los sedimentos celulares se congelaron-flash en nitrgeno lquido y se almacena en -80
C antes del anlisis. ARN total fue extrado por PureLink RNA Mini Life Technology Kitfrom (Grand
Island, NY) de acuerdo con el proveedor de instrucciones. Las muestras de ARN fueron enviados a
Virginia Instituto de Bioinformtica para mayor calidad y cantidad evaluacin, preparacin de ADNc
de biblioteca, y la secuenciacin.
mtodos analticos
Metabolitos de fermentacin incluyendo glucosa, glicerol, cido actico, y el etanol se cuantificaron
por alto rendimiento cromatografa lquida (Agilent Technologies Serie 1200) equipado con un
detector de ndice de refraccin y un cido H + Rezex ROA-Orgnica (8%) columna (Phenomenex
Inc., Torrance, CA, EE.UU.). La columna se eluida con H2SO4 0,005 N como fase mvil bajo la tasa
de 0,6 ml / min de flujo a 50 C. El crecimiento celular se monitoriz midiendo la densidad ptica a
600 nm (DO600) utilizando espectrofotmetro UV-visible (Thermo Fisher Scientific Inc., Waltham,
MA, EE.UU.).
Anlisis de ARN-ss y la bioinformtica
Todas las preparaciones de la biblioteca se realizaron en el Apolo 324 Robot (WaferGen, Fremont,
CA, EE.UU.). Calidad del total RNA se verific en Agilent 2100 BioAnalyzer (Agilent Tecnologas,
Santa Clara, CA, EE.UU.). 500 ng del total ARN fue enriquecido para poliA ARN utilizando PrepXPolyA
kit de aislamiento de ARNm (P / N 400047, WaferGen, Fremont, CA, EE.UU.). Entonces poliA ARN se
convirti en una biblioteca de molculas de plantilla utilizando PrepX RNA-Seq para Illumina Kit
Biblioteca, 24 muestras (P / N 400046, WaferGen, Fremont, CA, EE.UU.) para la generacin de
clster subsiguiente y secuenciacin de Illumina HiSeq. Brevemente, poliA mRNA fue fragmentado
en trozos ms pequeos (~ 140nt). 3 'y 5' adaptadores se ligaron a los fragmentos de ARN escindidos
y convertido a cDNA de primera cadena utilizando transcriptasa inversa, seguido por el segundo
captulo de sntesis. Los productos a continuacin, se purificaron y enriquecido con 12 ciclos de PCR
para crear la biblioteca de ADNc final. Las bibliotecas de 280-300 pb (160-180 pb insercin)
generado se validaron utilizando Agilent 2100 Bioanalyzer y se cuantific usando Quantit dsDNA S
Kit (Invitrogen) y qPCR. 12 indexados bibliotecas de cDNA se agruparon y se secuenciaron en cada
carril de celda de flujo HiSeq rpida ejecucin para generar 130 a 150 millones de solo lee.
Bibliotecas se agruparon en un flujo celular utilizando el kit Cluster TruSeq rpida SR de Illumina
2500 (GD-402-4.001) en el CBOT, y secuenciado 1 101 Ciclos SR utilizando dos Kits TruSeq rpida
SBS (50 ciclos) (FC-402 a 4.002).
Despus de la secuenciacin, los datos fueron recortados para ambos adaptador y la calidad
utilizando una combinacin de EA-utils [58] y Btrim [59]. La secuenciacin lee a continuacin, fueron
alineados a el genoma usando Tophat2 / Bowtie2 [60] y se cuentan a travs de HTSeq [61].

Estadsticas de resumen de control de calidad se examinaron a identificar las muestras

problemticas (por ejemplo, el recuento total de lectura, perfiles de calidad y la base de la
composicin ( recorte)), en bruto archivos de datos, archivos con formato FASTQ alineados (bam
y texto archivo que contiene estadsticas de alineacin de la muestra), y el recuento archivos
(archivos de texto HTSeq). Despus de la alineacin xito, Se determinaron los miARN y ARNm
expresiones diferenciales y la prueba de significacin mediante el Benjamini- Hochberg corregida
prueba de Wald en el DESeq2 R-paquete [62]. El anlisis de ontologa de genes se realiz mediante
el uso de genrica asignador GO plazo desarrollado por la Universidad de Princeton
(http://go.princeton.edu/cgi-bin/GOTermMapper).
PCR (qPCR) la validacin cuantitativa
Para validar las expresiones de genes diferenciados de ARN-ss anlisis, 24 muestras analizadas por
RNASeq fueron validados por TaqMan qPCR para diferencial expresin de genes diana (3 YML038CSC04151537, YHR127 W-SC04130738, y YJR096 W-SC04138893) y un control endgeno, YNL219CSC04159779 (ALG9). 1,5 g de ARN total fue transcrito inversa utilizando el kit de superndice VILO
Mastermix (P / N 100012386, Invitrogen). 25 ng de cDNA se utiliz para cada TaqMan Reaccin de
PCR. Cada muestra con cada objetivo de genes era echo por triplicado. qPCR se realiz utilizando
TaqMan Fast avanzada Mastermix (P / N4444557, Applied Biosystems), en el instrumento ViiA7
(Applied Biosystems) a 50 C durante 2 min, 95 C durante 20 s y 40 ciclos a 95 C y 1 s

60 C durante 30 s. Los datos fueron analizados de acuerdo con la Ct mtodo como se describe
en el manual Invitrogen RT-PCR.
Los niveles de expresin de todos los genes diana en el anlisis de qPCR se encontr que estar bien
correlacionada con los de RNA-Seq anlisis (archivo adicional 1: Figura S1). Anlisis de factores de
transcripcin Para identificar los factores de transcripcin que tienen ms probabilidades implicado
en la regulacin transcriptmica levadura, la transcripcin factor de anlisis se realiz utilizandouna
previamente mtodo publicado [63]. En general, la YEASTRACT base de datos
(http://www.yeastract.com/) fue solicitada, en que los genes expresados diferencialmente
identificados por la Anlisis de ARN-ss Se hicieron bsquedas en contra de toda la transcripcin
factores (TFS) en la base de datos YEASTRACT (slo con reglamentos directa o indirecta
documentado evidencias fueron tomadas en consideracin). Para proporcionar la Perfiles TF, el
nmero de genes que un TF puede regular en la piscina de genes que se encuentra para ser
diferencialmente expresado se calcul mediante la base de datos YEASTRACT.
Luego, se divide por el nmero total de genes que se encontr que se expresa diferencialmente.

Resultados
La fermentacin bajo la tensin de cido actico y furfural Hemos desarrollado una cepa YC1
resistente a los inhibidores (Tabla 1) a travs de nuestro trabajo anterior utilizando un librarybased
genmico inversa enfoque de ingeniera metablica [57].
En pocas palabras, se introdujo una biblioteca plsmido de todo el genoma en una matriz cepa de
S. cerevisiae, y los transformantes se caracterizaron y se tamiza en condiciones de estrs para
identificar el blanco de perturbacin gen provocar resistencia mejorada inhibidor. El YC1 cepa
contiene un plsmido multicopia con un fragmento de ADN genmico de levadura inserte (chrXV:
409,259-412,369). Los puertos de insercin secuencia completa del gen WHI2, que codifica una
citoplasmtica andamio de protenas globulares necesaria para la activacin de la respuesta de
estrs general [64, 65]. Comparado con la cepa de control S-C1 que contiene el plsmido sin el
insercin, la YC1 cepa tuvo significativamente mayor resistencia al cido actico [57]. La cepa
tambin mostr significativamente mejorar el rendimiento de fermentacin en el rastrojo de maz
hidrolizados en comparacin con la cepa de control [57], lo que sugiere su capacidad para resistir
los inhibidores de la fermentacin mixta.
Con la motivacin de entender y comparar transcripcional regulaciones bajo estrs inhibidor
individuo frente al estrs inhibidor mezclado en S. cerevisiae, diseamos experimentos
comparativos transcriptmica, centrndose en dos grandes inhibidores: cido actico y furfural.
Nos caracteriza la tensin y el control de tipo salvaje S-C1 en la fermentacin por lotes con la
presencia de cido y / o furfural actico bajo condiciones limitadas de oxgeno- (Figura 1). El YC1
cepa tuvo significativamente mayor las tasas de consumo de azcar, las productividades de etanol,
y las tasas de crecimiento de clulas que el control (prueba t, p <0,05) en el marco todas las
condiciones inhibidor, incluyendo el cido actico solo, cido furfural solo, y adems furfural actico
(Fig. 1). Los actuaciones de fermentacin de YC1 y S-C1 no tenan significativa diferencia con la
condicin de control sin inhibidor (archivo adicional 1: Figura S2) lo que sugiere que la mejora en la
YC1 cepa se asocia con respuesta celular al estrs inhibidor, pero no la capacidad en la utilizacin
de sustratos. Vale la pena mencionar que el
Fig. 1 Mejora de la fermentacin por el YC1 cepa en comparacin con la cepa de control S -C1 en SC
medio que contena glucosa (20 g / L) + cido actico (2 g / L) (a, d), furfural (1,5 g / L) (b, e), o en
cido actico (2 g / L) + furfural (1,5 g / L) (c, f).
Los resultados fueron los medios de experimentos duplicados; barras de error indican desviaciones
estndar no eran visibles cuando ms pequeo que el tamao del smbolo YC1 cepa tambin
demostr una mejora significativa en fermentacin de xilosa bajo estrs inhibidor como se
caracteriza previamente [57]. La presencia de tanto el cido actico y furfural fermentacin de la
glucosa gravemente inhibida en el cepa de control (Fig. 1e) en comparacin con las condiciones con
cido actico o furfural solo (Fig. 1a, b). Notablemente, la YC1 cepa mostr mejora sustancialmente
la resistencia a la los inhibidores mixtos, as como a los inhibidores individuales. Especficamente,
la productividad de etanol de la YC1 cepa fue 400% mayor que la de la cepa de control bajo actico
condicin de estrs furfural cido +, mientras que la mejora era 270% para la condicin de estrs
cido actico y 170% para condicin de estrs furfural. Los resultados sugirieron que la YC1 cepa

tena mecanismo de resistencia a los inhibidores distinta en comparacin con la cepa de tipo salvaje
S-C1 en respuesta a cido actico y / o el estrs furfural. El azcar mejorado la fermentacin
tambin se demostr en el rastrojo de maz hidrolizados, donde la fermentacin por la cepa de
control fue severamente inhibido [57]. Las respuestas de la transcripcin de la cepa de tipo salvaje
a diferentes condiciones de estrs Con el fin de revelar los mecanismos de la cido actico y
tolerancia furfural de S. cerevisiae, la cepa de tipo salvaje S-C1 se ha examinado bajo condiciones
diferentes 4, es decir, sin el estrs (espacio en blanco), con cido actico (AA), furfural (FF), o cido
actico y furfural (AA & FF). Para sistemtica caracterizar las respuestas transcripcionales de la
cepa S-C1 a estas diferentes condiciones de estrs, la RNAseq anlisis se realiz
correspondientemente, con tres rplicas biolgicas. Por ltimo, comparamos la expresin de genes
los perfiles de la cepa S-C1 bajo cada uno de los tres condiciones de estrs (AA, FF, y AA & FF) para
el control condicin (espacio en blanco), respectivamente. De cada una de las comparaciones, las
transcripciones se identificaran como significativamente arriba / abajo regulado por la eleccin del
punto de corte (base significa 1000; padj 0,001) en el paquete de anlisis de DE-ss.
Las transcripciones seleccionados como diferencialmente expresado eran a continuacin, se utiliza
para la ontologa de genes (GO) el anlisis. En la cepa de control S-C1, se identificaron 197
transcripciones a tener diferents niveles de expresin cuando se cultiva con cido actico, en
comparacin con las cultivadas bajo condicin en blanco (archivo de la figura 2 y la disposicin 2:.
Tabla S1).
Entre ellos, 99 genes fueron hasta reguladas y 98 genes fueron regulados hacia abajo. Bajo
condiciones de estrs furfural, Se identificaron 65 genes que se expres diferencialmente, entre los
cuales 20 genes fueron hasta reguladas y 45 genes fueron regulados hacia abajo. Cuando se
cultivaron las clulas tanto con cido actico y furfural, 192 genes tenan diferente los niveles de
expresin, con 70 genes regulados hacia arriba y
Fig. 2 La superposicin de los genes expresados diferencialmente en la cepa de control S-C1 (a) y la
cepa YC1 (b) bajo diferentes condiciones de estrs. El gen los perfiles de expresin de crecer sin la
tensin fueron utilizados como los controles. AA creciente con cido actico; FF crecimiento con
furfural; AA & FF crecimiento con cido actico y furfural

122 genes regulados. Los turnos de transcriptoma en respuesta al cido actico y furfural en S.
cerevisiae eran Tambin se inform en estudios anteriores [66]. Basndose en el anlisis GO, varios
procesos biolgicos tales como proceso metablico de aminocidos celular (GO: 0006520), una
pequea molcula que contiene nucleobases- proceso metablico (GO: 0055086), y transmembrana
transporte (GO: 0055085) participaron como la clave respuestas a todas las condiciones de estrs
(Fig. 3). Ahora bien, la importancia de estos bioprocesos para responder a diferentes inhibidores en
la naturaleza de tipo S. cerevisiae variada de estado a estado, tal como se refleja por el diferente
porcentajes de los genes regulados implicados en una especfica bioproceso bajo diferentes
condiciones de estrs (Fig. 3).

Por ejemplo, los procesos metablicos de lpidos (GO: 0006629) mostr su importancia significativa
en la tolerancia a cido actico condiciones, pero slo un gen relacionados con metabolismo lipdico
procesos mostraron diferentes niveles de expresin bajo furfural condiciones de tolerancia (Tabla
3). Adems, el hidrato de carbono bioprocesos metablica (GO: 0005975) y la respuesta al estrs
oxidativo (GO: 0006979) jugado ms importante papeles en la tolerancia que el furfural en cido
actico tolerancia. El proceso metablico aminocidos celular (GO: 0006520) se encontr que era
de bioprocesos clave en todo el
Fig. 3 Los bioprocesos importantes implicadas en la respuesta a diferentes condiciones de estrs en
la cepa de control S-C1 (a) y la cepa YC1 (b). Totalmente, Se seleccionaron ocho bioprocesos, ya que
se encontraron a desempear un papel importante en la respuesta transcripcional a la al menos una
condicin de estrs. Los porcentaje asociado con cada proceso GO se calcul como el porcentaje de
genes involucrados en el proceso GO correspondiente entre la piscina de los genes que son
regulados de manera significativa
Tabla 3 de Gene ontologa anlisis de las respuestas transcripcionales a diferentes condiciones de
estrs en S. cerevisiae cepa S-C1 (de tipo salvaje) de tres condiciones de estrs, aunque los genes
especficos relacionados para el proceso metablico aminocidos celular no fuera la misma en
respuesta a diferentes condiciones de estrs. Como muestra en la Tabla 3, slo tres genes en el
amino celular proceso metablico cidos fueron siempre regulada independientemente de la
condicin de estrs, mientras que 17 genes, 9 genes, y 25 genes fueron regulados especficamente
en respuesta a la tensin de cido actico, cido furfural, cido actico, y furfural, respectivamente.
En general, los datos indicaron que la cepa S-C1 adopt distinta endgena gentica reguladora
mecanismos para reprogramar el metabolismo de la clula en respuesta a diferentes condiciones
de estrs.
Las respuestas de la transcripcin de la cepa resistente a los inhibidores a diferentes condiciones de
estrs
A continuacin se determin y compar la transcripcin respuestas del YC1 cepa resistente a los
inhibidores bajo diferentes condiciones de estrs. Bsicamente, en comparacin con el
transcripcional perfiles en la condicin en blanco, 32 genes fueron identificado a tener diferentes
niveles de expresin cuando YC1 se cultiv bajo condiciones de estrs cido actico, incluyendo
19 genes hasta reguladas y 13 genes regulados hacia abajo. En condiciones de estrs furfural, se
identificaron 56 genes a tener diferentes niveles de expresin, con 40 genes up-regulados y 16 genes
regulados hacia abajo. Cuando el las clulas se cultivaron tanto con cido actico y furfural, 46
genes mostraron diferentes niveles de expresin, entre los cuales 42 genes fueron todos para
arriba-regulados y 4 genes se downregulated (Fig. 2 y archivo adicional 3: Tabla S2). es
interesante notar que un menor nmero de genes fueron diferencialmente expresado en YC1
comparacin a la de S-C1, lo que podra atribuir a la activacin de las respuestas al estrs por
generales sobre regulacin de WHI2. Se encontr que poda Whi2
interactuar con Msn2 / Msn4 para la activacin completa de los genes expresiones controlados por
elementos de respuesta a estrs [67, 68]. Los procesos biolgicos clave que participan en el estrs

respuesta en el YC1 cepa bajo diferentes tensiones inhibidor condiciones incluyen el metabolismo
de aminocidos celular (GO: 0006520), una pequea molcula que contiene nucleobasesproceso metablico (GO: 0055086), y transmembrana transporte (GO: 0055085) (Fig. 3). Sin
embargo, el gen objetivos que estaban sujetos a ser regulados en cada uno de los
bioprocesos eran muy diferentes. De hecho, ningn gen era universalmente regulado en todas las
condiciones de estrs (Tabla 4). En particular, los impactos de las diferentes bioprocesos sobre la
resistencia a condiciones de estrs en la cepa resistente YC1 eran
no el mismo que en la cepa S-C1 (Fig. 3). Por ejemplo, la respuesta a los productos qumicos (GO:
0,042221 millones) jug un papel ms importante en la resistencia al cido actico en el
YC1 cepa (es decir, 7 genes implicados en la respuesta a los productos qumicos fueron expresados
diferencialmente en un charco de totalmente 32 genes que son expresados diferencialmente) que
en el control cepa S-C1 (es decir, 23 genes son expresados diferencialmente
en una piscina de Totally 197 genes que estaban diferencialmente expresado), mientras que el
proceso metablico aminocidos celulares (GO: 0006520) fue ms importante en S-C1 (es decir, 32
genes fueron expresados diferencialmente en un charco de totalmente 197 genes que son
expresados diferencialmente en S-C1, mientras que 1 gen se expresa de forma diferente en una
piscina de 32 completamente genes que son expresados diferencialmente en YC1). Del mismo
modo, respuesta al estrs oxidativo (GO: 0006979) fue clave proceso biolgico implicado en
respuesta transcripcional a
furfural en la cepa S-C1, mientras que su contribucin a furfural resistencia en el YC1 cepa era
relativamente pequeo (es decir, 9 genes fueron expresados diferencialmente en un charco de
totalmente 65 genes que son expresados diferencialmente en S-C1, mientras que 4 genes fueron
expresados diferencialmente en un charco de totalmente 56 genes que son expresados
diferencialmente en YC1).
Bajo cido actico y furfural condicin inhibidor mixto, principales procesos biolgicos de las
respuestas al estrs, tanto en cepas incluidas respuesta a sustancias qumicas (GO: 0.042.221),
metabolismo de aminocidos celular (GO: 0006520), y transporte transmembrana (GO: 0055085).
sin embargo, el impactos de estos procesos no fueron las mismas en los dos
son; las respuestas de la transcripcin de la cepa a YC1 inhibidores mixtos fueron ligeramente ms
concentrado en el celular proceso metablico de aminocidos y transmembrana
el transporte en comparacin con la de la cepa S-C1. En general, 32 genes implicados en el
metabolismo de aminocidos celular fueron expresados diferencialmente en un charco de
totalmente 192 genes que son expresados diferencialmente en S-C1, mientras que
9 genes fueron expresados diferencialmente en un charco de totalmente 46 genes que son
expresados diferencialmente en YC1. Tambin, 29 genes implicados en el transporte
transmembrana fueron diferencialmente expresado en un charco de totalmente 192 genes que

se expresaron diferencialmente en S-C1, mientras que 9 genes eran diferencialmente expresado en

un charco de totalmente 46 genes que se expresaron diferencialmente en YC1. Estos resultados
indicaron que el YC1 cepa resistente haba alterado gentica
redes reguladoras y aplicado distintos molecular mecanismos (por ejemplo, el ajuste de los niveles
de expresin de genes involucrado en diferentes vas biolgicas) del tipo salvaje
esforzarse para lograr una mejor respuesta de estrs a actico cido y / o furfural.
Las respuestas transcripcionales a consenso diferente estrs condiciones
Con el fin de encontrar los rasgos genticos que conducen a la una mayor resistencia a diferentes
condiciones de estrs inhibidor, se compararon los perfiles de expresin gnica
entre el YC1 cepa resistente y la cepa control S-C1 en cada una de las condiciones de estrs. En
general, Se han identificado 455 genes tener diferente expresin
niveles bajo la condicin de espacio en blanco entre los dos levaduras cepas, mientras que 536, se
identificaron 407 y 399 genes que se expres diferencialmente en el YC1 tensin cuando
Tabla 4 de Gene ontologa anlisis de las respuestas transcripcionales a diferentes respuestas de
estrs en la cepa YC1 S. cerevisiae
creciente con cido, furfural, cido actico y furfural actico, respectivamente. Nos OVERLAPPED
todos ellos diferencialmente expresaron los genes y encontraron 184 genes de consenso
que siempre fueron regulados diferencialmente entre el YC1 cepa resistente y la cepa control. Entre
el 184 genes consenso, 168 resultaron ser universalmente
hasta reguladas en cada una de las condiciones de estrs, mientras que 25 genes fueron
universalmente las reguladas (adicional archivo 1: Figura S3, archivo adicional 4: Tabla S3). Estos
consensos genes podran muy probablemente conducir a la mejora
resistencia a diferentes condiciones de estrs en la resistentes colar YC1. Curiosamente,
encontramos un gen, YFL057C, comportamientos bifurcados demostrado en diferentes estrs
condiciones. Fue hasta reguladas La expresin gnica YFL057C bajo condiciones en blanco y furfural,
pero downregulated en virtud de cido actico y cido actico y furfural condiciones. Esto indic
que los efectos de la regulacin de Expresin YFL057C podra ser contradictorio para la levadura
resistencia al cido actico y furfural. El anlisis GO para estos genes consenso (Tabla 5) indic
varios procesos biolgicos clave involucrados, incluyendo carbohidratos
proceso metablico (GO: 0005975), la respuesta a qumica (GO: 0042221), el transporte
transmembrana (GO: 0055085), el metabolismo de aminocidos celular
(GO: 0006520), y nucleobases contienen molculas pequeas proceso metablico (GO: 0055086).
Dado que la exposicin de respuestas genticas complejas de S cerevisiae con el medio ambiente
se debi en gran parte a la transcripcin factores (TFS) que controlan el flujo de gentica

la informacin del ADN al ARNm, el prximo aplic un Anlisis TF para identificar los TFS evolucion
en la regulacin de la genes de consenso utilizando la base de datos YEASTRACT. los
porcentaje de genes de un TF puede regular se defini como la relacin entre el nmero de genes
consenso la lata TF regular al nmero de genes totales de consenso. Nosotros entonces generado
un perfil TF eligiendo los 20 mejores candidatos basado en la cobertura de los genes que regulan
(Fig. 4). Entre los cuatro TF principales candidatos, tres de ellos (Ace2p, Sfp1p y Ste12p) participan
en la regulacin de la ciclo de vida y el metabolismo del carbono de la levadura, mientras que uno
Se encontr TF (Msn2p) involucrar en las respuestas qumicas. Los TFS ms importantes
identificados fueron Ace2p y Sfp1p, que se ubic como los mejores de 1 y 2 TFS que
estn implicados en la regulacin de la respuesta de la levadura a cido actico y el estrs furfural.
Ace2p codifica un factor de transcripcin que pertenece a la clase de dedo de zinc C2H2 [69]. En el
final de la mitosis, Ace2p acta especficamente en clulas hijas para activar la transcripcin de
genes tales como quitinasas y glucanasas que se requieren para destruir el tabique y
permiten que las clulas madre y la hija se separen despus ciernes [69]. Sfp1p regula la expresin
de casi el 10% de los genes de la levadura, la mayora de los cuales estn involucrados en ribosoma
biognesis y la regulacin del tamao de la celda. Bajo ptima las condiciones de crecimiento, Sfp1p
se localiza en el ncleo y ayuda a promover ribosoma expresin de la protena del gen (RP), por
unin a los promotores de genes RP [70]. Cuando las clulas sufrido limitacin de nutrientes o de
estrs qumico, Sfp1p es
liberado de la RP genes promotores y deja el ncleo. Sfp1p media la informacin de respuesta al
estrs vas de sealizacin para la regulacin de la expresin de genes RP y, finalmente, los puentes
los cambios fisiolgicos
correspondiente al medio ambiente.

Tabla 5 de Gene ontologa anlisis de las respuestas de consenso de la transcripcin mediante la

comparacin de perfiles de expresin gnica de la
YC1 cepa resistente a los inhibidores y la de tipo salvaje cepa S-C1 a travs de diferentes condiciones
de estrs

Fig. 4 Factor de transcripcin (TF) perfiles para la regulacin de los genes implicados en la respuesta
de consenso a diferentes condiciones de estrs. El porcentaje de genes regulados por cada uno de
los 20 mejores TFS se calcul como el nmero de genes regulados por la TF en relacin con el
nmero total de consenso genes implicados en la respuesta a diferentes condiciones de estrs

Efectos de la sobreexpresin de ACE2 o sobre la resistencia SFP1 a cido actico y furfural

Desde la TFS identificados a travs del anlisis del TF son involucrados en la regulacin de Concenso
de genes relacionados con el estrs de respuesta a actico y furfural en S. cerevisiae, la hiptesis
que el fenotipo de resistencia a inhibidor podra ser posiblemente alterado cuando la TFS relevantes
son perturbados. Nosotros Elegimos el dos primeros TFS Ace2p y Sfp1p y evaluados los efectos de
su sobreexpresin en resistencia a los inhibidores en S. cerevisiae. Se construyeron dos cepas de
levadura manipuladas mediante la sobreexpresin del gen de ACE2 o gen SFP1 en la cepa madre
SR8-trp, respectivamente, produciendo de dos nuevas cepas S-ACE2 y S-SFP1 (Tabla 1). Actuaciones
de las cepas de S-ACE2, S-SFP1 y el control S-C1 en la fermentacin de la glucosa menores de tres
aos inhibidor diferente condiciones de estrs (cido actico solo, furfural solo, y cido actico +
furfural) se compararon (Fig. 5). En general, la sobreexpresin de ACE2 o SFP1 result en significativa
aumento de las tasas especficas de consumo de azcar, etanol productividades, y las tasas de
crecimiento celular en la ingeniera cepas en comparacin con el control bajo diferentes inhibidor
condiciones (prueba t, p <0,05). En la fermentacin con el presencia de cido actico y furfural, la
sobreexpresin de SFP1 mejor la productividad especfica de etanol en casi cuatro veces, mientras
que la sobreexpresin de ACE2 mejorado la tasa por tres veces. Los efectos positivos de la
sobreexpresin SFP1 o ACE2 se determinaron tambin en otro de tipo salvaje cepa, S. cerevisiae
CEN.PK. Las tasas de crecimiento de clulas especficas en la presencia de cido actico (2,5 g / L) +
furfural (1,5 g / L) el estrs se ha mejorado en un 25% (para SFP1 sobreexpresan cepa) y 18% (para
ACE2 cepa que sobreexpresa) en comparacin a la cadena principal de control de tipo salvaje que
contiene plsmido. Adems, se compararon los efectos de Sfp1p y Ace2p a Haa1p en trminos de
resistencia a los cidos actico, desde Haa1p es un conocido factor de regulacin de la transcripcin
levadura respuesta de estrs a cido actico [44, 45]. Son la sobreexpresin de SFP1 o ACE2 haba
mejorado especfica tasa de consumo de azcar similar a la cepa que sobreexpresa HAA1, mientras
que la sobreexpresin HAA1 provoc mejor celular crecimiento bajo estrs cido actico (archivo
adicional 1: Figura S4). Los resultados sugieren que la perturbacin de la transcripcin factor de
Sfp1p o Ace2p podran provocar alteracin de las redes de regulacin gentica que proporcionaron
proteccin efectos contra cido actico y furfural estrs en S. cerevisiae.
Adems, puesto que la sobreexpresin de SFP1 tena sustancial efectuar en la mejora de la
resistencia al cido actico y mezcla de furfural en la cepa de levadura de tipo salvaje, que adems
evaluado el efecto de la sobreexpresin de SFP1 juntos con WHI2 (sobreexpresin de que mejor
inhibidor resistencia en el YC1 cepa resistente). Un nuevo grupo de cepas de ingeniera se
construyeron, incluyendo S-WHI2-SPF1, S-WHI2-c, y S-C2 (Tabla 1), y su fermentacin actua en el
medio que contiene glucosa y niveles txicos de cido actico y furfural se cuantificaron y
comparacin (Fig. 6). La cepa S-WHI2-SPF1 tuvo el mayor tasa de consumo de azcar, etanol y la
productividad celular tasa de crecimiento, mientras que la cepa de control slo consume menos
superior a 5 g / l de glucosa dentro del marco de tiempo experimental.
En comparacin con la cepa S-WHI2 que sobreexpresa Slo WHI2, la cepa S-WHI2-SPF1 tuvo
aumento del 42% en la productividad de etanol y 20% tasa de aumento en el crecimiento celular, lo
que sugiere el efecto positivo de Sfp1p en la optimizacin resistencia a los inhibidores de la levadura
de fermentacin mixtos.

Fig. 5 actuaciones de fermentacin de las cepas de S-ACE2, S-SFP1, y el control S-C1 en condiciones
con cido actico (a), furfural (b), o actico cido + furfural (c). Las barras representan las tasas
especficas de consumo de azcar, productividades especficas de etanol, y las tasas de crecimiento
de clulas especficas. Los resultados fueron la medio de experimentos duplicados y barras de error
indican las desviaciones estndar

Estos datos experimentales sobre los efectos de Sfp1p y Ace2p indicado que la transcriptmica y la
bioinformtica El anlisis presentado en este estudio podra ser una prometedora marco mtodo
para descubrir TFS relevantes como gentica objetivos de perturbacin para optimizar el complejo
fenotipo tales como resistencia a inhibidores de mezclado en S. cerevisiae.

Discusin
En este estudio, las respuestas transcripcional de S. cerevisiae a la fermentacin condiciones de
estrs inhibidor confirmaron una vez ms que hay un solo camino se pudo encontrar que ser
exclusivamente responsable del fenotipo de resistencia. Ms bien, expresiones de genes globales
necesitan ser reconectados para responder a las condiciones de estrs. Es interesante notar que la
perfiles de transcripcin variaron en respuesta al cido ac tico y furfural, lo que podra estar
relacionado con el diferente txico efectos del cido actico y furfural. En general, encontramos que
los procesos de transporte transmembrana juegan papeles fundamentales en tanto YC1 cepa
resistente y la cepa de tipo salvaje en respuesta al cido actico, mientras que el metablica de
hidratos de carbono proceso es crucial para la respuesta de estrs de furfural. Adems, las
respuestas transcripcionales distintas a cido actico y la mezcla de furfural de la cepa resistente en
comparacin con el tipo salvaje sugerido la importancia de los procesos biolgicos tales como el
transporte transmembrana, metablica del proceso cido amino celular, y la respuesta a la
regulacin qumica en la levadura resistencia a los inhibidores de la fermentacin mixta.
Anlisis de los factores de transcripcin de los genes de consenso que fueron arriba o hacia abajo
regulados bajo todas las condiciones de estrs y la condicin en blanco en el YC1 cepa frente de tipo
silvestre revel determinantes clave para la mejora de la levadura resistencia al cido actico y
furfural. Se debera notar que algunos genes expresados diferencialmente a partir de RNA-Seq
conjunto de datos podra ser slo pasivamente hacia arriba o hacia abajo regulada y no puede
contribuir a la obtencin de respuestas de estrs. En para eliminar los falsos positivos y reducir
nuestros objetivos genticos relacionados con la mejora del inhibidor fenotipo de resistencia, se
proyect para el consenso genes a travs de todas las condiciones de cultivo, seguido mediante la
agrupacin de los genes de consenso por TFS que la mayora eran probable que regularlos. Entre los
mejores TFS (cobertura gen por encima de 80%), Sfp1p emerge intensamente como el
transcripcional
regulacin de los genes ribosmicos en respuesta a el hambre de nutrientes y el estrs [43]. Aunque
no hay evidencia directa de que sean o no Sfp1p podra participar

en el control de la transcripcin de todo el genoma respuesta a los cidos dbiles, se ha informado

de que todos las molculas que podran inducir limitacin general de nutrientes
se sugirieron tambin tener un efecto pro-oxidante en clulas de levadura [43], lo que podra
explicar por qu Sfp1p se destac como un TF importante en este estudio, ya que ambos de cido
actico y furfural tiene las propiedades oxidativas dentro de S. cerevisiae. Otro TF dominante,
Ace2p, podra activar varias genes con un papel crtico en la separacin de clulas y control
expresin especfica de clula hija de genes [71], lo que podra posiblemente contribuir a la
liberacin de la inhibicin del crecimiento tarifas y cambios del ciclo celular de S. cerevisiae
inducidos por qumicos en este estudio. Curiosamente, como descubierto previamente
en el estudio de las respuestas de estrs de S. cerevisiae a HMF y furfural en xilosa utilizacin [72],
Ace2p fue encontrado ser un factor de transcripcin de los genes reportero downregulated
despus de la pulsacin de HMF y furfural en la xilosa fase de consumo. Esto indica un papel
bifurcada Ace2 podra desempear en la regulacin del metabolismo de la levadura para resistir
diferentes inhibidores (acetato de furfural + vs + furfural HMF) bajo diferentes condiciones de
utilizacin de azcar (por ejemplo, glucosa V.S. metabolismo el metabolismo de la xilosa).
Mientras que no han sido evaluados en este estudio, la perturbacin apropiado de otros mejor
clasificados TFS como Msn2p, Msn4p, Gcn4p, Yap1p, Hsf1p, Rpn4p y Cin5p podra generar
potencialmente rasgos genticos beneficiosos para mejorar el estrs de levadura
respuestas, ya que estos TFS estn fuertemente involucrados en la regulacin de genes de
respuesta a estrs en la levadura para resistir varios estrs factores. Por ejemplo, la participacin de
Msn2p en el respuesta transcripcional a inhibidores de la fermentacin tiene ha documentado antes
del [42-44]. La caracterizacin inicial de los efectos de MSN2 que sobreexpresa en la cepa
SR8-trp mostr una mejora en la tasa de crecimiento especfico de clula en un 7% en comparacin
con la de S-C1 bajo furfural (1,5 g / L) en el estrs medio completo sinttico, pero ninguna mejora
significativa se observ bajo cido actico (2 g / L) en el estrs condicin experimental, indicando
la clara reguladora mecanismo para diferentes inhibidores de la fermentacin. Tambin el
factor de transcripcin Yap1p ha descubierto previamente para contribuir al inhibidor de la
tolerancia en ingeniera S. cerevisiae para la fermentacin de hidrolizado lignocelulsico [73].
Alteracin Este estudio no slo identificada de regulacin gentica redes y TFS relacionados travs
computacional anlisis de la bioinformtica, sino tambin determinar experimentalmente el efecto
de los mejores TFS como objetivos sobreexpresin en mejorar la resistencia inhibidor mixto en el
S. cerevisiae cepas ensayadas en este estudio. La mejora trada por sobreexpresin SFP1 y ACE2
(Fig. 5, 6) sugirieron que nuestro enfoque era eficaz para identificar factor de transcripcin metas
pertinentes para optimizar el fenotipo de destino
(es decir, resistencia a cido actico y furfural). Co-expresin ACE2 y SFP1 tambin mejoraron
significativamente la resistencia de la levadura a cido actico y furfural mezcla en comparacin con
expresando ACE2 o SFP1 individualmente, lo demuestra el mayor tasa de crecimiento especfico de
clula (en un 31%, P <0,05) y tasa de consumo de glucosa (en un 19%, P <0,05), lo que indica

podra haber algunos efectos sinrgicos de combinada la perturbacin de los dos TFS. Trabajo en
curso se centra en la caracterizacin de los efectos de la TFS identificados en ms detalle y dilucidar
sus funciones en la levadura mezclada inhibidor de resistencia.
Cabe sealar que es intrnsecamente complejo y desafiante para disear resistencia a la levadura
para la fermentacin mixta inhibidores porque cada tipo de inhibidor puede
tener efectos txicos distintos y la respuesta al estrs celular mecanismos [9, 10]. Nuestro trabajo
aqu ilustra una novela marco micas guiada por ingeniera metablica donde factores de
transcripcin que subyacen a un fenotipo complejo deseable podran ser identificados y perturbado
para la optimizacin de la tensin. En concreto, el marco de trabajo incluye dos claves
componentes. Por un lado, transcriptmica comparada anlisis genera informacin que se utilizar
para descubrir los mecanismos reguladores subyacentes para el deseado fenotipo (por ejemplo,
resistencia a los inhibidores) y la clave determinar TFS implicados. Por otro lado, puesto que los TFS
identificados regular los genes asociados con el fenotipo de destino, el TFS servir como los
objetivos de perturbacin genticos promisorios en ingeniera metablica para mejorar el fenotipo
de inters y lograr la optimizacin de tensin. Mientras que la presente estudio realiz la
sobreexpresin del seleccionado TFS como la manifestacin inicial, otra estrategia de perturbacin
Tambin podra aplicarse como eliminacin, proyeccin de Biblioteca de mutantes del TF, y puesta
a punto para determinar la mejor posible estrategia para la mejora del fenotipo. Adems, como la
cepa YC1 contiene va xilosa utilizacin, futuro estudio determinar los efectos de perturbacin
gentica en la mejora de la fermentacin de la glucosa y xilosa (los dos azcares ms abundantes a
partir de biomasa lignocelulsica) en presencia de inhibidores de la fermentacin mixta.
Redes de regulacin transcripcional podran variar en xilosa de fermentacin en comparacin con
la fermentacin de glucosa en S. cerevisiae [74, 75], por lo que tendra sentido para investigar
inhibidor mecanismos de respuesta al estrs e identificar la transcripcin objetivos de factores
desencadenantes resistencia mejorada inhibidor en ambas condiciones de fermentacin de azcar.
En general, en este estudio de prueba de concepto, confirmamos el papel fundamental
desempeado por TFS en respuesta al estrs y demostrado que la resistencia de la levadura a
factores de estrs podran de hecho mejorar perturbando la tecla TFS. Futuro trabajo
sistmicamente evaluar toda la otra altamente clasificado TFS y determinar sus efectos en las
respuestas de estrs a la levadura inhibidores de la fermentacin mixta. Adems, aunque la
presente estudio demostr identificacin exitosa de nuevos TFS
para mejorar la resistencia de la levadura a cido actico y furfural, sera significativa para
determinar la base molecular y dianas genticas para la tolerancia a los compuestos fenlicos
tambin. Ingeniera de la resistencia microbiana a los inhibidores de fermentacin
se hace an ms difcil y complejo como los tipos de inhibidores expandido en la mezcla. Con la
transcriptomicguided enfoque de ingeniera metablica demuestra en el presente trabajo, nuestro
trabajo futuro se aplicar el mtodo para identificar nuevos objetivos TF, caracterizan, as como ms
del TFS ya identificados en este estudio, por sus funciones en la obtencin de resistencia mejorada
a todos los tres inhibidores.

Conclusiones
En este estudio, hemos aplicado el anlisis transcriptmica comparada para avanzar en la
comprensin de la base molecular para las respuestas de estrs de S. cerevisiae a tanto sola e
inhibidores de la fermentacin mixta de cido actico y furfural.
Se identificaron dos factores de transcripcin, y Sfp1p Ace2p, como los reguladores fundamentales
en S. cerevisiae para controlar la resistencia de la levadura a cido actico y furfural, y se confirm
sus efectos positivos en la mejora de la inhibidor la resistencia a travs de la sobreexpresin de
genes. A nuestro leal saber y entender, que es la primera vez que estos dos factores de transcripcin
fueron descubiertos por sus funciones en la mejora de la levadura a resistencia a los inhibidores de
la fermentacin mixta. El transcriptomic-guiada ingeniera metablica enfoque que demostrado en
este estudio podra ser utilizado potencialmente como una estrategia para mejorar los fenotipos
complejos industriales microorganismos.

Archivos adicionales
Archivo adicional 1: Figura S1. Correlacin de los resultados qPCR y RNAseq anlisis de expresiones
de genes (R2 = 0.99). Figura S2. Fermentacin rendimiento del YC1 tensin y el medio SC cepa de
control S-C1IN que contiene glucosa (20 g / L) sin cido actico. Los resultados fueron los medios
de experimentos duplicados. Las desviaciones son menos de 10%. Figura S3. La superposicin los
genes expresados diferencialmente por la comparacin de la transcripcin perfiles de la cepa de
control S-C1 y el YC1 cepa bajo diferentes tensiones condiciones. En blanco: crecimiento sin
tensiones; AA: crecimiento con cido actico; FF: creciendo con furfural; AA & FF: creciente con
cido actico y furfural. Cifra S4. Actuaciones de fermentacin de las cepas de S-HAA1, S-ACE2, SFP1 y el control S-C1 en condiciones con cido actico. Las barras representan las tasas de consumo
de azcar especficas y las tasas de crecimiento de clulas especficas. Resultados eran los medios
de experimentos duplicados. Las desviaciones son menos de 15%.
Archivo adicional 2: Tabla S1. Transcripcional anlisis y anlisis de GO la cepa de tipo salvaje a
diferentes condiciones de estrs.
Archivo adicional 3: Tabla S2. Transcripcional anlisis y anlisis de GO la cepa resistente a los
inhibidores a diferentes condiciones de estrs.

Archivo adicional 4: Tabla S3. Transcripcional anlisis y anlisis de GO genes de consenso.

Abreviaturas
HMF: 5-hidroximetilfurfural; RNA-Seq: cido ribonucleico (RNA) secuenciacin; Factores de
transcripcin;: TFS YP: extracto de levadura-peptona; SC: completa sinttica; PCR: reaccin en
cadena de la polimerasa; qPCR: Reaccin en cadena de la polimerasa cuantitativa; AA: cido actico;
FF: furfural; AA & FF: cido actico y furfural; GO: ontologa de genes; RP: protena ribosoma.
Autores de las contribuciones YC, XF, y NW experimentos diseados. YC desarroll la cepa resistente
y perturbacin de genes realizado para la ingeniera de tensin. JYS, XF, y NW realiz Anlisis de los
datos RNA-Seq. YC, JYS, y JS llevaron a cabo experimentos de fermentacin.
YC y TJ prepararon y ARN purificado. YC, JYS, XF, y NW analizados y escribi el manuscrito. Todos los
autores leyeron y aprobaron el manuscrito final.
Detalles Autor
1 Departamento de Ingeniera Civil y Ambiental y Ciencias de la Tierra de la Universidad de Notre
Dame, 106E Cushing Saln de la Ingeniera, Notre Dame, del Sur
Bend, IN 46556, EE.UU.. 2 Departamento de Ingeniera de Sistemas Biolgicos, Virginia Instituto
Politcnico y Universidad Estatal, Blacksburg, VA, EE.UU.. Departamento 3 de Ingeniera Civil y
Ambiental de la Universidad de Pittsburgh, Pittsburgh, PA, EE.UU..
Expresiones de gratitud
Agradecemos al Dr. Yong-Su Jin de proveer las cepas SR8-trp y SR8-4. Agradecemos
Dr. Saikumar Karyala y el Dr. Robert Settlage en el Laboratorio de Investigacin Genmica
Virginia Bioinformtica Instituto, Virginia Tech para realizar el anlisis de ARN-ss y anlisis de la
bioinformtica.
Conflicto de intereses
Los autores declaran que no tienen intereses en conflicto. Recibido: 09 de septiembre 2015
Aceptado: 15 de diciembre 2015
Referencias
1. Hahn-Hgerdal B, Galbe M, Gorwa-Grauslund MF, Lidn G, Zacchi G.
Bio-etanol el combustible del futuro a partir de los residuos de hoy. Tendencias
Biotechnol. 2006; 24: 549 a 56.
2. Tilman D, Socolow R, Foley JA, Colina J, Larson E, L Lynd, Pacala S, Reilly
J, Searchinger T, C Somerville, Williams R.