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ANEXO 3

Perfil del proyecto


Capacidad inhibitoria de los extractos crudos de los actinomicetos L37, Ch50 y C92 frente a
los fitopatgenos Phytophthora infestans

, Rhizoctonia solani y Fusarium

sp.
1. Diagnstico de la situacin actual o lnea base.
La papa (Solanum tuberosum L.) es el cuarto cultivo alimenticio a nivel mundial (L pez et al,
2009) y uno de los cultivos ms representativos de la regin andina, como fuente de
alimentacin y de ingresos econmicos, especialmente para productores de bajos recursos
(Culqui, 2006). La produccin nacional se concentra en las provincias de Carchi, Pichincha,
Cotopaxi, Tungurahua y Chimborazo. Segn el INEC en 2012 Ecuador plant 35556
hectreas de papas, obteniendo un tonelaje final de 284629 (Andes, 2014).
Las enfermedades del suelo se distribuyen en todas las zonas paperas del Ecuador,
especialmente en zonas fras y hmedas, en sectores donde predomina el monocultivo; y se
diseminan a travs de rastrojos, por suelo y aguas contaminadas, implementos agrcolas o
mediante el uso de semilla contaminada. Entre los microorganismos ms comunes propios
del suelo que presentan un efecto patognico en el cultivo de papa estn: los hongos Costra
negra (Rhizoctonia solani), podredumbre seca del tubrculo
(Fusarium solani) (Mora et al,
S.A.) y el tizn tardo (Phytophthora

infestans) e insectos plagas como el gusano blanco


( Premnotrypes vorax) y la polilla

(Tecia solanivora), que se reflejan en bajos ndices de


productividad

(Monar et al, S.A.)


Los agricultores pueden mejorar la fertilidad del suelo al combinar fuentes orgnicas e
inorgnicas (Bernal, S.A.). El uso de productos a partir de fuentes biolgicas constituye un
nuevo paradigma en el manejo del suelo; debido a los altos precios elevados, el difcil
acceso y los problemas que acarrean los agroqumicos.
Actualmente en Ecuador no existe un nmero representativo de artculos cientficos
que reporten la existencia, distribucin, caracterizacin y funcin ecolgica
de los actinomicetos en el suelo. En 2010 Mogrovejo desaroll el Estudio de supresin a
Phytophthora Infestans por poblaciones microbianas aisladas de suelos paperos de la
Provincia de Chimborazo en dos diferentes tiempos de muestreo en la Escuela Politcnica
del Ejrcito; en 2011 un estudio consecutivo realizado por Villamarn, comprob la
inhibicin de P. infestans por actinomicetos nativos; confirmando la existencia de varias
especies en suelos paperos del pas; dentro del mismo estudio, se determin
mediante tcnicas moleculares, la presencia del gen PKS-I en los actinomicetos inhibidores.
Basadas en estos resultados Medina y Garcs dentro de sus estudios realizados en
el 2013, reportaron informacin consecuente sobre la capacidad de biocontrol de
los actinomicetos

nativos

sobre P. infestans

y R. solani a nivel in vitro y de invernadero, en


los suelos paperos del Ecuador (Guzmn, 2014; Rodrguez, 2014).
La identificacin de microorganismos antagnicos funcionales, que produzcan compuestos
qumicos inhibidores del crecimiento de fitopatgenos, es una fuente alternativa sustentable

en los sistemas de produccin agrcola y que fomenta el campo de accin de la


agrobiotecnologa (Rodrguez et al, 2014).
Los resultados contribuirn a la obtencin de metabolitos secundarios que inhiben 3
enfermedades de Solanum tuberosum L. producidas por fitopatgenos presentes en suelos
paperos del Ecuador, pudiendo ser usados en vez de pesticidas, mejorando la calidad de
vida y del medioambiente
2. Hiptesis o preguntas de investigacin.
Tienen los extractos crudos de los actinomicetos L37, Ch50 y C92 una capacidad
inhibitoria estadsticamente significativa

frente a los fitopatgenos Phytophthora infestans,


Rhizoctonia solani y Fusarium sp.?
3. Objetivos generales y especficos.
Objetivo general

Determinar la actividad inhibitoria de extractos crudos de actinomicetos


seleccionados

frente a los fitopatgenos Phytophthora infestans, Rhizoctonia solani


y Fusarium sp.

Objetivos especficos

Obtener y activar microorganismos.


Realizar pruebas de antagonismo entre las cepas seleccionadas.
Obtener extractos crudos.
Realizar pruebas de inhibicin entre los extractos crudos y los fitopatgenos.
Caracterizar genotpicamente las cepas de actinomicetos.

4. Mtodos a utilizar.
Obtencin y activacin de microorganismos

Activacin de actinomicetos
Se tomarn las cepas L37, Ch50 y C92 de actinomicetos del laboratorio de Microbiologa
Molecular de la Universidad de Las Fuerzas Armadas - ESPE obtenidos de trabajos
experimentales anteriores.
Los microorganismos se resuspendern en 10 mL de agua peptonada estril al 0.1% (p/v)
por una hora y se agitarn en vrtex. Se colocar una gota directamente en matraces con

80 mL de dos medios diferentes: caldo agua extracto de levadura (WYE, modificado de


Reddi y Rao, extracto de levadura 0.25 g/L; K2HPO4 0.5 g/L) (Crawford et al, 1993) y caldo

glicerol extracto de levadura [YGB, glicerol 5% (p/v), extracto de levadura 2.5 g/L], e
incubarn a 25C durante 10 das, en agitacin constante de 150 rpm. Los medios se
prepararn con agua destilada y se ajustarn con solucin NaOH 0.1N a pH 7.17.2 antes
de ser autoclavados. Se deben realizar cinco repeticiones. Una vez reconstituidos los
actinomicetos, se realizarn pases sucesivos en los mismos medios de cultivo
suplementados con agar (15-20 g/L). E incubar a 25C por 5 das (Franco e
t al, 2009).

Obtencin de fitopatgenos

Phytophthora infestans
El Centro Internacional de la Papa proporcionar la cepa C95. Para la rplica se emplear
el medio papa dextrosa agar (PDA), donde se realizarn cortes de 5 mm2 en el consorcio,
se extraer el implante y se lo sembrar en una nueva caja de PDA y se incubar a 20C
por 5 das (Ochoa & Montoya, 2010).
Despus de 7 das se debe tomar una porcin de micelio areo, el cual ser colocado sobre
medio Agar-centeno. Para mantener la virulencia del patgeno durante su almacenamiento
en medio artificial, se debern hacer subcultivos, transfiriendo el micelio areo del medio de
cultivo hacia un tubrculo y viceversa (Baquero, Brenes, & Gmez, 2006).

Rhizoctonia solani Khn

Una cepa denominada AG3, ser proporcionada por el laboratorio de Microbiologa de la


Universidad de las Fuerzas Armadas ESPE.
Se realizarn traspasos en el medio de cultivo, papa dextrosa agar PDA. Se realizarn
cortes de 5 mm2, se traspasarn a un medio nuevo y fresco; y se incubarn a 20C por 5
das (Rodrguez, 2014).

Fusarium sp.

Se seleccionarn trozos de tejido vegetal de Allium cepa de plantas con sntomas de


marchitez y con coloracin amarillenta roscea en el bulbo. Se examinarn las muestras en
el estereoscopio y se proceder a procesarlas, cortando cada muestra en pequeos trozos;
se desinfectarn con hipoclorito de sodio al 1.5% durante 1 a 3 minutos Se lavarn con
agua destilada y sern transferidos aspticamente a una cmara hmeda (caja Petri con un
papel filtro humedecido en agua esterilizada). Se transferirn los trozos desinfectados a
cajas Petri, conteniendo medio selectivo de Fusarium segn Quilambaqui, 2005: 39 g de
PDA, 750 mg de PCNB, 300 mg de sulfato de estreptomicina. Se incubarn durante 7 das a

24C y un fotoperodo de 12:12. A los 7 das los aislamientos se debern transferir a otras
cajas Petri con PDA para su purificacin.
Pruebas de antagonismo entre actinomicetos
Se realizar una siembra abundante de una cepa actinomicetos con el asa bacteriolgica, a
una distancia de 3 cm del borde. Se proceder a sembrar en el extremo opuesto a 3 cm de
la primera cepa 1 gota de la segunda cepa de actinomicetos, se incubarn a 25C por 10
das.
Se realizar una observacin diaria de la interaccin de los actinomicetos, en donde se
medir con una regla en milmetros, el crecimiento de la segunda cepa frente a los primeros
actinomicetos, modificado de (Garcs, 2014).
Se seleccionarn los grupos de dos cepas que no presenten actividad antagonista entre s.

Co-cultivo de actinomicetos
Fermentacin
Para los grupos seleccionados en la prueba de antagonismo entre actinomicetos:
Para cada cepa, se prepararn 50 mL de medio ISP 1, y se inocularn con 0.5 mL de cultivo
de 24 h de crecimiento. Los frascos sern incubados con agitacin de 120 rpm a 28C
durante 4 das, modificado de (Alam & Singh, 2011). Se realizarn cinco repeticiones.

Produccin del co-cultivo:


Para el co-cultivo, 10 mL de cultivo de 5 das de crecimiento de la primera cepa se
inocularn en ocho frascos Erlenmeyer con medio ISP1 inoculado con 10 mL de cultivo de
la segunda cepa con 5 das de crecimiento (Dasthi e
t al, 2014).
Obtencin de los extractos crudos
Despus de la fermentacin de los co-cultivos se filtrarn los caldos fermentados, y el
sobrenadante ser extrado con etil-acetato (2250 mL) obtenindose un extracto
etil-acetato. Se agregar resina XAD16 al licor madre, se agitar y filtrar para finalmente
extraer con acetona y obtener un extracto acetona. Las clulas y el micelio sern
macerados en un doble volumen de metanol con agitacin por 3 horas, luego se filtrarn y
se obtendr el extracto metanlico (Dasthi e
t al, 2014).

El caldo fermentado ser transferido a tubos y sern centrifugados a 5000 rpm por 5
minutos El sobrenadante ser tratado como extracto crudo extracelular y ser usado para:
extraccin por solventes, debido a que la naturaleza del metabolito es incierta (Alam &
Singh, 2011).

Extraccin y determinacin de la concentracin de metabolito extraceular e


intracelular en extractos crudos
Metabolito extracelular
Dos solventes (Cloroformo y Etil acetato) se usarn para la extraccin. Se tomarn 500 L
del extracto crudo extracelular en tubos eppendorf y se agregarn 500 L del solvente
respectivo. Se mezclar

por 1 hora y se centrifugarn los tubos a 10000 rpm por 10

minutos, se colectar la fase superior (cloroformo-etil acetato) que tiene disueltos


metabolitos en una caja Petri pesada previamente. El plato se almacenar en la estufa
(50C) hasta secar los solventes. Se pesar nuevamente la caja Petri y se calcular la
cantidad de metabolito extrado, el clculo se realizar restando el peso de la caja vaca del
peso de la caja despus del secado. El metabolito ser disuelto en 500 L de agua
destilada estril. Se anotarn los datos en la Tabla 1, donde se observar la concentracin
de metabolito secundario.
Tabla 1. Extraccin de metabolito por solventes.

Solvente

Peso de
caja
Petri
vaca
(g)

Peso de caja
Petri despus
del secado
(g)

Peso del
metabolito
(g)

Cantidad de
agua destilada
usada
(mL)

Concentracin de
metabolito
(g/mL)

Cloroformo
Etil acetato

Metabolito intracelular
Despus de colectar el metabolito extracelular, se resuspender el pellet de clulas en 467
L de buffer TE (Tris 200mM, EDTA 50mM), 30 L de SDS al 10 % y 3 L de Proteinasa K.
Los tubos se incubarn a 37C por 1 hora y sern centrifugados a 10000 rpm por 10
minutos, se colectar el sobrenadante, que corresponde al metabolito intracelular.

Se tomarn 500 L de metabolito intracelular y se colocarn en 1 tubo eppendorf agregando


500 L de metanol, se mezclar por 1 hora y los tubos sern centrifugados a 10000 rpm por
10 minutos. Se transferir la fase metanlica a una caja Petri pesada previamente y se
secar en la estufa (50C), se determinar la cantidad de metabolito como se describi
previamente, y finalmente se disolver el metabolito en un volumen doble de agua destilada
estril, obtenindose una concentracin final de 0.5 g/mL (Alam & Singh, 2011).
Pruebas de inhibicin entre los extractos crudos y los fitopatgenos
Se mojarn discos de papel filtro con los extractos crudos obtenidos y se inocularn los
patgenos R. solani, P. infestans y Fusarium sp., en cajas Petri con medio YGA y PDA. En
el centro de la caja Petri, a una distancia de 2.5 cm se colocarn cuatro discos a cada
extremo formando los vrtices de un cuadrado imaginario, se llevar a incubacin a 25C y
se observarn los resultados durante 15 das (Rodrguez, 2014).
Caracterizacin genotpica de las cepas de actinomicetos

Extraccin del ADN genmico de las cepas


Se tomarn las cepas con 20 das de crecimiento en caja Petri con medio PDA. Se
recuperarn las clulas de la superficie de la colonia con un pistilo de vidrio impregnado con
buffer de lisis (200mM Tris pH 8.5, 250mM NaCl, 25mM EDTA, 0.5% SDS), se colocarn en
un tubo cnico de 1.5 mL conteniendo 100 L del mismo buffer y se triturar la muestra con
un homogeneizador por 30 segundos. Se agregarn 350 L de buffer de lisis y 500 L de
fenol:cloroformo:alcohol isomilico (25:24:1), se realizarn dos pasos de extraccin con
fenol: cloroformo:alcohol isomilico y el ADN se resuspender en buffer TE 1X con RNAsa
(Franco et al, 2009).

Amplificacin del gen 16S ADNr


Se obtendr por la tcnica de PCR utilizando como molde el ADN genmico extrado
directamente de las clulas del actinomiceto. Los primers que se utilizazarn para la
reaccin de PCR son: F1 y R5 Tabla 2, homlogos a los extremos conservados del gen 16S
ADNr de bacterias. Se utilizar el programa Cook y Meyers 2003: denaturacin inicial de
95C por 2 minutos, 30 ciclos de denaturacin (94C por 1 minuto), anillamiento (55C por 1
minuto), extensin (72C por 3 minutos), extensin final (72C por 3 minutos) (Franco et al,
2009).

Tabla 2. Par de primers seleccionados para Actinomicetos.


Primer

Secuencia

F1

(5-AGAGTTTGATCITGGCTCAG-3)

R5

(5-ACGGITACCTTGTTACGACTT-3)

Secuenciacin
La secuenciacin ser llevada a cabo enviando el tubo que contenga los productos de la
PCR a la empresa Macrogen Inc., mediante la secuenciacin a gran escala desarrollada por
Applied Biosystems, concretamente el modelo 3730XL. Servicio que requiere para un
producto de PCR no purificado: concentracin de 10 ng/mL y un volumen mnimo de 20 L.
5. Resultados obtenidos o esperados.
Cultivo puro de actinomicetos
Se seguir un modelo de 3x2, en donde las 3 cepas seleccionadas sern dispuestas a dos
tratamientos, para cada tratamiento se harn 5 repeticiones, con la finalidad de obtener un
nmero de datos muestrales, n= 30. La herramienta estadstica que se utilizar para
almacenar los datos es una tabla de contingencia (doble entrada Tabla 3), y para el anlisis
de los datos se utilizar la prueba de homogeneidad de Chi cuadrado (permite determinar si
dos variables cualitativas estn o no asociadas). El parmetro a medir es el crecimiento
bacteriano a los 10 das despus de la siembra. Adicionalmente se deber establecer un
control para verificar la realizacin adecuada del experimento.
Tabla 3. Tabla de contingencia, Crecimiento de cepas actinomicetos 1,2 y 3 con los
tratamientos 1 y 2 a las 240 horas.
Crecimiento

Crecimiento promedio a los 10 das

bacteriano
Cepas

(CFU/mL)
Tratamiento 1

L37
Ch 50
C 92

Tratamiento 2

Cultivo mixto de actinomicetos


En la segunda fase, se plantea un Diseo Completamente al Azar sencillo (DCA). Para los
ensayos de antagonismo in vitro entre las cepas de actinomicetos, el parmetro a medir es
la distancia promedio en mm entre dos estirpes y se grabarn en una tabla de 3x3 (Tabla 4),
los datos se sometern a un anlisis de varianza.
Tabla 4. Crecimiento promedio (mm) entre las cepas de Actinomicetos.
Factor B
Factor A

L37

Ch 50

C 92

Media

L37
Ch 50
C 92
Media

Obtencin de un extracto crudo y cuantificacin del metabolito secundario


En la tercera fase, se planea un Diseo Completamente al Azar (DCA), para la obtencin
del extracto crudo actinomicetos, los datos se sometern a un anlisis de varianza.

Pruebas de inhibicin de los extractos crudos frente a los fitopatgenos


Para el anlisis estadstico de la inhibicion se llevar un registro del crecimiento de los
patgenos en medio YGA sin la presencia de los actinomicetos, crecimiento libre, y otro
registro del crecimiento de los consorcios con la presencia de los actinomicetos lo que se
conoce como crecimiento influenciado, y se medir el porcentaje de crecimiento radial
segn la siguiente frmula:
Ecuacin 1. Crecimiento influenciado promedio.

P CIR =

crecimiento librecrecimiento influenciado


crecimiento libre

x 100

Para la determinacin de la distribucin de los datos se realizar una prueba de normalidad


conocida como Shapiro-Wilks, que permite determinar si la variable en estudio tiene una
distribucin normal donde Ho supone que las observaciones tienen una distribucin normal;
mientras que HA supone que las observaciones no tienen una distribucin normal.
En el caso de que los datos demuestren que no tienen una distribucin normal en las
pruebas de normalidad, se llevar a cabo un anlisis no paramtrico conocido como Kruskal
Wallis con un nivel de significancia de p= 0.05.
El ANOVA propuesto por Kruskal y Wallis en 1952 para el anlisis de una varianza no

paramtrica permite comparar las esperanzas de dos o ms distribuciones sin esencialidad


de realizar el supuesto de que los trminos de error se distribuyeron normalmente.
Se determinar estadsticamente la actividad inhibitoria de los extractos crudos frente a los
fitopatgenos.

Identificacin molecular
Los resultados obtenidos de la secuenciacin de los fragmentos correspondientes al gen
ADNr 16S sern analizados con el algoritmo bioinformtico BLAST (Basic Local Alignment
Search Tool, que por medio de su programa BLASTN, permite comparar una secuencia
nucleotdica desconocida con una base de datos de la misma naturaleza e identificar la
especies.
Estos resultados, poseern el nivel cientfico y experimental necesario para ser publicados
en revistas de alto impacto relacionadas a la Microbiologa aplicada, Fitopatologa,
Biotecnologa y afines. El objetivo final del proyecto de investigacin es la divulgacin
cientfica, base para la consecucin de un bioproducto a partir de los actinomicetos
seleccionados.
6. Referencias bibliogrficas.

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AGRONMICA DE CUATRO CLONES PROMISORIOS Y TRES VARIEDADES DE
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CUATRO LOCALIDADES DE LA PROVINCIA BOLIVAR. Instituto de Investigacin
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Rodrguez, R., Pea, K., Fernndez, E., Almeyda, I., Acosta, E., & Rodrguez, R. A.
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CON POTENCIAL PARA EL BIOCONTROL DE Phythophtora capsici Leonian.
Nuevo Len - Mxico: Facultad de Ciencias Biolgicas