Enumeracin de mohos y levaduras.

I.

Introduccin:

Los hongos y levaduras son fcilmente encontrados en alimentos en los cuales

el ambiente es menos favorable para el crecimiento bacteriano por debajo pH 5
o <5, baja humedad, aw (0.75), alto contenido en sal o azcar, baja
temperatura de almacenamiento, la presencia de antibiticos o exposiciones a
irradiacin. Causan deterioro de estos alimentos si son almacenados en
condiciones deficientes, como por ejemplo (frutas frescas, jugos de fruta,
vegetales, quesos, cereales y alimentos deshidratados o congelados),
decoloracin de las superficies de los alimentos, olores y sabores extraos.
Habra que sumar al deterioro, el peligro potencial de produccin de
micotoxinas, producidas por algunas especies de hongos. Si estas sustancias
son ingeridas causan intoxicacin alimentaria.

Para eliminar o reducir tales problemas en los alimentos susceptibles se

debera:
a) Reducir la carga de esporas con buenas prcticas de higiene.
b) Consumo rpido de los alimentos preparados
c) Guardar los alimentos congelados a -12 C
d) Eliminar o reducir el contacto con el aire
e) Calentar los alimentos antes de envasarlos para destruir clulas
vegetativas y esporas.
f) Agregar cidos que eviten el crecimiento.
g) Agregar preservantes qumicos, tales como sorbatos o benzoatos.
Las levaduras crecen ms rpido que los hongos, pero generalmente
crecen en conjunto. Los hongos son generalmente aerobios estrictos, en
cambio las levaduras pueden crecer con o sin oxgeno; en presencia de
ste crecen mejor.

Recuento de mohos y levaduras

Este procedimiento se aplica para realizar el recuento de mohos y

levaduras por la tcnica de recuento de colonias en placa por
incorporacin. Basado en Norma ISO 7954.
II.

Materiales
Tubos 16x160 mm.
Placas de Petri
Pipetas bacteriolgicas de 1 mL
Equipos
Estufa de incubacin regulada entre el rango de 22C a 25 C
(24C 1C).
Medio de cultivo y reactivos
Agar Cloranfenicol- dextrosa- extracto de levadura (cloranfenicol
puede ser reemplazado por oxitetraciclina). - OGY
Solucin de Cloranfenicol u Oxitetraciclina al 0,1%.
Solucin de agua peptonada al 0,1 % o Agua buffer fosfato.
Tincin de Gram o Reactivos para Tincin Simple.

III.

Procedimiento:
1. Prepara la dilucin
Agregar 10 g de muestra en un matraz con 90 mL de agua
peptonada (10-1),
realizar las diluciones (10-2, 10-3) consecutivas.
2. Pipetear por duplicado a placas Petri estriles alcuotas de 1 mL
de la muestra si es producto lquido o 1 mL de la dilucin 10 -1 en
el caso de otros productos.
3. Sembrar por lo menos dos diluciones (10 -2, 10-3) consecutivas por
duplicado.
4. Se recomienda esta serie de diluciones cuando no se conoce el
rango aproximado de microorganismos.
5. Agregar 15 mL de agar fundido y temperado a 47C 2C.
6. El tiempo transcurrido entre la preparacin de la suspensin
inicial y el momento de agregar el agar no debe exceder de los 15
min.
7. Mezclar el inculo con el medio fundido, inclinando y girando las
placas. La forma adecuada de llevar a cabo esta operacin sera
la siguiente:
Mover la placa con movimientos de vaivn 5 veces en una
direccin,
hacerla girar 5 veces en el sentido de las agujas del reloj,
mover con movimientos de vaivn en una direccin que
forme ngulo recto con la primera y

 hacerla girar 5 veces en el sentido contrario a las agujas

del reloj.
8. Una vez solidificado el agar, no invertir las placas.
9. Incubar a 22 - 25C durante 3 a 5 das.
10. Realizar controles de ambiente, medio de cultivo y diluyente.
11. Anotar resultados.
Lectura
1. Tomar todas las precauciones necesarias al manipular las placas
Petri, para evitar la contaminacin del rea de trabajo. Las
esporas de los mohos se dispersan con gran facilidad.
2. Si parte de la placa presenta desarrollo excesivo de hongos, o si
es difcil contar colonias aisladas en menos tiempo, registrar los
recuentos obtenidos y registrar el perodo de incubacin, ya sea
tres o cuatro das.
3. No contar las placas antes de 3 das de incubacin, la
manipulacin podra provocar colonias secundarias por dispersin
de esporas.
4. Contar las colonias de mohos
Las que se presentan bajo una forma filamentosa
caracterstica (micelio) de color variable. Estas se
desarrollan ms tardamente que las levaduras.
Anotar resultados.
5. Contar las colonias de levadura por separado.
Las colonias de levaduras se presentan en forma de
colonias opacas, blancas o amarillas. Anotar resultados.
Realizar Tincin de Gram o microscopa al fresco a las
colonias sospechosas de levaduras para confirmar su
presencia. Anotar el resultado.
Clculo
El nmero de Mohos y Levaduras por gramo o mL de alimento se
determina segn la siguiente frmula:
N=

C
[ ( 1 xn 1 ) + ( 0,1 xn 2 ) ] x d

Donde:
N = nmero de colonias por ml o g de producto
C = suma de todas las colonias contadas en todas las placas
n1 = nmero de placas contadas de la menor dilucin.
n2 = nmero de placas contadas de la dilucin consecutiva.
d = dilucin de la cul fue obtenido el primer recuento
6. El resultado se expresa en Recuento de Mohos por gramo o mL
de alimento y Recuento de Levaduras por gramo o mL de
alimento.

7. Si todas las placas de ambas diluciones no presentan crecimiento

o desarrollo, informar como menor de uno por el valor recproco
de la dilucin menor por g o mL.
< 1 x 1/ dm, donde dm = menor dilucin
IV.

Bibliografa

PRT- 712.02-031, (2008). Procedimiento recuento mohos y

levaduras en alimentos. NORMA ISO 7954. Chile.

Recuento de mohos y levaduras muestras de alimentos

Tcnica de recuento en placa

Este procedimiento se aplica para realizar el recuento de mohos y levaduras

por la tcnica de recuento de colonias en placa en muestras de alimentos.
Procedimiento segn APHA 2001. Tomado de ANMAT, 2014.
I. Materiales

Frascos de 150 ml de capacidad

Placas de Petri de 100 x 15 mm
Pipetas
Termmetros
Asa Drigalsky

Medio de cultivo y reactivos

Buffer fosfato de Butterfield

Agua peptona al 0.1 %
Agar Dicloran Rosa de Bengala Cloranfenicol (DRBC) para alimentos

con actividad de agua < 0,95

Agar Dicloran 18 % Glicerol (DG 18) para alimentos con actividad de

agua 0.95
Agar plate count (PCA)

II. Procedimiento
1. Se verter 15 - 20 ml del medio en placas de Petri de 9 cm de dimetro y
luego de se secan a temperatura ambiente por una noche (21 - 25C).
2. Inocular 0.1 ml de la dilucin decimal apropiada por duplicado sobre el
agar solidificado y distribuir en toda la superficie usando una esptula de
vidrio estril.
3. Si el recuento estimado de la muestra es menor a 100 UFC/g o ml,
inocular 1 ml dividiendo el volumen en cuatro placas, tres con 0.3 ml y
una con 0.1 ml.
4. Incubar las placas sin invertir por 5 das a 22 - 25C en pilas de no ms
de 3 placas; sin tocar hasta que las colonias puedan contarse, ya que el
movimiento de las placas puede provocar un crecimiento secundario
(debido al desplazamiento de esporas) e invalidar el resultado final.
Contar las placas que contengan entre 15 - 150 colonias. Contar por el
lado inferior de la placa luego que el desarrollo de hongos haya ocurrido.

5. En la placa seleccionada, contar separadamente las colonias con

aspecto filamentoso, algodonoso o pulverulento lo que es caracterstico
de los mohos y registrar el resultado.
6. En la misma placa, las colonias remanentes pueden ser levaduras o
bacterias. Seleccionar al menos cinco colonias y verificar la morfologa
de las clulas al microscopio, observando si el cultivo es de levaduras,
bacterias o una mezcla de ambos. Determinar el nmero de levaduras.
7. Para calcular el nmero total de mohos y levaduras, sumar al nmero de
colonias de mohos el nmero confirmado de levaduras y multiplicar por
la inversa de la dilucin.
8. Informar el recuento como UFC por gramo o ml de muestra.

Si se usa agar DRBC se agrega cloranfenicol 100 g/ml. Almacenar las

placas de DRBC en la oscuridad para evitar la fotogeneracin de
inhibidores a partir del colorante rosa de bengala.

Si se siembra en el agar PCA es suplementado con 100 g/ml de

cloranfenicol y las placas no necesitan ser almacenadas en la oscuridad.

El agar DG18 se usa para alimentos testeados alimentos con baja

actividad acuosa tales como cereales, harinas, nueces y especias es el
mejor porque permite que los hongos xerfilos sean enumerados

III. Bibliografa

ANMAT, 2014. Mtodo Analtico Oficial. Vol.3. RenaLao. Crdova,

Argentina.

Investigacin de Vibrio cholerae en alimentos

I.

Introduccin:

Vibrio cholera es la especie mejor conocida como causa del clera humano
contrado por agua contaminada, alimentos contaminados, y han sido
registradas 7 pandemias. En el siglo XIX, en Estados Unidos, hubo tanto
epidemias de clera como casos aislados. La mayor parte de los brotes que
ocurrieron en el siglo XX afectaron pases de Asia. Entre 1 991 y 1 992 se inici
una gran epidemia de clera en el Per, que se disemin a muchos pases de
Amrica del Sur, y afect a 640 000 personas y ocasion 5 600 muertes. Esta
epidemia fue llevada a Estados Unidos por sujetos que haban viajado a esos
pases y que comieron alimentos contaminados o introdujeron a este pas, de
manera oculta, alimentos prohibidos. Tanto en la Unin Americana como en
otros pases, adems de las cepas O1 se ha implicado en casos de clera V.
cholerae no O1. Antes se pensaba que las cepas O1 eran incapaces de causar
epidemias masivas, pero en 1 992 se asoci el serotipo no O1, no O139 a una
gran epidemia en India y Bangladesh.
Caractersticas
-

Bacilos Gram negativos, frecuentemente curvados o rectos, cortos.

No esporulados
Generalmente mviles (monotrico) debido a un flagelo polar provisto de

vaina.
Son anaerobios facultativos.
Son oxidasa positiva, no producen gas y son sensibles al compuesto

O/129.
Crecen en concentraciones altas de sales biliares, y tambin en medios

alcalinos.
No crecen en medios con 6% y 8% de NaCl.
La temperatura ptima de crecimiento comprende un rango de 30 a

37C.
La tasa de crecimiento es muy rpida, aun a temperatura ambiente. Las
clulas no se multiplican en cangrejos, peces ni otras vivos. Sin
embargo, en alimentos marinos cocinados, puede haber un crecimiento

veloz a 25 a 35C
Los alimentos alcalinos propician la multiplicacin rpida de las clulas.
Crece en el medio cistina lactosa deficiente en electrolitos de Mackey y
Sandys (1 966), modificado por Bevis (1 968). Lo que lo diferencia de V.

parahaemolyticus y V. alginolyticus.
Tiene dos biotipos Clsico y El Tor, que se diferencian basndose en el
carcter hemoltico.

Ambos tipos son sensibles al calor y mueren a la temperatura que se

usa para cocinar. El calentamiento inadecuado no mata a las clulas

presentes en un alimento.
El serotipo O1 no posee cpsula, mientras que O139 s la tiene.
Los serotipos no O1, no aglutinan con anticuerpos preparadas en contra
de antgenos O1; similares a los serotipos O1, no son sensibles a

trimetoprim-sulfametaxazol con furazolidona.

El perodo de enriquecimiento no debe exceder las 8 horas, para que la
flora competidora no sobrepase a V. cholerae.

Sobrevive:
Ancas de rana: -20C por ms de 28 das.
Ancas de rana: 4C por ms de 2 das.
Alimentos cocinados (arroz, tallarines, carne, jamn, etc): 5-10C por 2-

5 das.
Alimentos crudos (camarones, pescado ahumado, marisco, ostras, carne

cruda, pescados pequeos, lechugas, pepino, etc.): 5-10C por 4-9 das.
La supervivencia de stas es mayor en alimentos cocinados que se
almacenan a 5 a 10C.

Identificacin
Se puede identificar como vibrio en base:
-

Crecimiento en medio TCBS,

La morfologa,
La reaccin oxidasa positivo,
La fermentacin de la glucosa sin produccin de gas y,
Base a la sensibilidad al compuesto O/129.

La sensibilidad al compuesto O/129 dese ser ensayada en medios que tengan

un contenido de sal bajo.
V. cholerae se puede identificar en base:
Crecimiento en caldo nutritivo que no tenga NaCl
Fermentacin de la sacarosa
Motilidad
II.

Procedimiento

a. Aislamiento de Vibrio cholerae

Material
Instrumentos para la preparacin de las muestras: cuchillos, tenedores
pinzas, tijeras, cucharas y esptulas. Todos esterilizados.
Recipiente de vidrio con tapn de rosca de 500 ml.
Asa bacteriolgica.
Placas Petri
Medios

Agar tiosulfato citrato sales biliares sacarosa (TCBS)

Agar de Aronson
Agar nutritivo
Agar taurocolato tripticasa telurito gelatina (TTG)
Agua peptonada alcalina
Agar gelatina.

Procedimieno
1. Pesar 25 g de muestra en recipientes tarados. Cortarla en trozos
pequeos con unas tijeras.
2. Aadir 225 ml de agua de peptona alcalina y mezclar cuidadosamente.
3. Incubar las suspensiones a 35-37C durante 6 horas (rango 4-8 horas).
4. Preparar placas secas de agar tiosulfato citrato sales biliares sacarosa y
de un agar no selectivo como el agar nutritivo, el agar de Aronso o el
agar taurocolato tripticasa telurito gelatina
5. Pasar una asada de la suspensin en caldo a la superficie de cada uno
de los medios slidos y sembrar en estras, de tal manera que puedan
desarrollarse colonias aisladas.
6. Incubar las placas durante 18-24 horas a 35-37C.
7. Hacer una resiembra con un asa a partir del cultivo de 6 horas en agua
de peptona alcalina en un nuevo tubo con 10 ml de agua de peptona
alcalina, incubando el tubo durante 6 horas.
8. Pasar una asada de la suspensin en caldo del apartado anterior a la
superficie de dos placas de dos medios slidos e incubar 18-24 horas a
35-37C.
9. Examinar el cultivo de 6 horas en agua de peptona alcalina para
observacin de la motilidad tpica en gota pendiente o lmina hmeda,
con iluminacin de campo oscuro.

10. Reincubar el cultivo en agua de peptona alcalina una noche a 35-37C;

resembrar en dos placas de medios slidos distintos, como se indic en
el apartado 5, e incubar estas placas durante 18-24 horas a 35-37C.
11. Resembrar 3 o ms colonias tpicas de cada una de las placas en agar
nutritivo inclinado.

A. Las colonias tpicas de V. cholerae en agar tiosulfato citrato sales biliares

sacarosa son grandes (2-3 mm), lisas, amarillas y ligeramente aplanadas,
con el centro opaco y la periferia translcida.
B. Las colonias tpicas de V. cholerae en agar gelatina son transparentes y
presentan una zona turbia caractersticas, que se hace ms evidente
despus de unos minutos en el frigorfico.
C. Las colonias tpicas de V. cholerae en agar de Aronson son de 2-3 mm de
dimetro, lisas, translcidas y en forma de bveda baja, con centro rosa o
rojo y periferia sin color. Despus de un tiempo mayor de incubacin, las
colonias se vuelven de un tono rojo fuerte uniforme.
D. Las colonias tpicas de V. cholerae en agar nutritivo son grandes,
translcidas y grisceas. La mayora de los microorganismos entricos,
tales como Escherichia coli, forman en este medio colonias opacas.
b. Pruebas bioqumicas y confirmacin de V. Cholerae
Materiales

Asa bacteriolgica
Pipetas de 1 ml.
Dihidrocloruro de tetrametil-parafenileno-diamina
Agente vibriosttico O/129
Aceite mineral estril
Solucin de desoxicolato sdico
Placas Petri
Tubos de 150 x 15 mm

Medios
Agar triple azcar hierro
Agar nutritivo
Agar gelatina

 Caldo de peptona azcar (1% azcar) (Azcares: glucosa, sacarosa,

arabinosa, manosa, manitol e inositol)
Medio para prueba de la descarboxilasa, en tubos con: 1% de L-lisina,
1% L-ornitina.
Medio de Hugh-Leifson
Procedimiento
1. Reaccin en agar triple azcar hierro (TSI)
-

Incubar cada uno de los cultivos sospechosos en un tubo de agar

triple azcar hierro inclinado, sembrando en estra la parte inclinada

y por picadura la columna de medio.

- Incubar los tubos inoculados durante una noche a 35-37C.
Los cultivos de V. cholerae producirn una parte inclinada cida
(amarilla) y una columna de medio tambin cida, sin produccin
de gas ni ennegrecimiento (produccin de H 2S) de la columna de
medio.
El agar hierro de Klieger es tambin utilizado habitualmente para
esta prueba; en este medio, los cultivos de V. cholerae aparecen
con parte inclinada alcalina (roja) y columna de medio cida
(amarilla), sin produccin de gas ni H2S.

2. Fermentacin en el medio de Hugh-Leifson.

-

Inocular por siembra en picadura profunda dos tubos del medio de

Hugh-Leifson con un asa recta.

Cubrir un tubo con una capa de 1 cm de aceite de parafina o de

parafina fundida.
Incubar los tubos durante una noche a 35-37C.
La produccin de cido (amarillo) en ambos tubos es indicativo de
fermentacin.
La produccin de cido en la parte superior del tubo sin parafina
unido a la falta de crecimiento en el otro tubo es indicativo de
oxidacin (Hugh y Leifson, 1 953).

3. Realizar la prueba de la oxidasa.

-

Colocar un trozo de papel filtro (6 cm de lado), dentro de una placa

Petri.

Aadir en el centro 3 gotas de tetrametil-parafeno-ilendiamina.

Extender cuidadosamente un asa de cultivo sobre el papel
impregnado de reactivo.
La prueba de la oxidasa es positiva si el cultivo que se ha
extendido toma un color prpura oscuro en 5-10 segundos.
Es negativa si el cultivo en agar glucosa sal toma un color
amarillo.
Esta prueba

diferencia

los

miembros

de

la

Familia

enterobacteriaceae de V. cholerae.
Los miembros de la familia Enterobacteriaceae son negativos a
esta prueba, en tanto que V. cholerae es positivo, aunque tambin
lo son las Pseudomonas.

4. Fermentacin de carbohidratos.
-

Inocular ligeramente, a partir de un cultivo en agar nutritivo de 24

horas, tubos con caldo de peptona azucarado hechos con glucosa,

sacarosa, arabinosa, manosa, manitol e inositol.

Incubar a 35-37C y examinar diariamente durante 4-5 das. Para las
reacciones que presenta V. cholerae con cada uno de estos
carbohidratos.
La produccin de un color rojo en el medio es indicativo de
produccin de cido.

5. Prueba de la descarboxilasa (Moller, 1 955).

-

Inocular ligeramente los medios con cada uno de los tres

aminocidos, as como el medio control, a partir de un cultivo en

agar nutritivo inclinado de 24 horas.

Despus de inoculados, colocar en cada tubo una capa de 10 mm

de aceite mineral estril, incluido el control.

- Incubar a 35-37C y observar diariamente durante 4 das.
Estos medios, en un principio, se ponen amarillos debido a la
produccin de cido a partir de la glucosa y posteriormente, si se
produce la descarboxilacin, el medio se vuelve prpura (reaccin

alcalina).
Los tubos control y las reacciones negativas deben de
permanecer cidos (amarillos).
6. Prueba de la filamentosidad.
-

Elegir una colonia grande a partir de un cultivo en agar en placa o a

partir del crecimiento en un agar inclinado, y

Emulsificarla sobre un portaobjetos con ayuda de un asa fra en una
gota grande de suspensin acuosa al 0,5% de desoxicolato sdico.
En 60 segundos se forma una masa mucoide, material que forma
hilos al ser elevada el asa del portaobjetos.

Este test descrito por H. L. Smith (1 970) es una prueba

presuntiva muy til para cepas sospechosas de ser V. cholerae.
Todos los biotipos son positivos
7. Test vibriosttico.
-

Extender formando una pelcula sobre la superficie de una placa

seca de agar nutritivo un asa llena de un cultivo de 24 horas de la

cepa en estudio.
Colocar un disco seco de papel de filtro (previamente impregnado
con el agente vibriosttico O/129) sobre el cultivo extendido,
Incubar la placa durante 24 horas a 35-37C
V. cholerae es sensible a este agente y no crecer en el rea que
rodea al disco.

c. Prueba para diferenciar los biotipos El Tor y Cholerae (Clsico)

Materiales

Pipetas de 1 ml
Asa bacteriolgica
Solucin salina
Hemates ovinos lavados
Hemates de pollo lavados
Placas
Tubos de 150 x 15 mm
Discos de polimixina B de 50 mg (50 unidades)

 Reactivos para prueba Voges-Proskauer

Dilucin de fago IV para V. cholerae
Medios

Caldo infusin de corazn

Agar Mueller-Hinton
Agar nutritivo
Caldo glucosa tamponado

Procedimiento
1. Hemlisis de eritrocitos ovinos (prueba en tubo).
-

Inocular un tubo de caldo infusin de corazn con clulas de un

cultivo en agar nutritivo inclinado de 24 horas.

Incubar el tubo durante una noche a 35-37C.
Pasar 0,5 ml de este cultivo a un tubo conteniendo 0,5 ml de una

suspensin al 1% de hemates ovinos lavados en solucin salina.

Mezclar e incubar a 35-37C durante 2 horas, y a continuacin
dejarlo una noche a 3-5C, examinar y comprobar si hay hemlisis
(Feeley y Pittman, 1 963). Son necesarios los correspondientes
controles.
El biotipo El Tor es generalmente hemoltico, en tanto que el
biotipo clsico no lo es.

2. Sensibilidad a los fagos.

-

Sembrar en estra una placa de agar Mueller-Hinton de un cultivo en

caldo infusin de corazn de 4 horas, de tal modo que se obtenga

crecimiento confluente.
Pasar un asa de 3 mm de la dilucin apropiada de prueba del fago
IV a la superficie del agar inoculado.
Incubar 15-24 horas a 35-37C.
El grupo fgico IV de Mukerjee (1 961) es utilizado a la dilucin
para pruebas de rutina segn la tcnica descrita por Mukerjee (1
963).
EL biotipo clsico es sensible al fago IV, en tanto que el biotipo El
Tor es resistente.

3. Sensibilidad a la polimixina B.
-

Inocular en una placa con agar Mueller-Hinton con un cultivo de 4

horas de V. cholerae en caldo infusin de corazn, de tal forma que

se obtenga un crecimiento confluente.

Una vez seca la superficie inoculada, colocar un disco de polimixina
B de 50 mg (50 unidades) sobre el agar de Mueller-Hinton.
El biotipo clsico es sensible a la polimixina y El Tor resistente.

4. Prueba de Voges-Proskauer.
-

Inocular, a partir de un tubo de agar nutritivo inclinado de 24 horas,

un tubo con 1 ml de caldo glucosa tamponado

Incubar a 21-23C durante 48 horas.
Realizar la prueba de Voges-Proskauer.
El biotipo El Tor generalmente da reaccin positiva, en tanto que
el biotipo clsico la da negativa.

5. Aglutinacin de glbulos rojos de pollo.

-

Emulsificar sobre un portaobjetos el crecimiento de agar nutritivo

inclinado de 24 horas en una gota de suspensin de solucin salina

al 2,5% de eritrocitos lavados de pollo.

Balancear el portaobjetos atrs y adelante durante aproximadamente
un minuto.
La aglutinacin de los hemates es indicativa de positividad de la
prueba.
El biotipo El Tor, generalmente, da una reaccin positiva mientras
que el biotipo clsico la da negativa.
El mtodo es el de Finkelstein y Mukerjee (1 963), modificado por
Barua y Mukerjee (1 965). Los hemates de pollo pueden ser
sustituidos por los de ovino, conejo, humanos y caballo, pero no
por los de cobayo.

d. Estudio Serolgico de V. cholerae

Materiales
Portaobjetos
Lpiz de cera

Asa bacteriolgica
Solucin salina formolizada de yoduro mercrico
Antisuero polivalente O
Antisuero Ogawa e Inaba.
Agar nutritivo

Procedimiento
1. Pasar varias colonias tpicas crecidas en placas de agar nutritivo, de
agar gelatina, de agar de Aronson o de agar tiosulfato citrato sales
biliares sacarosa, a tubos inclinados de agar nutritivo, e incubar durante
4-18 horas a 35-37C.
2. Lavar el crecimiento del agar inclinado con solucin salina formolizada
de yoduro mercrico.
3. Marcar dos secciones de aproximadamente 1x2 cm en la cara interna de
una placa Petri o en un portaobjetos, utilizando un lpiz de cera.
4. Colocar una pequea cantidad de la suspensin del apartado 2 anterior
de cada cultivo en la parte superior de cada una de las dos reas
marcadas.
5. Aadir una gota del antisuero O polivalente V. cholerae solamente a una
seccin. Mezclar la gota de antisuero con la suspensin bacteriana,
utilizando una aguja o asa estril. La otra seccin, conteniendo
solamente la suspensin (el antgeno), sirve de control.
6. Mover el portaobjetos atrs y adelante durante un minuto y observarlo
sobre un fondo oscuro. Una aglutinacin rpida y fuerte es indicativa de
reaccin positiva.
7. Investigar los cultivos positivos con los antisueros Ogawa e Inaba. Los
laboratorios estatales o nacionales de referencia hacen normalmente el
serotipado con estos antisueros. La mayora de los serotipos de V.
cholerae reaccionan o con el antisuero Ogawa o con el Inaba, aunque
algunos lo hacen con ambos a la vez.
8. La aglutinacin positiva en porta puede ser confirmada por la
aglutinacin en tubo.

III.
Bibliografa
ICMSF, 2 000. Microorganismo de los alimentos 1. Zaragoza, Espaa.

Prueba de la reduccin de colorantes para la determinacin rpida de la

calidad de la leche: Azul de metileno, rezasurina y TTC
I.

Introduccin

La mayora de los grmenes de la leche elaboran reductasas que modifican el

potencial de xido-reduccin de la misma. Para demostrar ese fenmeno basta
aadir a la leche una sustancia que se decolore al pasar de la forma oxidada a
la forma reducida. La rapidez con que cambia de color est en funcin de la
poblacin bacteriana y, por ello, puede ser un ndice del grado de
contaminacin de la leche. El colorante ms empleado es el azul de metileno,
pero tambin se pueden utilizar la resazurina y el cloruro de 2, 3, 5,
trifeniltetrazolium, ya que son colorantes fcilmente absorbibles por las clulas
vivas.
En general se admite que la decoloracin es ms rpida cuanto mayor es el
nmero de microorganismos en la leche. Sin embargo, las bacterias presentan
distinta habilidad para reducir el azul de metileno, as el Streptococcus
liquefaciens, los grmenes del grupo coliaergenos y los de la putrefaccin
(Bacillus subtilis) se muestran muy activos. Las clulas somticas presentes en
la leche tambin influyen mucho en la velocidad de decoloracin, sobre todo los
leucocitos.
II.

Material
Tubos de ensayo con tapones estriles.
Bao mara estufa a 37C.
Pipetas graduadas

Reactivos

III.

Solucin de azul de metileno. Preparar una solucin madre

diluyendo unos gramos de azul de metileno en alcohol de 96
hasta conseguir la saturacin.
Para preparar la solucin de trabajo tomar 2.5 mL de la
solucin madre y adicionar 97.5 mL de agua destilada estril.

Procedimiento

1. Agitar la leche y agregar 10 mL de leche a un tubo de ensayo.

2. Aadirle 0.5 mL azul de metileno, evitar el contacto con la leche.

3. Tapar los tubos e introducirlos en bao mara a 37C.

4. Realizar dos ensayos simultneos para cada muestra.
5. Leer los resultados al cabo de 10 minutos y a la hora.

IV.

Observaciones e Interpretacin

La presencia de microorganismos en la leche y por su accin reductora, se

produce una modificacin del color del azul de metileno, pasando de color azul
intenso a azul claro, pudiendo desaparece totalmente de acurdo a la carga
microbiana presente. Una leche con un contenido bajo en microorganismos, no
modifica el tinte azul del colorante o tarda mucho tiempo en modificarlo. Ser
considera que en la leche natural fresca el tiempo de decoloracin del colorante
en la prueba de la reductasimetra debe ser superior a las dos horas, mientras
que en la certificada debe ser superior a las cinco horas, dada la mayor calidad
higinica de los productos obtenidos en las granjas diplomadas.

V.

Bibliografa
Periago, 2014. Higiene Inspeccin y Control Alimentario. Universidad de
Murcia.Espaa.