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DEPARTAMENTO ACADMICO
DE CIENCIAS BSICAS
GUA DE PRCTICAS
DE
MICROBIOLOGA
SEGUNDO AO
SEGUNDO SEMESTRE ACADMICO
2016 - II
CHICLAYO - PER
Introduccin
El Manual de Prcticas de Microbiologa tiene como objetivo orientar a los alumnos a un
mejor conocimiento y aplicacin de los procedimientos de identificacin y aislamiento de la
variada flora microbiana de importancia en medicina humana. La microbiologa es una
disciplina que estudia la biologa de los microorganismos capaces de producir enfermedad.
Desde que se describiera por primera vez la morfologa de las bacterias (Leeuwenhoek
.Siglo XVII), luego el aislamiento y diagnstico de distintos microorganismos sobre todo en las
dos ltimas dcadas del Siglo pasado en la que se inicia la denominada poca dorada de la
bacteriologa , sta ha evolucionado tremendamente. Continuamente se describen procesos
infecciosos as como situaciones nuevas en los pacientes motivando ello la disponibilidad de
informacin cientfica relacionada con la microbiologa clnica y la infectologa.
Los avances tecnolgicos con aumento de la automatizacin, el desarrollo de la biologa
molecular, la qumica de los cidos nucleicos, los avances en inmunologa clnica y los
conocimientos de la patogenicidad microbiana hacen necesario la revisin continua de los
textos de microbiologa.
Tenemos el convencimiento que sta orientacin acadmica proporcionar a los alumnos
de la Asignatura de Microbiologa los recursos para preveer el inicio del padecimiento , as
como la base para la orientacin teraputica y la prevencin de las enfermedades infecciosas.
Se da una relacin concisa de los mtodos de laboratorio empleados en el estudio de las
bacterias, hongos, rickettsias y virus. Con tal motivo sern expuestos conceptos y ejercicios
fundamentales, con lo que esperamos uniformar criterios acorde con la actualizada tecnologa.
Los trabajos de laboratorio se han ordenado metodolgicamente a fin de facilitar la
aplicacin de los conceptos bsicos y as llegar al diagnstico de los diferentes procesos
infecciosos en humanos.
El objetivo de estas prcticas consiste en familiarizar al alumno con algunas de las tcnicas
ms comnmente utilizadas en los laboratorios de Microbiologa y permitir la observacin
experimental de los conceptos aprendidos durante las clases tericas.
Debemos dejar establecido que el presente Manual de Prcticas , no es una compilacin
amplia del tema, sino un Manual que contiene los requerimientos bsicos y orientacin,
adecuando los recursos y procedimientos que contribuirn a cimentar la formacin integral del
mdico humano.
Como docentes, nos sentiremos satisfechos si al final del curso se han cumplido los
objetivos, utilizando los elementos y procedimientos de diagnstico en el proceso enseanza
aprendizaje.
Generalidades
El estudio de las bacterias y de su estructura es particularmente difcil, debido al tamao
que presentan, siendo ste entre 1 y 6 micras. Para su observacin se requiere el empleo del
microscopio de luz , el cual , no proporciona el suficiente poder de resolucin que permite
observar las diferentes estructuras de las bacterias lo que hace necesario el uso del
microscopio electrnico.
Para la observacin y estudio de las bacterias se utilizan diversos mtodos. El ms simple
de ellos consiste en la observacin en fresco, de esta manera se visualizan caractersticas
someras que proporcionan una idea del tamao, forma y en ciertas especies la movilidad;
estos aspectos pueden mejorarse con el empleo del microscopio de contraste de fase.
Otra tecnologa que permite observar con mayor claridad a las bacterias, lo constituyen los
mtodos tintoriales , que facilitan el estudio de la forma , agrupamiento, y afinidad a diversos
colorantes. Entre las tcnicas de mayor utilidad destaca la tincin de Gram, la cual permite
clasificar a las bacterias segn su afinidad tintorial en Gram positivas y Gram negativas.
Existen grupos bacterianos que para su observacin requieren otras tcnicas como la de
Ziehl-Neelsen, la cual identifica a las bacterias cido-alcohol resistente. Algunas bacterias
poseen ciertas estructuras importantes que pueden ser evidenciadas mediante tcnicas de
coloracin especial como por ejemplo, para observar cpsula, esporas, flagelos .
Para realizar el diagnstico de hongos y virus existen tcnicas particulares, las mismas
que sern descritas en los captulos correspondientes.
CRONOGRAMA DE PRCTICAS
SEMANA
FECHA
TEMA
1ra
4 agosto
2da
11 agosto
3ra
18 agosto
4ta
25 agosto
5ta
1 septiembre
6ta
8 septiembre
7ma
15 septiembre
8va
22 septiembre
9na
29 septiembre
10ma
6 octubre
11va
13 octubre
Prctica de Laboratorio N 8:
Cultivo de muestras clnicas: Urocultivo, Coprocultivo
Prctica de Laboratorio N 9: Identificacin y aislamiento de
Mycobaterium.
Coloracin de Ziehl- Neelsen y Aislamiento de Bacterias Anaerobias
Prctica de Laboratorio N 1:
Bioseguridad Practica
Prctica de Laboratorio N 2:
Obtencin y manejo de muestras clnicas
Prctica de Laboratorio N 3:
Preparacin, fijacin y coloraciones bacterianas (coloracin simple y
coloracin diferencial: Gram y Ziehl Neelsen )
Prctica de Laboratorio N 4:
Medios de Cultivo, Mtodos de siembra y aislamiento bacteriano
Prctica de Laboratorio N 5:
Pruebas bioqumicas para bacterias grampositivas
Prctica de Laboratorio N 6:
Actividad antimicrobiana in vitro: Antibiograma
Prctica de Laboratorio N 7:
Pruebas bioqumicas para bacterias gramnegativas (enterobacterias)
12va
20 octubre
13va
27 octubre
14va
3 noviembre
15 va
10 noviembre
16 va
17 noviembre
17va
24 noviembre
PRCTICA N 1
Normas de Bioseguridad
Disposiciones Generales
En general en todo laboratorio deben seguirse normas que garanticen la calidad de las
tcnicas y asimismo, la seguridad en el trabajo. En el caso particular del Laboratorio de
Microbiologa donde se trabaja con materiales susceptibles de contaminacin accidental, se
recomienda la adopcin rigurosa de normas de seguridad e higiene a fin de evitar el riesgo de
infeccin de las personas que en l laboran.
Con tal motivo, en el Laboratorio de Microbiologa se consideran cuatro niveles de seguridad
biolgica, segn los microorganismos con los que se trabaja :
Nivel 1 : Microorganismos no patgenos y patgenos oportunistas
Nivel 2 : Microorganismos o muestras con un potencial de riesgo moderado
Nivel 3 : Microorganismos y muestras de alto riesgo; los trabajos se realizan en cabinas de
seguridad , nunca en las mesas.
Nivel 4 : Microorganismos de altsimo riesgo , solo se hacen en laboratorios de
experimentacin y no en laboratorios de microbiologa clnica . Se requiere este nivel cuando
se maneja microorganismos de riesgo, especialmente virus, tambin con algunas bacterias y
hongos.
De toda forma durante las prcticas se deben cumplir las siguientes recomendaciones :
1. Los alumnos ingresarn a la Sala de Prcticas solamente con el uniforme obligatorio y el
mandil . No est permitido el ingreso con otras prendas de vestir o cualquier otro objeto
diferente al material asignado para el ejercicio.
2. Observar en todo momento las medidas de asepsia con el material de trabajo . Los
profesores de cada grupo les indicarn la metodologa a seguir.
3. Est prohibido comer, beber y/o fumar durante las clases prcticas, as como llevarse los
dedos , el lpiz o cualquier otro objeto a las proximidades de la boca y ojos.
4.La evaluacin de los alumnos de las asignaturas correspondientes al Departamento de
Ciencias Bsicas se regir segn el Reglamento de Evaluacin de Estudiantes de Pregrado ,
Perodo Lectivo 2013.
5. Por razones de seguridad, ningn material de prcticas saldr de la sala de trabajo. En
caso que se rompa algn material de vidrio con cultivo microbiano , avisar de inmediato al
profesor para que disponga la inmediata desinfeccin y limpieza.
6. Uno de los instrumentos de trabajo , el asa o mango de Kolle , terminado el ejercicio
programado deber ser esterilizado mediante flameado , de acuerdo con las instrucciones
dadas por el profesor.
7. Todo material de trabajo como son: lminas portaobjetos, laminillas o pipetas, debern ser
depositadas en los bocales de vidrio con solucin desinfectante, los que estarn a la vista en
cada mesa. Si fuera material de desecho , como restos de algodn , papel, etc. , depositarlos
en los recipientes para la basura, nunca en la mesa de trabajo o en el suelo . Los tubos,
placas de Petri o frascos de cultivo se dejarn en canastillas o depsitos destinados para ser
esterilizados.
8. Los profesores estarn en todo momento atentos para orientar y/o resolver cualquier duda
que se presente en el desarrollo de las prcticas.
9. Cada alumno debe disponer obligatoriamente del Manual de Prcticas, el que deber ser
estudiado con anterioridad a cada ejercicio, de forma tal que tenga conocimiento previo de los
ejercicios que se van a presentar.
Autoclave
PRCTICA N 2
OBTENCIN Y MANEJO DE MUESTRAS CLNICAS
OBJETIVOS
Realizar los procedimientos adecuados para asegurar las medidas de bioseguridad
apropiadas.
Conocer las tcnicas de toma de muestra y manejo de las diferentes muestras clnicas para
su ptimo procesamiento.
Conocer las precauciones para el manejo y transporte de muestras clnicas.
INTRODUCCIN
En trminos de la efectividad del Laboratorio de Microbiologa , nada es ms importante que la
apropiada seleccin , coleccin y transporte de las muestras clnicas. Estos procedimientos
quedan inutilizados muchas veces por falta de cuidado y mtodos defectuosos usados en la
recoleccin y manejo de las muestras.
Independientemente del hecho que algunos tipos de muestras requieren metodologa de
recoleccin muy especiales, podemos enumerar algunos aspectos generales que deben ser
tenidos en cuenta al coleccionar las muestras clnicas :
La muestra debe ser representativa del proceso infeccioso.
Cuando se va a proceder a tomar un espcimen clnico, es importante evitar la
contaminacin con microorganismos saprofitos del rea. Esta flora normal puede interferir con
la interpretacin del cultivo y enmascarar la presencia del verdadero agente etiolgico de la
enfermedad.
Seleccionar el lugar anatmico correcto de donde se obtendr el espcimen y utilizar la
tcnica apropiada y los instrumentos o elementos adecuados para su obtencin .
Especialmente en el caso de investigar microorganismos anaerobios.
Nunca refrigerar una muestra por anaerobios.
Coleccionar un apropiado volumen de la muestra.
Insuficiente material puede ser causa de resultados falsos negativos.
Junto con la muestra se debe enviar una solicitud de anlisis en la que debe figurar el
nombre del paciente, nmero de identificacin personal, procedencia, tipo de muestra, fecha y
hora de coleccin, especificar regin anatmica, diagnstico clnico, duracin de la
enfermedad, terapia antibitica , prueba requerida e iniciales del funcionario que tom la
muestra.
El paciente debe ser informado en forma clara y sencilla de acuerdo a su grado de
instruccin sobre los procedimientos a realizar.
Obtener en lo posible muestras antes de administrar antibiticos o agentes antimicrobianos.
Si se han administrado, informar de ello al laboratorio. A menudo un lquido cefalorraqudeo no
revela patgenos bacterianos en frotis ni cultivo, cuando se ha tomado un antibitico en las 24
horas anteriores.
Colocar la muestra en un recipiente estril y adecuado para su transporte como cajas,
gradillas, bandejas, llevando en la base papel absorbente embebido en desinfectante , con el
fin de asegurar la sobrevivencia del posible agente infeccioso, evitar derrame del espcimen y
mantener medidas de bioseguridad apropiadas.
Ordenar siempre un frotis para tincin o coloracin de Gram, para los especmenes que
procedan de cavidades aspticas y anotar su inters en determinado microorganismo.
CRITERIOS DE RECHAZO DE UNA MUESTRA
Hoja de solicitud de anlisis no llenada correctamente
Muestras sin rotular o inadecuadamente rotuladas
Muestras sin medios de transporte adecuado, en contenedores quebrados, rotos o
con derrames
Muestras secas o con contaminacin obvia
Muestras sin preservacin adecuada
Las muestras ms frecuentes en los estudios microbiolgicos son :
ORINA :
En las muestras de orina se pueden realizar diferentes anlisis como : examen microscpico
de orina, urocultivo, determinacin de algunos residuos de medicamento (doping) e
investigacin de microorganismos especiales como Leptospira. El xito de estos exmenes
depender de la tcnica con que se tome la muestra y sobre todo del tiempo transcurrido entre
la toma de la muestra y el anlisis, ya que el proceso de descomposicin que se sucede en la
orina por accin de las bacterias all presentes , modifica el parmetro de los componentes y
muy especialmente altera la carga microbiana.
Procedimiento
Lavarse las manos
Las pacientes mujeres deben realizar previamente el lavado de los genitales externos con
agua y jabn y de adelante hacia atrs, mientras que los hombres solo lo realizarn en el caso
de solicitarse cultivos.
Secarse con un apsito estril
Las muestras deben colocarse en un frasco de boca ancha y tapa de rosca estriles,
depositar aproximadamente entre 30 y 40 ml de preferencia la primera muestra de la maana
a travs del chorro medio (miccionar una buena cantidad en el inodoro y luego en el envase).
En mujeres la miccin debe ser separando los labios mayores de la vulva.
En hombres se hace la retraccin del prepucio de manera que el chorro de orina salga
directamente .
Tapar el frasco con precaucin , evitando contaminar la muestra y/o derramarla.
En casos de nios pequeos utilizar bolsas colectoras adheridas a los genitales.
La muestra debe ser enviada inmediatamente al laboratorio. En caso de no ser posible
refrigerarla no ms de 4 horas.
HECES :
Las muestras de heces se solicitan para examen bacteriolgico, virolgico, bioqumico y para
la bsqueda de parsitos.
Las muestras de heces de un paciente sospechoso de enfermedades diarreicas deben
colectarse antes de la administracin de cualquier antibitico.
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Procedimiento
Muestra evacuada : La persona debe defecar en un recipiente limpio y seco, teniendo
cuidado de no miccionar para que sta no se mezcle con orina.
Hisopado rectal : La muestra se obtiene con un hisopo de algodn estril , el cual se
desenvuelve y se lubrica antes de su uso, introducindolo en el medio de transporte , de
preferencia Cary Blair, y luego se introduce en el recto , unos 3 cm, mediante movimientos de
rotacin.
El hisopo con la muestra se introduce hasta el fondo del tubo que contiene el medio de
transporte (Cary Blair o Amies).
El frasco con la muestra o tubo con el medio de transporte se pueden conservar a temperatura
ambiente hasta su procesamiento o envo al laboratorio, no ms de 12 horas.
No se debe refrigerar la muestra.
HEMOCULTIVO:
La sangre de los individuos sanos es estril. Una presencia repentina de bacterias
habitualmente es eliminada del torrente circulatorio en un perodo de tiempo corto de minutos
a horas, excepto cuando existe una infeccin masiva o est presente un foco intravascular
infectado. Bsicamente cuando las bacterias se multiplican a tasas que exceden el sistema
retculoendotelial para eliminarlas , se habla de BACTERIEMIA. El trmino FUNGEMIA se
utiliza para designar la presencia de hogos en sangre.
Siempre que exista una razn para sospechar de una bacteriemia se debe practicar el cultivo
de la sangre o hemocultivo.
Procedimiento
Los hemocultivos se obtendrn antes de iniciar la terapia antibitica, el incumplimiento de
este punto puede dar lugar a resultados falsamente negativos, pudiendo comprometer la vida
del paciente.
Los microorganismos de la piel pueden contaminar la sangre durante la extraccin,
dificultando la interpretacin de los resultados. Adems algunos contaminantes actan como
patgenos oportunistas , por lo que se debe ser muy cuidadoso durante la extraccin.
La toma debe realizarse por venopuncin y para ello debe hacerse :
Lavado de manos y utilizacin de guantes estriles
Limpiar con jabn lquido o alcohol el lugar de la puncin
Aplicar durante un minuto povidona yodada, dejar secar
Desinfectar los tapones de los frascos
Efectuar la extraccin
No airear los frascos
Nunca debe hacerse la extraccin a travs de catteres , salvo en aquellas
circunstancias en que se indica especficamente.
Cuando la extraccin se realice con adaptador , se debe esterilizar o ser de un slo
uso.
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Muestras
Lquido asctico o peritoneal
Lquido articular o sinovial
Lquido pericrdico
Lquido pleural
Procedimiento
La obtencin de estos lquidos es un procedimiento mdico
La toma se realiza por puncin percutnea (toracocentesis, paracentesis, puncin
pericrdica o puncin articular)
Para el estudio bacteriano se requerir de 1 a 10 ml; para lquido de dilisis
peritoneal se requerir de un volumen superior a 100 ml.
Para evitar la coagulacin de algunos lquidos se utilizar heparina sin
conservantes, ya que otros anticoagulantes podran tener accin antibacteriana.
Los recipientes idneos son los viales de transporte para anaerobios
Los frascos de hemocultivo tambin son tiles para cultivar lquidos biolgicos
estriles. Si se sospecha de anaerobios colocar la muestra luego de ser extrada en
un frasco para anaerobios.
LQUIDO CFALORRAQUIDEO (LCR)
La meningitis es un proceso inflamatorio del Sistema Nervioso Central, que afecta a las
leptomeninges y al lquido cefalorraqudeo . Se trata de una urgencia mdica y requiere un
diagnstico y tratamiento precoz . Su morbimortalidad , en meningitis agudas bacterianas , se
relaciona directamente con el retraso en el inicio de la teraputica.
Los casos espordicos de meningitis agudas bacterianas , se relacionan directamente con el
retraso en el inicio de la teraputica, aparecen en edades extremas de la vida, ocurriendo el 75
% de los casos en menores de 1 ao.
Muestra
La toma de la muestra la realiza el mdico tratante o el patlogo clnico del
laboratorio.
Se obtendr antes de instaurar cualquier terapia antimicrobiana , siempre que las
condiciones lo permitan.
LCR se obtiene por puncin lumbar
Generalmente se obtendrn dos tubos, el primero se enviar para el estudio
bioqumico, el segundo para el estudio microbiolgico con el mayor volumen
posible.
El tubo ms turbio se enviar a Microbiologa.
Se debe solicitar simultneamente hemocultivos, porque las meninges suelen ir
acompaadas de un proceso bacterimico
El volumen mnimo para el estudio bacteriolgico rutinario es 1 ml, aunque es
preferible disponer de volmenes superiores. Para hongos o micobacterias se
necesitarn al menos 2 ml adicionales por cada uno de los estudios, siendo deseable
llegar a los 10 ml.
La muestra debe enviarse inmediatamente al laboratorio, pues algunos agentes
etiolgicos como Streptococcuspneumoniae pueden lisarse rpidamente a partir de
la primera hora de su recogida
Si no fuera posible se mantendr en estufa entre 35 a37C y una parte se incubar
en frasco de hemocultivo, que se mantendr en idnticas condiciones.
Si no se dispone de estufa se mantendr a temperatura ambiente. Nunca se
refrigerar pues se afectar la viabilidad de Neisseriameningitidis y H. influenzae.
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EVALUACIN
1. Por qu una muestra de lquido cefalorraqudeo no debe ser refrigerada , si no se enva de
inmediato al laboratorio?
2. Cules son los agentes etiolgicos de la meningitis aguda en neonatos, nios y adultos?
REFERENCIAS BIBLIOGRFICAS
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PRCTICA N 3
COLORACIONES BACTERIANAS SIMPLES
OBJETIVOS
Explicar la coloracin Azul de metileno.
Identificar la diferencia entre coloracin simple y coloracin diferencial
INTRODUCCIN
Debido al pequeo tamao de los microorganismos , se requiere de un microscopio ptico, ya
sea de campo claro (lo ms usado) o de campo oscuro, para hacer la descripcin morfolgica
de estos. La observacin de los frotis teidos es lo ms recomendable. El frotis se prepara
haciendo una extensin de los microorganismos sobre una superficie transparente, en la cual
se fijan y se tien los microorganismos.
Las coloraciones son tcnicas que permiten observar microorganismos en funcin de la
capacidad de los mismos para retener (o no), determinadas sustancias colorantes, lo que
depende de la carga de la clula y del colorante. Estos colorantes pueden ser de distintos
tipos:
Catinicos : sustancias que tienen carga positiva. Penetran en el interior de las
clulas y las tien. Ejemplos: Azul de metileno, Cristal violeta, Safranina.
Aninicos : Con carga negativa, no penetran en el interior de la clula, de modo que
no tien las clulas sino el entorno. En este caso se habla de tincin negativa.
Ejemplos: Eosina, Nigrosina.
Liposolubles: se mezclan con los lpidos celulares y los tien. Ejemplo: Negro sudn.
Los colorantes aumentan el contraste combinndose qumicamente con el protoplasma
microbiano y permiten localizar estructuras especficas del microorganismo y diferenciarlos en
su forma, tamao, agrupacin y afinidad a ciertos colorantes . Las bacterias pueden presentar
las siguientes formas esfricas (cocos), estos a su vez disponerse en cadenas (estreptococos)
, en pares (diplococos), o en racimos (estafilococos), sarcinas, en forma alargadas cilndricas
(bacilos) y espirales (espiroquetas y espirilos).
De acuerdo al nmero de soluciones colorantes y a los objetivos de estudio se pueden realizar
diferentes tipos de tinciones como son :
Simples : Utiliza un slo colorante. Las clulas presentan una composicin qumica
diferente a la de su entorno, de modo que ambos se comportan de forma distinta
frente a un colorante . El colorante tie las clulas como en el caso de : Azul de
metileno, Safranina o no la tie : Nigrosina.
Diferenciales : Los diferentes tipos de clulas presentan distinta composicin
qumica y por lo tanto reaccionan de forma diferente frente a una tincin, lo que
permite clasificar a los microorganismos en diferentes grupos, segn su capacidad de
tincin. Ejemplos: tincin de Gram y Ziehl-Neelsen, ambas utilizan ms de un
colorante.
Selectivas: Distintas estructuras celulares tienen diferente composicin qumica de
modo que se tien selectivamente con ciertos colorantes. Ejemplos: tincin de
esporas, de flagelos, de paredes celulares, de corpsculos metacromticos. Pueden
utilizar uno o ms colorantes.
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METODOLOGA
HISOPADO FARNGEO
1. El profesor, con la colaboracin de un alumno, ensear a tomar una muestra de
exudado farngeo. El paciente ( en este caso el alumno), se sentar cmodamente
de frente al profesor , el rea debe tener buena iluminacin para que permita
visualizar adecuadamente el sitio anatmico a examinar.
2. Indicar abrir la boca y con ayuda del bajalengua deprimir la lengua para favorecer
que la faringe quede expuesta, con un hisopo estril frotar firmemente la pared
posterior de la faringe y las amgdalas, particularmente en donde existan puntos
blancos o reas que presenten signos de inflamacin o sangrado.
3. Cuando el paciente no tenga amgdalas, la muestra se obtendr del fondo de las
fosas amigdalinas. Al retirar el hisopo tener la precaucin de no hacer contacto con
ninguna otra rea de la boca.
4. A partir de la muestra tomada, se realizar la siembra por el mtodo de
aislamiento en estra en placa, se utilizarn placas de agar sangre , agar chocolate
y agar manitol salado.
5. Antes de eliminar el hisopo , realizar una extensin para preparar un frotis, fijar la
muestra y teir con una tincin simple (Azul de metileno) para observar :
Morfologa de la bacteria
Agregacin o tipo de distribucin bacteriana.
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RESULTADOS
Frotis de hisopado farngeo :
Hisopo
Lmina
portaobjetos
Aislamiento en estra
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EVALUACIN
1. Cules son las estructuras celulares o molculas que pueden ser observadas cuando se
emplea la tincin simple?. Ejemplos de dos (2) colorantes que podran utilizarse para realizar
una tincin simple.
2. Grafique cada una de las formas bacterianas que se pueden observar al emplear la tincin
simple.
3. Ejemplos de dos (2) colorantes que se podran utilizar en la realizacin de una tincin
simple.
REFERENCIAS BIBLIOGRFICAS
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1. Cubrir con
cristal violeta
(1 minuto)
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5. Decolorar con
alcohol acetona
(5 a 6 gotas)
7. Cubrir con
safranina
(30 segundos)
Bacteria Gram
positiva
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Bacteria Gram
negativa
RESULTADOS
Graficar lo observado al microscopio
EVALUACIN
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REFERENCIAS BIBLIOGRFICAS
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PRCTICA N 4
MEDIOS DE CULTIVO
MTODOS DE SIEMBRA Y AISLAMIENTO BACTERIANO
OBJETIVOS
Comprender la utilidad de los medios de cultivo en el trabajo microbiolgico.
Diferenciar los distintos medios de cultivo de acuerdo a su consistencia y funcin.
INTRODUCCIN
Un medio de cultivo es un conjunto de nutrientes, factores de crecimiento y otros
componentes, que crean las condiciones necesarias para el desarrollo de los
microorganismos. Debido a que la diversidad metablica de los microorganismos es muy
amplia, la variedad de los medios de cultivo tambin lo es. La mayora de los medios de cultivo
se comercializan en forma de liofilizados , que es preciso rehidratar . La preparacin de un
medio de cultivo se reduce a pesar la cantidad del medio y disolverlo en agua destilada ( libre
de inhibidores de crecimiento), siguiendo las instrucciones del fabricante. Las sustancias
termolbiles se esterilizan por filtracin y se aaden al resto de los componentes previamente
esterilizados en la autoclave.
CONDICIONES GENERALES
Presentar todos los elementos necesarios, en sus proporciones y/o cantidades
necesarias.
pH adecuado
Condiciones osmticas adecuadas
Estril y preservado de cualquier contaminacin.
Medio fresco ya que se desecan y pierden humedad, concentrndose el resto de los
componentes.
COMPONENTES DE LOS MEDIOS DE CUTIVO
Agua : destilada o desionizada
Agar : se utiliza como agente solidificante. Es un polisacrido que se obtiene de
ciertas algas marinas. Las bacterias no son capaces de degradarlo.
Azcares : son una fuente de carbono para los microorganismos. Los ms
empleados son : glucosa, lactosa y sacarosa.
Extractos : son preparados de ciertos rganos o tejidos animales o vegetales,
obtenidos con agua y calor. Ejemplo : extracto de carne , de levadura, de
malta.
Peptonas : son protenas hidrolizadas , se obtienen por digestin qumica o
enzimtica de protenas animales o vegetales.
Fluidos corporales : sangre completa, sangre desfibrinada, plasma o suero
sanguneo, son aadidos a los medios empleados para el cultivo de algunos
microorganismos patgenos.
Sistemas amortiguadores : son sales que se aaden al medio para mantener el pH
dentro del rango ptimo del crecimiento bacteriano. Ejemplo : fosfatos bisdicos o
bipotsicos.
Indicadores de pH : son indicadores cido-base que se aaden para detectar
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cambios de pH en el medio.
Agentes reductores : sustancias que se aaden al medio para crear condiciones que
permitan el desarrollo de los grmenes microaerfilos o anaerobios. Ejemplo :
cistena, tioglicolato.
CLASIFICACIN
Por su consistencia
Medio de cultivo lquido: caldo Nutritivo, caldo Selenito, caldo Peptonado
Medio de cultivo semislido: agar Sulfuro, Indol y Movilidad (SIM), agar Movilidad,
Indol y Ornitina (MIO)
Medio de cultivo slido: agar Sangre, agar Mac Conkey, agar Manitol salado.
Por su funcin o fines especiales
Medios nutritivos (simples): con nutrientes mnimos para que las bacterias poco
exigentes desarrollen . Ejemplo: caldo y agar Nutritivo.
Medios nutritivos enriquecidos: son medios simples a los que se aaden ciertos
productos a manera de suplemento nutritivo que permiten el aporte de factores de
crecimiento. Ejemplo: agar Sangre, agar Chocolate.
Medios de enriquecimiento: son medios lquidos que por su composicin qumica
favorecen o permiten la multiplicacin de unos microorganismos, inhibiendo
parcialmente la de otros. Ejemplo: caldo Selenito, caldo Peptonado alcalino.
Medios selectivos: permiten el crecimiento slo de la especie que se desea aislar,
para lo cual se les agrega colorantes bacteriostticos: Azul de metileno, Verde
malaquita, Verde brillante. Ejemplos: agar Mac Conkey, agar Salmonella-Shigella
(SS), agar Manitol salado.
Medios diferenciales: contienen sustancias nutritivas y un indicador de pH que
permite detectar las reacciones bioqumicas especficas de los microorganismos.
Ejemplo: agar Triple azcar (TSI),agarrea, agar Citrato de Simmons.
Medios de transporte: permite mantener viables a los microorganismos durante el
traslado al laboratorio. Ejemplo: caldo Hafna, Cary Blair, Stuard.
MATERIALES
Caldo nutritivo : en matraz y tubos
Agar nutritivo en matraz ,placas y tubos
Agar Mac Conkey, agar Salmonella-Shigella, agar Manitol salado, agar Chocolate,
agar Triple Azcar (TSI), agar rea, agar Citrato de Simmons, agar SIM.
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METODOLOGA
Observar y diferenciar los medios de cultivo proporcionados en la prctica.
Medios Simples:
Medios Enriquecidos:
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Medios Selectivos:
Medios Diferenciales:
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EVALUACIN
1. Qu precauciones se deben tener antes de sembrar en medios para anaerobios?
REFERENCIAS BIBLIOGRFICAS
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OBJETIVOS
Conocer y realizar las diferentes tcnicas de siembra y aislamiento bacteriano.
Observar el desarrollo de bacterias aisladas a partir de un cultivo puro.
INTRODUCCIN
En Microbiologa se entiende como siembra al proceso mediante el cual se lleva una porcin
de una poblacin de microorganismos (inculo), de un cultivo crecido a un medio nutritivo para
su crecimiento. Todo este proceso hay que llevarlo a cabo con instrumentos y medios
previamente esterilizados y siguiendo las instrucciones de los profesores de prctica. La
principal advertencia consiste en trabajar siempre prximos a la llama del mechero que ,
debido a las corrientes de conveccin verticales que genera es capaz de crear un ambiente
estril en la zona inmediatamente alrededor y debajo de la llama.
Para realizar un cultivo de microorganismos es necesario que el nmero de clulas
bacterianas (inculo) sea transferido (inoculado) a un medio de cultivo estril. Al querer aislar
una especie en particular a partir de una mezcla de microorganismos deben emplearse
tcnicas de aislamiento lo que permite, obtenerlas en forma pura. Esto implica la utilizacin de
medios tanto simples como especiales , mayormente slidos de acuerdo a la naturaleza del
microorganismo.
Las tcnicas de cultivo se realizan por siembra o diluciones sucesivas :
Por siembra : es el procedimiento por el cual se pone en contacto al microorganismo
con un medio de cultivo, para que en condiciones ptimas de temperatura y tiempo
de incubacin , pueda desarrollar y multiplicarse in vitro. La finalidad es el
aislamiento para tener un cultivo puro de bacterias a partir de una muestra
problema (orina, heces, secreciones, agua servida).
La siembra puede ser :
Por inoculacin
Por estras simples
Por dispersin o agotamiento
Por puntura
Por diluciones sucesivas : consiste en hacer diluciones seriadas de la muestra o del
inculo, sta se utiliza cuando se tienen muestras lquidas ( orina, agua ) , se realiza
haciendo diluciones a las muestras : 1 :100, 1:1 000, 1:10 000 etc. Luego se
siembra cada dilucin en placas de Petri con medios de cultivo.
Una vez obtenidos los cultivos, se puede proceder al examen macroscpico :
morfologa de las colonias, actividades bioqumicas o caractersticas inmunolgicas
de los microorganismos aislados.
30
MATERIALES
Asa de siembra en aro y en punta
Tubos de vidrio de 16 x150mm
Tubos de caldo Nutritivo con cultivo mixto bacteriano :Staphylococcusaureus y
Escherichiacoli
Placas con agar Nutritivo, agar Sangre y agar Manitol salado
Tubos con caldo y agar Nutritivo
Suero fisiolgico estril
Mechero de Bunsen
METODOLOGA
Manejo del asa bacteriolgica o de siembra :
El profesor demostrar el manejo adecuado del asa y explicar las precauciones que se deben
tener en la toma de la muestra :
Esterilizar el asa y dejarla enfriar para evitar quemar a las bacterias
Sumergir el asa hasta el fondo del cultivo lquido, ya que en este lugar se encuentra
una mayor concentracin de microorganismos.
Observar que al retirar el asa del tubo est cubierta por una pelcula lquida.
31
El asa de siembra se
toma del
mango como si fuera un
lpiz
32
Figura N 1
Figura N 2
Figura N1
Figura N2
33
RESULTADOS
Realizar la lectura, observar y graficar los resultados.
Staphylococcusaureus
Agar Nutritivo
Agar Sangre
Agar Manitol
Salado
Escherichiacoli
Agar Nutritivo
Agar Sangre
Agar Mac
Conkey
34
EVALUACIN
1. Por qu el agar Nutritivo es un medio de uso general para el cultivo bacteriano? Qu
sustancia se le puede agregar para hacerlo enriquecido para bacterias Gram positivas?
REFERENCIAS BIBLIOGRFICAS
35
PRCTICA N5
DIFERENCIACIN BIOQUMICA DE BACTERIAS GRAM POSITIVAS
OBJETIVOS
Reconocer las caractersticas morfolgicas y en los cultivos de las bacterias Gram
positivas
Identificar bioqumicamente las diferentes bacterias Gram positivas de importancia
clnica.
INTRODUCCIN
Existen una gran variedad de bacterias Gram positivas de importancia clnica con forma de
cocos como Staphylococcusaureus, especies de Streptococcus , principalmente S.
pneumoniae y cocos anaerobios : Peptostreptococcus.
Entre los bacilos Gram positivos patgenos ms comunes tenemos Bacillusanthracis,
Clostridium, Gardnerella, Listeria ,Corynebacterium.
Todas esta bacterias se encuentran causando procesos infecciosos en los seres humanos y
en algunos casos estas se encuentran colonizando alguna parte del cuerpo junto con bacterias
de la flora normal. Por eso se hace necesario para su aislamiento e identificacin realizar toma
de muestras y procesamiento bacteriolgicos correctos.
Dentro de los Gram positivos, los cocos y en especial las especies de Streptococcus y los
Staphylococcusson los ms fciles de aislar e identificar mediante observacin de hemlisis,
pruebas bioqumicas o diferenciales especficas como la prueba de catalasa para diferenciar
Staphylococcusde Streptococcus , la prueba de coagulasa para diferenciar Staphylococcus
patgenos de los no patgenos, la reaccin de Quellung para distinguir neumococos etc.
MATERIALES
Cultivos de Streptococcuspneumoniae en agar Sangre
Cultivo de Staphylococcusaureus en agar Manitol salado y agar Sangre
Tubos con plasma (1ml ) y pipetas graduadas de 1 ml estriles
Reactivo de perxido de hidrgeno
Equipo para la coloracin de Gram
Lminas portaobjetos
Asas bacteriolgicas
Mecheros
Microscopios
METODOLOGA
Pruebas bioqumicas para Staphylococcusy Streptococcus
Observar el tipo de hemlisis que presentan las placas de agar Sangre
Realizar la prueba de catalasa con una colonia de la placa de agar Sangre y con una
de Manitol salado.
Para la prueba de coagulasa , en dos tubos con un ml de plasma cada uno,
depositar en uno 0,5 ml del cultivo de Staphylococcusaureus y en otro un ml de
Streptococcusepidermidis . Incubar 30 minutos a 37 C.
Preparar un frotis con las colonias que han desarrollado en el agar Sangre y en agar Manitol
salado.
36
Preparacin de Frotis :
METODOLOGA
La identificacin de Staphylococcus y Streptococcus, se basa en la morfologa de las colonias
que se observan en los cultivos primarios y en el tipo de hemlisis en agar Sangre. Sin
embargo para evitar errores de interpretacin , se emplean pruebas bioqumicas como :
Prueba de Catalasa
La catalasa es una enzima que cataliza la descomposicin de perxido de hidrgeno en agua
y oxgeno. Se encuentra presente en la mayora de los microorganismos aerobios y
anaerobios facultativos excluyendo los estreptococos.
La prueba se considera positiva cuando se produce una efervescencia rpida con
desprendimiento de burbujas : la enzima catalasa convierte el perxido de hidrgeno , en agua
y oxgeno molecular. Esta prueba se emplea para diferenciar los gneros Micrococcus y
Staphylococcus : catalasa positivo del gnero Streptococcus : catalasa negativo.
37
negativo.
Perxido de
hidrgeno
Figura N 1
Figura N 2
(+)BURBUJEO :Staphylococcus
POSITIVO
NEGATIVO
38
Cogulo
No se forma
cogulo
POSITIVO
NEGATIVO
39
Hemlisis
Prueba de
catalasa
Staphylococcusaureus
Fermentacin
del manitol
Prueba de
catalasa
Prueba de
coagulasa
40
Staphylococcusepidermidis
Fermentacin
del manitol
Prueba de
catalasa
Prueba de
coagulasa
EVALUACIN
1. Pruebas bioqumicas ( dos) que permitan diferenciar:
Streptococcuspneumoniae:
Streptococcuspyogenes:
Describir cada una de ellas.
REFERENCIAS BIBLIOGRFICAS
41
PRCTICA N6
ACTIVIDAD ANTIMICROBIANA IN VITRO : ANTIBIOGRAMA
OBJETIVOS
Entender el fundamento del antibiograma , el modo en que se realiza y las
principales fuentes de error.
Conocer los principales mtodos de susceptibilidad a un antimicrobiano.
Evaluar la sensibilidad o resistencia a diversos antibiticos de una bacteria de
crecimiento rpido aislada en prcticas anteriores. El mtodo utilizado es el de
difusin en agar o de Kirby-Bauer.
INTRODUCCIN
La actividad de los antimicrobianos (antibiticos y quimioterpicos) debe ser evaluada in vitro
para obtener la informacin que permitir decir si un microorganismo es susceptible o
resistente a determinado producto.
Los antimicrobianos actan produciendo toxicidad selectiva , no actan directamente sobre el
husped, sino que se combinan qumicamente con determinados sistemas de los
microorganismos , enfocando as la accin sobre los microorganismos ms que sobre el
husped.
La determinacin de la mnima concentracin inhibitoria (MIC) nos proporciona la dosis
mnima necesaria del quimioterpico para impedir el desarrollo bacteriano, lo que permite
hacer estudios de uso clnico y detectar mutantes resistentes.
Dos son los procedimientos empleados para conocer sta informacin, el mtodo del tubo
dilucin y el del disco difusin en agar, a ste ltimo se le denomina : antibiograma.
Accin de los antibiticos
La actividad antimicrobiana in vitro determina:
a. La potencia de un agente antibacteriano en solucin
b. Su concentracin en los lquidos del cuerpo o en los tejidos
c. La sensibilidad de un microorganismo a concentraciones conocidas del
medicamento.
Inhibicin de sntesis de pared celular: Penicilina, Cefalosporinas, Bacitracina,
Vancomicina, Novobiocina.
Alteracin de la permeabilidad de la membrana celular: Anfotericina B, Colistina,
Nistatina, Polimixina.
Inhibicin de la sntesis proteica :Aminoglucsidos ( Kanamicina, Amikacina ,
Estreptomicina ), Tetraciclinas, Cloramfenicol, Macrlidos ( Eritromicina ),
Lincomicinas.
Inhibicin de sntesis de cidos nucleicos : cido Nalidxico, Novobiocina,
Sulfonamidas, Trimetropin, Rifampicina.
Medicin de la actividad antimicrobiana
Esta se determina mediante los mtodos de dilucin o difusin, utilizando un microorganismo
standard y una cantidad conocida del antimicrobiano. Para ello se utilizan las pruebas de
dilucin en tubos y el mtodo de difusin.
Prueba de dilucin
En ste ensayo se incorporan cantidades conocidas de antimicrobianos en medios lquidos, se
inoculan despus con las bacterias en prueba y se incuban. El punto final se toma cuando la
42
43
Normalmente la CMI es suficiente para combatir una determinada infeccin, ya que los
mecanismos inmunitarios se encargan de eliminar al microorganismo.
MATERIALES
Caldo de cultivo con suspensin bacteriana a la escala de turbidez de N 0,5 de Mc
Farland
Placas de Petri con agar MellerHinton
Torundas estriles
Discos impregnados con diferentes antibiticos
Pinzas estriles.
METODOLOGA
Sumergir la torunda en caldo tripticasa de soya con cepa bacteriana , presionar
firme sobre las paredes del tubo y extender uniformemente en la superficie de la
placa de agar MuellerHinton.
Colocar con la ayuda de pinzas, los discos impregnados con diferentes antibitico
sobre la superficie del agar.
Los discos deben quedar a una distancia de 25 mm entre ellos.
Incubar a 37C durante 24 horas.
44
Sensible
Resistente
Concentracin del
Disco mcg
10 ug
30 ug
30 ug
30 ug
30 ug
30 ug
30 ug
30 ug
300 ug
231,2 ug
5 ug
Antibitico
Halo de Inhibicin
Sensible Intermedio Resistente
+17
14-16
-13
+17
-15
+19
14-18
-13
+18
15-17
-14
+21
16-10
-15
+21
14-20
-13
+18
15-18
-14
+18
14-17
-13
+17
15-16
-14
+16
11-15
-10
+21
16-20
-15
45
Antibitico
EVALUACIN
1. Qu importancia clnica tiene el antibiograma?
46
4. Defina : Halo
5. Defina : Inhibicin
REFERENCIAS BIBLIOGRFICAS
47
PRCTICA N 7
IDENTIFICACIN DE ENTEROBACTERIAS.
PSEUDOMONA
OBJETIVOS
Conocer los procedimientos de identificacin bioqumica de las principales bacteria
Gram negativas.
Interpretar los resultados de las pruebas bioqumicas y correlacionarlas con la
diferentes especies de bacterias Gram negativas.
INTRODUCCIN
Las bacterias Gram negativas pueden presentarse como bacilos o cocos siendo los primeros
los ms abundantes tanto en el hombre como en los animales. Varios de estos
microorganismos pertenecen a la flora intestinal normal , algunos estn asociados a
infecciones entricas y a procesos infecciosos (especialmente cuando stas bacterias invaden
otros rganos o sistemas).
Es posible que las infecciones procedan de un reservorio animal , de un portador sano o de la
diseminacin endgena de la bacteria en una persona susceptible, pudindose ver afectado
cualquier rgano del cuerpo.
Familia de bacilos entricos
Esta familia Enterobacteriaceae, incluye a varios patgenos que causan sndromes diarreicos .
Un gran nmero de ensayos han sido desarrollados a manera de identificar rpidamente al
patgeno, para que posteriormente el mdico, con base en el reporte, indique el tratamiento
adecuado o para que los epidemilogos puedan localizar la fuente de infeccin. Dentro de los
bacilos Gram negativos , las enterobacterias son responsables del 30 a 35 % de todas las
septicemias, ms del
70 % de todas las infecciones del tracto urinario y muchas infecciones intestinales.
Dentro de las especies de enterobacterias que son los agentes etiolgicos de infecciones
entricas tenemos :Salmonella , Shigella, y Escherichiacoli. Estas pueden producir cuadros
diarreicos e infeccin sistmica , que son procesos infecciosos que se diseminan
generalmente por va sangunea o linftica.
Medios de aislamiento primario
Son medios selectivos porque permiten el desarrollo de algunas bacterias e inhiben el
desarrollo de otras. Esta capacidad puede ser moderada (agar Eosina azul de metileno (EMB)
y Mac Conkey) y alta (agar Salmonella-Shigella, Desoxicolato y Citrato) o completamente
especfica (Sulfato de bismuto y Verde brillante).
Algunos de los medios selectivos contienen lactosa y un indicador de pH, lo que permite desde
el principio tener colonias aisladas de bacterias fermentadoras como Escherichiacoli y no
fermentadoras de la lactosa :Salmonella, Shigella.
Medios diferenciales : Pruebas Bioqumicas
Son aquellos en los que se pone de manifiesto las propiedades metablicas de los
microorganismos frente a diferentes sustratos. Existen medios que permiten observar una, dos
o ms caractersticas metablicas de la bacteria inoculada . Entre los ms utilizados estn :
48
Agar Triple Azcar (TSI): medio slido que contiene glucosa, sales de hierro
y un indicador de pH. Permite conocer la capacidad de la bacteria para fermentar los
carbohidratos. Se detecta la produccin de sulfuro de hidrgeno (H2S), as como de gas. El
tubo se siembra por picadura y en estra por lo que se debe observar tanto
el fondo como la superficie del medio
Agar Lisina Hierro (LIA) : medio slido que contiene lisina, sales de hierro, glucosa y un
indicador de pH. Se determina la descarboxilacin y desaminacin oxidativa de la lisina, la
produccin de cido sulfhdrico o sulfuro de hidrgeno (H2S) y la fermentacin de glucosa. Se
siembra por picadura y estra.
Medio para Sulfuro ,Indol y Movilidad (SIM) : medio semislido, se utiliza en la produccin
de sulfuro de hidrgeno, la formacin de Indol y movilidad. Se inocula con una nica puncin
con asa de siembra recta a travs del centro, hasta una profundidad de unos dos tercios del
medio.
Agar Citrato de Simmons : medio slido que contiene citrato de sodio, compuesto que
puede ser utilizado como nica fuente de carbono, por algunas bacterias. Se siembra por
picadura y estra
Agar rea (Mtodo de Christensen) : medio slido, se utiliza para determinar la capacidad
de un organismo para producir la enzima ureasa, que hidroliza la rea . La hidrlisis de la rea
produce amonaco y anhdrido carbnico. La formacin de amonaco alcaliniza el medio y el
cambio de pH se detecta por el cambio de color del rojo fenol de naranja plido a magenta.
Existen ms pruebas bioqumicas que pueden utilizarse como complemento a las ya descritas
como son : rojo de metilo, VogesProskawer, utilizacin de malonato, las cuales ayudan a
determinar la especie del microorganismo aislado. En ocasiones a pesar de recurrir a diversas
pruebas metablicas, no se consigue la identificacin , siendo necesario realizar reacciones
inmunolgicas para llegar al diagnstico definitivo.
BACTERIAS PIGENAS GRAM NEGATIVAS
Otro grupo menos abundantes en especies pero de gran importancia clnica son las bacterias
pigenas Gram negativas, que pueden ser cocos o cocobacilos . Las enfermedades que
producen por lo general incluyen la acumulacin de abundantes cantidades de pus y afectan
frecuentemente el aparato genital o respiratorio. Dichas enfermedades comprenden : uretritis
purulenta (gonococo) , meningitis , neumonas , bronquitis, sinusitis, otitis media, conjuntivitis,
epiglotitis etc.
Las bacterias pigenas Gram negativas patgenas en humanos son :Neisseria, Haemophilus,
Bordetella, Moraxella.
Las bacterias del gnero Neisseria son diplococos Gram negativos inmviles, cuyos lados
adyacentes son aplanados y ligeramente cncavos. Slo dos especies de este gnero son
patgenas exclusivamente de humanos :Neisseriagonorroheae o gonococo, agente causal de
la enfermedad de transmisin sexual, la gonorrea y la
N .meningitidis o meningococo productos comensales para el hombre y que habitan
principalmente el tracto respiratorio superior.
Espordicamente se pueden comportar como patgenos oportunistas N. sicca y
N. mucosa.
El diagnstico definitivo de una infeccin gonoccica se hace por el aislamiento en cultivo de
N. gonorrhoeae.
Para el diagnstico del gonococo, el lugar de la toma de la muestra depender de la edad,
sexo y de las caractersticas de la infeccin.
49
La tincin de Gram es el mtodo de eleccin para el examen directo de las muestras. Son
oxidasa positiva.
Para los cultivos , el medio debe ser de preparacin reciente, bien hidratado y precalentados.
Se utilizan medios selectivos como agar Thayer Martin modificado. Se debe utilizar un medio
no selectivo ya que algunas cepas pueden inhibirse por los antimicrobianos contenidos en los
medios selectivos. Debe estar adems en una atmsfera que contenga de 3 a 5 % de CO2.
El diagnstico de la infeccin meningoccica, se hace con el aislamiento de N. meningitidis a
partir de lquido cefalorraqudeo, sangre, lquido sinovial, pleural o pericrdico. Las ms
utilizadas son las dos primeras.
Con la tincin de Gram se observan como diplococos Gram negativos, crecen en los medios
de cultivo enriquecidos y su crecimiento se favorece con una atmsfera de CO2. Son oxidasa
positivo y fermentan los carbohidratos.
MATERIALES
Placas con agar Eosina azul de metileno sembradas con cepas problemas.
Placas con medio Mac Conkey, Eosina azul de metileno (EMB) y Salmonella-Shigella
Tubos con medio TSI, Citrato de Simmons, LIA, REA, SIM, sin sembrar y
sembrados con cepa problema
Asas de siembra
Reactivo de Kovacs
Lminas fijadas con frotis de lquido cefalorraqudeo con tincin de Gram.
Microscopio
Aceite de inmersin
Placas de cultivo con agar Chocolate.
METODOLOGA
Enterobacterias
En las prcticas se harn los trabajos de laboratorio que nos permitan observar las
caractersticas de cultivo y con ello su identificacin
A partir de uno de los tubos problema, tomar con el asa de siembra previamente
esterilizada una muestra y sembrar por estras en los medios Eosina azul de
metileno y Salmonella Shigella. Incubar a 37C por 24 horas.
Transcurrido el tiempo de incubacin , observar la morfologa de las colonias de las
placas sembradas (Mac Conkey, EMB y S-S).
Seleccionar una colonia y realizar cultivos en los tubos de TSI, Citrato de Simmons,
LIA y SIM. Esto se hace por puntura en los medios y luego en estras en la parte de
inclinacin (pico de flauta) como lo indicar el profesor en cada medio. Llevar a
incubar a 37C por 18 a 24 horas.
Hacer la lectura de las pruebas bioqumicas, interpretar y realizar la identificacin
del microorganismo proporcionado.
Interpretacin Bioqumica
Agar Triple Azcar (TSI):
Fermentacin de glucosa : en la picadura (fondo del tubo) el medio vira a color
amarillo. Es una reaccin dbil.
Fermentacin de sacarosa : en todo el tubo el medio cambia a amarillo,
principalmente en el fondo, donde se intensifica el color debido a la reaccin de la
glucosa.
50
Escherichia
coli
51
Klebsiella
Salmonella
Shigella
52
RESULTADOS
Realizar la lectura e identificacin de los microorganismos, observar y anotar los resultados.
Escherichia coli :
TSI
LIA
Citrato de
Simmons
SIM
rea
Klebsiellasp
TSI
LIA
Citrato de
Simmons
rea
SIM
53
Proteussp
TSI
LIA
Citrato de
Simmons
rea
SIM
Salmonella sp
TSI
LIA
Citrato de
Simmons
rea
SIM
Shigellasp
TSI
LIA
Citrato de
Simmons
rea
SIM
54
PSEUDOMONA
Las especies pertenecientes al gnero Pseudomonas son ubicuos, se encuentran en la
tierra, materia orgnica en descomposicin, en la vegetacin, en el agua. Tambin podemos
encontrar estos microorganismos en el ambiente hospitalario, en lugares hmedos, como
comida, baos, respiradores. No forman parte de la flora normal del ser humano con
excepcin de los pacientes hospitalizados y en pacientes ambulatorios inmunodeprimidos.
Debido a las sencillas necesidades de crecimiento y a la versatilidad nutricional , se logra su
amplia distribucin ambiental, siendo capaces de utilizar un gran nmero de compuestos
orgnicos como fuentes de carbono y nitrgeno.
Son bacilos Gram negativos mviles rectos o ligeramente curvos, que son aerobios
estrictos, la mayora de las cepas son mviles por medio de uno o ms flagelos polares;
utilizan glucosa y otros hidratos de carbono de manera oxidativa; y suelen ser citocromo
oxidasa positivos
El gnero Pseudomonasse divide en cuatro grupos : Grupo fluorescente, Grupo Stutzeri,
Grupo Alcalgenes y Grupo con pigmento amarillo.
Grupo fluorescente : Pertenecen a este grupo las especies : Pseudomonaaeruginosa,
Pseudomonafluorescens y Pseudomonaputida , las cuales se caracterizan por la produccin
de un pigmento pioverdina hidrosoluble que da fluorescencia blanca a verde azulada bajo luz
ultravioleta de longitud de onda larga (400 nm). Slo una especie, Pseudomonaaeruginosa ,
produce el pigmento hidrosoluble azul llamado piocianina.
Pseudomonaaeruginosa produce un aspecto caracterstico cuando crece en una placa de agar
sangre , se pueden observar grandes colonias grises y presenta beta hemlisis. Las colonias
tienen un aspecto de piel de caimn y con brillo metlico.
La exudacin de pus azulado, con olor similar a las uvas , por la produccin de piocianina es
caracterstico en las heridas infectadas por este microorganismo. La piocianina es un
antibitico que puede permitir que la Pseudomonaaeruginosa exista en la naturaleza, tambin
puede desempear un papel en la nutricin , al funcionar como una forma de adquirir fosfatos
inorgnicos.
Se puede realizar una
identificacin rpida de Pseudomonaaeruginosa si se observan las siguientes caractersticas :
morfologa tpica de las colonias, produccin de pigmentos difusibles, olor a fruta y positividad
en la prueba de oxidasa.
Pseudomonaaerugino
sa
+
Pseudomonafluoresce
ns
+
Pseudomonaputi
da
+
MATERIALES
Placas con agar Nutritivo sembrada con cepa problema.
Asas de siembra
55
Pseudomona
aeruginosa
piocianina
RESULTADOS
EVALUACIN
1.Cules son las principales enterobacterias causantes de cuadros diarreico?
REFERENCIAS BIBLIOGRFICAS
56
PRCTICA N 8
CULTIVO DE MUESTRAS CLNICAS: UROCULTIVO Y COPROCULTIVO
OBJETIVOS
Conocer el procedimiento para el cultivo de una muestra clnica.
Identificar los microorganismos ms frecuentes causantes de patologas clnicas.
Conocer las condiciones para una adecuada toma de muestra para cultivo de una
muestra clnica.
CULTIVO DE ORINA: UROCULTIVO
La infeccin del tracto urinario (ITU) , se define como la presencia y multiplicacin de
microorganismos en el tracto urinario con invasin de tejidos adyacentes. La presencia de
leucocitos en la orina , indica una respuesta inflamatoria del tracto urinario, la mayora de las
veces debido a una invasin tisular por bacterias. Por lo general la piuria, est presente en las
ITU , por lo que se le considera un criterio diagnstico para sta enfermedad.
La mayora de las ITU son causadas por bacilos Gram negativos de las enterobacterias ,
siendo la Escherichiacoli y Klebsiellasp, los ms frecuentemente aislados , en infecciones no
complicadas. Tambin pueden ser causa de ITU otros bacilos Gram negativos como
Proteussp ,Enterobactersp y Pseudomonaaeruginosa sobre todo en pacientes sometidos a
instrumentacin, portadores de catteres urinarios, con anomalas anatmicas o funcionales
del tracto urinario y en pacientes hospitalizados.
Entre las bacterias Gram positivas pueden estar Staphylococcusepidermidis y
Enterococcussp. En la mayora de las ITU , se recupera un nico microorganismo en la orina.
La presencia de ms de una especie bacteriana puede deberse a una contaminacin de la
muestra o pacientes con infecciones complicadas como por ejemplo litiasis , abscesos renales
o sondaje prolongado.
El diagnstico definitivo de la ITU se hace mediante el cultivo de orina :urocultivo . Hay que
considerar que por cuidadosa que sea la tcnica de toma de muestra ( salvo puncin
suprapbica) , es difcil excluir la contaminacin de la orina con las bacterias del tramo distal
de la uretra , lo que puede causar interpretaciones erradas.
La orina de miccin media es la ms recomendable para el urocultivo. En pacientes femeninas
es recomendable el lavado de genitales externos, en el paciente masculino retraer la piel del
prepucio. La primera parte de la miccin casi siempre ests contaminada con la flora
bacteriana uretral, por lo cual se debe descartar . La miccin media debe recogerse en un
envase estril. Se recomienda obtener la primera muestra de orina de la maana , donde se
encuentra mayor nmero de bacterias.
El cultivo de orina se realizar para identificar y cuantificar el nmero de bacterias presentes
por mililitro en la orina, lo que se expresa en unidades formadoras de colonias (UFC) . La
muestra de orina debe enviarse el laboratorio en el plazo mximo de 2 horas a temperatura
ambiente, puesto que la orina es un buen medio de cultivo para muchas bacterias y la
multiplicacin de los grmenes
entre el momento de la toma de muestra y el cultivo, alterar los resultados.
Es recomendable que en todas las muestras de orina para urocultivo , se realice un examen
microscpico cuantitativo , para determinar el nmero de leucocitos por milmetro cbico.
57
MATERIALES
Frasco estril de 100 ml
Asa de siembra calibrada 0,01ml
Pipetas graduadas de 1ml estriles
Placas con agar Mac Conkey y Eosina azul de metileno
Lminas portaobjetos , laminilla
Equipos de coloracin para tincin de Gram
Centrfuga y microscopio
METODOLOGA
Evitar la contaminacin de la muestra, utilizando equipos estriles: frascos, pipetas,
placas de Petri, tubos de pruebas estriles.
Examen directo:
Centrifugar aproximadamente 10 ml de orina por tres (3) minutos a 3 000 rpm y
luego decantar el sobrenadante y observar el sedimento al microscopio a lente de
40X
Cultivo
Con el asa de siembra calibrada : 0,01 ml, previa agitacin de la muestra , tomar
una muestra con el asa y sembrar por estras en agar Mac Conkey, previamente
dividida en cuatro cuadrantes , empezando las estras por el primer cuadrante y
sin esterilizar el asa continuar la siembra en el segundo, tercer y cuarto
cuadrante.
Rotular la placa e incubar 24 horas a 37 C.
RESULTADOS
58
Realizar la lectura de la placa y a partir de una colonia bien aislada realizar las pruebas
bioqumicas para la diferenciacin.
Realizar el contaje de colonias para obtener el recuento total de UFC/ml.
Sedimento urinario
TSI
LIA
Citrato de
Simmons
rea
SIM
59
60
RESULTADOS
Realizar la lectura de los medios de cultivo y las colonias sospechosas , realizar las pruebas
bioqumicas para diferenciar las especies de enterobacterias.
TSI
LIA
Citrato de
Simmons
rea
SIM
61
62
La mayora de las situaciones clnicas que pueden ser objeto de estudios microbiolgicos para
el aislamiento o visualizacin del agente etiolgico son :
Vulvovaginitis : agentes etiolgicos ms frecuentes : Cndida spp , principalmente C.
albicans; Trichomonasvaginalis y virus Herpes simple.
La presencia de un cultivo puro de otros microorganismos observados en tincin de Gram con
leucocitos , puede tener significacin.
Vaginosis : desde el punto de vista microbiolgico se caracteriza por la ausencia o
disminucin de la flora mixta compuesta por Gardnerellavaginalis, anaerobios (Mobilluncus,
Bacteroides, cocos anaerobios) y Mycoplasmahominis.
Infeccin gonoccica : la endocervicitis gonoccica cursa con leucorrea , el exudado vaginal
no es la muestra adecuada para el diagnstico por lo que se recomienda la obtencin de
exudado endocervical.
Tipos de estudios microbiolgicos
Cultivo bacteriano
Cultivo de levaduras
Despistaje de Streptococcusagalactiae
Cultivo de virus Herpes simple ya que requiere de toma de muestra y medio de transporte y
cultivos especiales, se realiza por peticin expresa del clnico.
Toma de muestra
No debe usarse antisptico previo a la toma de la muestra . Si se utiliza espculo,
lubricar con agua caliente.
Se recomienda tomar dos (2) hisopados .
Se introduce un hisopo estril en la vagina y se recoge la muestra de la zona de
mayor exudado o en su defecto del fondo del saco vaginal posterior. Se introduce el
hisopo en el medio de transporte.
El envo de la muestra al laboratorio debe de ser de inmediato siempre que sea
posible. Cuando no se pueda procesar la muestra de inmediato, se mantendr en
refrigeracin o a temperatura ambiente.
Si se sospecha de infeccin gonoccica, no refrigerar la muestra.
Tiempo mximo de procesamiento con medio de transporte : 24 horas.
PROCESAMIENTO DE LA MUESTRA
Uno de los hisopos se emplear para el examen microscpico y el otro para el cultivo.
Examen microscpico : es el nico mtodo aceptado para el diagnstico microbiolgico de la
vaginosis bacteriana. Se har una extensin del hisopo en lmina y tincin de Gram.
Cultivo : se pueden establecer diferentes combinaciones de medios en funcin de la
orientacin diagnstica : agar Sangre en atmsfera de CO2 , agar Chocolate en atmsfera de
CO2, MacConkey, agar Thayer Martin en atmsfera de CO2, medio para Gardnerella en
atmsfera de CO2 , Sabouraud con antibitico u otro medio para Cndida, caldo para cultivo de
Trichomonavaginalis.
Examen de la muestra
Examen microscpico : en el exudado vaginal normal se observar flora regional con
predominio de morfotipoLactobacillussp y clulas epiteliales
Presencia de leucocitos
63
64
REFERENCIAS BIBLIOGRFICAS
65
PRCTICA N 9
IDENTIFICACIN Y AISLAMIENTO DE MYCOBACTERIUM
COLORACIN DE ZIEHL-NEELSEN.
BACTERIAS ANAEROBIAS
OBJETIVOS
Conocer los riesgo y precauciones durante el procesamiento de muestras con
micobacterias.
Conocer el procesamiento de las muestra para el estudio de micobacterias.
Explicar el fundamento de la coloracin de Ziehl-Neelsen.
Ejecutar la tcnica de coloracin de Ziehl-Neelsen.
INTRODUCCIN
El gnero Mycobacterium est integrado por ms de 100 especies, presentan alto contenido
de cidos miclicos en su pared que retienen las anilinas utilizadas como colorantes : fucsina ,
auramina, aun despus de ser tratadas con alcohol-cido de modo que todas las especies se
presentan como cido-alcohol resistentes (BAAR).
El complejo Mycobacteriumtuberculosis comprende varios agentes etiolgicos de tuberculosis
M.tuberculosis ,M.africanum y M.canetti, los cuales son primariamente patgenos en el
hombre.
M.tuberculosis y M.africanumson las especies de micobacterias ms importantes por ser
altamente patgenas para el hombre y muy transmisibles de persona a persona por aerosoles
expulsados por la tos de pacientes con lesin pulmonar.
La muestra ms examinada en la investigacin de Mycobacteriumtuberculosis es la de esputo
debido a que la tuberculosis pulmonar es la ms frecuente, sin embargo dado que la
enfermedad puede manifestarse en cualquier rgano , con menor frecuencia puede requerirse
la investigacin de muestras como orina, lquido cefalorraqudeo, lquido pleural, lquido
asctico, sangre, pus de cavidades abiertas, biopsias, las cuales deben procesarse tambin
para cultivo.
La muestra de esputo mucopurulenta proveniente del rbol bronquial que se obtiene despus
de un esfuerzo de tos, es la que asegura mayor probabilidad de que se puedan observar
bacilos, debe tener un volumen aproximado de 3 a 5 ml .Se recomienda analizar 2 3
muestras de cada sintomtico respiratorio. La primera muestra debe obtenerse en el momento
de la consulta y la segunda al da siguiente al despertar por la maana. Puede obtenerse una
tercera muestra al momento de entregar al laboratorio la segunda muestra. El envase debe ser
de boca ancha y con tapa de rosca.
Si la muestra de esputo no va a ser procesada el mismo da, se debe introducir cada envase
en una bolsa de polietileno y anudar la bolsa por encima de la tapa , se conservarn en
refrigeracin a 4 C, para impedir la proliferacin de la flora secundaria, preferentemente
dentro de una caja de plstico.
Para manipular las muestras y sobre todo los pasajes a otros medios de cultivo es importante
hacerlos en la cabina de seguridad.
Para que la baciloscopa sea positiva es preciso que la muestra contenga entre 5 000 y 10 000
bacilos por ml de muestra.
66
Las micobacterias se multiplican con ms lentitud que otras bacterias patgenas para el
hombre a causa de su pared celular hidrfoba, que las hace agruparse e inhibe la
permeabilidad celular a los nutrientes
El medio de cultivo ms conocido es el Lwenstein-Jensen. La temperatura ptima de
crecimiento es de 37C. Los cultivos se revisarn diariamente hasta un total de 60 das ,
pasados los cuales si no hay crecimiento se considerarn negativos.
Lectura de los extendidos
Observar cada campo microscpico en superficie y profundidad , moviendo el tornillo
micromtrico antes de desplazarse al siguiente campo; seguir un recorrido en lneas rectas,
para recorrer el extendido evitando repetir la lectura de los campos , ejemplo : de izquierda a
derecha. El nmero mnimo de campos a examinar es de 100 , los cuales pueden ser ledos
por un microscopista experimentado en cinco .
Los bacilos se observarn como bastoncillo delgados , ligeramente curvos, rojo fucsia,
destacndose claramente contra en fondo azul. Pueden presentarse aislados, apareados o
agrupados.
Escala semicuantitativa para los extendidos examinados por tincin Ziehl-Neelsen
Resultado del examen microscpico
No se encuentran BAAR en 100 campos observados
Se observan de 1 a 9 BAAR en 100 campos
observados
Se observan entre 10 y 99 BAAR en 100 campos
observados
Se observan de 1 a 10 BAAR en 50 campos
observados
Se observan ms de 10 BAAR en 20 campos
observados
Informe
No se observan bacilos cido-alcohol
resistentes
N exacto de bacilos en 100 campos
Positivo (+)
Positivo (++)
Positivo (+++)
Tincin de Ziehl-Neelsen
La cido-alcohol resistencia es la propiedad que tienen las micobacterias de captar en su
pared fucsina fenicada y retenerla aun con la accin de los decolorantes como la mezcla de
cido y alcohol . Esta caracterstica se debe al alto contenido lipdico fundamentalmente
fosfolpidos, ceras y cidos miclicos.
MATERIALES
Muestras de esputo inactivadas (autoclavadas) de pacientes Bk positivos
Frotis fijos de Mycobacteriumtuberculosis a partir de esputos
Tubos con medios de cultivo Lwestein-Jensen mostrando colonias de micobacterias
Equipo de coloracin para tincin de Ziehl-Neelsen
Mecheros
Lminas portaobjetos
Microscopios
METODOLOGA
Preparacin y fijacin del extendido
1. Ordenar las muestras
2. Numerar las lminas portaobjetos
3. Tomar la muestra y la lmina portaobjetos y colocarlas por detrs del mechero, de
67
68
3. Enjuagar con
abundante agua
5. Enjuagar con
abundante agua
7. Enjuagar con
abundante agua
69
bacilos cido-alcohol
resistentes
Medio de cultivo
Lwenstein-Jensen
Crecimiento de
Mycobacteriumtuberculosis
RESULTADOS
Realizar la observacin microscpica de las lminas y graficar los resultados.
70
BACTERIAS ANAEROBIAS
Las bacterias anaerobias han sido encontradas en infecciones que comprometen todos
los rganos y regiones anatmicas del cuerpo. Los abscesos ms profundos y las lesiones
necrosantes que involucran anaerobios son polimicrobianos y pueden incluir aerobios
obligados, anaerobios facultativos, microaerfilos como microorganismos acompaantes.
Estos microorganismos, de forma conjunta con el trauma, la stasis vascular o la necrosis
tisular, reducen la tensin de oxgeno y el potencial de oxidoreduccin en los tejidos y proveen
las condiciones favorables para la multiplicacin de los anaerobios obligados.
En las ltimas dcadas , las infecciones anaerobias se han vuelto ms comunes, para lo cual
existen dos probables explicaciones : a) el aislamiento por parte del laboratorio de las
bacterias anaerobias ha mejorado de modo que las infecciones endgenas no son ms mal
diagnosticadas o pasan inadvertidas , b) una proporcin mayor de pacientes est recibiendo
frmacos inmunosupresores por neoplasias u otras enfermedades , lo que deriva en la
resistencia del husped inmunodeprimido. Las infecciones anaerobias primarias se establecen
fcilmente en reas de tejido daado y la bacteriemia, diseminacin metastsica de las
bacterias con formacin de abscesos distantes y una cadena progresiva de eventos , pueden
suceder a veces con un desenlace mortal. Es importante el aislamiento e identificacin de las
bacterias anaerobias debido a que estas se asocian a una elevada morbimortalidad y a que el
tratamiento vara segn la especie implicada.
Aislamiento de bacterias anaerobias
Seleccin de las muestras para el cultivo :
Debido a que los anaerobios residentes a menudo
estn presentes en grandes cantidades como flora normal en las superficies de las mucosas ,
incluso la contaminacin mnima de una muestra puede dar resultados errneos. Todos los
materiales recogidos de lugares que carecen de flora natural como lquidos corporales que no
sea orina, exudados de abscesos profundos, aspirados con aguja fina y biopsias de tejidos
pueden ser cultivados para bacterias anaerobias.
Recoleccin y transporte de las muestras:
Al tomar muestras de piel o mucosas, se debe se
descontaminar la superficie, para lo cual se debe utilizar jabn , alcohol etlico al 70 % y tintura
de yodo por un minuto ( en crculos concntricos comenzando por el centro), tambin se
puede utilizar yodopovidona al 10 % , luego de lo cual se espera al menos 2 minutos antes de
la extraccin de la muestra . El material para el cultivo anaerobio se obtiene mejor por biopsia
de tejidos o por puncin y aspiracin . El empleo de hisopos no es una alternativa adecuada
debido a la exposicin excesiva de la muestra a los efectos de la desecacin , la posibilidad de
contaminacin durante la recoleccin y a que los microorganismos pueden quedar retenidos
dentro de las fibras del hisopo. Si se utiliza un hisopo, este debe provenir de un sistema de
transporte exento de oxgeno.
Un factor crucial para la viabilidad de los cultivos anaerobios es el transporte de las
muestras; el efecto letal del oxgeno atmosfrico debe ser nulo hasta que la muestra pueda
procesarse en el laboratorio. Ya no se acepta tapar de nuevo una jeringa ni el transporte de la
aguja y la jeringa al laboratorio debido a los problemas secundarios a lesiones por puncin .
Por lo tanto incluso los aspirados deben inocularse en el mismo tipo de tubo o frasco ampolla
libre de oxgeno. La muestra (pus, lquidos corporales u otro material lquido) se inocula a
travs del tapn de goma despus de extraer todo el aire de la jeringa y la aguja. Si slo se
puede obtener una muestra con hisopo, se requiere de un dispositivo especial para la
recoleccin con una atmsfera libre de oxgeno. Cuando se reinserta el hisopo, debe de
tenerse cuidado de no inclinar el recipiente , lo que provocara la salida y el desplazamiento
del anhdrido carbnico o el nitrgeno libre de oxgeno al aire ambiental.
El tejido puede colocarse en una pequea cantidad de lquido para preservarlo de la
desecacin y luego colocarlo en una bolsa para anaerobiosis.
71
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GNERO
Piel
Tracto
Intestino
Genitales
Uretra
Vagina
Respiratorio
externos
Superior
BACTERIAS GRAM NEGATIVAS
Bacteroides
0
+/2
+/+/+/Prevotella
0
2
2
1
+/1
Porphyromonas
0
1
1
D
D
+/Fusobacterium
0
2
1
D
D
+/Veillonella
0
2
1
0
D
1
BACTERIAS GRAM POSITIVAS
Finegoldia
1
2
2
1
+/1
magna
Micromonas
1
2
2
1
+/1
micros
Clostridium
+/+/2
+/+/+/Actinomices
0
1
1
0
0
+/Bifidobacterium
0
1
2
0
0
+/Eubacterium
0
1
2
D
D
1
Lactobacillus
0
1
1
0
+/2
Propionibacteriu
2
1
+/+/+/1
m
D:Desconocido; 0: No se encuentra o raro; +/-: irregular; 1: por lo comn presente; 2 :
Presente en grandes cantidades
MATERIALES
Placas con agar Chocolate
Jarra anaerobia
RESULTADOS
73
EVALUACIN
1. Qu personas son ms susceptibles a la contaminacin con Mycobacterium tuberculosis?
2. Defina :Multidrogorresistente
REFERENCIAS BIBLIOGRFICAS
...............
74
PRCTICA N 10
DIAGNSTICO MICOLGICO: HONGOS AMBIENTALES
OBJETIVOS
Conocer las tcnicas para la toma de muestra en el diagnstico micolgico.
Identificar los productos patolgicos de donde se pueden aislar los agentes
etiolgicos de las micosis humanas.
Conocer las caractersticas de los exmenes directos, como de los cultivos de
hongos.
INTRODUCCIN
La mayora de los hongos tienen un hbitat saproftico, presentan una variedad de morfologa,
desde las levaduras hasta los hongos filamentosos. Los hay comestibles, de inters para la
industria alimentaria, qumica farmacutica y los venenosos. Del gran nmero de especies
estudiadas hasta la fecha (ms de 250 000) muy pocas son capaces de colonizar al ser
humano inmunocompetente, produciendo en stos casos las enfermedades denominadas
micosis.
Los hongos que producen micosis en el ser humano se encuentran en dos estados
morfolgicos bsicos: levaduras y mohos.
Levadura
Puede definirse como un hongo unicelular, redondo u ovalado que se reproduce por gemacin
o fisin binaria. Una levadura tambin puede ser el estadio morfolgico en el ciclo biolgico de
una especie filamentosa , se denomina a esto dimorfismo.
Mohos
Son hongos multicelulares cuya estructura filamentosa se forma por el crecimiento continuo a
partir de una espora .El elemento tubular que emerge de denomina hifa, el que sigue
creciendo y ramificndose llegando a formar un conjunto entrelazado al que se denomina
micelio o talo. Parte de las hifas se introducen en el sustrato y forman el micelio vegetativo
y las que se proyectan hacia el exterior constituyen el micelio areo, muchas levaduras en
determinadas circunstancias y dependiendo de la especie , pueden producir pseudohifas.
El micelio areo muestra macroscpicamente diferentes caractersticas, lo cual contribuye a la
identificacin primaria; puede ser algodonoso, velloso, arrugado, polvoriento, cerebriforme,
pigmentado o no, etc. En l se producen los elementos de propagacin, las esporas y los
conidios. Los micelios tienen la capacidad de germinar un nuevo sustrato y as producir un
nuevo elemento. Este conjunto de caractersticas observadas sobre el medio de cultivo se
denomina colonia.
Los hongos como clulas eucariticas poseen ncleo, nucleolo, retculo endoplasmtico,
ribosomas, mitocondrias, vacuolas, cuerpos lipdicos y otras inclusiones. Rodeando el
citoplasma existe una membrana y una pared celular con caractersticas muy definidas. Se
multiplican a travs de estructuras
que pueden ser asexuales o sexuales previa fusin del protoplasma y ncleo de clulas
distintas. Tambin lo hacen mediante crecimiento vegetativo expansivo como ocurre de rutina
en el laboratorio con levaduras o fragmentos de micelio.
Como en otras enfermedades infecciosas , las micosis se diagnostican en el laboratorio
siguiendo el esquema clsico : examen directo, cultivos e inmunodiagnstico.
75
Examen directo
Se realizar un estudio directo (pelo, escama, ua ,sangre, gota de pus. exudado, etc )
colocando la muestra entre un portaobjetos y un cubreobjetos, y luego observndola al
microscopio
Se puede realizar una preparacin en fresco en lmina portaobjetos adicionando una gota de
hidrxido de potasio al 10% (KOH al 10 %). Para la visualizacin de la cpsula de
Criptococcusneoformans (LCR), se puede adicionar una gota de tinta china. En los exudados
purulentos se recomienda realizar una tincin de Gram, Giemsa, y tambin Wright. Si se trata
de cortes histolgicos hacer una preparacin con hematoxilina y eosina.
Cultivos
El medio ms utilizado en micologa clnica es el descrito por Sabouraud. A este medio base
se le aade una cantidad superior de glucosa (40 X 100), denominndose as agar glucosado
de Sabouraud (SGA) , al cual posteriormente se le han adicionado antibiticos con el fin de
evitar la contaminacin bacteriana y cicloheximida (actidiona) , para inhibir los hongos
saprofitos.
La incubacin en micologa mdica es siempre en aerobiosis, oscilando el tiempo desde 2 a 3
das para levaduras y especies saprofitas. La temperatura de incubacin es 32 C ; los
dermatofitos y otros causantes de micosis cutneas a 25 a 30 grados centgrados
(temperatura ambiental)
El producto patolgico y la tcnica de toma de muestra se elegir de acuerdo con el tipo de
micosis por investigar.
MATERIALES
Tubos de prueba conteniendo agar glucosado de Sabouraud (SGA)
Cultivos de especies ambientales :Penicillum , Alternaria , Aspergillus,
Hormodendrum
Frasco con KOH al 10 %
Asa de siembra
METODOLOGA
Observar macroscpicamente y realizar preparaciones con Azul de lactofenol para su
observacin microscpica.
Penicillum
76
Aspergillus
fumigatus
Aspergillus
niger
Rhizopus
77
RESULTADOS
Observar al microscopio (10X y 40X) las muestras directas.
78
79
EVALUACIN
1. Elaborar un cuadro comparativo de caractersticas morfolgicas , nutricionales y sensibilidad
a antibiticos de hongos y bacterias.
2. Explicar las tcnicas de diagnstico directas e indirectas para hongos.
REFERENCIAS BIBLIOGRFICAS
80
PRCTICA N 11
DIAGNSTICO DE LAS MICOSIS SUPERFICIALES Y CUTNEAS
OBJETIVOS
Describir las caractersticas de las colonias de hongos causantes de las micosis
superficiales y cutneas en cultivos con agar glucosado de Sabouraud y
microscpicamente.
INTRODUCCIN
La colonizacin e invasin en mayor o menor grado de una especie fngica se denomina
micosis. Dentro de las micosis superficiales se incluyen las causadas por hongos que
colonizan la superficie queratinizada de la piel o pelo. Varios son los agentes etiolgicos que
pueden colonizar la piel.
Las infecciones cutneas incluyen una variedad de procesos en los que se encuentran
afectados piel y anexos (pelo y uas). La infeccin puede estar limitado a la capa crnea o
llegar a los estratos ms profundos , sin invasin linftica. Producidos por los hongos
denominados dermatofitos y las enfermedades por ellos producidas dermatofitosis. La
dermatomicosis incluye a cualquier proceso mictico de la piel y el de dermatofitosis se
reserva para los producidos por hongos dermatofitos.
MICOSIS SUPERFICALES
Piedra Negra
Se caracteriza por la presencia de ndulos en la porcin extrafolicular del pelo, ptreos y de
color negro. El agente causal es Piedra hortae
Piedra blanca
Muestra ndulos blanco-grisceos , que son masas agrupadas de hifas y pueden encontrarse
en la parte distal o central de pelo axilar , pubiano y crural. Agente
causal :Trichosporumcutaneo o T. beigelii.
Tia negra
Es una infeccin superficial de la piel debido a la colonizacin de Hortaeawerneckii. Se
caracteriza por la presencia de manchas negro-marronceas, no descamativas e indoloras ,
frecuente en las palmas , dedos y plantas , que en otro lugar de la piel.
Pitiriasis versicolor
Caracteriza lesiones furfurceas a veces papulomatosas o eritematosas, confluentes con
pigmento variable (hipo o hiperpigmentadas). Tiene como agente causal a Malasseziafurfur, se
localiza preferente en el tronco sobre todo hombros y espalda . Al examen microscpico
detectan los grupos de levaduras con hifas
MICOSIS CUTNEAS
Dermatomicosis
Micosis producida por Cndida albicans, hongo oportunista. Agente causal de intertrigos
(submamario o inguinal) , eczema de paales, onicomicosis con paroniquia y granuloma
candidisico., Adems de C. albicans tambin pueden presentar onicomicosisCndida
stellatoidea, C.tropicalis, C. guillermondi y C. parapsilosis.
Las preparaciones teidas con Gram , muestran levaduras Gram positivas redondas u ovales ,
con brotes de blastosporas de 3 a 4 m acompaadas de pseudohifas de 3 a 10 micras de
longitud.
81
82
Cndida
albicans
Trichophytonm
entagrophytes
Trichophytonr
ubrum
Trichophyton
tonsurans
Microsporum
gypseum
83
METODOLOGA
Examinar al microscopio las lminas preparadas y esquematizar sus observaciones.
84
EVALUACIN
1. Qu caractersticas morfolgicas en los cultivos presentan los siguientes hongos?
Epidermophytonflocosum:
Trichoporumcutaneum :
2. Cules son las manifestaciones clnicas de las micosis producidas por :
Malasseziafurfur:
Piedra hortae:
REFERENCIAS BIBLIOGRFICAS.
85
PRCTICA N 12
DIAGNSTICO DE LAS MICOSIS SUBCUTNEAS, SISTMICAS Y OPORTUNISTAS
86
METODOLOGA
Examinar al microscopio las lminas preparadas y esquematizar sus observaciones.
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88
89
90
91
92
93
94
PRCTICA N 13
DIAGNSTICO VIROLGICO
OBJETIVOS
Familiarizar al estudiante con las diferentes tcnicas de aislamiento de virus
aprovechando las propiedades que presentan
Observar y caracteriza morfolgicamente clulas cultivadas
Explicar la importancia de las tcnicas de cultivo de tejidos en virologa y en otras
disciplinas cientficas.
La demanda de los servicios de los laboratorios de virologa clnica, han aumentado en las
ltimas dos dcadas debido a la disponibilidad comercial de reactivos de alta calidad, el uso
por parte de los mdicos de frmacos antivirales especficos, el desarrollo de tcnicas de
diagnstico rpido y la aplicacin de los procedimientos de cultivo celular para virologa al
diagnstico de otras enfermedades como infeccin genital por Chlamydia.
Las enfermedadesvirales que requieren diagnstico de laboratorio son las enfermedades
de transmisin sexual, las diarreas, las enfermedades respiratorias en nios y adultos, las
meningitis aspticas, las enfermedades congnitas y las infecciones en huspedes
inmunodeprimidos.
CULTIVO CELULAR
Los cultivos celulares comenzaron a principio del siglo XX, con cultivos de rganos
completos y luego con mtodos de clulas individualizadas : cultivos de clulas primarias
(clulas somticas de un animal de experimentacin o tomadas de un paciente humano (que
pueden mantenerse en cultivo durante un perodo breve de tiempo) o lneas celulares
inmortalizadas, las cuales en condiciones adecuadas pueden continuar creciendo en cultivo
indefinidamente.
En 1952 Renato Dulbecco fue el primero que cuantific virus animales, utilizando un ensayo
de placas de lisis, tcnica para la cual se preparan diluciones del virus con las que se infectan
clulas crecidas en monocapas, que luego se recubren con agar blando para impedir la
difusin del virus. ste destruye las clulas en focos localizados que se observan al teirse la
monocapa.
MECANISMOS DE LESIN CELULAR
La infeccin viral origina una variedad de cambios que se detectan mediante el examen
visual o bioqumico de las clulas infectadas, estos cambios se deben a la produccin de
protenas y cidos nucleicos vricos, y a las alteraciones biosintticas de las clulas. En las
clulas infectadas por virus se reconocen cambios fenotpicos comunes, denominados efectos
citopticos del virus , los cuales son :
Forma alterada : las clulas adherentes que normalmente estn pegadas a otras clulas ( in
vivo ) o a un sustrato artificial ( in vitro ) pueden adoptar una morfologa redondeada diferente
de su apariencia aplanada normal . Se eliminan de la clulas los procesos de ampliacin
implicados en la adhesin y la movilidad.
Despegamiento del sustrato : para las clulas adherentes , esta fase de dao celular sigue
de la anterior. Ambos efectos son causados por la degradacin parcial o la disrupcin del
citoesqueleto, el cual se encarga de mantener la forma de la clula.
Lisis : es el caso ms extremo, la clula entera se rompe, se pierde la integridad de la
membrana y la clula se puede hinchar por la absorcin de lquidos extracelulares y
95
finalmente estalla. ste es un caso extremo de dao celular, no todos los virus causan este
efecto, aunque pueden causar otros efectos citopticos.
La lisis es beneficiosa para un virus ya que constituye un mtodo para liberar nuevas
partculas vricas de una clula infectada.
Fusin de membranas : las membranas de las clulas adyacentes se fusionan originando
una masa de citoplasma que contiene ms de un ncleo : sincitio, o dependiendo del nmero
de clulas que se fusionan : clula gigante. Las clulas fusionadas tienen vida corta y luego se
lisan.
Permeabilidad de membranas : diversos virus causan un aumento en la permeabilidad de
membranas, permitiendo la entrada de iones extracelulares como el sodio. La traduccin de
algunos ARNm vricos es resstente a altas concentraciones de iones de sodio , permitiendo la
expresin de genes vricos a expensas de mensajeros celulares.
Cuerpos de inclusin : son reas de la clulas en las que se han acumulado componentes
vricos. Se trata frecuentemente de sitios de ensamblaje de viriones y algunas inclusiones
celulares consisten en acmulos cristalinos de partculas vricas. No est claro si estas
estructuras daan a la clula, pero frecuentemente estn asociadas a virus que causan lisis
celular , como los herpesvirus.
Apoptosis : la infeccin vrica puede activar la apoptosis ( muerte clular programada ),
mecanismo implicado en el crecimiento normal y el desarrollo de los organismos.
INMUNODIAGNSTICO
ENSAYO INMUNOENZIMTICO
La prueba de inmunoabsorcin ligada a enzimas (ELISA) o inmunoensayos ligados a
enzimas (EIAs) en la cual el antgeno o anticuerpo est adsorbido a una fase slida ,
constituye uno de los primeros inmunoensayos enzimticos primeramente descritos por
Engvall y Perlmann en 1971 y luego aplicados al diagnstico microbiolgico por Voller y
colaboradores. ELISA tiene la ventaja sobre las tcnicas de inmunofluorescencia (IF) de su
mayor sensibilidad ya que , la enzima acta catalticamente y de forma objetivable , por lo que
es posible medir la densidad ptica de la coloracin final. Las enzimas son seguras, de bajo
costo y estables, si se comparan con los radio-istopos utilizados en radioinmunoensayo
(RIA).
En la actualidad estas pruebas estn tomando un rol importante en los laboratorios
mdicos y de investigacin, porque brindan una alternativa viable, mediante la cual es posible
realizar la identificacin de muchos virus a nivel de gnero. Estn reemplazando a los RIA en
muchos laboratorios, por su comparable sensibilidad sin los problemas de manejo, eliminacin
y corto tiempo de vida de los materiales radioactivos .
Debido a su objetividad, facilidad de automatizacin y posibilidad de trabajar con un gran
nmero de muestras, estos ensayos inmunoenzimticos estn reemplazando parcialmente a
tcnicas en el laboratorio como :inmunofluorescencia y aglutinacin.
Estos ensayos presentan tres piezas constantes que originan distintos tipos de EIA en
funcin de cmo se combinen : el analito (antgeno {Ag} o anticuerpo {Ac} ), el conjugado (de
antgeno o de anticuerpo) y el sustrato. Utilizan enzimas como marcadores inmunoqumicos
que permiten valorar las uniones antgeno-anticuerpo que se producen tras un periodo de
incubacin, con la adicin posterior de un sustrato.
Fundamento
La prueba de ELISA se basa en la reaccin antgeno-anticuerpo, uno de los cuales debe ser
de reactividad conocida. El color se genera por la interaccin de un sustrato cromognico y
una enzima que ha sido acoplada al anticuerpo detector. Si debe medirse el anticuerpo, se
coloca el antgeno en la fase slida, como una capa de captura. Despus de la reaccin del
96
antgeno con el suero del paciente, la capa de deteccin puede ser un reactivo
antiinmunoglobulina clase especfica (IgM o IgG) para detectar respuesta de anticuerpos clase
especficos
Dentro de los parmetros fisicoqumicos que intervienen en la unin del antgeno con el
anticuerpo tenemos:
Fuerzas de Van der Walls producidas por el movimiento de tomos en la superficie de
las molculas generado por un cambio elctrico. Son fuerzas dbiles presentes cuando la
proximidad del Ag y el Ac es grande.
Fuerzas electrostticas originadas por la fuerza de atraccin entre molculas de carga
inica opuesta, como sucede con los grupos NH3+ (amonaco)que reaccionan vidamente con
el grupo COOH- (grupo carboxilo).
Uniones por puentes de hidrgeno son de carga energtica baja entre tomos
electropositivos de hidrgeno y tomos electronegativos de oxgeno o nitrgeno.
Metodologa
Los mtodos de ELISA se dividen en :
ELISA directo : ensayo ELISA simple de dos capas
Las placas ELISA se preparan recubriendo los pocillos con las soluciones en las que se
sospecha se encuentra el antgeno. Se incuban con anticuerpos marcados e indican la
presencia de antgeno en la solucin analizada. Se debe incluir controles negativos que sern
muestras del mismo tipo de las analizadas (sangre, orina) pero en las que se tenga la certeza
de la ausencia del antgeno buscado y controles positivos (soluciones donde se encuentra el
antgeno buscado, o bien se le ha aadido).
ELISA indirectoLas placas ELISA se preparan de igual forma que en el mtodo directo, los
controles positivos y negativos son los mismos. El sistema de deteccin emplea dos
anticuerpos : uno primario contra el antgeno, y uno secundario marcado contra el primario. La
deteccin tiene mayor sensibilidad por presentar una amplificacin de seal debida a la unin
de dos o ms anticuerpo secundarios por cada primario.
ELISA sndwich : ensayo de captura de antgeno y deteccin mediante inmunocomplejos
Se trata de un ensayo muy empleado en el que se recubre el pocillo con un primer anticuerpo
anti-antgeno. Despus de lavar el exceso de anticuerpo se aplica la muestra problema en la
que se encuentra el antgeno, que ser retenido en el pocillo al ser reconocido por el primer
anticuerpo. Despus de un segundo lavado que elimina el material no retenido se aplica una
solucin con un segundo anticuerpo anti-antgeno marcado. As pues cada molcula de
antgeno estar unida a un anticuerpo en la base que lo retiene y un segundo anticuerpo, al
menos, que lo marca. Este ensayo tiene una gran especificidad y sensibilidad debido a la
amplificacin de seal que permite el segundo anticuerpo.
Fijacin del Antgeno a la fase slida :
La reaccin inmunolgica tiene lugar en la fase slida, sta puede ser de plstico, vidrio o
nitrocelulosa. Los ms usados son los de plstico, dentro de stos los de
poliestirenogammairradiados y los de cloruro de polivinilo ya que tienen mayor capacidad para
formar enlaces estables que los de poliestireno no tratados.
El antgeno diluido en buffer es adherido a la fase slida por enlaces electrostticos entre los
97
sitios activos del plstico y regiones de la protena responsables de esta interaccin. El buffer
puede ser carbonato a pH 9,6 o buffer fosfato salino ( PBS 1X ) a pH 7,4.
La estabilidad de los enlaces electrostticos, el tiempo de incubacin y la temperatura son
factores importantes a tener en cuenta para evitar prdidas de las protenas y que pueden
afectar la sensibilidad del ensayo.
Reaccin con anticuerpo :
La reaccin del antgeno con el anticuerpo se debe realizar en condiciones similares a las
fisiolgicas : pH 7,4, temperatura de 37C y concentracin salina equivalente a 0.15M de
cloruro de sodio (NaCl). El tiempo puede variar entre 1 a 3 horas.
Molculas no especficas en solucin pueden adherirse a la fase slida afectando el resultado
final del ensayo, para disminuir este riesgo se suele agregar al medio de reaccin un exceso
(0,1% a 1%) de una protena inerte para que compita eficientemente por los sitios de unin
inespecficos en la fase slida. Esta protena puede ser seroalbmina bovina, casena, suero
entero, gelatina u otros.
Tambin es necesario aadir al medio Tween 20 (Monolaurato de
polioxietilenosorbitn{ surfactante } )para evitar uniones inespecficas de macromolcula. Por
este motivo es agregado en los tampones de dilucin y de lavado.
Adicin del conjugado enzimtico :
El conjugado enzimtico se prepara por unin covalente de una enzima con el anticuerpo; esta
enzima puede ser peroxidasa de rbano (Horseradishperoxidase
{ HRP } ), fosfatasa alcalina (AlcalinePhosphatase { AP } ) o beta-galactosidasa. Los criterios a
tomar en cuenta en la seleccin de la enzima apropiada son su toxicidad, estabilidad,
disponibilidad, viabilidad de conjugarla eficazmente con el anticuerpo elegido, sensibilidad y
costo.
Las condiciones de reaccin entre el conjugado y el complejo formado por la unin antgenoanticuerpo son similares a las descritas en la etapa anterior.
Adicin del sustrato:
La eleccin del sustrato va de acuerdo con el tipo de enzima presente en el conjugado. El
sistema AP hidroliza al p-nitrofenil fosfato o p-nitrofenol generando un producto soluble de
color amarillo. El sistema HRP reduce al sustrato perxido de hidrgeno produciendo oxgeno
que oxida a otros compuestos cromgenos tales como:
Tetrametilbenzidina (TMB) : la oxidacin genera un producto de color azul oscuro.
o-phenylenediamine (OPD): es oxidado a un producto coloreado que puede variar de color
naranja a pardo oscuro.
cido azino-(3-etil)-benzo-sulfnico (ABTS) : la oxidacin genera un producto que puede
variar del color al azul.
La intensidad del color desarrollado es de acuerdo con la cantidad de enzima presente en la
reaccin.
La lectura se realiza en un espectrofotmetro a 405 nanmetros
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Prueba para la deteccin del VIH en la cual los antgenos virales se encuentran unidos a una
membrana de nitrocelulosa dentro de un contenedor plstico. Los antgenos utilizados son
recombinantes o sintticos. Se utilizan conjugados de anti-inmunoglobulina ligados a una
enzima que se fija al anticuerpo del paciente. La adicin del sustrato permite la visualizacin
del color en el papel.
Su ventaja y principal indicacin es la posibilidad de identificacin entre los dos tipos de virus .
Las pruebas son rpidas y fciles de realizar, pero son costosas. Muchas producen resultados
en 5 15 minutos.
TCNICAS DE INOCULACIN EN ANIMALES DE LABORATORIO
Este fue el primer mtodo que se utiliz para el aislamiento de virus , demostrndose la
reaccin positiva por la muerte y los cambios histolgicos o clnicos. Existen factores negativos
en el uso de animales de laboratorio : el confinamiento de los mismos de tal manera que no se
pueda impedir una infeccin cruzada a otros animales y al personal de laboratorio, la
presencia de enfermedades vricas latentes en los animales de experimentacin que pueden
activarse por el mismo trauma que supone la inoculacin con la consiguiente interferencia a la
hora de la interpretacin de los resultados .
Debe elegirse cuidadosamente el tipo y la edad del animal que va a utilizarse , as como la va
de inoculacin, ya que cada especie tiene su propia sensibilidad y cada virus sus propios
requerimientos respecto a un tipo de clulas . El animal ms utilizado es el ratn de menos de
dos das de edad especialmente como animal de rutina con fines diagnstico siendo el que
proporciona el principal mtodo de aislamiento de los virus Coxsakie A.
el ratn lactante se utiliza en virologa para :
Inocular por va intracerebral (0,06 ml) :Herpes simple
Inocular por va subcutnea (0,06 ml) : infeccin por Coxsakie, Arbovirus y
Reovirus
Inocular por va intradrmica (0,02ml) virus Coxsakie
el ratn adulto se utiliza :
Inocular por va intracerebral (0,03ml) o intraperitoneal hasta 2 ml de
encefalitis
Inocular por va intracerebral : rabia, coriomeningitis linfocitaria
Inocular por va intranasal( 0,05 ml): Influenza A,B y C
Inocular por va intraperitoneal o intracerebral para obtencin de
inmunosueros.
la cobaya se utiliza para :
Inocular por va intraperitoneal hasta 5 ml de coriomeningitis linfocitaria
Inocular por va intraperitoneal o intramuscular para obtencin de
inmunosueros hasta un ml.
el conejo se utiliza para :
Inocular por va intradrmica Herpes tipo B
Inocular por va intradrmica para la obtencin de vacunas
Inocular por va intravenosa hasta 2 ml o intramuscular hasta 2 ml o
intraperitoneal hasta 2 ml para la obtencin de inmunosueros.
Materiales : jeringa con aguja de 1 ml, embudo de cristal, tubos de ensayo, algodn.
Reactivos : alcohol etlico de 70, ter etlico, solucin de inoculacin
Tcnica :
a) Anestesiar al ratn con un algodn empapado de ter etlico colocado en el interior
de un embudo invertido , introducir en l el ratn.
b) rasurar la zona a inyectar e inyectar la solucin de inoculacin en el lugar de
inoculacin que puede ser : IC intracraneal, IM intramuscular, IN intranasal, SC
subcutnea, ID intradrmica, IV intravenosa, IP intraperitoneal.
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Interpretacin de los resultados : Se manifiesta la infeccin en el ratn ,se observar sta por
la sintomatologa , la muerte o la elevacin del ttulo de anticuerpos. Se observar durante dos
o ms semanas el animal inoculado
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Fuentes de Informacin
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Bailey & Scott.Diagnstico Microbiolgico .11 edicin 2004.Editorial Mdica
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Koneman Diagnstico Microbiolgico 6 edicin .2008.Editorial Mdica
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Acribia
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