Cap 5 Cromatografía Introducción-Gas-HPLC 2015

FACULTAD DE CIENCIAS AGRARIAS
Asignatura: ANLISIS INSTRUMENTAL

Carreras: Bromatologa Licenciatura en Bromatologa
CAPTULO V
INTRODUCCIN A LAS
SEPARACIONES
CROMATOGRAFICAS
Captulo V Introduccin a las Separaciones Cromatogrficas
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INTRODUCCIN A LAS SEPARACIONES CROMATOGRFICAS

La cromatografa es uno de los mtodos fsicos generales, que ms ampliamente se
emplean para aislar los componentes de una mezcla dada. La separacin de los mismos se
basa en las diferencias que presentan sus respectivos coeficientes de distribucin entre dos
fases inmiscibles.
Una de esas fases circula (fase mvil) y la otra est fija o esttica (fase estacionaria)
En todas las separaciones cromatogrficas, la muestra se disuelve en una fase mvil,
que puede ser un gas, un lquido o un fluido supercrtico. Esta fase mvil se hace pasar a
travs de una fase estacionaria inmiscible, la cual se mantiene fija en una columna o sobre una
superficie slida. Las dos fases se eligen de tal forma, que los componentes de la muestra se
distribuyen de modo distinto entre la fase mvil y la fase estacionaria.
La velocidad de migracin es funcin de la distribucin que se produzca en el equilibrio:
si los componentes se distribuyen ms fcilmente en la fase estacionaria, migrarn ms
lentamente por la columna cromatogrfica.
Aquellos componentes que son retenidos con fuerza por la fase estacionaria se
mueven lentamente con el flujo de la fase mvil; por el contrario, los componentes que se unen
dbilmente a la fase estacionaria, se mueven con rapidez. Como consecuencia de la distinta
movilidad, los componentes de la muestra se separan en bandas discriminadas que pueden
analizarse cualitativa y/o cuantitativamente.
Los fenmenos fsicos que influyen directamente sobre las constantes de equilibrio de
distribucin entre ambas fases son entre otros: absorcin o particin, adsorcin e intercambio
inico.
Clasificacin de los mtodos cromatogrficos
Los mtodos cromatogrficos se pueden clasificar de dos modos distintos:
a) segn la forma en que las fases estacionaria y mvil se ponen en contacto.
cromatografia en columna: la fase estacionaria se mantiene dentro de un tubo
estrecho a travs del cual se hace pasar la fase mvil por presin o por gravedad.
cromatografia plana: la fase estacionaria se mantiene sobre una placa lisa o en los
intersticios de un papel; la fase mvil se desplaza a travs de la fase estacionaria
por capilaridad o por gravedad.
b) segn el tipo de fase mvil y estacionaria, y en la clase de equilibrios implicados en la
transferencia de los solutos entre las fases.
La Tabla 1 relaciona tres clases generales de cromatografa: cromatografa de lquidos,
cromatografa de gases y cromatografa de fluidos supercrticos. Como su nombre indica,
las fases mviles en las tres tcnicas son, respectivamente, lquidos, gases y fluidos
supercrticos. Como se indica en la columna 2 de la tabla, las dos primeras clases
generales incluyen varios mtodos cromatogrficos. Solamente la cromatografa de
lquidos es la que puede realizarse en columnas o sobre superficies planas; por otra parte,
la cromatografa de gases y la de fluidos supercrticos estn restringidas a los
procedimientos en columna.
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TABLA 1. Clasificacin de los mtodos cromatogrficos

Clasificacin general
Cromatografa de
lquidos
(LC)
Fase mvil: lquida
Mtodo especfico
Lquido-lquido, o
reparto
Lquido-slido, o
adsorcin
Intercambio inico
Exclusin por tamao
Afinidad
Cromatografa de
gases (GC)
Fase mvil: gas
Cromatografa de
fluidos supercrticos
(SFC)
Fase mvil: fluido
supercrtico
Gas-lquido
Gas-slido
Fase estacionaria
Lquido adsorbido o unido a
una superficie slida
Tipo de equilibrio
Reparto entre lquidos
inmiscibles
Slido
Adsorcin
Resina de intercambio inico

Lquido en los intersticios de
un slido polimrico
Lquido con un grupo
especfico unido a una
superficie slida
Lquido adsorbido o unido a
Slido
Intercambio inico
Especies orgnicas unidas a

Reparto/ tamizado
Reparto entre un
lquido superficial y
lquido mvil
Reparto entre un gas
y un lquido
Adsorcin
Reparto entre un
fluido supercrtico y
una superficie unida
La Figura 1 muestra esquemticamente cmo dos sustancias A y B se separan en una

columna por cromatografa de elucin. La elucin implica el transporte de una especie a travs
de una columna por la adicin continua de nueva fase mvil.
Como se indica en la figura, una porcin de la muestra, contenida en la fase mvil, se
introduce en la parte superior de la columna (tiempo to en la Figura 1) y a continuacin los
componentes de la misma se distribuyen entre las dos fases. La introduccin de fase mvil
adicional (el eluyente) hace que la fase mvil que contiene una parte de la muestra se mueva
hacia abajo por la columna, donde tiene lugar un posterior reparto entre la fase mvil y las
porciones nuevas de fase estacionaria (tiempo ti). Al mismo tiempo, tiene lugar una distribucin
entre el disolvente nuevo y la fase estacionaria en el lugar en que inicialmente se ubicaba la
muestra.
Sucesivas adiciones de fase mvil hacen descender las molculas de analito por la
columna en una serie continua de transferencias entre las fases estacionaria y mvil. Sin
embargo, debido a que el movimiento de los componentes de la muestra slo puede ocurrir en
la fase mvil, la velocidad promedio con la que la especie migra depende de la fraccin de
tiempo que reside en esta fase. Esta fraccin es pequea para las sustancias que son
retenidas fuertemente por la fase estacionaria (por ejemplo, el compuesto B en la Figura 1) y
es grande cuando es ms probable la retencin en la fase mvil (componente A).
La diferencia de velocidad que resulta hace que se separen los componentes de la
mezcla en dos bandas, o zonas, que se extienden a lo larga de la columna (ver tiempo t2 en la
Figura 1).
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Fase mvil
Muestra
A+B
Columna de
relleno
Seal del
detector
t0
Detector
t1
t2
t3
A
t0
t1
t2
Tiempo
Fig 1: (a) Diagrama que muestra la

separacin de una mezcla de componentes A
y B por cromatografa de elucin en columna
(b) Salida de la seal del detector en las
diversas fases de la elucin
t4
B
t3
t4
Luego que el analito llega al detector, se representa su seal en funcin del tiempo (o
del volumen de fase mvil aadido), de esta manera se obtienen una serie de picos (como se
muestra en la parte inferior de la Figura 1); obteniendo un grfico denominado cromatograma,
el cual es til tanto para el anlisis cualitativo como cuantitativo.
Parmetros cromatogrficos:
Velocidad de migracin de las especies: La efectividad de una columna cromatogrfica para
separar dos analitos depende, en parte, de las velocidades relativas con las que eluyen las dos
especies. Esas velocidades estn determinadas por la magnitud de las constantes de los
equilibrios de distribucin de las especies entre las fases estacionaria y mvil.
a.
Constante de distribucin (K): Los equilibrios de distribucin implicados en

cromatografa se describen por ecuaciones que suponen la transferencia de un analito
entre las fases estacionaria y mvil. As, para la especie analito A, se puede escribir
A mvil A estacionaria
La constante K para este equilibrio se denomina constante de distribucin, razn de
distribucin o coeficiente de distribucin, y se expresa como:
K= Cs / CM
Cs: es la concentracin molar del analito en la fase estacionaria

CM: es la concentracin molar del analito en la fase mvil
Idealmente, el coeficiente de distribucin es constante en un amplio intervalo de

concentraciones; de este modo, Cs es directamente proporcional a CM. La cromatografa
en la que es aplicable la ecuacin anterior, se denomina cromatografa lineal.
b.
Tiempo de retencin (tR): es el tiempo que transcurre desde de la inyeccin de la

muestra hasta que el pico del analito alcance el detector. En la figura 2 se denomina
tiempo muerto (tM), al tiempo que emplea la fase mvil para llegar al detector.
La velocidad de migracin de la especie no retenida coincide con la velocidad promedio
del movimiento de las molculas de la fase mvil.
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La velocidad lineal media de la migracin del analito es:

donde L es la longitud del relleno de la columna. De manera semejante, la velocidad
lineal media del movimiento u de las molculas de la fase mvil es:
u = L / tM
tR
tM
Tiempo
Fig 2: Cromatograma caracterstico de una mezcla de dos
componentes. El pico pequeo de la izquierda representa una especie
que no se retiene en la columna y alcanza el detector inmediatamente
despus de la elucin.
c.
La velocidad de migracin del soluto; factor de retencin (k): Se utiliza para describir
las velocidades de migracin de los analitos en las columnas. Para una especie A, el
factor de capacidad kA est relacionado con la velocidad a la cual A migra a travs de
una columna. Es la cantidad de tiempo que pasa un soluto en la fase estacionaria en
relacin con el tiempo que pasa en la fase mvil. Se expresa como:
kA = KA VS
VM
k= tr tM
tM
donde tR y tM se pueden obtener a partir de un
cromatograma.
Cuando el factor de capacidad para una especie es mucho menor que la unidad, la
elucin tiene lugar tan rpidamente que es difcil determinar con exactitud los tiempos de
retencin. Cuando el factor de capacidad es del orden de 20 a 30 o tal vez mayor, los
tiempos de retencin son demasiado largos. Idealmente, las separaciones se realizan en
unas condiciones en las que los factores de capacidad para las especies de una mezcla
oscilan entre 1 y 5.
d.
Velocidad de migracin diferencial; factor de selectividad (): Proporciona una medida

de la eficacia con la cual la columna puede separar los analitos. El factor de selectividad
de una columna para dos especies A y B se expresa como:
= KB
KA
donde KB es la constante de distribucin para la especie ms fuertemente retenida B, y
KA es la constante de distribucin para la menos retenida, la especie A, (o que eluye con
ms rapidez). Con esta definicin siempre es mayor que la unidad.
Existe una relacin entre el factor de selectividad para dos analitos y sus factores de
capacidad:
= (tR)B tM
o
= k B
(tR)B tM
k A
Donde kB y kA son los factores de capacidad de B y A, respectivamente.
Reordenando ambas expresiones, resulta una ecuacin que permite la determinacin de
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a partir de un cromatograma experimental:

= (k)B - tM
(k)A - tM
Ensanchamiento de banda:
La teora cintica, o de la velocidad, de la cromatografa explica en trminos cuantitativos las
formas de los picos y los efectos de distintas variables en la anchura de los mismos.
Resulta bueno considerar la conducta de una partcula individual del analito, la cual,
durante la migracin, experimenta miles de transferencias entre las fases estacionaria y mvil.
El tiempo que pasa en cada fase despus de una transferencia es muy irregular, y depende de
que gane accidentalmente la suficiente energa trmica del medio para que se produzca la
transferencia inversa y de la afinidad que tenga con la fase estacionaria quedando all retenida
ms tiempo y tardando ms tiempo en pasar a la fase mvil, y al final de la columna, llegar al
detector.
La anchura de una banda aumenta a medida que se mueve a travs de la columna,
debido a que cuanto ms tiempo transcurre mayor es la dispersin que puede tener lugar. Por
ello, la anchura de la zona est relacionada directamente con el tiempo de residencia en la
columna, e inversamente con la velocidad a la que fluye la fase mvil.
Eficiencia de la columna:
Dos trminos afines se utilizan con frecuencia como medidas cuantitativas de la eficiencia de
una columna cromatogrfica: a) la altura de plato H y b) el nmero de platos tericos N.
Los dos estn relacionados por la ecuacin: N = L/H donde L es la longitud (normalmente en
centmetros, si es cromatografa lquida y en metros si es cromatografa gaseosa) del relleno
de la columna.
La eficiencia de la columna cromatogrfica aumenta cuanto mayor es el
nmero de platos tericos y cuanto menor es la altura de platos tericos
Relacin entre la altura de plato y las variables que afectan la eficiencia de la columna:
La eficiencia de las columnas cromatogrficas puede evaluarse por la expresin:
H = B/u + Csu + CMu (1)
H = A + B/u + Cu
(Ecuacin de Van Demmter)
donde H es la altura de plato en centmetros y u es la velocidad lineal de la fase mvil en

centmetros por segundo. Las magnitudes A, B y C son constantes, que se relacionan
con las propiedades de la columna y del analito.
A= coeficiente de difusin aparente o de caminos mltiples
B= coeficiente de difusin longitudinal
C= coeficiente de difusin por transferencia de masa
1. Difusin aparente o caminos mltiples (A): es ocasionada por la multitud de
caminos de diferente longitud, creados dentro del empaque de la columna. As,
dependiendo del camino tomado por las partculas, stas llegan al final de la columna a
diferentes tiempos por cual ensanchan los picos cromatogrficos. Aumenta este factor
al aumentar el flujo de la fase mvil.
2. Difusin longitudinal (B/u): Es una causa del ensanchamiento de banda por la que
los analitos difunden desde la zona ms concentrada en el centro de la banda hacia las
regiones ms diluidas por delante y por detrs del centro de la banda es decir, en el
mismo sentido y en el opuesto a la direccin del flujo de la fase mvil.
La contribucin de la difusin longitudinal resulta ser inversamente proporcional a la
velocidad de la fase mvil. Esta correlacin no es sorprendente puesto que, cuanto
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ms alto es el caudal, ms breve es el periodo de tiempo que el analito reside en la

columna. As, la difusin desde el centro de la banda hacia los extremos tiene menos
tiempo para poder producirse.
3. Coeficientes de transferencia de masa (CS y CM): La necesidad de introducir las dos
constantes de transferencia de masa CS y CM en la ecuacin (1), se debe a que el
analito requiere un cierto tiempo para transferirse entre las fases mvil y estacionaria.
Cuando el caudal es demasiado rpido, no puede alcanzarse el equilibrio.
Optimizacin de la eficiencia de una columna:
Una separacin cromatogrfica se optimiza variando las condiciones experimentales hasta que
los componentes de una mezcla se separan totalmente en el menor tiempo posible. Los experimentos de optimizacin tienen como objetivo bien (a) reducir el ensanchamiento de zona, o
bien (b) modificar las velocidades relativas de migracin de los componentes. Las variables
cinticas que incrementan la altura de plato de una columna producen un ensanchamiento de
banda. Por otra parte, las velocidades de migracin son modificadas por aquellas variables
que afectan a los factores de capacidad y selectividad de la solucin.
e.
Resolucin de la columna: La resolucin RS de una columna constituye una medida

cuantitativa de su capacidad para separar dos analitos. Se expresa como:
RS = 2 [(tR)B (tR)A]
W A + WB
A partir de la figura 3 se observa que una resolucin de 1,5 permite una separacin
esencialmente completa de los dos componentes, mientras que no es as con una
resolucin de 0,75. Con una resolucin de 1,0 la zona de A contiene aproximadamente
un 4 % de B, y la zona de B contiene una cantidad similar de A.
Con una resolucin de 1,5 el solapamiento es del orden de un 0,3 %.
Para una fase estacionaria dada, la resolucin puede mejorarse alargando la columna,
aumentando as el nmero de platos. Sin embargo, una consecuencia adversa del
aumento del nmero de platos es un aumento del tiempo necesario para la separacin.
Fig. 3: Separaciones correspondientes a tres resoluciones distintas

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Aplicaciones de la cromatografa
La cromatografa ha pasado a ser el principal mtodo para la separacin de especies
qumicas estrechamente relacionadas entre s. Adems, se puede emplear para la
identificacin cualitativa y para la determinacin cuantitativa de las especies separadas. Se
considerarn algunas de las caractersticas generales de la cromatografa como una
herramienta para el anlisis.
- Anlisis cualitativo: Un cromatograma proporciona slo una parte de la informacin
cualitativa correspondiente a las especies de la muestra a saber, su tiempo de retencin o su
posicin en la fase estacionaria tras un cierto perodo de elucin.
Se emplea para reconocer la presencia o ausencia de componentes en mezclas que
contengan un nmero limitado de posibles especies de las que se conozca su identidad. Por
ejemplo, si en la muestra no aparece un pico con el mismo tiempo de retencin que el
estndar en las mismas condiciones, se puede asumir que el compuesto en cuestin est
ausente (o est presente a una concentracin por debajo del lmite de deteccin del
procedimiento).
- Anlisis cuantitativo: La cromatografa debe su crecimiento espectacular durante las
pasadas cuatro dcadas en parte a su rapidez, simplicidad, bajo costo, y a su gran
aplicabilidad como herramienta de separacin.
La cromatografa en columna cuantitativa se basa en la comparacin de la altura, o del
rea, del pico del analito con la de uno o ms estndares. En cromatografa plana, el rea
cubierta por las especies separadas sirve como parmetro analtico. Si se controlan las condiciones adecuadamente, esos parmetros varan linealmente con la concentracin.
Anlisis basados en las reas de pico

El rea de pico es independiente de los efectos del ensanchamiento. Desde este punto de
vista, las reas son un parmetro analtico ms adecuado que las alturas de pico.
Los instrumentos cromatogrficos ms modernos estn equipados con integradores
electrnicos digitales, los cuales permiten una precisa estimacin de las reas de pico.
Calibracin y patrones
El mtodo ms sencillo para el anlisis cromatogrfico cuantitativo implica la preparacin
de una serie de disoluciones de patrn de composicin igual a la de la muestra. A
continuacin se obtienen los cromatogramas de los patrones y se representan las alturas
o reas de pico en funcin de la concentracin. La representacin de los datos debera
originar una lnea recta que pasara por el origen de coordenadas; los anlisis se basan en
esta grfica. Para una mayor exactitud es necesaria una reestandarizacin frecuente.
El mtodo del estndar interno

En cromatografa cuantitativa la mayor precisin se consigue por el uso de patrones internos debido a que se evitan las incertidumbres que se introducen en la inyeccin de la
muestra. En este procedimiento, se introduce en cada estndar y en la muestra una
cantidad exactamente medida de una sustancia estndar interno, y la relacin de las
reas (o alturas) del analito y del estndar interno sirve como parmetro analtico. Para
poder aplicar este mtodo, es necesario que el pico del estndar interno est bien
separado de los picos de los dems componentes de la muestra (R S > 1,5); por otra parte,
el pico del estndar debera aparecer cerca del pico del analito. Con un estndar interno
adecuado, se pueden conseguir precisiones mejores que el 1 % relativo.
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El mtodo de la normalizacin de reas

Otro procedimiento que evita las incertidumbres asociadas con la inyeccin de la muestra
es el mtodo de la normalizacin de reas. Se requiere la elucin completa de todos los
componentes de la muestra.
En el mtodo de la normalizacin, se determinan las reas de todos los picos eluidos; tras
corregir esas reas debido a las diferencias en la respuesta del detector a los distintos
tipos de compuestos, la concentracin del analito se calcula por la relacin de su rea con
el rea total de los picos.
Resumen de las ecuaciones de inters en cromatografa
El nmero de parmetros, trminos y ecuaciones que se emplean en cromatografa es
grande y a menudo confuso. En las tablas 2 y 3 se resumen las ecuaciones y definiciones ms
importantes que se utilizarn.
TABLA 2. Parmetros cromatogrficos experimentales, smbolos y su forma de
determinacin
Nombre
Smbolo del
parmetro
Determinacin
Experimental
tM
Cromatograma
(tR )A , (tR )B
Cromatograma
(tR )A
W A, W B
L
F
(tR )B = (tR )A / t M
Tiempo de migracin, especies no retenidas

Tiempos de retencin, especies A y B
Tiempo de retencin ajustado especie A
Anchuras de pico, especies A y B
Longitud del relleno de columna
Caudal
Volumen de la fase estacionaria
VS
Concentracin del analito en la fase mvil y

estacionaria
CM, CS
Cromatograma
Medida directa
Medida directa
Datos de preparacin
del relleno
Datos del anlisis y de
la preparacin
TABLA 3. Nombre, clculo y relaciones entre parmetros

Nombre
Clculo
Relacin con otros parmetros
Velocidad lineal de la fase mvil:

Volumen de fase mvil:
Factor de capacidad, o razn de reparto:
Coeficiente de distribucin:
Factor de selectibidad :
Resolucin:
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Nmero de platos:
Altura del plato:
Tiempo de retencin:
Volumen de retencin:
CROMATOGRAFA GASEOSA (GC)

En la cromatografa de gases, los componentes de una muestra vaporizada se separan
como consecuencias de su reparto entre una fase mvil gaseosa y otra fase estacionaria
lquida o slida mantenida en una columna. La muestra se vaporiza y se inyecta en la cabeza
de una columna cromatogrfica. La elucin se logra mediante el flujo de una fase mvil de gas
inerte. Son dos tipos de cromatografa de gases, la cromatografa gas - lquido y la
cromatografa gas - slido. La primera es de amplio uso y suele abreviarse GC y se basa en el
reparto del analito entre una fase mvil gaseosa y una fase lquida inmovilizada sobre la
superficie de un slido inerte o en las paredes del tubo capilar.
Los componentes bsicos de un instrumento de GC caracterstico se describirn a
continuacin:
Gas portador
Entre los gases portadores, que deben ser qumicamente inertes, se encuentran el helio,
argn, nitrgeno, dixido de carbono y el hidrgeno.
Como se indicar posteriormente, la eleccin del gas est con frecuencia determinada por
el tipo de detector que se utiliza. Con el suministro del gas se encuentran asociados los
reguladores de presin, manmetros y medidores de flujo. Adems, el sistema de gas
portador contiene generalmente un tamiz molecular para eliminar el agua u otras
impurezas.
Fig. 4: Representacin esquemtica de un cromatgrafo de gases.
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Sistema de inyeccin de muestra

La eficacia de la columna requiere que la muestra sea de un tamao adecuado y que sea
introducida como un tapn de vapor; la inyeccin lenta de muestras demasiado grandes
provoca un ensanchamiento de las bandas y una mala resolucin.
El mtodo ms comn de inyeccin de muestra implica el uso de una microjeringa para
inyectar una muestra lquida o gaseosa a travs de un diafragma o septum de goma de
silicona, en una cmara de vaporizacin instantnea situada en la cabeza de la columna
(la cmara de muestra normalmente est a 50C por encima del punto de ebullicin del
componente menos voltil de la muestra).
Para las columnas analticas ordinarias, el tamao de muestra vara desde unas pocas
dcimas de microlitro a 20L. las columnas capilares exigen muestras mucho menores
(10-3L); en estos casos se emplea un divisor de la muestra que permite pasar a la
columna solamente una pequea fraccin de la muestra, desechndose el resto.
Configuraciones de columna y hornos
Las columnas cromatogrficas varan desde menos de 2 a 50 m, o ms. Se construyen de
acero inoxidable, vidrio, slice fundida, o tefln. A fin de poder colocarse en el interior de un
termostato, normalmente se configuran como helicoides con dimetros de 10 a 30 cm.
La temperatura de la columna es una variable importante que para un trabajo preciso ha
de regularse a las dcimas de grado, por ello la columna normalmente se introduce dentro
de un horno termostatizado. La temperatura ptima de la columna depende del punto de
ebullicin de la muestra y del grado de separacin requerido. En la prctica, con una
temperatura igual o ligeramente superior al punto de ebullicin promedio de la muestra, se
obtienen tiempos de elucin razonables (2 a 30 min).
Para muestras con un amplio intervalo de ebullicin, a menudo es conveniente emplear
una programacin de temperatura, con lo que se aumenta la temperatura de la columna
bien de forma continua, bien por etapas, al mismo tiempo que tiene lugar la separacin.
En general, la resolucin ptima se asocia con una menor temperatura; sin embargo, la
consecuencia de una reduccin de temperatura es un aumento en el tiempo de elucin, y
por tanto del tiempo que se necesita para completar un anlisis.
Es importante que todas las partes del cromatgrafo gaseoso mantengan una temperatura
bastante elevada, para mantener la muestra al estado gaseoso (voltil). El puerto de
inyeccin de muestra (septum) es el que est a mayor temperatura para volatilizar
rpidamente la muestra.
En cromatografa de gases se usan dos tipos generales de columnas:
a) las empaquetadas o de relleno: Las actuales columnas de relleno se fabrican con
tubo de vidrio, metal (acero inoxidable, cobre, aluminio), o de Tefln, con una longitud
caracterstica de 2 a 3 m y un dimetro interno de 2 a 4 mm.
b) las tubulares o capilares: Las columnas capilares de slice ms frecuentemente

utilizadas tienen dimetros internos de 320 y 250 m. Tambin se venden columnas de
alta resolucin, con dimetros de 200 y 150 m. La utilizacin de estas columnas es
ms problemtica y son ms exigentes con respecto a los sistemas de deteccin y de
inyeccin. Por ejemplo, se ha de utilizar un divisor de muestra para reducir el tamao
de la muestra inyectada en la columna, y se requiere un sistema de deteccin ms
sensible con un tiempo de respuesta rpido. Recientemente, han aparecido en el
mercado capilares de 530 m, a veces llamados columnas macrocapilares, las cuales
admiten muestras de tamao similar a los empleados en las columnas de relleno. Las
caractersticas de las columnas macrocapilares no son tan buenas como las columnas
de menor dimetro, pero son significativamente mejores que en las columnas de relleno
Detectores
En cromatografa de gases, un detector ideal tiene las siguientes caractersticas:
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1. Adecuada sensibilidad. Lo que constituye una adecuada sensibilidad no se puede

evaluar de forma cuantitativa. Por ejemplo, las sensibilidades de los detectores que se
van a describir difieren por un factor 10 7. Aunque todos se utilizan extensamente y son
adecuados en ciertos casos; sin embargo, en algunas aplicaciones los menos sensibles
no resultan convenientes. En general, las sensibilidades de los detectores actuales se
encuentran en el intervalo de 10-8 a 10-15 g de analito/s.
2. Buena estabilidad y reproducibilidad.
3. Una respuesta lineal para los analitos que se extiendan a varios rdenes de magnitud.
4. Un intervalo de temperaturas de trabajo comprendido desde la temperatura ambiente
hasta al menos 400 C.
5. Un tiempo de respuesta corto que lo haga independiente del caudal.
6. Alta fiabilidad y manejo sencillo. Hasta el punto de estar a prueba de la impericia de
operadores inexpertos.
7. Respuesta semejante para todos los analitos, o por el contrario, una respuesta
selectiva y altamente predecible para una o ms clases de analitos.
8. No destructivo de la muestra.
De hecho, no hay detector que rena todas las caractersticas, y tampoco parece probable
que pueda llegar a disearse nunca.
Se describirn los utilizados ms frecuentemente.
a) De ionizacin de llama: (FID) es uno de los ms extensamente utilizados. Es
insensible a los gases no combustibles como H2O, CO2, SO2 y NO2. Se usa para el
anlisis de la mayora de compuestos orgnicos, incluyendo aquellos que estn
contaminados con agua y con xidos de nitrgeno y de azufre.
Posee una elevada sensibilidad (10-13 g/s), un gran intervalo lineal de respuesta (107),
y un bajo ruido. Por lo general, es resistente y fcil de utilizar. Una desventaja es que es
destructivo de la muestra.
b) De conductividad trmica (TCD): Uno de los primeros detectores que se utilizaron en
cromatografa de gases, y uno de los que todava tiene una gran aplicacin, se basa en
los cambios en la conductividad trmica de la corriente de gas ocasionados por la
presencia de las molculas de analito.
Las conductividades trmicas del helio y del hidrgeno son aproximadamente de seis a
diez veces mayores que las de la mayora de los compuestos orgnicos, de modo que,
incluso en presencia de pequeas cantidades de materia orgnica, tiene lugar una
disminucin relativamente grande de la conductividad trmica del efluente de la
columna y, en consecuencia, el detector experimenta un marcado aumento en la
temperatura. Las conductividades de los otros gases portadores son parecidas a las de
los constituyentes orgnicos y por esta razn con un detector de conductividad trmica
debe usarse hidrgeno o helio como gas portador.
Las ventajas son su simplicidad, su amplio rango dinmico lineal (105), su respuesta
universal tanto a especies orgnicas como a inorgnicas y su carcter no destructivo, lo
que permite recoger los solutos tras la deteccin. Una limitacin es su sensibilidad
relativamente baja (10-8 g de soluto/mL de gas portador). Otros detectores son de 10 4
a 107 veces ms sensibles. Debera subrayarse que la baja sensibilidad, hace imposible
con frecuencia su utilizacin con columnas capilares, debido al pequeo tamao de
muestra con el que estas columnas operan.
c) Termoinico (TID): es un detector selectivo de los compuestos orgnicos que
contienen fsforo y nitrgeno. Su respuesta a un tomo de fsforo es aproximadamente
10 veces mayor que a un tomo de nitrgeno, y de 10 4 a 106 veces superior que a un
tomo de carbono. En comparacin con el detector de ionizacin de llama, el detector
termoinico es unas 500 veces ms sensible para los compuestos que contienen
fsforo y unas 50 veces ms sensible a las especies nitrogenadas. Estas propiedades
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hacen de la deteccin termoinica un sistema particularmente til para la deteccin y

determinacin de muchos pesticidas que contienen fsforo.
d) De captura de electrones: (CE) El detector de captura de electrones es de gran
respuesta selectiva, siendo muy sensible a las molculas que contienen grupos
funcionales electronegativos tales como halgenos, perxidos, quinonas; en cambio, no
es sensible a grupos funcionales como aminas, alcoholes e hidrocarburos. Una
aplicacin importante es la deteccin y determinacin de insecticidas clorados.
e) Fotomtrico: Es selectivo y muy sensible a los compuestos que contienen azufre y
fsforo, se ha utilizado extensamente para el anlisis de contaminantes del aire y del
agua como los pesticidas y los hidrocarburos.
CROMATOGRAFA LQUIDA DE ALTA RESOLUCIN (HPLC)

Existen cuatro tipos bsicos de cromatografa en los que la fase mvil es un lquido:
(1) cromatografa de reparto;
(2) cromatografa de adsorcin, o lquido-slido;
(3) cromatografa inica;
(4) cromatografa de exclusin por tamaos, o en geles.
En las primeras etapas del desarrollo de la cromatografa de lquidos, los cientficos se
dieron cuenta que se podan conseguir grandes aumentos en la eficacia de la columna
disminuyendo el tamao de las partculas de los rellenos. Sin embargo, no fue sino hasta
finales de los aos sesenta cuando se desarroll la tecnologa adecuada para producir y
utilizar rellenos de tamao de partcula del orden de los 3 o 10 m. Esta tecnologa requiere
una instrumentacin sofisticada, que contrasta con las simples columnas de vidrio de la
cromatografa de lquidos clsica.
Con objeto de alcanzar un caudal de eluyente razonable con rellenos de tamao de
partcula entre 3 y 10 m, que, por otra parte, son comunes en la moderna cromatografa de
lquidos; se requieren presiones de algunos cientos de kilos por centmetro cuadrado. Como
consecuencia de estas elevadas presiones, el equipo necesario para la HPLC tiende a ser ms
sofisticado y caro que el que se utiliza en otros tipos de cromatografa. La Figura 5 muestra un
esquema de los componentes fundamentales de un cromatgrafo de lquidos de alta
resolucin tpico.
Fig. 5: Esquema de un equipo de HPLC

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Fase ,mvil:
Los disolventes ms usados son: hexano, cloruro de metileno, isopropanal, cloroformo,
acetonitrilo, metanal, agua.
Un aparato moderno de HPLC se equipa con uno o ms recipientes de vidrio o de acero
inoxidable, cada uno de los cuales contiene unos 500 mL de un disolvente. Los recipientes
a menudo se equipan con un sistema para eliminar los gases disueltos -en general
oxigeno y nitrgeno- que interfieren formando burbujas en los sistemas de deteccin. Un
desgasificador puede consistir en un sistema de bombeo por vaco. Con frecuencia estos
sistemas tambin contienen un dispositivo para la filtracin del polvo y de las partculas
slidas en suspensin de los disolventes. Por ejemplo, una forma conveniente de tratar los
disolventes antes de introducirlos en el recipiente, consiste en filtrarlos mediante el vaco a
travs de un filtro de poro muy pequeo. Este tratamiento elimina los gases adems de la
materia en suspensin.
Una separacin que utiliza un solo disolvente de composicin constante se denomina una elucin isocrtica.
Con frecuencia, la eficiencia de la separacin se aumenta notablemente por una elucin
con gradiente. En este caso se utilizan dos (y a veces ms) disolventes con una polaridad
significativamente distinta. Una vez que comienza la elucin, se vara la relacin de los
disolventes de forma programada, a veces continuamente y a veces mediante una serie de
etapas escalonadas.
Los instrumentos modernos de HPLC estn equipados con unos dispositivos que
permiten introducir los disolventes desde dos o ms recipientes en una cmara de mezcla
a una velocidad que varia continuamente y la relacin de volumen de los disolventes se
puede modificar lineal o exponencialmente con el tiempo.
La elucin con gradiente acorta notablemente el tiempo de separacin sin sacrificar la
resolucin de los primeros picos. Tambin tiene efectos similares a los producidos por la
programacin de temperaturas en cromatografa de gases.
Bombas:
Se utilizan tres tipos de bombas, cada una con sus propias ventajas y desventajas: bombas
recprocas,
bombas de jeringa o de desplazamiento y bombas neumticas o de presin constante.
Generalmente se usan las recprocas o de pistn que desplazan flujos de volumen
constante en forma.
Inyeccin de muestra
A menudo, el factor limitante en la precisin de las medidas en cromatografa de lquidos
es la reproducibilidad con que se puede introducir la muestra en la columna. El problema se
agrava por el ensanchamiento de banda que acompaa a la sobrecarga de las columnas.
Por ello, los volmenes que se emplean han de ser muy pequeos - de unas pocas
dcimas de microlitro, a tal vez 500m. Adems, se ha de poder introducir la muestra sin
despresurizar el sistema.
El mtodo ms ampliamente utilizado para la introduccin de la muestra es con bucles .
Estos dispositivos estn normalmente integrados en el equipo cromatogrfico y hay bucles
intercambiables que permiten la eleccin de tamaos de muestra desde 5 a 500 m, a
presiones de hasta 7000 psi con una precisin relativa de unas dcimas por ciento.
Tambin existen vlvulas de inyeccin de micromuestras, con bucles con volmenes de
0,5 a 5 m.
Columnas :
Las columnas son generalmente de acero inoxidable de dimetro interno uniforme, aunque
en algunas ocasiones se encuentran tubos de vidrio de paredes resistentes. Estas ltimas slo
se utilizan a presiones menores de unos 600 psi., tienen una longitud entre 10 y 30 cm. Por lo
comn, las columnas son rectas y se pueden alargar, si es necesario, acoplando dos o ms
columnas.
Los tpicos reIlenos de partculas porosas estn formados por micropartculas porosas con
dimetro entre 3 y 10 m. Las partculas son de slice, almina o de una resina de intercambio
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inico, aunque la slice es el material ms comn se recubren muchas veces con pelculas
orgnicas, que se unen qumica o fsicamente a la superficie.
Precolumnas: En muchas ocasiones, para aumentar la vida de la columna analtica, se coloca
delante una precolumna que elimina la materia en suspensin y los contaminantes de los disolventes.
Termostatos: En muchas aplicaciones no se necesita un control estricto de la
temperatura, y las columnas trabajan a temperatura ambiente. Sin embargo, muchas veces si
se controla la temperatura de la columna en unas pocas dcimas de grado centgrado, se
obtienen mejores cromatogramas. La mayora de los instrumentos comerciales llevan
actualmente hornos para las columnas que controlan la temperatura de la columna a las dcimas de grado, desde la temperatura ambiente hasta 150 C.
Detectores:
A diferencia de la cromatografa de gases, en la cromatografa de lquidos no hay
detectores tan aplicables universalmente ni tan fiables como los detectores de ionizacin
de llama y de conductividad trmica. Uno de los mayores retos en el desarrollo de la
cromatografa de lquidos ha sido el perfeccionamiento de los detectores.
Un detector ideal para cromatografa de lquidos debera poseer todas las propiedades
listadas en relacin con la cromatografa de gases, con la excepcin de que un detector
para cromatografa de lquidos no es necesario que sea sensible en un intervalo tan
grande de temperaturas. Adems, debe tener un volumen interno mnimo a fin de reducir
el ensanchamiento de banda.
Los detectores son de dos tipos
Los detectores basados en una propiedad de la disolucin: responden a una propiedad de
la fase mvil, tal como el ndice de refraccin, la constante dielctrica, o la densidad,
que se modifican por la presencia de los analitos.
Los detectores basados en una propiedad del soluto: responden a algunas
propiedades del soluto, como la absorbancia UV, fluorescencia, o intensidad de
difusin, que no son propias de la fase mvil.
a) Detectores de ultravioleta : Los detectores de absorcin UV ms simples son los
fotmetros de filtros con una lmpara de mercurio como fuente. Lo ms comn en estos
casos es aislar la lnea intensa a 254 nm por medio de filtros; en algunos equipos
tambin se pueden utilizar las lneas a 250, 313, 334 y 365 nm empleando otros filtros,
que este tipo se utiliza de forma restringida para aquellos solutos que absorben a
alguna de estas longitudes de onda. Como se ha indicado algunos grupos funcionales
orgnicos y diversas especies inorgnicas exhiben una banda ancha de absorcin a
una o ms de esas longitudes de onda.
b) Detectores de fluorescencia:Una ventaja inherente es su alta sensibilidad, que resulta
ser ms de un orden de magnitud mayor que la de los sistemas de absorbancia. Se ha
aprovechado esta ventaja para la separacin y determinacin de los componentes
fluorescentes de las muestras. relacionados con el anlisis de materiales farmacuticos,
productos naturales, muestras clnicas y productos del petrleo.
c) Detectores de ndice de refraccin: Tienen la ventaja de que responden a casi todos
los solutos.
Es decir, son detectores universales anlogos a los detectores de llama en
cromatografa de gases. Adems son fiables y no dependen del caudal. Sin embargo,
son muy sensibles a los cambios de temperatura y se han de mantener a una
temperatura constante en unas pocas milsimas de grado centgrado. Por otra parte, no
son tan sensibles como la mayora de los otros detectores y por lo general no se
pueden utilizar en la elucin con gradiente.
d) Detectores electroqumicos: Los fabricantes de instrumentos proporcionan en la
actualidad varios tipos de detectores electroqumicos que se basan en la oxidacin o
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reduccin de 16 grupos funcionales orgnicos. Por tanto, la deteccin electroqumica

parece poder cubrir una necesidad que largo tiempo ha tenido la HPLC, que es la de
disponer de un detector general o universal sensible.
Aplicacin de HPLC
Es incuestionable que la cromatografa de lquidos de alta resolucin es la tcnica de
separacin ms ampliamente utilizada. Las razones son su sensibilidad, su fcil adaptacin a
las determinaciones cuantitativas exactas, su idoneidad para la separacin de especies no
voltiles o termolbiles y, sobre todo, su gran aplicabilidad a sustancias que son de primordial
inters en la industria, en muchos campos de la ciencia y para la sociedad en general.
Algunos ejemplos de estos materiales incluyen los aminocidos, protenas, cidos
nucleicos, hidrocarburos, carbohidratos, drogas, terpenoides, plaguicidas, antibiticos
esteroides, especies organometlicas y una cierta variedad de sustancias inorgnicas.
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GUA TERICA
INTRODUCCIN A LA SEPARACIONES CROMATOGRFICAS
1) Explique el fundamento de una tcnica cromatogrfica.
2) Complete el siguiente cuadro:

Clasificacin general
Mtodo especfico
Fase estacionaria
Tipo de equilibrio
Cromatografa de
lquidos
(LC)
Fase mvil: lquida
Cromatografa de gases
(GC)
Fase mvil: gas
3) Qu es una elucin cromatogrfica?
4) Qu es y para qu sirve un cromatograma?
5) Defina los siguientes trminos:

Constante de distribucin:
Tiempo de retencin (tR):
Tiempo muerto (tm):

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Factor de retencin o factor capacidad (k):
Factor de selectividad ():
Resolucin (Rs):
Inyector
6) Complete el siguiente cuadro estableciendo las diferencias entre las diferentes tcnicas
cromatogrficas:
CROMATOGRAFA GASEOSA
CROMATOGRAFA LQUIDA
Fase mvil
Volumen de
inyeccin
Jeringas
Temperatura
Columnas
Descripcin
Tamao
(long., diam.
Interno)
Fase
estacionaria
Temperatura
Detectores
Caractersticas de
los analitos
Aplicaciones
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TRABAJO PRCTICO N 4
CROMATOGRAFA
Introduccin
Las tcnicas cromatrogrficas son tcnicas de separacin. Tienen como finalidad la
separacin de mezclas de solutos que, disueltas en un solvente, son fraccionadas en sus
distintos componentes, en funcin de la diferente afinidad de stos por dos fases.
La separacin cromatogrfica se produce entre dos fases: la fase mvil, un flujo lquido o
gaseoso en el cual estn los solutos que se van a separar, y la fase estacionaria, que es el
lecho a travs del cual va a fluir la fase mvil, la fase estacionaria puede ser un slido inerte o
una fina partcula de lquido que pinta la columna.
Los distintos componentes de la mezcla se van a separar en funcin de su distribucin entre
la fase mvil y la fase estacionaria, en virtud de un proceso en equilibrio. De esta forma, un
compuesto que tenga ms afinidad que otro por la fase estacionaria, se retrasar en su avance
a travs de sta ms que aquel que tiene menor afinidad, que la atravesar antes. El reparto
entre las fases se fundamenta en las diferencias fsicas y/o qumicas de los componentes de la
muestra.
Una vez que todos los componentes de la mezcla han atravesado la fase estacionaria, salen
separados unos de otros, lo cual puede ser empleado con fines de identificacin, cuantificacin
o concentracin, para posteriores estudios.
Clasificacin: Las tcnicas cromatogrficas se han clasificado generalmente de acuerdo

con las caractersticas fsicas de las fases mvil y estacionaria.
Segn estas caractersticas se denominan las diferentes tcnicas, de manera que en la definicin se
incluye la naturaleza de ambas fases. La naturaleza de la fase mvil puede ser: Lquida, Gaseosa la
naturaleza de la fase estacionaria puede ser: Slida, Lquida
Tambin se pueden clasificar las tcnicas por el mecanismo fsico que lleva a la separacin
de los solutos entre las dos fases. Estos mecanismos son: Adsorcin, Particin, Intercambio
inico, Exclusin molecular, afinidad.
La cromatografa de gases siempre se lleva a cabo en columnas, mientras que la
cormatografa lquida se puede realizar sobre soportes planos (capa fina, papel) o sobre
columnas.
Formas de cromatografa: La ejecucin de la tcnica se puede llevar a cabo mediante el

empleo de distintas formas de soportes inertes sobre los que actuarn las fases de separacin,
dando lugar a: Cromatografa en papel, capa fina o en columna.
Cromatografa en papel: El soporte es plano, y consiste en una hoja de papel de celulosa de
elevada pureza.
La hoja de papel se encuentra recubierta de una capa de agua asociada a las fibras de
celulosa, que es la que constituye la fase estacionaria; vemos, por tanto, que la fase
estacionaria de esta cromatografa es lquida.
La fase mvil, en la que ir disuelta la muestra, es lquida tambin, y est formada por
solventes cuya naturaleza (polaridad) se elige en funcin de los componentes que se
pretenden separar. Esta es, por tanto, una cromatografa lquido Ilquido.
Cromatografa en capa fina: El soporte es plano, y consiste en una capa muy fina de
partculas situadas sobre una placa que suele ser de vidrio. Las placas se fabrican
depositando una suspensin uniforme de partculas sobre la placa de vidrio, que
posteriormente se seca y se activa por accin del calor.
La fase estacionaria est constituida por partculas slidas adheridas al vidrio generalmente
de gel de slice es, por tanto, slida.
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La fase mvil es lquida, y est formada por solventes de polaridad que va en funcin de la de
la fase slida estacionaria. Esta es, por tanto, una cromatografa lquido I slido. La corrida
cromatogrfica se realiza dentro de una cubeta que contiene el solvente y el vidrio.
Cromatografa en columna:
Como se puede observar en el esquema anterior, los mtodos en columna se emplean para
varios tipos de cromatografa. Se emplea tanto para cromatografa lquida como para
cromatografa gaseosa, y tanto con fases estacionarlas liquidas como solidas.
Dependiendo de la naturaleza de las fases mvil y estacionaria, los mecanismos en virtud de
los cuales se producen la separacin son de dos tipos: adsorcin, cuando la fase estacionaria
es slida, y particin, cuando la fase estacionaria es lquida.
Las columnas con las que se trabaja en estas cromatografas estn formadas por un tubo de
longitud y ancho variables que lleva empaquetado en su interior un soporte slido. Este
soporte slido puede ser la propia fase estacionaria, o bien ir asociado a un lquido que
constituye la fase estacionaria.
La fase mvil es un solvente que se hace pasar a travs de la columna en la cromatografa
lquida, o un gas en la cromatografa gaseosa.
La muestra se introduce en la columna junto con la fase mvil. Las fases mvil y estacionaria
se encuentran en equilibrio, de manera que la separacin de los componentes de la muestra
se lleva a cabo por su distribucin entre las dos fases.
Despus de la separacin en la columna, los componentes de la muestra son eludos fuera
de sta, de forma que se obtienen distintas fracciones de fase mvil que contienen
concentraciones aumentadas de los distintos componentes.
Se efectan lecturas sobre el eludo que se va obteniendo, de manera que se tiene un
registro en el cual los diferentes componentes se detectan separados entre s con distinto
ancho y altura dependientes de su concentracin y de la eficacia de la separacin. En la
actualidad, las tcnicas de cromatografa en columna ms empleadas son:
a) Cromatografa lquida de alta resolucin (HPLC): Emplea instrumentos relativamente
complicados, y mediante la impulsin controlada del solvente con la muestra o por medio de
una bomba, consigue separaciones en tiempos cortos, del orden de minutos, que con la
cromatografa lquida en columna tradicional eran del orden de horas o das. El desarrollo de
soportes nuevos para las fases slidas la han hecho cada vez de mayor aplicacin
b) Cromatografa de gases (CG): La fase mvil es un gas portador proveniente de un tanque a
presin. En el gas se inyecta la muestra y la mezcla pasa por la columna, todos los
compartimentos del cromatografo gaseoso se encuentran a alta temperatura para mantener
siempre voltil la muestra que se encuentra incluida un horno para columna cuya funcin es
mantener volatilizada la muestra.
Fundamentos de la separacin cromatogrfica: En la mayora de las tcnicas actualmente
empleadas, las sustancias son eluidas, es decir, se arrastran hasta que salen del sistema
apareciendo en distintos tiempos o volmenes del eluyente en comparacin con tiempos o
volmenes de referencia.
- Cromatograma:
Es la representacin grfica de una corrida cromatogrfica.
Se obtiene graficando tiempo en abscisas y seal del detector en ordenadas. Los principales
parmetros que se obtienen de un cromatograma son los siguientes:
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tiempo cero (to) es el tiempo que demora en recorrer la columna hasta llegar al detector slo la
fase mvil.
tiempo de retencin de cada compuesto (tr) es el tiempo que demora cada compuesto en
llegar al detector. Es el que nos permite identificar a cada compuesto.
rea del pico cromatogrfico nos representa la concentracin del compuesto .
- Parmetros que se deben conocer para manejar estas separaciones:
Velocidad de migracin de las especies: La efectividad de una columna cromatogrfica para
separar dos analitos depende, en parte, de las velocidades relativas con las que eluyen las dos
especies. Esas velocidades estn determinadas por la magnitud de las constantes de los
equilibrios de distribucin de las especies entre las fases estacionaria y mvil.
f.
Constante de distribucin (K): Los equilibrios de distribucin implicados en

cromatografa se describen por ecuaciones que suponen la transferencia de un analito
entre las fases estacionaria y mvil. As, para la especie analito A, se puede escribir
A mvil A estacionaria
La constante K para este equilibrio se denomina constante de distribucin, razn de
distribucin o coeficiente de distribucin, y se expresa como:
K= Cs / CM
Cs : es la concentracin molar del analito en la fase estacionaria

CM : es la concentracin molar en la fase mvil
Idealmente, el coeficiente de distribucin es constante en un amplio intervalo de

concentraciones; de este modo, Cs es directamente proporcional a CM. La cromatografa
en la que es aplicable la ecuacin anterior, se denomina cromatografa lineal.
g.
Tiempo de retencin (tR): es el tiempo que transcurre desde de la inyeccin de la

muestra hasta que el pico del analito alcance el detector. En la figura 2 se denomina
tiempo muerto (tM), al tiempo que emplea la fase mvil para llegar al detector.
La velocidad de migracin de la especie no retenida coincide con la velocidad promedio
del movimiento de las molculas de la fase mvil.
La velocidad lineal media de la migracin del analito es:
donde L es la longitud del relleno de la columna. De manera semejante, la velocidad
lineal media del movimiento u de las molculas de la fase mvil es:
u = L / tM
Fig 2: Cromatograma caracterstico de una mezcla de dos componentes. El pico pequeo de la izquierda representa
una especie que no se retiene en la columna y alcanza el detector inmediatamente despus de la elucin.
h.
La velocidad de migracin del soluto; factor de capacidad (k): Se utiliza para describir
las velocidades de migracin de los analitos en las columnas. Para una especie A, el
factor de capacidad kA se expresa como:
kA = KA VS
VM
k= tr tM
tM donde tR y tM se pueden obtener a partir de un cromatograma.
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Cuando el factor de capacidad para una especie es mucho menor que la unidad, la
elucin tiene lugar tan rpidamente que es difcil determinar con exactitud los tiempos de
retencin. Cuando el factor de capacidad es del orden de 20 a 30 o tal vez mayor, los
tiempos de retencin son demasiado largos. Idealmente, las separaciones se realizan en
unas condiciones en las que los factores de capacidad para las especies de una mezcla
oscilan entre 1 y 5.
i.
Velocidad de migracin diferencial; factor de selectividad (): El factor de selectividad

de una columna para dos especies A y B se expresa como:
= KB
KA
donde KB es la constante de distribucin para la especie ms fuertemente retenida B, y
KA es la constante de distribucin para la menos retenida, la especie A, (o que eluye con
ms rapidez),. Con esta definicin siempre es mayor que la unidad.
Existe una relacin entre el factor de selectividad para dos analitos y sus factores de
capacidad:
= (tR)B tM
o
= k B
(tR)B tM
k A
Donde kB y kA son los factores de capacidad de B y A, respectivamente.
Reordenando ambas expresiones, resulta una ecuacin que permite la determinacin de
a partir de un cromatograma experimental:
= (k)B - tM
(k)A - tM
Es la distancia entre el centro de ambos picos dividido por el ancho promedio de la base
columna
Se requiere un valor de R de 1,5 o mayor para considerar que una separacin cromatogrfica
es buena. Si R es menor de 0,4 entonces la forma del pico no mostrar claramente fa
presencia de dos componentes.
La resolucin depende, al fin, de dos parmetros: el ancho del pico y la distancia de su
mximo al punto de origen.
22 |

CROMATOGRAFA GASEOSA
En esta cromatografa la fase mvil es un gas inerte portador (carrier) que circula a una
temperatura adecuada para que las molculas de la muestra fluyan por la columna en fase
vapor.
El gas portador circula en forma continua a lo largo de la columna y en un momento
determinado se introduce la muestra a analizar en fase vapor. Segn las afinidades de los
constituyentes de la mezcla con la fase estacionaria, tendrn distintas velocidades y eluirn de
la columna a tiempos diferentes, separados por molculas del gas carrier, presentando picos
en el cromatograma a tiempos de retencin diferentes.
Partes de un cromatgrafo: en fase gaseosa se compone de:
Gas portador:
Es la fase mvil, la cual debe ser qumicamente inerte. El gas ms usado es el Helio tambin
se usa Nitrgeno ,Argn e Hidrgeno. Se requieren reguladores de presin (manmetros) y
medidores de flujo.
El gas no debe reaccionar ni con la muestra ni con la fase estacionaria. Debe ser de alta
pureza y sin absolutamente nada de agua o de oxgeno.
Generalmente el detector que usamos al final de la columna, determina la seleccin del gas.
Inyeccin de la muestra:
En la cromatografia gaseosa es un requisito principal que la muestra pueda vaporizarse o
gasificarse por lo tanto que sean muestras voltiles y termoresistentes de lo contrario no
pasarn a travs de la columna.
La eficiencia de la columna requiere que la muestra sea de tamao pequeo y se introduzca
como un "tapn de Vapor". La inyeccin lenta o las muestras de tamao excesivo producen
una baja resolucin en la columna.
Las muestras se inyectan mediante una microjeringa en una cmara caliente situada en la
cabeza de la columna. La temperatura de la cmara generalmente es 50C por encima del
punto de ebullicin del compuesto menos voltil de la muestra.
La inyeccin dividida es decir que no pasa toda la muestra sino que una parte se descarta, es
la ms empleada, mientras que la inyeccin sin divisin es mejor para el anlisis cuantitativo.
Columnas:
Existen las columnas empacadas o de relleno que admiten muestras grandes, pero las ms
empleadas y las de mayor resolucin son las columnas capilares. Estas son ms modernas y
permiten lograr separaciones de hasta 3.000.000 platos tericos ms.
Estas columnas se pueden fabricar en acero inoxidable, vidrio o slice fundida, tienen un
dimetro de 0,25 a 0,5 mm y longitudes de 25 a 50m.
Su superficie interna est recubierta con una fina capa estacionaria lquida, las ms
modernas estn construdas de slice fundida y se las hace resistentes mediante un
revestimiento externo de poliamida siendo bastante flexibles y fuertes pudiendo doblarse en
espirales de pocas pulgadas de dimetro.
Para realizar la corrida con tiempos de retencin reproducibles es necesario controlar la
temperatura de la columna. Por este motivo la columna enrollada se coloca en un horno
termostatizado. La temperatura ptima depende del punto de ebullicin de los componentes de
la muestra, llegando algunos hasta 450C Temperatura Isotrmica:
Es decir constante
durante toda la corrida,se utiliza para muestras con punto de ebullicin muy prximos, a veces
no produce una buena separacin pues de bajo punto de ebullicin salen al principio todos
juntos y sto provoca que se superpongan.
Temperatura Programada: Significa un aumento lineal de la temperatura de la columna con
el tiempo, es muy til para muestras con punto de ebullicin muy distintos. Permite una mejor
resolucin, es importante tenerlo en cuenta al comprar el equipo.
23 |

Detectores :
A medida que los compuestos salen de la columna entran en el detector. Este tiene que
responder rpidamente a bajas concentraciones de soluto, respuesta lineal, estable, universal
( para una gran variedad de compuestos qumicos) o bien de respuesta selectiva ( grupo
limitado de solutos).
Los ms usados en cromatografia gaseosa son:
ionizacin de llama (FID), el de captura de electrones (DCE) y el de conductividad trmica.
Todos stos se basan en distintos principios pero todos manifiestan un cambio en la seal
cuando atraviesa por ellos slo el gas portador y cuando lo hace un compuesto determinado.
La eleccin del detector debe hacerse en funcin de la naturaleza de los compuestos a
determinar, del gas portador a utilizar y de la sensibilidad que necesitemos para nuestro
anlisis.
Aplicaciones:
Analiza todas aquellas sustancias que presentan punto de ebullicin menor a 350 400 C.
Deben ser voltiles y termoresistentes. Es difcil tratar compuestos inicos, compuestos de
elevada polaridad y compuestos de peso molecular mayor a 600, por esto solo gases y
aproximadamente el 15% de los compuestos orgnicos pueden ser analizados.
Ejemplos: pesticidas (suelos , cultivos y aguas); composicin y separacin de hidrocarburos;
cidos grasos; aceites escenciales.
CROMATOGRAFA
LQUIDA
Se denomina as, a la modalidad cromatogrfica en la cual la fase mvil es un lquido.

A este grupo pertenece la Cromatografa en Capa Delgada (TLC), la Cromatografa
Lquida en Columna Abierta, y la Cromatografa Lquida de Alta Performance (H.P.L.C.).
A pesar de las diferencias entre las diferentes modalidades, los principios que gobiernan la
separacin son los mismos en todos los casos.Partes de un HPLC se compone de:
Fase mvil :
La fase mvil debe tener las siguientes caractersticas indispensables:
Disolver la muestra; no degradar o disolver la fase estacionaria; tener baja viscosidad; ser
compatible con el tipo de detector utilizado; tener la polaridad adecuada para permitir una
retencin conveniente de la muestra en columna; ser de alta pureza, grado
espectrofotomtrico o cromatogrfico sobre todo para detectores de luz ultravioleta o de
fluorescencia.
Los disolventes ms usados son: hexano, cloruro de metileno, isopropanol, cloroformo,
acetonitrilo, tetrahidrofurano, metanol, agua .
Los recipientes de almacenamiento de la fase mvil pueden ser de vidrio, acero inoxidable o
plsticos inertes, con una capacidad de 1 a 3 litros.
El tubo de entrada al depsito de solventes se protege con un filtro de poro fino, que retiene
particulas de polvo mayores de 2 a 5 milimicrones .
Las burbujas de gas que se forman por cambios de presin o por mezclado de ciertos
solventes interfieren en el funcionamiento adecuado de la columna y el detector, por lo tanto
siempre se deben eliminar por medio de la evacuacin, ebullicin o purga con helio (el cual es
muy insoluble) en el cromatgrafo o en sistema de suministro del solvente.
Si la elucin de la muestra es con un solo solvente durante todo el tiempo se dice que la
elucin es isocrtica, pero si un solvente no discrimina adecuadamente entre varios
componentes de una mezcla, o si no produce una elucin suficientemente rpida puede
utilizarse ms de un solvente. Generalmente se realiza un cambio continuo de composicin o
proporcin porcentual del solvente, y esto se lo denomina elucin por gradiente.
Bombas:
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Generalmente se usan bombas recprocas o de pistn que desplazan flujos de volumen

constante en forma no continua, sino pulsante.
Inyeccin de la muestra :
Si bien existen varios puertos , la vlvula de inyeccin es una de las ms usadas, vienen de
distintos tamaos y volmenes fijos entre 2 y 1000 microlitros.
Columnas :
Las columnas son generalmente se acero inoxidable, de unos 30 cm de largo rellenas de
material inerte, el ms comn es el gel de slice, tambin se usa la almina, la celulosa, el
carbn activado y el florisil que es un coprecipitado de xido de magnesio y slice, todos estos
materiales se encuentran en tamaos de partculas muy pequeos con dimetros de 5 a 10
milimicrones.
Generalmente todas las columnas de cromatografa tienen antes de la columna analtica una
precolumna o columna guardia con la misma fase estacionaria que aquella para prevenir la
contaminacin de la misma.
Algunas columnas se mantienen a temperatura ambiente, pero en otros equipos la columna
se coloca en un horno cuya temperatura puede regularse entre 30 y 100C.
Al aumentar la temperatura de la columna disminuye la viscosidad del solvente y por lo tanto
se requiere menos presin para que el fase mvil circule adecuadamente por la columna.
Detectores:
El detector ideal es aquel que es sensible a bajas concentraciones del compuesto ,que da
una respuesta lineal es decir una seal proporcional a la concentracin del analito y en
cromatografa lquida tambin debe ser insensible a los cambios de temperatura y de
composicin del solvente. Los ms usados son:
ultravioleta, ndice de refraccin,
electroqumico, fluorescencia.
Cada uno de ellos tiene un principio particular de deteccin pero podemos decir que todos
envan una seal cuando pasa el los solventes slos y otra seal cuando pasa la fase mvil
con el compuesto disuelto en ella. La eleccin de uno u otro depende del compuesto que
vamos a determinar, de la fase mvil y de la sensibilidad que necesitemos.
Aplicaciones:
Los.mtodos utilizados en cromatografia de gases son ms rpidos y sensibles, el
instrumental ms sencillo y en general menos costosos, la lquida no es tan sencilla ni tan
rpida pero su espectro de aplicacin es ms amplio, si bien el instrumental es
considerablemente ms caro.
No hay competencia entre cromatografa gaseosa y lquida pues ambas tcnicas se
complementan.
En cromatografa lquida se requiere que la muestra sea soluble en la fase mvil, y sto hace
posible el anlisis de compuestos de muy alto peso molecular, orgnicos e inorgnicos, inicos
y covalentes, lo que si es imprescindible es encontrar la fase estacionaria adecuada que
separe selectivamente la muestra lo cual en teoria es posible, pero en la prctica puede
resultar difcil.
Ejemplos: vitaminas; aminocidos; protenas; colorantes; conservadores; aflatoxinas;
pesticidas (carbamatos); compuestos inicos; azcares; miel; cidos grasos; estimulantes;
edulcorantes; aromatizantes artificiales, hormonas, aceites esenciales de alto peso molecular.
El desarrollo de la HPLC es el resultado de contar con un sistema de separacin en fase
lquida, que sea complementario de la cromatografa en fase gaseosa (GC).
Una diferencia fundamental entre GC y HPLC es la influencia de la fase mvil en la
separacin. En la GC, la fase mvil es un simple transportador del soluto y prcticamente no
influye en la separacin. Por el contrario, en HPLC la fase mvil es el parmetro fundamental
que gobierna la separacin. En consecuencia en GC se necesitan muchas columnas para
abarcar el rango de separaciones posibles, mientras que en HPLC con una sola columna es
posible separar sustancias polares, inicas y no polares simplemente modificando la
composicin de la fase mvil, que si interacta con la muestra para su separacin.
25 |

Figura 4: Diagrama esquemtico de un cromatgrafo gaseoso.
Figura 5: Diagrama esquemtico de un aparato para cromatografa lquida de alta resolucin

(HPLC)
26 |

EXPERIENCIAS A REALIZAR
Objetivos:
Caracterizar los sistemas cromatogrficos y conocer las modalidades de operacin.
Conocer y caracterizar los sistemas cromatogrficos: Cromatgrafo Gaseoso (GC) y
Cromatgrafo Lquido de Alta Performance (HPLC).
Actividades:
1- Colocar los nombres en los siguientes esquemas:
a- Cromatografa de capa fina (TLC)
b- Cromatografa en columna
27 |

c- Cromatgrafo Gaseoso (GC)
d- Cromatgrafo Lquido de Alta Performance (HPLC)
28 |

2- Complete el siguiente cuadro:

CROMATGRAFO GASEOSO
CROMATGRAFO LQUIDO
Tipo
INYECTOR
T
Longitud
Dametro
COLUMNA
Fase
estacionaria
Tipo
DETECTOR
T
FASE MVIL
PRESIN
T HORNO
SISTEMA DE COLECCCIN DE
DATOS
APLICACIONES
29 |

Para recordar
EJERCITACIN N 12
TCNICAS CROMATOGRFICAS
Smbolo
Funcin
F
w
Tm
(tR)A
(tR)A
Vs
Velocidad de flujo (mL I min) de la elucin, caudal.

El ancho de la base de cada pico
Tiempo de migracin de especies no retenidas
Tiempo de retencin ajustado de la especie A
Tiempo de retencin especie A
Volumen de la fase estacionaria
Concentracin del analito en las fases mvil y
estacionaria
Longitud de la columna
Cm ; Cs
L
Determinacin
Medida directa
Medida del cromatograma

TR =TR - tM
Datos de preparacin del relleno
Datos de anlisis y preparacin
Medida directa
Ecuaciones y parmetros lineales de Inters:

Nombre
Clculo
Relacin con otros parmetros
Velocidad lineal de la fase mvil:

Volumen de fase mvil:
Factor de capacidad, o razn de reparto:
Coeficiente de distribucin:
Factor de selectibidad :
Resolucin:
Nmero de platos:
Altura del plato:
Tiempo de retencin:
Volumen de retencin:
ANLISIS CUANTITATIVO: clculo de la concentracin del analito.

11- El anlisis cuantitativo depende de la relacin entre la cantidad de una soluto y el tamao de la banda de
elucin que resulta de l.
La concentracin del analito en la muestra se puede calcular por diferentes mtodos:
Mtodo de normalizacin por reas.

a- Mtodo del estndar externo.
b- Mtodo del estndar interno.
30 |

e- Mtodo de Normalizacin de reas :

Consiste en referir el contenido del analito al total de reas en el cromatograma, es muy difundido para
cromatografa gaseosa pero no se utiliza en HPLC. Se calcula:
Pi =% del componente en la muestra
Ai =rea del componente
Ai =sumatoria de todas las reas del cromatograma.
Para componentes puros, el mtodo se corrige calculando los factores:
El factor de respuesta de un componente n de la mezcla ser:
f 1 : factor de respuesta , calculado para la inyeccin de c/u de los
componentes.
Ci: componente en la mezcla. Concentracin
Ai : rea del componente.
Luego corregir las reas multiplicando cada una por el factor de respuesta correspondiente.
MTODO DE NORMALIZACIN POR REAS
Ventajas
Evita las incertidumbres de la inyeccin de la
muestra.
No requiere estndar de referencia
Limitaciones
Necesita que los componentes de la mezcla se
separen
por el mtodo cromatogrfico elegido.
Se requiere que todos los componentes tengan el
mismo factor respuesta.
Ejemplos:
Mtodo de Normalizacin de reas :
Un cromatograma correspondiente a la corrida de un producto comercial, por cromatografa gaseosa,

dio las siguientes reas bajo cada componente. Calcular la composicin porcentual de la mezcla,
suponiendo que son iguales las respuestas del detector.
Pico
rea
A
31 cm2
B
53,2 cm2
C
14, 5 cm2
98,7 cm2
A
Resolucin:
rea total: 31 + 53,2 + 14,5 = 98,7
A = 31,0 x 100 = 31,4 %
98,7
B = 53,2 x 100 = 53,9 %
98,7
C = 14,5 x 100 = 14,7 %
98,7
31 |

EJERCICIOS A RESOLVER
1- a. Una columna cromatogrfica de longitud 10,3 cm y dimetro interno 4,61 cm, esta empaquetada
con una fase estacionaria que ocupa el 61,0% de su volumen. Si el caudal es de 113 mL por min, hallar
la velocidad lineal de flujo en cm/min. (Volumen del cilindro: 3,14 x r2 x h)
b. Cunto tiempo tarda el disolvente (que es el mismo que tarda un soluto no retenido) en atravesar
la columna?
c. Hallar el tr de un soluto que tiene un factor de capacidad de 10,0.
R= a) 17,43 cm min-1
b) 0,591 min
c) 6,50 min
2- En una columna de 30,0 cm, las sustancias A y B tienen un tiempo de retencin de 16,40 y de 17,63
min. Las anchuras de pico (en la base) para A y B son 1,11 y 1,21 min, respectivamente. Calcular:
a. La resolucin de la columna
b. El nmero promedio de platos de la columna
c. La altura del plato
d. La longitud de la columna necesaria para conseguir una resolucin de 1,5
e. La altura de plato necesaria para una resolucin de 1,5 utilizando la columna original de 30,0 cm
y en el tiempo dado originalmente.
R=a) 1,06
b) 3445
c) 8,71x10-3 cm
d) 60 cm
e) 4,35x10-3 cm
3- En una columna de 122 cm de longitud, operada a 160 C, se obtuvieron stos tiempos de retencin
(en minutos): pico de aire 0,90; heptano 1,22 y octano 1,43. Los anchos de las bases fueron 0,14 para el
heptano y 0,20 para el octano cul es la retencin relativa (factor de selectividad) y la resolucin para
estas bandas?
R= = 1,66
R= 1,23
4- Las reas de pico, obtenidas por cromatografa de gases en una determinacin de colesterol fueron:
Areas
Oxidos del colesterol
19- hidroxicolesterol
22504
7-alfa hidroxi colesterol
7813
7- beta hidroxicolesterol
8572
alfa- epoxicolesterol
2054
beta- epoxicolesterol
8655
Triol
637
20- hidroxicolesterol
926
Suponiendo que las respuestas de deteccin son iguales, calcular el porcentaje de cada compuesto que
contiene el colesterol.
R= 43,99%
15,27%
16,75%
4,01%
16,92%
1,24%
1,81%
5- De acuerdo con estudios de distribucin, se sabe que las especies Z y X tienen contantes de
distribucin agua/hexano de 6,01 y 6,2 respectivamente. Las dos especies tienen que ser separadas por
elucin con hexano. La relacin Vs/Vm para la columna es 0,422. Calcular:
a) factor de retencin para cada soluto.
b) factor selectividad
c) nmero de platos tericos para obtener una resolucin de 1,5
d) longitud de la columna si la altura de platos tericos es de 2,2x10-3 cm.
R= a) kz=2,53 kx=2,61
b) =1,03
c) 80774
d) 178 cm
32 |

6. En un Laboratorio de Agroalimentos se desea determinar la concentracin de catequina y

resveratrol en vinos tinto mediante HPLC. El laboratorio cuenta con dos columnas C18 de diferentes
dimensiones para realizar los ensayos (Columna 1: 0,5m ODS2 100mm x 4,6mm d.i.; Columna 2:
0,5m ODS2 250mm x 4,6mm d.i.) y necesitan saber con cul de ellas se obtienen mejores resultados.
Para ello se realiza una corrida cromatogrfica con la mezcla de los compuestos en ambas columnas.
Los resultados obtenidos son:
Columna 1
tr (min)
W
(min)
Columna 2
Catequina
Resveratrol
Catequina
Resveratrol
5,91
6,19
17,35
18,6
0,19
0,21
0,9
1,21
a. Calcular la resolucin de los compuestos para ambas columnas.

b. Calcular la eficiencia y la altura de platos terico de cada columna.
c. Interprete los resultados y decida que columna es conveniente usar. Justifique su eleccin.
R= a) R1= 1,4; R2= 1,18; b) N1= 13901 H1= 7,19 10-4 cm y N2=3780 H2= 6,61 10-3
7. De una muestra comercial se extrajeron y purificaron tres compuestos, identificados como A, B y C.
Una vez identificados los componentes, la muestra se analiz por cromatografa de gases con detector
de ionizacin de llama, utilizando una columna carbowax de 15 m de longitud, 0.32 mm de dimetro
interno y 0.25 m de espesor de pelcula.
Los valores de tr, to y wb se encuentran enlistados en la siguiente tabla:
Soluto
tr (min)
wb(min)
No retencin
0,98
1,72
0,24
2,28
0,31
3,26
0,42
Calcular:
a. El flujo del gas portador (fase mvil) en la columna en ml/min
b.
El nmero de platos tericos efectivos del compuesto C
c.
El factor de capacidad del compuesto A
d.
La resolucin entre los compuestos A y B y los compuestos B y C
e.
La selectividad entre los compuestos B y C

R= a) F=1,23 mL min-1; b) N=964; c) kA=0,75; d) R1=2,04 R2=2,68; e) =1,75
33 |

Cap 5 Cromatografía Introducción-Gas-HPLC 2015

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Asignatura: ANLISIS INSTRUMENTAL

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INTRODUCCIN A LAS SEPARACIONES CROMATOGRFICAS

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TABLA 1. Clasificacin de los mtodos cromatogrficos

Resina de intercambio inico

Especies orgnicas unidas a

La Figura 1 muestra esquemticamente cmo dos sustancias A y B se separan en una

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Constante de distribucin (K): Los equilibrios de distribucin implicados en

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Idealmente, el coeficiente de distribucin es constante en un amplio intervalo de

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La velocidad lineal media de la migracin del analito es:

Velocidad de migracin diferencial; factor de selectividad (): Proporciona una medida

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a partir de un cromatograma experimental:

(Ecuacin de Van Demmter)

donde H es la altura de plato en centmetros y u es la velocidad lineal de la fase mvil en

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ms alto es el caudal, ms breve es el periodo de tiempo que el analito reside en la

Resolucin de la columna: La resolucin RS de una columna constituye una medida

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Anlisis basados en las reas de pico

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El mtodo de la normalizacin de reas

Tiempo de migracin, especies no retenidas

Concentracin del analito en la fase mvil y

TABLA 3. Nombre, clculo y relaciones entre parmetros

Relacin con otros parmetros

Velocidad lineal de la fase mvil:

Factor de capacidad, o razn de reparto:

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CROMATOGRAFA GASEOSA (GC)

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Sistema de inyeccin de muestra

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