UNIVERSIDAD JSE FAUSTINO SNCHEZ

CARRIN

FACULTAD DE INGENIERA PESQUERA

ESCUELA ACADEMICA DE INGENIERIA PESQUERA
Tema

: Tincin de Gram

Asignatura :

Microbiologa

Docente

Ingeniero Rubn Guerrero Romero

Ciclo

VII

Alumnos

: Carranza Bustamante, Denisse

Changana Oyola, Leonardo
Hermenegildo Carquin, Cesar
Avila Tupa, Alexis

Huacho - Per

I.

INTRODUCCIN

El tamao de la mayora de las clulas bacterianas es tal que resultan

difciles de ver con el microscopio ptico. La principal dificultad es la falta
de contraste entre la clula y el medio que la rodea. El modo ms simple
de aumentar el contraste es la utilizacin de colorantes.
Si se desea simplemente aumentar el contraste de las clulas para la
microscopa, son suficientes los procedimientos que usan un solo
colorante llamado de tincin simple. Sin embargo, a menudo se utilizan
mtodos que no tien de igual modo todas las clulas, es el proceso
denominado tincin diferencial. Uno muy usado en microbiologa es la
tincin Gram. Basndose en su reaccin a la tincin Gram, las bacterias
pueden dividirse en dos grupos: gram positivas y gram negativos. Esta
tincin tiene gran importancia en taxonoma bacteriana ya que indica
diferencias fundamentales de la pared celular de las distintas bacterias.

II.

OBJETIVOS

III.

Brindar al alumno herramientas bsicas en la confeccin y

el manejo de extendidos y la tincin de los mismos de
acuerdo a la observacin que se desee realizar.
Aprender a diferenciar por medio de la tincin las gram
positivas y las gram negativas.

FUNDAMENTO TERICO

III.1

Tincin

Es el proceso por el cual las molculas de un colorante se

absorben a una superficie. El uso de colorantes permite
cambiar el color de las clulas de los microorganismos y poder
realizar la observacin en microscopio ptico. Dado que las
bacterias son casi incoloras, no presentan contraste con el
medio en el cual se encuentran suspendidas y no pueden
observarse claramente sin algn tratamiento previo.

a) Tincin simple

El colorante utilizado sirve solo para denotar la morfologa

celular.

b) Tincin diferencial

El colorante utilizado pone de manifiesto diferencias entre

clulas bacterianas o entre partes de una misma clula.
Estas tcnicas utilizan ms de un colorante o bien ciertos
reactivos complementarios para la tincin. Ejemplos:
Tincin de Gram, Tincin de Ziehl-Neelsen, etc.

III.2

Colorantes

Los colorantes ms utilizados: azul de metileno, cristal violeta,

safranina, son catinicos y se combinan fuertemente con
componentes celulares cargados negativamente, como los
cidos nucleicos y los polisacridos cidos (las envueltas
externas de los microorganismos estn por lo general
cargadas negativamente).

III.3

Tincin diferencial de Gram

Esta tincin se denominada as por el bacterilogo dans

Christian Gram, quien la desarroll en 1844. Sobre la base de
su reaccin a la tincin de Gram, las bacterias pueden
dividirse en dos grupos, Gram positivas y Gram negativas (en
este caso, los trminos positivo y negativo no tiene nada que
ver con carga elctrico, sino simplemente designan dos grupos
morfolgicos distintos de bacterias). Descripta en forma breve,
la secuencia de la tincin es la siguiente: el Frotis fijado con
calor se tie 1 min con Violeta Cristal, se lava con agua, se
cubre con solucin Yodada durante 1 - 2 min. Y se lava de
nuevo con agua, decolorar con mezcla alcohol etlico/acetona.
Escurrir y cubrir con Safranina (color de contraste) durante 1
2 min. Lavar y secar. Las bacterias gram-positivas y gramnegativas tien de forma distinta debido a las diferencias
constitutivas en la estructura de sus paredes celulares. La
pared de la clula bacteriana sirve para dar su tamao y forma
al organismo as como para prevenir la lisis osmtica. El
material de la pared celular bacteriana que confiere rigidez es

el peptidoglicano. La pared de la clula gram-positiva es

gruesa y consiste en varias capas interconectadas de
peptidoglicano as como algo de cido teicoico. Generalmente,
80%-90% de la pared de la clula gram-positiva es
peptidoglicano. La pared de la clula gram-negativa, por otro
lado, contiene una capa mucho ms delgada, nicamente de
peptidoglicano y est rodeada por una membrana exterior
compuesta de fosfolpidos, lipopolisacridos, y lipoprotenas.
Slo 10% - 20% de la pared de la clula gram-negativa es
peptidoglicano.

IV.

MATERIALES

Portaobjetos
Asa
Mechero
Alcohol
Microscopio
Cultivo
Reactivos
-

V.

Cristal
Violeta
Yodo de gram
Alcohol etlico
Safranina

PROCEDIMIENTO
1. Obtenga 5 portaobjetos limpios.
2.
a) En un portaobjeto se coloca en el centro una gota de
cultivo es preferible usar un gotero para solo colocar una
gota.
b) Tomar en condiciones aspticas una pequea cantidad
del cultivo bacteriano en medio solido(es necesario
antes de adicionar el cultivo poner cerca del mechero
para recin poder sacar el cultivo y adicionar al
portaobjetos), luego remover la mezcla hasta formar una
suspensin homognea y que quede bien extendida para
facilitar el secado.
c) Esperar que el lquido se evapore acelerando su
evaporacin con la ayuda del mechero debemos de
tener en cuenta que no debemos de calentar mucho el
portaobjetos ya que se puede romper o daar y las
clulas pueden daarse o romperse y eso no se quiere
(lo adecuado es pasarlo varias veces cerca del mechero
lo ms rpido posible agarrando de una parte de la asa
hasta obtener el reactivo evaporizado.
d) Para preparar el frotis de la mezcla ESCHERICIA COLIMICROCOCCUS LUTEUS, colocar una gota de agua en el
portaobjetos y luego transfiriendo cada organismos
separadamente a la gota de agua usando una asa

esterilizada
enfriada,
luego
mezclando
microorganismos en movimientos circulares

ambos

Foto N1 Esterilizando el asa

Foto N2 Agregamos una gota de cultivo en un

portaobjeto
3. Permite que los frotis se sequen al aire y luego fjelos en el
calor.

Foto N3 Secado del cultivo

4. Tia con cristal violeta agregando suficiente colorante y
deje que acte por 1 min
Foto N 4 Adicin del cristal violeta

Foto N5 Muestra teida

5. Lave suavemente con agua.

Foto N 6 Lavado de la muestra

6. Inunde suavemente con el mordiente, yodo de GRAM, y deje
de actuar por 1 min.

Foto N7 Adicin de
yodo de Gram
7. Lave
suave
mente
agua.

con

Foto
8

Lavado de la muestra
8. Decolore con alcohol etlico al 95%, agregue el alcohol gota
a gota hasta que salga casi claro solo ligeramente azul.
Nota: no sobre decolore.
Foto N9 Adicin del
alcohol etlico
9. Lave

suavemente con agua.

10.Agregue la safranina para la tincin del contraste.

Foto N10 Adicin de la safranina

11.Lave suavemente con agua

12.Seque la preparacin.
13.Examine al microscopio con el objetivo 100X de inmersin
de aceite (en este examinamos con el objetivo 40x

Foto N 11 Adicin del aceite

VI.

RESULTADOS

VII. ANEXO

Imagen N1 Procedimiento para la tincin

de un cultivo