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Universidade Federal de Pernambuco

Centro de Cincias da Sade


Departamento de Enfermagem
Curso de Bacharelado em Enfermagem

Ana Beatriz Nunes de Lima Pereira


Anne Karoline Morais Cavalcanti
Amanda Marcela dos Santos Gonalves
Paulo de Tarso Verssimo Ferreira
Andressa Costa

Relatrio da aula prtica de Centrifugao

Recife
2016

INTRODUO
Centrifugao um procedimento utilizado com a finalidade de isolar
partculas, macromolculas e organelas utilizando-se da fora G (Alberts,
2011). H dois tipos de centrifugao, a Diferencial, que consiste na separao
por tamanho de partculas, onde as partculas maiores sedimentam mais rpido
que as menores (Karp, 2005). H tambm a centrifugao em Gradiente de
Densidade, que consiste em adicionar um facilitador da homogeneizao,
como a sacarose, e as partculas separam-se por densidade, formando um
boto celular no fundo do tubo de ensaio, com as partculas mais densas.
importante salientar a necessidade da homogeneizao antes de realizar o
processo na centrfuga. A substncia pode ser homogeneizada por lminas ou
waring blender quando tecidos duros (ex. msculos), pode ser do tipo PoterElvehjem quando tecidos moles (ex. fgado, pncreas, crebro) e do tipo
Polytron-Ultrassons quando forem paredes e organelas celulares.
H trs tipos de centrfugas, so elas a centrfuga de mesa, centrfugas
preparativas e as ultracentrfugas. Sendo a primeira do tipo: sem refrigerao,
atinge velocidade mxima de 4.000 a 6.000 g (baixa velocidade), no possuem
vcuo, podem ter ou no trava de segurana e so subdivididas em: rotor
basculante, roto fixo ou angular e rotor vertical. A segunda, que so as
centrfugas preparativas, so refrigeradas (com o objetivo de no superaquecer
o material nem o aparelho, danificando ambos), atingem velocidade mxima de
40.000 at 50.000g (mdia velocidade), podem ou no ter vcuo e possuem
trava de segurana. J a terceira, Ultracentrfuga, so refrigeradas, atingem
velocidade de 100.000 at 500.000g(alta velocidade), possuem vcuo e trava
de segurana.

Discusso
Essa tcnica existe para acelerar o processo natural de sedimentao
que ocorre devido fora da gravidade. Vamos usar uma velocidade de
centrifugao que seja centenas de milhares de vezes maior que a gravidade.
A unidade o g, sendo assim, ao usarmos uma velocidade de 4000, dizemos
400g. Em algumas vezes, em vez de usar g, usamos RPM (rotaes por
minuto), entretanto, no uma unidade padronizada, pois cada centrfuga tem
um rotor diferente. Ou seja, se a centrfuga tem um dimetro menor sero
realizadas mais rotaes por minuto. g = 1,118 x 10-5 x RaioROTOR x n. n =
velocidade aplicada (em RPM).
Quando se liga a centrfuga realizado um movimento circular uniforme,
responsvel pela sedimentao. Nesse processo existem duas foras de
sentidos opostos: a fora centrfuga, direcionada para fora, e a centrpeta,
direcionada para o centro do raio. Ao rotacionar, o material dentro do tubo tenta
vencer a inrcia e empurrado pela fora centrpeta para a parte mais
externa da circunferncia. Ao final do procedimento, as clulas hepticas
estaro no boto celular. O objetivo da aula de hoje corar o ncleo dessas
clulas usando azul de metileno.
Ser observado o precipitado corado no microscpio. O homogeneizador
um tubo acompanhado de um pistilo.
ETAPAS:
1. Fragmentao do fgado bovino (2g) utilizando tesoura e pina na
placa de Petri. OBS.: O fgado utilizado no uma pea fresca,
uma pea descongelada; Esses 2g de fgado sero colocados
num homogeneizador juntamente 18ml de Sacarose a 0,25 molar;
Realizar movimento de pisto dentro do pistilo em prol de liberar
as clulas hepticas; A Sacarose um meio menos denso que o
fgado, facilitando a homogeneizao no processo de
fracionamento celular e tambm permite a centrifugao das
clulas no final do processo de fracionamento celular. OBS.: O
nome do homogeneizador Potter-Elvejhen que um dos trs
tipo necessrio para esse experimento. Existe um para tecido
mole e um para tecido duro e um para parede celular e organelas.
OBS.: necessrio que o meio seja menos denso que a
substncia que se deseja centrifugar, pois s assim haver a
precipitao; A sacarose comea amarela e ao final ficar com
uma cor leitosa amarronzada. Foi utilizada esta soluo, pois a
sacarose j estava padronizada.
Fase intermediaria (balanceamento): se a soluo no estiver balanceada
corretamente, podero ocorrer acidentes e no ser obtido o boto celular no
fundo do tubo, ele poder ficar na parede do tudo de coleta, o que no

correto. Os tubos devem ter as mesmas dimenses e pesos comparados um


aos outros, pois isto dificulta o acontecimento do desbalanceamento alheio. No
experimento, um era mais pesado do que o outro. Utilizou-se ento, dois tubos
de dimenso (volume) 12x12 e em cada um tinha 2,5 ml de sobrenadante,
porm um dos dois estava desnivelado comparado ao outro, por isso para
corrigir o peso acrescentou-se sacarose para que os dois ficassem no mesmo
nvel.

FOTO DA BALANA

Antes e depois do balanceamento


2. Etapa de Fracionamento celular:
Obs: Ao acabar a homogeneizao, por decantao separa-se o sobrenadante
(componente que est em soluo). As clulas que esto em suspenso
sero levadas a um novo tubo. Vai virando ate deixar o mximo de slido nesse
novo tubo de coleta. Desse material, sero retirados 2,5 ml em cada tubo de
centrifugao (modelo utilizado: horizontal).

Ao finalizar o balanceamento, coloca-se os tubos na


centrfuga de mesa (baixa velocidade) por 10 minutos a
uma velocidade 2000 r.p.ms. Velocidade mxima dela 7
mil r.p.m e no possui trava de segurana. Nesta etapa
houve a formao do boto celular no fundo do tubo da
centrfuga, retirou-se o sobrenadante e descartou-o na pia.
O boto celular permanecer no fundo do tubo de ensaio,
mesmo que o tubo de ensaio seja inclinado, pois ele
formado de clulas densas. O boto celular foi
resuspendido com sacarose a 0,25 M (1 ml) e depois
realizou-se a preparao da lmina e posteriormente teve a
observao da lmina atravs do microscpio. Se as
clulas fossem sanguneas, no poderia ser feito dessa
forma.

OBS: utiliza-se azul de metileno para corar os ncleos das clulas, pois ele
um corante bsico que tem afinidade com regies cidas do nosso sistema. O
ncleo da clula heptica formado por DNA e cido, haver uma reao de
cido-base. Ento por ser bsico (o corante), ele ir se ligar ao ncleo das
clulas hepticas produzindo uma cor azul escura. Tudo que for visualizado em
azul-escuro no microscpio formado pelo ncleo das clulas que foram
retirados do fgado bovino.
3. Preparao das lminas:
Coloca 1 ml de sacarose a 0,25 Molar (para formar
novamente uma suspenso de clulas (boto dissolvido),
para agit-las j que elas estavam no fundo do tubo de
ensaio). O material possui colorao leitosa, porm est
composta praticamente de clulas hepticas precipitadas
do boto celular.
Suspender as clulas usando pipeta pasteur.
Colocar uma gota desta suspenso na lmina.
Coloca 1 ou 2 gotas do corante azul de metileno.
Depois coloca uma lamnula em cima.
Retira o excesso do corante com um papel toalha. quanto
mais retirar o excesso, melhor para a observao
Observa a lmina no microscpio.

Foto esquerda: Lmina pronta,


clulas hepticas coradas com azul de
metileno.

1. Tipos de rotores (centrfuga de mesa):


1.1. ngulo Fixo - o tubo de coleta tem certa inclinao em relao ao
centro do rotor e esse ngulo no se modifica durante todo o processo
de centrifugao.
1.2. ngulo Horizontal - ngulo ajustvel. Existe um anel que mvel e
dentro desse anel tem um suporte onde o tubo ser encaixado. Volume
de 12 15 ml. No pode trabalhar com um tubo muito maior e nem
muito menor, pois poder danificar a centrfuga e quebrar o tubo de
ensaio. Ele s muda de posio quando a centrfuga ligada, quando

ela desligada o tubo volta a posio de repouso. Velocidade 7000


r.p.m
1.3. Basculante - utilizam-se grandes volumes, at 12 litros. Utiliza-se um
pequeno balde e ela centrifugar o lquido a uma baixa velocidade.
2. Tipos de centrfuga: se diferenciam quanto a velocidade, travas de
segurana, refrigerao, vcuo.
2.1. Centrifuga de mesa: atinge velocidade mxima de 4 a 6 mil r.p.m, no
possuem refrigerao e no possui vcuo e podem ou no ter travas de
segurana. Velocidade mxima em g: 4 6 mil x g. Baixa velocidade.
2.2. Preparativa: so refrigeradas, podem atingir uma velocidade de at 2
mil r.p.m, podem ou no ter vcuo e possuem travas de segurana.
Velocidade mxima em g: 40 a 50 mil x g. Mdia velocidade.
2.3. Ultracentrfuga: Velocidade de 60 mil r.p.m, so refrigeradas, possui
vcuo, possui travas de segurana e atinge velocidade em g de 100 a
500 mil. Alta velocidade.
Obs: vcuo: retirada de todo o ar do ambiente.
Importncia de ter o vcuo: quando o ar retirado, partculas de ar do sistema,
a centrfuga consegue girar a uma velocidade alta sem produzir tanto calor,
pois o atrito ser reduzido. Importncia de refrigerar o rotor: resfriar a
temperatura (diminu-la) e no deixar que o aparelho superaquea e tambm
para no destruir as clulas do material coletado.
Medidas de segurana cuidados gerais:

Verificar se o rotor est corretamente posicionado na centrfuga antes de


iniciar o processo.
Balancear os tubos antes de iniciar a centrifugao.
Colocar sempre os tubos em lados opostas (2 a 2).
Sempre trabalhar com tubos apropriados para as centrfugas que forem
utilizadas
Nunca centrifugar com a tampa aberta.
Se a centrfuga for refrigerada, importante que o rotor mantenha uma
temperatura padro. desligar o rotor e mant-lo refrigerado e s deve
retir-lo quando for utiliz-lo novamente.
Nunca tentar substituir e nem alterar nenhuma caracterstica da
centrfuga
Sempre utilizar nmero par de tubos de coleta na hora de centrifugar.
Nunca sair do laboratrio ate que a centrfuga atinja a velocidade
mxima.

Metodologia:
O mtodo de centrifugao utilizado ocorreu em algumas etapas. Foram
utilizados 8 materiais:
1- Fgado bovino
2- Sacarose 0,25M
3- Azul de metileno
4- Tubos de ensaio para centrfuga
5- Pipeta Pasteur
6- Lmina + lamnula
7- Centrfuga
8- Microscpio ptico
Uma amostra de fgado homogeneizada e em seguida submetida a uma
srie de centrifugaes de fora crescente. Inicialmente

foi cortado

aproximadamente duas gramas do fgado bovino, adicionado uma soluo


chamada de Sacarose 0,25 M. Logo aps a soluo e os fragmentos do fgado
so colocados no Homogeneizador, onde os fragmentos do fgado so
atritados quando passam entre o mbolo em movimento e a parede do cilindro.
Aps o trmino da homogeneizao a substncia ficou em repouso
observando-se j a decantao das fibras e clulas intactas. Comeou a partir
desse processo a centrifugao na velocidade de duas mil rpm/10minutos,
depois do equilbrio das massas. Foi-se desprezado o sobrenadante. O
precipitado com sacarose foi utilizado para preparar uma lmina juntamente
com o azul de metileno, e recoberto com a lamnula. Depois utilizando o
microscpio ptico foi visualizado os ncleos.

Resultados e concluso:

O experimento foi dividido basicamente em

10 etapas. A experincia de

centrifugao dos fragmentos do fgado atravs do processo de fracionamento


celular diretamente proporcional ao RPM e o tempo. Esses dois fatores esto
relacionados com o conhecimento da massa, viscosidade, superfcie e peso
especfico das organela e ncleos que foram estudados. A funo da sacarose
no fracionamento celular manter a integridade dos componentes celulares e
evita a tendncia das organelas se aglutinarem quando as clulas se rompem.
A partir desse procedimento foi possvel visualizar para estudo os ncleos e
algumas organelas para o fgado bovino.