The impact of a freshwater fish farm on the community of

tetracycline-resistant bacteria and the structure of

tetracycline resistance genes in river water
Monika Harnisz, , Ewa Korzeniewska, Iwona Goa
Show more doi:10.1016/j.chemosphere.2015.01.035

The aim of this study was to assess the impact of a fish farm on the structure of antibiotic
resistant bacteria and antibiotic resistance genes in water of Drwca River. Samples of
upstream river waters; post-production waters and treated post-production waters from fish
farm; as well as downstream river waters were monitored for tetracycline resistant
bacteria, tetracycline resistant genes, basic physico-chemical parameters and
tetracyclines concentration. The river waters was characterized by low levels of pollution,
which was determined based on water temperature, pH and concentrations of dissolved
oxygen and tetracycline antibiotics. Culture-dependent (heterotrophic plate counts, counts
of bacteria resistant to oxytetracycline (OTCR) and doxycycline (DOXR), minimum inhibitory
concentrations for oxytetracycline and doxycycline, multidrug resistance of OTCR and
DOXR, qualitative composition of OTCR and DOXR, prevalence of tet genes in resistant
isolates) and culture-independent surveys (quantity of tet gene copies) revealed no
significant differences in the abundance of antibiotic-resistant bacteria and antibiotic
resistance genes between the studied samples. The only way in which the fish farm
influenced water quality in the Drwca River was by increasing the diversity of tetracyclineresistance genes. However, it should also be noted that the bacteria of the
genera Aeromonas sp. and Acinetobacter sp. were able to transfer 6 out of 13
tested tetgenes into Escherichiacoli, which can promote the spread of antibiotic resistance
in the environment.

El objetivo de este estudio fue evaluar el impacto de una

piscifactora en la estructura de las bacterias resistentes a los
antibiticos y los genes de resistencia a antibiticos en el
agua del ro Drwca. Las muestras de las aguas de los ros
aguas arriba; aguas y aguas tratadas de post-produccin de la
granja de peces post-produccin; as como fueron controlados
aguas de ro aguas abajo para las bacterias resistentes a la
tetraciclina, los genes resistentes a la tetraciclina, los
parmetros fsico-qumicos bsicos y la concentracin de las
tetraciclinas. Las aguas de los ros se caracterizan por bajos
niveles de contaminacin, tal como se determin en base a la
temperatura del agua, el pH y las concentraciones de oxgeno
y antibiticos de tetraciclina disueltos. Cultura-dependiente
(recuentos de placas heterotrfica, los recuentos de bacterias
resistentes a la oxitetraciclina (OTCR) y doxiciclina (DOXR), las

concentraciones inhibitorias mnimas de la oxitetraciclina y

doxiciclina, resistencia a mltiples frmacos de OTCR y DOXR,
composicin cualitativa de OTCR y DOXR, la prevalencia de los
genes tet en aislados resistentes) y encuestas cultura
independiente (cantidad de copias del gen tet) no revel
diferencias significativas en la abundancia de bacterias
resistentes a antibiticos y genes de resistencia a antibiticos
entre las muestras estudiadas. La nica manera en la que la
piscifactora influenciado la calidad del agua en el ro Drwca
fue aumentando la diversidad de genes de resistencia a
tetraciclina. Sin embargo, tambin hay que sealar que las
bacterias de los gneros Aeromonas sp. y Acinetobacter sp.
fueron capaces de transferir 6 de cada 13 genes tet probados
en Escherichia coli, que puede promover la propagacin de la
resistencia a los antibiticos en el medio ambiente.
1. Introduction
In recent decades, a significant increase in global aquaculture production was
accompanied by intensified use of antimicrobials to treat bacterial infections
(Boxall, 2010). Cabello et al. (2013) reported that 80% antibiotics used in
aquaculture enter the water environment. Antibiotic concentrations in the
ecosystem are high enough to exert selective pressure on bacteria by
completely or partially inhibiting wild-type (sensitive to antimicrobials) bacterial
populations (Tello et al., 2012). This process alters biodiversity in aquatic
environments and the microbiota characteristic of water animals.

Antibiotic-resistant bacteria are increasingly often found in the vicinity of fish

farms where antimicrobials are used, which points to a causal relationship
between these two phenomena (Guardabassi et al., 2000 and Schmidt et al.,
2000). Bacterial resistance to antibiotics is determined by genes located on the
chromosome or mobile genetic elements, such as plasmids, transposons and
integrons (Korzeniewska and Harnisz, 2013), which facilitates their transfer
between different bacterial species. In view of the above, antibiotic-resistant
bacteria (ARB) and antibiotic resistance genes (ARGs) have been identified as
contaminants of emerging concern (Pruden et al., 2006). A knowledge of the
sources and mechanisms of ARB and ARG dissemination is required because
their proliferation and transfer poses a serious public health risk. The
knowledge will support the development of effective strategies for controlling
antibiotic resistance and assessing human health risks.

In practice, ARB and ARGs may be more widespread in aquacultures because

most studies analyze resistance with only cultured-based methods
(Guardabassi et al., 2000 and Schmidt et al., 2000). Culture-independent
methods, including measurements of gene copy numbers by quantitative
polymerase chain reaction (qPCR), provide a less biased estimation of ARGs in
the environment. The number of ARGs in marine aquacultures has been
investigated by very few studies (Tamminen et al., 2011, Gao et al., 2012, Di
Cesare et al., 2013 and Muziasari et al., 2014), and it has never been analyzed
in freshwater fish farms.

Tetracyclines are widely used in aquaculture, in particular to control

furunculosis in salmonids, and oxytetracycline is a drug of first choice in the
Polish fish farming industry (www.wetgiv.gov.pl). However, the continued
widespread use of antibiotics has led to the development of tetracyclineresistant microorganisms in all farming operations, from fish feed (Kerry et al.,
1995) to water that circulates in and out of the pond (Miranda et al., 2003). Our
previous studies (Harnisz et al., 2011 and Harnisz, 2013) demonstrated that
tetracycline-resistant (tetR) bacteria are sensitive to changes in the
physicochemical parameters of water and antibiotic concentrations and that
they are more abundant in polluted environments. Similar results were
reported by Chen et al. (2013a) who confirmed that water contamination levels
can be analyzed based on tetracycline resistance genes.

The aim of this study was to assess the impact of a freshwater fish farm on an
antibiotic-resistant bacterial community based on the prevalence of
tetracycline-resistant bacteria (TRB) and tetracycline resistance (tet) genes.
Two parallel approaches were used to examine the prevalence of TRB and tet
genes: a culture-based method involving standard PCR, and a method relying
on quantitative PCR. To our knowledge, this paper makes the first attempt to
investigate antibacterial resistance in freshwater fish farms of Central-Eastern
Europe with the use of qPCR.

1. Introduccin
En las ltimas dcadas, un aumento significativo de la produccin acucola
mundial fue acompaada por una intensa utilizacin de los antimicrobianos
para tratar las infecciones bacterianas (Boxall, 2010). Cabello et al. (2013)
reportaron que el 80% de antibiticos utilizados en la acuicultura entran en el

medio acutico. concentraciones de antibitico en el ecosistema son lo

suficientemente altos para ejercer una presin selectiva sobre las bacterias
mediante la inhibicin total o parcialmente de tipo salvaje (sensible a los
antimicrobianos) poblaciones bacterianas (Tello et al., 2012). Este proceso
altera la biodiversidad en los ambientes acuticos y la caracterstica de la
microbiota de los animales acuticos.

bacterias resistentes a antibiticos son cada vez encuentran a menudo en las

proximidades de las granjas de peces donde se usan agentes antimicrobianos,
lo que apunta a una relacin causal entre estos dos fenmenos (Guardabassi et
al., 2000 y Schmidt et al., 2000). La resistencia bacteriana a los antibiticos
est determinada por los genes localizados en el cromosoma o elementos
genticos mviles, tales como plsmidos, transposones y integrones
(Korzeniewska y Harnisz, 2013), lo que facilita su transferencia entre diferentes
especies bacterianas. En vista de lo anterior, las bacterias resistentes a los
antibiticos (ARB) y genes de resistencia a antibiticos (ARG) se han
identificado como contaminantes de inters emergente (Pruden et al., 2006).
Se requiere un conocimiento de las fuentes y mecanismos de ARB y difusin
ARG porque su proliferacin y la transferencia plantea un serio riesgo para la
salud pblica. El conocimiento apoyar el desarrollo de estrategias eficaces
para controlar la resistencia a los antibiticos y la evaluacin de los riesgos
para la salud humana.

En la prctica, ARB y ARGs pueden ser ms generalizada en la acuicultura

porque la mayora de estudios analizan resistencia con solamente los mtodos
basados en cultivadas (Guardabassi et al., 2000 y Schmidt et al., 2000).
mtodos independientes del cultivo, incluyendo mediciones de nmero de
copias de genes por reaccin en cadena de la polimerasa cuantitativa (qPCR),
proporcionan una estimacin menos sesgada de los ARG en el medio ambiente.
El nmero de los ARG en la acuicultura marina ha sido investigado por muy
pocos estudios (Tamminen et al., 2011, Gao et al., 2012, Di Cesare et al., 2013
y Muziasari et al., 2014), y nunca ha sido analizada en las granjas de peces de
agua dulce.

Las tetraciclinas son ampliamente utilizados en la acuicultura, en particular,

para controlar la forunculosis en los salmnidos, y oxitetraciclina es un frmaco
de primera eleccin en la industria de la piscicultura Polaco
(www.wetgiv.gov.pl). Sin embargo, el uso generalizado continuado de
antibiticos ha dado lugar al desarrollo de microorganismos resistentes a la
tetraciclina en todas las operaciones de cultivo, a partir de alimentos para

peces (Kerry et al., 1995) al agua que circula en y fuera del estanque (Miranda
et al., 2003). Nuestros estudios previos (Harnisz et al., 2011 y Harnisz, 2013)
demostraron que (tetR) bacterias resistentes a la tetraciclina son sensibles a
los cambios en los parmetros fsico-qumicas de agua y concentraciones de
antibiticos y que son ms abundantes en ambientes contaminados.
Resultados similares fueron reportados por Chen et al. (2013A), que
confirmaron que los niveles de contaminacin del agua pueden ser analizadas
sobre la base de los genes de resistencia a la tetraciclina.

El objetivo de este estudio fue evaluar el impacto de una granja de peces de

agua dulce en una comunidad bacteriana resistente a los antibiticos sobre la
base de la prevalencia de bacterias resistentes a la tetraciclina (TRB) y genes
de resistencia a la tetraciclina (tet). Dos enfoques paralelos se utilizaron para
examinar la prevalencia de los genes TRB y tet: un mtodo basado en la
cultura que implica PCR estndar, y un mtodo depender de PCR cuantitativa.
Para nuestro conocimiento, este trabajo hace que el primer intento de
investigar la resistencia antibacteriana en las granjas de peces de agua dulce
de Europa Central y del Este con el uso de qPCR.