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Prctica N 4

Siembra de microorganismos aerobios


Se denomina siembra a la operacin mediante la cual una porcin de un material
biolgico, se deposita en un medio de cultivo para obtener el crecimiento y
desarrollo de los microorganismos presentes en ella.
El material que se siembra puede contener una sola especie microbiana o varias
especies mezcladas. Para efectuar una siembra, se necesita seguir ciertas reglas
fundamentales que exigen las tcnicas bacteriolgicas, y que tienen por objeto
evitar la contaminacin del material de estudio por los microorganismos presentes
en el ambiente.
Una siembra puede hacerse con dos fines:
1. Replicar o trasplantar las cepas puras u obtener cultivos jvenes.
2. Obtener la separacin de las distintas especies que se encuentran en la
mezcla (aislar) y comprobar su pureza.

Siembra en placas. Este mtodo de inoculacin recibe el nombre de siembra


por diseminacin. En esta tcnicas, el cultivo microbiano se distribuye sobre la
superficie del agar, solidificado en placas de Petri; bien sea mediante el uso de una
asa de platino o varilla de vidrio. El objetivo inmediato de este procedimiento es el
desarrollo de colonias bacterianas bien separadas a partir de una suspensin
concentrada de clulas. Esta siembra se puede efectuar haciendo deslizar el asa
sobre la superficie del agar en forma de zig- zag, cuidando de no romper el agar,
para observar colonias bien diferenciadas.
Debido a la alta concentracin de agua en el agar se forma agua de condensacin
de las placas de Petri durante el periodo de incubacin. El agua de condensacin
se deposita en la cubierta y cae en forma de gotas sobre la superficie del agar, lo
que interfiere en la separacin de las colonias debido a que se mezcla con el
inculo, se riega sobre la superficie y se forma una masa de crecimiento

desordenado. Para evitar esto las placas una vez inoculadas deben incubarse en
posicin invertida para que el agua de condensacin permanezca depositada sobre
la tapa de la placa y se evapore por la temperatura de incubacin.

Nota. Recuerde que debe trabajar al lado de la llama de un mechero y que debe flamear
tanto la boca de los tubos de ensayo como el asa o aguja de inoculacin antes y despus
de cada inoculacin para destruir todos los grmenes contaminantes de las superficies de
esos objetos. Tan pronto como aprenda el procedimiento correcto para transferir los
cultivos, usted, debe desarrollar ms velocidad para llevar a cabo estos ensayos; puesto
que, cualquier retardo en el re-taponamiento de los tubos incrementa grandemente las
oportunidades de contaminacin.

Siembra por puncin. Para discriminar entre microorganismos anaerobios y


aerobios es necesario excluir el oxigeno libre (aire) de un cultivo durante el
crecimiento. El desarrollo de ciertos microorganismos es inhibido por exposicin al
oxigeno; con excepcin de los microorganismos anaerbicos estrictos, los cuales
pueden ser cultivados mediante inoculacin profunda en un medio slido.
En este mtodo el agar esterilizado y fundido se deja solidificar manteniendo los
tubos en posicin vertical. Cuando el agar ha solidificado y enfriado el medio es
inoculado mediante la introduccin de la aguja de platino a travs del centro del
agar hasta el fondo del tubo. Durante la incubacin, se desarrolla un centro de
crecimiento microbiano siguiendo la trayectoria de la lnea de inoculacin. Los
cultivos as preparados pueden ser almacenados. Algunas veces por muchos meses
si una capa de aceite mineral (1/4 de pulgada) es depositado sobre la superficie
del agar para evitar la entrada de aire y prevenir la evaporacin. La transferencia
del material desarrollado a partir de estos cultivos se realiza mediante la
introduccin de una aguja de platino o pipeta fina estril siguiendo la trayectoria
de la lnea de crecimiento. Esta tcnica de siembra, tambin se utiliza para inocular
medios de cultivos semislidos (contenido de agar-agar de 0,4 al 0,8%) para los
estudios de la movilidad que se pone en manifiesto por el crecimiento difuso fuera
de la lnea de inoculacin.

Agar inclinado. El mtodo de siembra en agar inclinado, consta sencillamente


de un tubo, el cual contiene agar que ha solidificado sobre un ngulo formando
una especie de cua o pico de flauta, dejando libre una superficie fcilmente
inoculable con el asa o aguja de inoculacin. Este mtodo de siembre, es
especialmente

recomendable

para

cultivar

microorganismos

aerbicos

anaerbicos facultativos. Algunas caractersticas culturales, como la formacin de


pigmentos, son observados con mayor facilidad por este mtodo.

Medios estriles de crecimiento

Instrumentos de transferencia microbiolgica.

Objetivo de la prctica:
Emplear las diferentes tcnicas para la siembra de microorganismos.
Familiarizarse y dominar las diferentes tcnicas

para la siembra de

microorganismos.
Establecer contrastes entre las distintas tcnicas y medios de siembra de
microorganismo.

Materiales
Cubre-objetos.
Caldo nutritivo.
Agar nutritivo inclinado.
Agar Kliger o T.S.I inclinado.
Agar nutritivo en placas.
Cultivos en agar nutritivo (en placas).
Agar Mc Conkey en placas.
Cultivos en caldo nutritivo.
Cultivo poli-microbiano en caldo nutritivo.

Metodologa:
1. Se suministrar a cada grupo de estudiantes cultivos en crecimiento en
medios slidos (placas con agar nutritivo) y en medios lquidos (caldo
nutritivo).
2. As mismo se suministrar a cada grupo medios estriles de crecimiento
slidos (placas con agar nutritivo, agar nutritivo inclinado, agar TSI) y
lquidos (caldo nutritivo) en cada una de las cuales se realizar la siembra
de los microorganismos en crecimiento anteriormente suministrados.
3. Tome la aguja, o el asa de inoculacin (dependiendo el medio y la tcnica
de siembra) como si fuera un lpiz y esterilice ponindola verticalmente a
la llama del mechero hasta que toda su longitud se ponga al rojo vivo.
4. Deje transcurrir unos segundos, antes de tomar el inculo, para que se
enfre el alambre de platino y evitar matar los organismos.
5. Con la mano izquierda, tome la cpsula de Petri que contiene al
microorganismo y colquela al frente del mechero, tome la pequea
porcin de una colonia aislada y coloque la cpsula en su posicin original.
6. Tome con la mano izquierda, un

tubo que contenga el medio de

crecimiento estril, destape la placa (con la mano izquierda) o desenrosque

la tapa del tubo con la mano que sostiene la aguja de inoculacin, y


siembra.
7. Flamee nuevamente la boca del tubo y tpelo.
8. Esterilice la aguja de inoculacin.
9. Incube los tubos a 37 C por 24 horas.
10. Registre los resultados observados.

Preguntas a investigar:
1. Quin fue Alfred Mac Conkey? y Cul fue su aporte a las tcnicas de

siembra microbiolgica?
2. Por qu las placas se invierten ante de llevarlas a incubacin?
3. Por qu es necesario esterilizar el asa o la aguja antes de realizar una

siembra?
4. Cul es la composicin del agar nutritivo? y Por qu es un medio de

crecimiento universal?
5. Cuntos instrumentos de transferencia microbiolgica pueden

emplearse?
6. Nombre las tcnicas de transferencia microbiolgica y diga las ventajas

y las desventajas, si las hubiere, de cada una de ellas.


7. Para que se emplea la tcnica de puncin.
8. Explique la tcnica combinada de puncin y estra y diga en cual medio

de crecimiento se realiza.

Procedimiento para la siembra de aerobios

Bibliografa consultada
PRESCOTT, L.; HARLEY, J.; KLEIN, D. Agud Aparicio, Jos Luis (Traductor);
Gamazo de la Rasilla, Carlos (Revisor) Microbiologa, Mc Graw-Hill, Madrid,
Espaa.
COLLINS, C. Mtodos microbiolgicos, Editorial ACRIBIA, S.A. Zaragoza, Espaa, 5ta
edicin.
HARLEY, J.; PRESCOTT, L. 2002. Laboratory Exercises in Microbiology, 5ta edicin.
The McGrawHill Companies.