REMOCIN DE ANTIINFLAMATORIOS POR DIFERENTES ESPECIES DE MICROALGAS

Barrera-Hernndez, C.1, Garca-De La Cruz, R.F.2, Gonzlez-Ortega, O. 3 y Soria-Guerra, R.E.3

1

Ingeniera Ambiental, Facultad de Ingeniera, cynthia.barrera@alumnos.uaslp.edu.mx. 2Laboratorio de

Bioqumica Vegetal rgarcia@uaslp.mx. 3Laboratorio de Biotecnologa Molecular de Clulas Vegetales
ruth.soria@uaslp.mx, omar.gonzalez@uaslp.mx. Facultad de Ciencias Qumicas, UASLP. Av. Dr.
Manuel Nava 6, Zona Universitaria, San Luis Potos, S.L.P.
Resumen
La presencia de diferentes frmacos en el ambiente representa un serio problema, en nuestro pas el diclofenaco es uno de
los frmacos de mayor consumo debido a su accin teraputica y a que es medicamento de venta libre. Este tipo de
compuesto no se encuentra reglados por las normas de calidad por lo que constituyen un riesgo al ambiente debido a su
toxicidad, persistencia y bioacumulacin. Se ha reportado a una concentracin de 0.225 g/L de diclofenaco en las aguas
superficiales.

Este estudio evalo la capacidad de cuatro especies de microalgas: Chlamydomonas reinhardtii, Chlorella vulgaris,
Nannochloropsis oculata y Scenedesmus acutus para remover una concentracin de 5 g/ml de diclofenaco en solucin. Se
utilizaron dos diferentes cepas de C. reinhardtii una con pared celular y otra sin pared, estas mismas se sometieron a un
estrs nutricional para forzarlas a consumir el diclofenaco como nutriente, esta accin resulto positiva para el estudio. Todas
las cepas mostraron capacidad para remover el frmaco del medio, siendo S. acutus la que mostr la mayor capacidad con el
81% de remocin. Mientras que la cepa de C. reinhardtii que no tiene pared celular mostro mayor capacidad de remocin a
comparacin de la que si presenta pared, lo que sugiere una remocin por absorcin del frmaco a nivel de la membrana
celular.
Palabras clave: contaminantes emergentes, frmacos, biorremediacin, clulas vegetales

Introduccin
En nuestro pas los anti-inflamatorios no esteroideos son los frmacos de mayor consumo debido a su
accin teraputica y a que son medicamentos de venta libre. Estos compuestos no se encuentran
reglados por las normas de calidad existentes por lo que constituyen un riesgo al medio ambiente
debido a su toxicidad persistente y bioacumulacin (Acosta K, 2010). Adicionalmente otros factores
que contribuyen a su liberacin al ambiente son: a) excrecin humana del principio activo en elevados
porcentajes, b) falta de regulacin del tratamiento y disposicin de los medicamentos caducados, c)
descarga al sistema de drenaje y cuerpos de agua, y d) disposicin a tiraderos a cielo abierto (Quesada
I, et al. 2009)
Se han reportaron concentraciones de frmacos en las aguas residuales (procedentes de hospitales, de
centros de produccin de medicamentos o municipales), en los efluentes de plantas de tratamiento de
aguas residuales (Figura 1), y en las aguas superficiales, alcanzndose concentraciones de 0.225 g/L
tanto para el diclofenaco como para el ibuprofeno (Ramos C, 2006).
La liberacin de frmacos de distinto origen y estructura qumica y cuya presencia en el ambiente pasa
desapercibida en trminos de distribucin y concentracin, representa un serio problema ambiental
tanto pare el hombre, la flora y la fauna. Por ejemplo, se ha reportado que el diclofenaco afecta las
branquias y los riones de peces de agua dulce adems de alterar los patrones de reproduccin. Por lo
anterior es importante disear estrategias metodolgicas para disminuir o eliminar los frmacos
presentes en las aguas residuales e incluso en el agua de consumo ya que los actuales sistemas de
purificacin de agua no contemplan el anlisis de frmacos.

Figura 1: Ruta de frmacos hacia aguas residuales (Quesada I, et al. 2009).

Existen diferentes procesos para la remocin de diclofenaco: carbn activado granular, oxidacin con
ozono, oxidacin avanzada y lodos activos; estos procesos, aunque efectivos (con 90% de remocin del
frmaco) suelen ser muy costosos por el precio de inversin e infraestructura necesaria (Miceli A, et al,
2014).
Adems de las tecnologas mencionadas existe la biorremediacin, que se basa en el uso de diferentes
organismos (plantas, hongos, bacterias, algas, entre otras) para neutralizar o remover sustancias toxicas.
Este tipo de tratamiento puede ser muy efectivo en la eliminacin de compuestos orgnicos txicos y
biodegradables en suelos y aguas residuales (Guzmn M, 2007). Las microalgas es un campo dinmico
y basto al ser organismos de elevada produccin de biomasa, inocuos y de desarrollo hetertrofo y
auttrofo; una de sus aplicaciones comprende su uso en procesos ambientales ya que tienen la
capacidad para utilizar nitrgeno inorgnico y fsforo para su crecimiento, y tambin han demostrado
capacidad para eliminar metales pesados, as como algunos compuestos orgnicos txicos (Arrieta E,
2008).
Entre los contaminantes que pueden ser removidos por microalgas se encuentran los frmacos, sin
embargo, la informacin descrita en la literatura es escasa. Con base en lo anterior, en este proyecto se
propone determinar la capacidad de remocin de diclofenaco en solucin mediante el empleo de las
siguientes especies de microalgas: Chlamydomonas reinhardtii, Chlorella vulgaris, Nannochloropsis
oculata y Scenedesmus acutus con el objetivo de realizar un anlisis comparativo de la remocin del
frmaco por estos microorganismos. Adicionalmente se utilizaron dos cepas diferentes de
Chlamydomonas reinhardtii cc137m+ y 1731, la diferencia entre ambas cepas es que la primera cuenta
con pared celular mientras que la segunda carece de pared celular; esto con el fin de determinar el
mecanismo de remocin del frmaco.

Materiales y mtodos
Asepsia del material
Todo el material de vidrio utilizado para la propagacin de las cepas de Chlamydomonas reinhardtii
(cc137m+), Chlamydomonas reinhardtii (1731), Chlorella vulgaris, Nannochloropsis oculata y
Scenedesmus acutus, y experimentos de remocin de diclofenaco, fue lavado con jabn lquido
comercial y enjuagado con agua potable del grifo. Posteriormente fue esterilizado en autoclave a una
presin de 0.1 MPa, durante 15 min a 120C.
Propagacin y condiciones de cultivo de C. reinhardtii (cc137m+ y 1731) en medio TAP (TrisAcetato-Fosfato) slido
Las cepas de C. reinhardtii (cc137m+ y 1731) fueron suministradas por el laboratorio de Biotecnologa
Molecular de Clulas Vegetales de la Unidad de Biotecnologa de Plantas de la Facultad de Ciencias
Qumicas en la UASLP.
Los cultivos de C. reinhardtii se propagaron en medio Tris-Acetato-Fosfato (TAP) (Lpez A, 2014) el
cual se ajust a pH 7 con cido actico glacial concentrado. Para la preparacin del medio TAP slido
se aadieron 20 g/L de agar bacteriolgico. El medio se esteriliz en autoclave a una presin de 0.1
MPa, durante 15 min a 120C.
Para llevar a cabo la propagacin y mantenimiento de la cepa de C. reinhardtii en medio solido se
emple la tcnica de cultivo por estra desarrollado bajo condiciones de esterilidad en campana de flujo
laminar tipo II. Las cepas resembradas se incubaron durante una semana en un cuarto de crecimiento a
25C con una fuente de luz blanca en fotoperiodo de 16 h luz y 8 h obscuridad.
Propagacin y condiciones de cultivo de C. vulgaris, N. oculata y S. acutus en medio basal Bold
slido
Las cepas de C. vulgaris, N. oculata y S. acutus fueron suministradas por el laboratorio de
Biotecnologa Molecular de Clulas Vegetales de la Unidad de Biotecnologa de Plantas de la Facultad
de Ciencias Qumicas en la UASLP.
Los cultivos de C. vulgaris, N. oculata y S. acutus se propagaron en medio basal Bold (Montes J. et al,
2012; Moha-Len J, et al, 2006; Pokora W, et al, 2003). Para la preparacin del medio Bold slido se
aadieron 20 g/L de agar bacteriolgico. El medio se esteriliz en autoclave a una presin de 0.1 MPa,
durante 15 min a 120C.
Para llevar a cabo la propagacin y mantenimiento de las cepas de C. vulgaris, N. oculata y S. acutus
en medio solido se emple la tcnica de cultivo por estra desarrollado bajo condiciones de esterilidad
en campana de flujo laminar tipo II. Las cepas resembradas se incubaron durante una semana en un
cuarto de crecimiento a 25C con una fuente de luz blanca en fotoperiodo de 16 h luz y 8 h obscuridad.
Preparacin de pre-inculos de C. reinhardtii (cc137m+), C. reinhardtii (1731), C. vulgaris, N.
oculata y S. acutus.
Se prepararon 25 mL de medio lquiudo y con la ayuda de un asa bacteriolgica de 1 L se tomaron
volmenes de cada una de las cepas que se encontraban en medio slido para posteriormente incubarlas
durante una semana en las condiciones antes mencionadas hasta alcanzar una DO750nm=0.2.
Cintica de crecimiento y remocin de diclofenaco en solucin por C. reinhardtii (cc137m+y
1731), C. vulgaris, N. oculata y S. acutus.
Se prepararon matraces Erlenmeyer de 50 mL con 30 mL de medio TAP y medio mnimo HS para C.
reinhardtii y medio basal de Bold para C. vulgaris, N. oculata y S. acutus con una D.O.750nm=0.07
procedentes de un pre-inculo colectado en la fase de crecimiento a una D.O.750nm=0.2. A los cultivos

preparados como se mencion anteriormente se les aadi una concentracin de 5 g/mL de un

estndar certificado de diclofenaco sdico (Pureza 100%, Lote: 042K1581, Marca: SIGMA), y como
control se prepararon matraces de la misma manera, pero en ausencia del frmaco
Los matraces fueron incubados en las mismas condiciones que el pre-inoculo. Se tom un mililitro de
los cultivos a las 0, 12 y 24h y posteriormente cada 24 h durante 15 das o hasta que los cultivos
alcanzaran la fase estacionaria. Para la cintica de crecimiento se tomaron dos muestras de 200 L
para medir la D.O. a una longitud de onda de 750 nm en un espectrofotmetro Glomax Multi Detection
System Promega.
Determinacin de la concentracin de diclofenaco en el medio de cultivo
Para el anlisis de la concentracin de diclofenaco se tomaron 600 L de cultivo de cada cepa al
ltimo tiempo, estas muestras se centrifugaron a 13,000 rpm por cinco minutos en una centrifuga
Spectrafuge 16M Labnet, el sobrenadante obtenido se transfiri a otro tubo de 1.5 mL los cuales se
colocaron en una evaporadora a 30 C por 3 horas.
Una vez evaporadas todas las muestras se re-suspendieron en 600 L de etanol al 100% y se agitaron
en un vortex a la mxima intensidad por cinco minutos, posteriormente se centrifugaron a 13,000 rpm
por cinco minutos, se separaron los sobrenadantes y se colocaron en una estufa a 70 C por una noche
para evaporacin del solvente, una vez evaporadas todas las muestras se re-suspendieron en 600 L de
etanol al 100% y se agitaron por un minuto en un vortex a la mxima intensidad.
Posteriormente las muestras se analizaron en un equipo de Cromatografa Liquida de Alta Resolucin
(HPLC por sus siglas en ingls) Agilent 1260 Infinity en el que se utilizaron como fase mvil
acetonitrilo al 0.1% con una columna empacada con slica esfrica (Agilent, eclipse XDB c-18) con un
tiempo de retencin aproximadamente de 11 minutos.
Determinacin de la concentracin de diclofenaco retenido en la pared celular por enlaces inicos
El pellet que contiene la biomasa recuperada al finalizar la cintica se obtuvo al centrifugar las

muestras, posteriormente a esta biomasa se les hizo un lavado con 200 L de NaCl [1M], se agitaron
en vortex a la mxima intensidad por un minuto, se centrifugaron a 13,000 rpm por cinco minutos, se
separ el sobrenadante y se llev a una evaporadora a 30 C por 2 horas.
Una vez evaporadas todas las muestras se re-suspendieron en 200 L de etanol al 100% y se sigui el
mismo procedimiento descrito en el prrafo anterior, se re suspendieron al final en 200 L de etanol al
100%.
Curva de calibracin del diclofenaco
Se elabor una curva de calibracin a las concentraciones 0, 1, 3, 5 g/mL de un estndar certificado
de diclofenaco diluido en etanol para su lectura en el equipo de HPLC. Los datos que se obtuvieron
fueron utilizados para establecer la relacin rea-concentracin y de esta manera interpolar las reas de
las muestras en la curva estndar de diclofenaco. El equipo de HPLC tiene gran exactitud y no fue
necesario realizar repeticiones.

Resultados y discusin
Curvas de crecimiento de las microalgas en presencia y ausencia de 5 g/ml de diclofenaco
Con el propsito de determinar la cintica de crecimiento de C. reinhardtii (cc137m+), C. reinhardtii
(1731), C. vulgaris, N. oculata y S. acutus en presencia y ausencia de diclofenaco se prepararon
matraces Erlenmeyer con 30 mL de medio TAP o Bold.

Figura 2. Cintica de crecimiento para las cepas a) C. reinhardtii (cc137m+) en medio TAP, b) C. reinhardtii (1731) en
medio TAP, c) C. vulgaris, d) N. oculata y e) S. acutus en (
)presencia y (
)ausencia de diclofenaco.

Los resultados se muestran en la Figura 2 e indican el comportamiento de C. reinhardtii (cc137m+), C.

reinhardtii (1731), C. vulgaris, N. oculata y S. acutus en presencia y ausencia de diclofenaco.
Para ambas cepas de C. reinhardtii el frmaco no afecto el crecimiento de la microalga, sin embargo,
llegaron a una fase estacionaria al segundo da para la cepa cc137m+ y tercer da para la cepa 1731.

Como se logra ver en la curva de crecimiento estas microalgas crecieron muy poco a comparacin de
las otras cepas, esto se puede atribuir a alguna contaminacin en el medio que inhibi su crecimiento.
En el caso de C. vulgaris el crecimiento no se ve afectado por el frmaco hasta el octavo da donde la
cepa que est expuesta al frmaco frena su crecimiento, sin embargo, al noveno da sigue creciendo,
esto se puede atribuir a su metabolismo mixotrfico (Pestana R, 2012) el cual en la cepa sin frmaco en
el medio alcanza su fase estacionaria hasta el dcimo da, es decir dos das despus que la que s estuvo
expuesta a diclofenaco.
La cepa de N. oculata expuesta al diclofenaco se mostr ligeramente afectada desde el segundo hasta el
quinto da, sin embargo, a partir del sexto da esta empieza a crecer ms que el control, este suceso se
atribuye a su metabolismo mixotrfico, ya que puede tomar como nutrientes a componentes orgnicos
presentes en el medio (Heidi SnchezTorres H, et al, 2008) lo que sugiere una mayor absorcin de
nutrientes que la microalga sin diclofenaco y puesto que la nica diferencia del medio es la
concentracin del diclofenaco sugiere que la microalga est internalizando el frmaco para su
crecimiento.
La microalga S. acutus es la nica especie con la que se trabaj que presenta alteracin en la cintica de
crecimiento a partir del segundo da, la microalga se sigue desarrollando constantemente, sin embargo,
el crecimiento es menor respecto al control (Vera A, et al, 2002).
Curva de crecimiento de C. reinhardtii en medio mnimo HS
Con el propsito de determinar la cintica de crecimiento de C. reinhardtii (cc137m+ y 1731), en
presencia y ausencia de diclofenaco y forzar a estas a introducir el frmaco dentro de la clula se
redujeron la cantidad de nutrientes. Los cultivos se crecieron en las mismas condiciones que las
mencionadas anteriormente
La cepa de C. reinhardtii (cc137m+) no presento alteracin en su crecimiento, con un crecimiento
constante, en el caso de la cepa C. reinhardtii (1731) la concentracin de diclofenaco en el medio no le
afecto en lo absoluto, al contrario, esta creci ms que el control a partir del segundo da, aunque su
crecimiento es mnimo (Figura 3).

Figura 3. Cintica de crecimiento para las cepas a) C. reinhardtii (cc137m+), b) C. reinhardtii (1731) en medio
mnimo HS en (
) presencia y (
) ausencia de diclofenaco.

Porcentaje de diclofenaco en solucin, retenido en pared celular y remocin por cada una de las
cepas de microalgas.

El anlisis de la capacidad de remocin de diclofenaco en solucin de las cinco cepas de microalgas se

realiz como se describi en la seccin de metodologa. Teniendo como resultados los cromatogramas
que se muestran en la Figura 4 y 5.

Figura 4. Cromatograma obtenido para la muestra del medio de cultivo de C. vulgaris. El pico observado a un
tiempo de 10.846 min corresponde al diclofenaco.

Para evaluar la cantidad de diclofenaco retenida en la pared celular de las microalgas debido a
interacciones inicas se les hizo un lavado con cloruro de sodio a una concentracin de 1M.

Figura 5. Cromatograma obtenido para la determinacin de la concentracin de diclofenaco adherido a la pared

celular de C. vulgaris a los 15 das del cultivo. El pico observado a un tiempo de 10.3576 min corresponde al
diclofenaco.

Los resultados de porcentaje de remocin de diclofenaco en el medio, el porcentaje adherido a la pared

celular por interacciones inicas y el porcentaje en medio se muestran en la Figura 6.

Porcentaje de diclofenaco
100%
80%
60%
40%
20%
0%

43%
13%
44%

64%
16%
19%

31%

39%

25%

15%

44%

46%

Porcentaje de diclofenaco en solucin

57%
18%
25%

23%
14%
63%

55%
20%
24%

Pared celular de la microalga

Porcentaje de remocin

Figura 6 Porcentaje de diclofenaco en medio de cultivo, en pared celular y removido por C.

reinhardtii (cc137m+), C. reinhardtii (1731), C. vulgaris, N. oculata y S. acutus
La cepa de C. reinhardtii (cc137m+) tiene mayor eficiencia de remocin que C. reinhardtii (1731) y al
ser la cepa que tiene pared celular se puede concluir que el mecanismo de remocin es por adsorcin.
La cepa que tiene mayor capacidad para remover el frmaco del medio es S. acutus al registrar el 81%,
mientras la cepa que muestra menor capacidad de remocin es C. reinhardtii (1731) en medio TAP con
solo el 37% de remocin, del cual el 14% estaba adherido a la clula, al cambiar la cepa a un medio
mnimo HS esta misma eleva su capacidad de remover alcanzando un 75% de remocin de diclofenaco
del medio al igual que la cepa C. reinhardtii (cc137m+) en medio mnimo. Las cepas C. vulgaris, N.
oculata y C. reinhardtii (cc137m+) en medio TAP remueven alrededor del 55% de diclofenaco del
medio.
Las algas, al igual que las plantas, llevan a cabo diferentes mecanismos que regulan la entrada de
nutrientes al interior de la clula, ya sea acumulndolos en la pared celular o bien internalizndolos a la
clula y acumulndolo en su sistema. Segn Yifei L., et al (2014) los humedales remueven de un 20 a
un 90 % del frmaco, este tipo de tecnologa necesita un amplio espacio para ser establecido, aunque la
remocin del diclofenaco por S. acutus es menor al 90% es una excelente opcin ya que no se necesitan
grandes espacios para poder desarrollar la tcnica.
Conclusiones
La presencia de diclofenaco afecta negativamente el crecimiento de S. acutus, en cambio para las cepas
de N. oculata y C. reinhardtii (1731 en medio mnimo) se observa un efecto positivo.

 El porcentaje de remocin de diclofenaco para C. reinhardtii (1731, microalga sin pared celular) en
medio TAP es de 54%, este porcentaje es mayor al observado en la cepa cc137m+ (microalga con
pared celular) lo que indica que el mecanismo de remocin se ve favorecido por la adsorcin a la
membrana celular.
Al someter las cepas de C. reinhardtii a un estrs nutricional se observa una mayor remocin de
diclofenaco en comparacin con las cepas creciendo en medio completo.
Scenedesmus acutus es capaz de remover hasta un 81% de diclofenaco, siendo esta especie (en
comparacin con las cuatro estudiadas en este proyecto) la que logr una mayor capacidad de
remocin.
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