KROMATOGRAFI KOLOM

II.2.1 Pengertian Kromatografi Kolom

Kromatografi kolom memiliki prinsip yang sama dengan kromatografi lapis tipis, yakni komponen
akan dipisahkan antara dua fase yaitu fase diam dan fase gerak. Fase diam akan menahan komponen campuran
sedangkan fase gerak akan melarutkan zat komponen campuran. Komponen yang mudah tertahan pada fase
diam akan tertinggal. Sedangkan komponen yang mudah larut dalam fase gerak akan bergerak lebih cepat.
Kromatografi kolom umumnya digunakan dalam proses pemurnian, pemisahan campuran, dan isolasi
senyawa, baik dalam skala kecil maupun besar. Kromatografi kolom digolongkan ke dalam kromatografi cair
padat (KCP) kolom terbuka.
Perangkat dalam kromatografi kolom terdiri dari tabung kromatografi, batang pemampat, cakram kaca
berpori, tabung pengalir, dan kran.
1.Tabung kromatografi
Terbuat dari kaca (kecuali dinyatakan lain), berbentuk silinder dengan diameter 10-30mm dan panjang
150-400mm.
2. Sebuah batang pemampat
Batang silinder, melekat kuat pada sebuah tangkai kromatografi. Diameter lebih kurang 1 mm <
diameter dalam kolom. Batang ini diperlukan untuk memadatkan wol kaca atau kapas pada dasar tabung jika
diperlukan, serta untuk memadatkan zat penyerap atau campuran zat penyerap dan air secara merata di dalam
tabung.
3.

Cakram kaca berpori

Melekat pada dasar tabung dan berfungsi untuk menyangga isinya.

4.

Sebuah tabung pengalir dengan diameter yang lebih kecil

Berfungsi untuk mengeluarkan cairan yang menyatu dengan tabung atau disambung melalui suatu

sambungan anti bocor pada ujung bawah tabung utama. Tabung pengalir umumnya berdiameter dalam antara 3
mm hingga 6 mm.
5.

Kran
Berfungsi untuk mengatur laju aliran pelarut yang melalui kolom dengan teliti.
Pada kromatografi kolom, di dalam kolom terdapat fase diam dan fase gerak. Fase diam berupa

adsorben yang tidak boleh larut dalam fase gerak. Contoh : alumina, silica gel, arang, bauksit, magnesium
karbonat, talk, selulosa, tanah diatom dan pati. Fase gerak yang digunakan dapat berupa pelarut tunggal atau
campuran beberapa pelarut dengan komposisi tertentu. Pelarut yang digunakan dapat bersifat polar maupun
nonpolar. Contoh fase cair : beragam senyawa kimia, seperti polyetilen glikol, ester, dan amida berbobot
molekul tinggi, hidrokarbon, gom, dan cairan silicon.
II.2.2 Penggunaan Kromatografi Kolom
a.

Dalam penentuan, baik kualitatif maupun kuantitatif, senyawa dalam protein.

b.

Pemisahan molekul-molekul penting seperti asam nukleat, karbohidrat, lemak, vitamin dan molekul

penting lainnya.
1

c.

Mengontrol kondisi obat tersebut sehingga bisa bertahan lama.

d.

Dalam bidang clinical (klinik), menginvestigasi fluida badan seperti air liur. Dari air liur seorang pasien,

dokter dapat mengetahui jenis penyakit yang sedang diderita pasien tersebut.
e.

Deteksi senyawa oksalat dalam air kencing bagi pasien kidney stones (batu ginjal).

II.2.3 Jenis-jenis Kromatografi Kolom

Kromatografi kolom dapat digolongkan berdasarkan mekanisme pemisahan yang
digunakan, yakni :
Kromatografi kolom adsorbsi
Digunakan untuk pemisahan golongan senyawa berdasarkan gugus
fungsional yang terdapat dalam senyawa tersebut. Fase gerak biasanya bersifat
nonpolar terhadap fase diam. Pelarut yang digunakan metanol, kloroform, dietil

eter, isopropanol.
Kromatografi kolom partisi
Fase diam: silika/alumina yang permukaannya dilapisi lapisan cair.Fase diam
terikat pada partikel padat. Kromatografi kolom partisi terbagi dua berasarkan fase
terikat, yaitu fase normal dan fase terbalik. Perbedaan kedua fase tersebut dapat
diliahat dari tabel di bawah ini.
Tabel Perbedaan Fase Normal dan Fase Gerak pada Kromatografi Kolom
Partisi
Jenis/Sifat
Fase diam
(kolom)
Jenis Kolom
Fase
gerak(eluen)
Jenis elusi
Urutan elusi

Fase Normal

Fase Terbalik

Polar

Non polar

Silika, alumina

-C18, -C8, -CN, -Fenil

Non polar

Polar

Heksana, kloroform

MeOH,H2O, CH3CN, THF

Non polar di awal

Polar di awal

Polar dibelakang

Non polar di belakang

II.2.4 Prosedur Kromatografi Kolom

Metode Pemasukan Zat ke dalam Kolom
Ada 2 metode yang dapat diterapkan dalam memasukkan zat, yaitu:
a.

Metode basah

1)

Zat dilarutkan dalam pelarut yang sesuai dan dimasukkan ke kolom.

2)

Kran yang berada di bagian bawah dibuka sehingga larutan tersebut dapat mengalir ke bawah hingga

batas permukaan fase diam.

3)

Kran ditutup dan dituangkan fase gerak.

4)

Kran kembali dibuka dan larutan (zat dan fase

gerak) akan mengalir ke bawah mengikuti gaya

gravitasi.
2

Catatan:
Fase gerak harus tetap dialirkan untuk menjaga agar penyangga tidak mengering.
b.

Metode kering

Kepolaran pelarut > eluent, maka zat dapat tidak terikat secara sempurna dengan fase diam.
1)

Zat uji dilarutkan dalam sedikit pelarut.

2)

Kemudian di dalamnya ditambahkan 100 mg penyangga (contoh, gel silika).

3)

Campuran diaduk hingga pelarutnya dan meninggalkan

4)

Campuran kering dimasukkan ke dalam kolom, ditambahkan

5)

Larutan akan mengalir ke bawah dan proses elusi dapat berjalan.

campuran kering zat dan penyangga.

fase gerak dan kran dibuka.

Catatan:
Sama seperti metode basah, fase gerak harus tetap dialirkan untuk menjaga agar penyangga tidak mengering.
-

Proses Elusi

Proses elusi adalah prosedur pemisahan zat terlarut oleh suatu proses migrasi differensial dinamis dalam sistem
yang terdiri dari dua fase atau lebih.
Laju gerakan zat dipengaruhi oleh sejumlah variabel, misalnya:
-

Daya adsorpsi fase diam

Ukuran partikel dan luas permukaan

Sifat dan polaritas pelarut, tekanan yang digunakan dan suhu sistem kromatografi.

Jika senyawa yang terpisah itu berwarna atau berfluoresensi di bawah cahaya ultraviolet, kolom

penjerap dapat dikeluarkan, dengan cara memotong melintang, lapisan yang diperlukan dapat dipisahkan.
Gambaran proses elusi kromatografi kolom dapat dilihat pada gambar berikut:

Gambar 2. Proses Elusi

Sampel yang akan dipisahkan dielusikan dalam kolom . Contoh pada gambar: pemisahan zat berwarna
merah dan dan zat berwarna hijau. Hal ini dapat terjadi karena zat berwarna hijau memiliki sifat lebih polar
dibandingkan zat berwarna merah sehingga dapat membentuk ikatan dengan fase diam (teradsorpsi di
permukaan penyangga). Hal ini mengakibatkan zat berwarna hijau lebih lama tertahan dalam fase diam dan
tidak terbawa oleh fase gerak. Selain itu, zat berwarna merah memiliki kepolaran yang lebih rendah sehingga
tidak tertahan pada fase diam dan ikut terbawa aliran fase gerak. Akibatnya, zat berwarna merah meninggalkan
3

kolom kromatografi lebih cepat dibandingkan tinta biru. Adanya perbedaan kepolaran ini menyebabkan zat
campuran terelusi menjadi zat berwarna merah dan hijau.
Proses elusi berjalan akibat adanya tekanan yang diberikan ke dalam kromatografi. Tekanan dapat
berasal dari tekanan atmosfer ataupun pemberian tekanan tambahan (dengan dipompa ataupun gas
terkompresi).Akibat dari adanya tekanan tersebut adalah fase gerak dan zat uji dapat mengalir turun di dalam
kromatografi.Jika proses aliran berjalan lambat, tekanan dapat ditambahkan salah satunya dengan memasang
karet pipet di atas kolom kromatografi.
Kromatogram adalah hasil pemisahan zat oleh proses elusi.
Kromatogram dapat dibedakan sebagai berikut:
1.

Berupa lapisan/pita-pita zat terpisah dalam kolom

Jika senyawa yang terpisah itu berwarna atau berfluoresensi di bawah cahaya ultraviolet. Lapisan yang
diperlukan dapat dipidahkan. Senyawa yang dikehendaki kemudian diekstraksi dari tiap lapisan dengan pelarut
yang sesuai.
2.

Berupa eluat
Eluat merupakan larutan yang keluar dari kolom dan merupakan hasil elusi. Fraksi-fraksi elusinya

ditampung secara terpisah dan dapat diidentifikasikan secara tersendiri. Kadar eluat dapat ditentukan dengan
cara titrasi, spektrofotometri atau kalorimetri, atau pelarutnya dapat diuapkan sehingga diperoleh zat dalam
kadar murni.
Volume retensi (VM): volume eluen (VR) yang diperlukan untuk membawa zat tersebut keluar dari kolom.
Sementara itu, tR :waktu yang diperlukan zat tersebut untuk melintasi kolom(tM )
VR = VM (1+K)

tR = tM (1+k)

k = factor kapasitas