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Cortisol saliva

KAPDB290

Cortisol saliva
Para la determinacin cuantitativa de cortisol por inmunoensayo enzimtico en saliva humana.

KAPDB290
DIAGNSTICO IN VITRO
USO
Determinacin cuantitativa de cortisol mediante inmunoensayo enzimtico en saliva
humana.
nicamente para diagnstico in vitro.
PRINCIPIO DE LA PRUEBA
El principio de la siguiente prueba de inmunoensayo enzimtico sigue el tpico caso
de enlace competitivo.La competencia se produce entre un antgeno no marcado
(presente en los calibradores, muestras control y de paciente) y un antgeno marcado
con enzima (conjugado) durante un nmero limitado de sitios de unin de anticuerpos en
la placa de micropocillos. Los procedimientos de lavado y decantacin eliminan los
materiales no ligados. Despus del lavado, se aade el sustrato de la enzima. La
reaccin enzimtica se termina mediante la adicin de la solucin de parada. La
absorbancia se mide en un lector de microplacas. La intensidad del color formado
es inversamente proporcional a la concentracin de cortisol en la muestra. Se utiliza
un conjunto de calibradores para trazar una curva de calibracin de la cual se puede
leer directamente la cantidad de cortisol en muestras de pacientes y controles.
APLICACIONES CLNICAS
El cortisol es el esteroide de circulacin ms abundante y la mayora de los
glucocorticoides principales secretadas por la corteza suprarrenal. El cortisol es
fisiolgicamente eficaz para el mantenimiento de la presin arterial y la actividad antiinflamatoria.Tambin participa en la absorcin de calcio, la gluconeognesis, as
como en la secrecin de cido gstrico y pepsina. ste se aumenta en situaciones de
estrs, ejercicio fsico y administracin externa de ACTH. La medicin de los niveles
de cortisol, en general, se puede utilizar como un indicador de la funcin adrenal y el
diagnstico diferencial de las enfermedades de Addison y Cushing, as como la
hiperplasia suprarrenal y carcinoma.
La mayora de cortisol circulante se une a la globulina de cortisol o transcortina y
albmina. El cortisol libre, considerado como la parte activa de la sangre, es
aproximadamente 1 - 2%. En ausencia de cantidades apreciables de protenas de
cortisol en saliva, el cortisol en saliva se considera libre y presenta un ritmo diurno
con niveles ms altos en la maana y niveles ms bajos durante la noche.
PRECAUCIONES Y ADVERTENCIAS DE PROCEDIMIENTO
1. Los usuarios deben tener un conocimiento profundo de este protocolo para el
correcto uso de este kit. Solo se logra un rendimiento fiable mediante el estricto y
cuidadoso cumplimiento de las instrucciones proporcionadas.
2. Los materiales de control deben incluirse en cada ejecucin a un nivel alto y bajo
con el fin de evaluar la fiabilidad de los resultados.
3. Cuando se especifica el uso de agua para la dilucin o reconstitucin, utilice
desionizada o agua destilada.
4. Con el fin de reducir la exposicin a sustancias potencialmente nocivas, se deben
utilizar guantes durante el manejo del kit de reactivos y muestras humanas.
5. Todos los reactivos del kit y las muestras deben estar a temperatura ambiente.
Estos se deben mezclar por completo y suavemente antes de su uso. Evite el
continuo congelado y descongelado de reactivos y muestras.
6. Se debe establecer una curva de calibracin para cada ejecucin.
7.El control se debe incluir en cada ejecucin y debe mantenerse dentro de los
lmites establecidos de confianza.
8. Las tcnicas inadecuadas de procedimiento, pipeteado impreciso, lavado
incompleto as como el inadecuado almacenamiento de reactivos pueden
presentarse cuando los valores de ensayo para el control no reflejan los rangos
establecidos.
9. Al leer la microplaca, la presencia de burbujas en los pocillos
afecta la densidad ptica (OD). Retire con cuidado las burbujas antes de
continuar con la lectura.
10. La solucin de sustrato (TMB) es sensible a la luz y debe permanecer incolora si
se almacena correctamente. La inestabilidad o la contaminacin se pueden indicar
mediante el desarrollo de un color azul, en cuyo caso no deben ser utilizados.
11. Al suministrar el sustrato y solucin de parada, no use pipetas en
que los lquidos entren en contacto con las piezas metlicas.
12. Para evitar la contaminacin de los reactivos, use una nueva punta desechable
para dispensar cada reactivo, muestra, calibrador y control.
13. No mezcle varios nmeros de lote de componentes del kit dentro de una prueba y
no utilice los componentes ms all de la fecha de vencimiento impresa en la
etiqueta.
14. Los reactivos del kit deben considerarse como residuos peligrosos y deben ser
eliminados de acuerdo a las normativas nacionales.

LIMITACIONES
1. Todos los reactivos en el kit estn calibrados para la determinacin directa de
cortisol en la saliva humana. El kit no se encuentra calibrado para la determinacin
de cortisol en suero, plasma u otras muestras de origen humano o animal.
2. Todas las muestras o sueros que contienen azida de control o timerosal no son
compatibles con este equipo, ya que pueden conducir a resultados errneos.
3. nicamente el calibrador 0 puede ser utilizado para diluir las muestras de altas de
saliva. El uso de cualquier otro reactivo puede conducir a resultados errneos.
4.Los resultados obtenidos con este equipo nunca debe utilizarse como la nica base
para una diagnstico clnico. Por ejemplo, la aparicin de anticuerpos heterfilos en
pacientes expuestos regularmente a animales o productos de origen animal tiene el
potencial de causar interferencias en las pruebas inmunolgicas. De este modo, el
diagnstico clnico debe incluir todos los aspectos de fondo de un paciente,
incluyendo la frecuencia de exposicin a animales o productos si se sospecha de
resultados falsos.
PRECAUCIONES Y ADVERTENCIAS DE SEGURIDAD
MATERIAL BIOLGICO POTENCIALMENTE DAINO
El suero humano que se puede utilizar en la preparacin de los calibradores y control
ha sido analizado y se comprob que no es reactivo frente al antgeno de superficie
de hepatitis B y tambin ha sido analizado para determinar la presencia de
anticuerpos contra el VHC y el virus de inmunodeficiencia humana (VIH), y se
encontr negativo. Sin embargo, ningn mtodo de prueba puede ofrecer la completa
seguridad de la ausencia de VIH, VHC y virus de la hepatitis B o de cualquier agente
infeccioso. Los reactivos deben ser considerados un peligro biolgico potencial y
manipularse con las mismas precauciones que se aplican a cualquier muestra de
sangre.
RIESGOS QUMICOS
Evite el contacto con reactivos que contengan TMB, perxido de hidrgeno y cido
sulfrico. Si entra en contacto con cualquiera de estos reactivos, lave con abundante
agua. TMB es un carcingeno potencial.
RECOLECCIN Y ALMACENAMIENTO DE ESPECMENES
Aproximadamente 1 ml de saliva es necesaria para la determinacin por duplicado.
Recoger 4-5 ml de saliva en un tubo de vidrio limpio (se puede utilizar Salivette por
Sarstedt) sin necesidad de fuerza o induccin y antes de comer, beber o lavarse los
dientes. Simplemente enjuague la boca con agua antes de la recoleccin.No utilice
muestras contaminadas con sangre. Almacene las muestras a 4C durante un
mximo de 24 horas o a -10 C o menos si el anlisis se realiza en una fecha
posterior. Considere todas las muestras humanas como posible material de riesgo
biolgico y tome las debidas precauciones al manipularlas.
PRETRATAMIENTO DE LA MUESTRA
Los tubos de muestras se colocan en un congelador y se dejan congelar. Cuando
estn listos para su uso, las muestras deben ser descongeladas y centrifugadas. Los
sobrenadantes se recogen y se vierte en tubos recin etiquetados.
REACTIVOS Y MATERIAL NECESARIO PERO NO PROPORCIONADO
1. Pipetas de precisin para dispensar 50, 100, 150 y 300 l l
2. Puntas desechables para pipetas
3. Agua destilada o desionizada
4. Agitador de placas (200 rpm)
5. Centrfuga de mesa
6. Lector de microplacas con un grupo de filtros a 450 nm y un lmite superior de OD
de 3.0 o mayor * (vase procedimiento de ensayo paso 10).
REACTIVOS SUMINISTRADOS
Pocillos separables - Placas de micropocillos recubiertos de anticuerpos de
conejo anti-cortisol - Listo para Usar.
Contenido: Una microplaca recubierta con anticuerpo policlonal de 96 pocillos (12x8)
en una bolsa resellable con desecante.
Conservacin: Refrigerar a 2-8 C
Estabilidad: 12 meses o segn lo indicado en la etiqueta.

Ag
HRP
CONC
Concentrado de conjugado peroxidasa (HRP) rbano de cortisol - X50
Contenido: Conjugado de cortisol-HRP en un tampn con base en protena con
conservante sin mercurio
Volumen: 300 l / vlal
Conservacin: Refrigerar a 2-8 C
Estabilidad: 12 meses o segn lo indicado en la etiqueta.
Preparacin: Diluya 1:50 en tampn de ensayo antes de su uso (ej.:, 40 l de PRH
en 2 ml de bfer de ensayo). Si toda la placa se va a utilizar diluir 240 l de HRP en
12 ml de bfer de ensayo. Deseche lo que quede.
CAL
N
Calibradores cortisol saliva- Listo para Usar. N = 0 a 5
Contenido: Seis frascos que contienen cortisol en un bfer basado en una protena
con un conservante que no contenga mercurio. Preparado mediante la adicin de
tampn con una cantidad definida de cortisol.
* A continuacin se mencionan concentraciones aproximadas, por favor, consulte las
etiquetas de los viales para conocer las concentraciones exactas.
Calibrador
Calibrador 0
Calibrador 1
Calibrador 2
Calibrador 3
Calibrador 4
Calibrador 5

Concentracin
0 ng / ml
1 ng / ml
3 ng / ml
10 ng / ml
30 ng / ml
100 ng / ml

Volumen / Vial
2,0 ml
0,6 ml
0,6 ml
0,6 ml
0,6 ml
0,6 ml

Conservacin: Refrigerar a 2-8 C


Estabilidad: 12 meses en frascos sin abrir o segn lo indicado en la etiqueta. Una vez
abiertos, los calibradores deben utilizarse dentro de 14 das o de manera alcuota y
almacenarlos congelados. Evite mltiples ciclos de congelacin y descongelacin.
CONTROL

PROCEDIMIENTO DEL ENSAYO


Pretratamiento de muestras:
Congelacin y centrifugacin.
Todos los reactivos deben estar a temperatura ambiente antes de su uso. Los
calibradores, controles y muestras de especmenes deben ser analizados por
duplicado.Una vez que el procedimiento se ha iniciado, se deben cumplir todos los
pasos sin interrupcin.
1. Prepare las soluciones de trabajo del conjugado HRP-cortisol y tampn de
lavado.
2. Retire el nmero necesario de tiras para microplacas. Vuelva a sellar la bolsa y
regrese las tiras no utilizadas al refrigerador.
3. Pipetee 50 l de cada calibrador, control y muestra de espcimen en duplicados
dentro del pocillo debidamente etiquetado.
4. Pipetee 100 l de solucin de conjugado en cada pocillo de trabajo (le
recomendamos utilizando una pipeta multicanal).
5. Incube en un agitador de placas (aproximadamente a 200 rpm) durante 45
minutos a temperatura ambiente.
6. Lave los pocillos 3 veces con 300 l de tampn de lavado diluido por pocillo y tape
sacuda la placa firmemente contra papel absorbente para asegurarse de que est
seca (se recomienda el uso de un sistema de lavado).
7. Pipetee 150 l de substrato TMB en cada pocillo a intervalos cronometrados.
8. Incube en un agitador de placas durante 15-20 minutos a temperatura ambiente (o
hasta que el calibrador cero alcance un color azul oscuro para la densidad ptica
deseada).
9. Pipetee 50 l de solucin de parada en cada pocillo a los mismos intervalos
cronometrados del paso 7.
10. Lea la placa con un lector de microplacas a 450 nm dentro de los 20 minutos
despus de adicionar la solucin de parada.
* Si la densidad ptica excede el lmite superior de deteccin o si no se dispone de
un filtro de 450 nm, se puede sustituir con un filtro de 405 o 415 nm. Las densidades
pticas sern menor, sin embargo, esto no afectar los resultados de las muestras de
control o pacientes.

Contenido: Un frasco con cortisol en tampn con base protenica con contenido de
conservante sin mercurio. Preparado mediante la adicin de tampn con una
cantidad definida de cortisol. Consulte en la etiqueta del frasco el valor esperado y el
rango aceptable. Volumen: 0,6 ml / vial
Almacenamiento: Refrigerar a 2-8 C
Estabilidad: 12 meses en envase cerrado o segn se indique en la etiqueta. Una vez
abierto, el control debe ser utilizado dentro de los 14 das o mantenido en alcuotas y
almacenado de manera congelada. Se deben evitar los mltiples ciclos de
congelacin y descongelacin.

CLCULOS
1. Calcule la media de densidad ptica para cada duplicado de calibrador.
2. Dibuje una curva de calibracin en papel semi-logartmico con las densidades
ptica promedio en el eje Y y las concentraciones de calibracin en el eje X. Si se
est utilizando un programa de inmunoensayo, se recomienda una curva de 4
parmetros.
3. Calcule la media de densidad ptica de cada duplicado de muestra desconocida.
4. Lea los valores de las muestras desconocidas directamente de la curva de
calibracin.
5. Si la muestra presenta ms de 100 ng/ml entonces dilyala con calibrador 0 en un
dilucin de no ms de 1:8. El resultado obtenido debe ser multiplicado por el
factor de dilucin.

WASH

DATOS TABULADOS

Control - Listo para Usar.

SOLN CONC

Solucin de lavado concentrada - X10


Contenido: Una botella de tampn con un detergente no inico y un conservante sin
mercurio.
Volumen: 50 ml / botella
Almacenamiento: Refrigerar a 2-8C
Estabilidad: 12 meses o segn lo indicado en la etiqueta.
Preparacin: Diluya 1:10 en agua destilada o desionizada antes de su uso. Si se va a
utilizar toda la placa diluya 50 ml de concentrado tampn de lavado en 450 ml de
agua.
ASS

BUF

Tampn de ensayo - Listo para Usar.


Contenido: Un vial que contiene un tampn con base en protena con conservante sin
mercurio.
Volumen: 15 ml / vial
Conservacin: Refrigerar a 2-8 C
Estabilidad: 12 meses o segn lo indicado en la etiqueta.
CHROM

TMB

Sustrato TMB - Listo para Usar.


Contenido: Una botella que contiene tetrametilbenzidina y perxido de hidrgeno en
un tampn con contenido sin DMF o con DMSO.
Volumen: 16 ml / botella
Conservacin: Refrigerar a 2-8 C
Estabilidad: 12 meses o segn lo indicado en la etiqueta.
STOP SOLN
Solucin de parada - Listo para Usar.
Contenido: Un vial que contiene cido sulfrico a 1M.
Volumen: 6 mL / vial
Conservacin: Refrigerar a 2-8 C
Estabilidad: 12 meses o segn lo indicado en la etiqueta.

Calibrador

DO 1

DO 2

0
1
2
3
4
5
Desconocido

2.241
1.965
1.757
1.221
0.540
0.222
0.287

2.133
1.914
1.799
1.254
0.502
0.216
0.283

DO
media
2.187
1.940
1.778
1.238
0.521
0.219
0.285

Valor
(ng / ml)
0
1
3
10
30
100
63

CURVA DE CALIBRACIN
nicamente ejemplo de curva. NO utilice para calcular los resultados.

CARACTERSTICAS DE DESEMPEO
SENSIBILIDAD
El lmite de deteccin se calcula a partir de la curva de calibracin, mediante la
determinacin de la concentracin resultante de la DO media del calibrador 0
(basado en 10 anlisis repetidos) menos SD 2. Por lo tanto, la sensibilidad del kit
DIAsource Cortisol Saliva de ELISA es de 1,0 ng / ml.

LINEALIDAD
Se diluyeron tres muestras de saliva de paciente con calibrador 0. Los resultados (en
ng/ml) se tabulan a continuacin:

ESPECIFICIDAD (REACTIVIDAD CRUZADA)


Los siguientes compuestos fueron probados frente a la reactividad cruzada con el kit
Cortisol Saliva de ELISA con reaccin cruzada de cortisol al 100%.

1
1:2
1:4
:8

Resultado
Observado.
18,18
10,32
5,09
2,20

Esteroides
Cortisol
Prednisolona
Corticosterona
Desoxicorticosterona
Progesterona
Cortisona
Desoxicortisol
Pednisone
Dexametasona

2
1:2
1:4
1:8
3
1:2
1:4
1:8

% de reactividad cruzada
100
13.6
7.6
7.2
7.2
6.2
5.6
5.6
1.6

No se detect ninguna reaccin cruzada con DHEAS y Tetrahydrocortisone.


Tenga en cuenta que se observa una reactividad cruzada de 13,6% con
prednisolona. Ya que la prednisona se convierte en prednisolona in vivo, se debe
tener precaucin al analizar los niveles de cortisol de pacientes que estn recibiendo
terapia.

Muestra

Result Esperado % de
recuperacin
9.09
4.55
2.27

113.5
112.1
96.7

49,89
28,03
13,29
7,97

24.95
12.47
7.24

112.3
106.6
110.1

68,53
34,27
17,13
8,57

31.49
13.81
7.48

91.9
80.6
87.3

VALORES NORMALES ESPERADOS


En cuanto a todos los ensayos clnicos, cada laboratorio debe recoger datos y
establecer su propio rango de valores normales esperados.
Muestras al azar de hombres y mujeres fueron tomadas en la madrugada y
presentaron un rango absoluto de:
5 - 21,6 ng / ml

PRECISIN INTRAENSAYO
Se analizaron tres muestras diez veces cada una en la misma curva de calibracin.
Los resultados (en ng / ml) se tabulan a continuacin:
Ejemplo:
1
2
3

Media
6.6
24.8
52.4

SD
0.68
1.98
3.40

CV%
10.3
8.0
6.5

PRECISIN INTER-ENSAYO
Se analizaron tres muestras diez veces durante un perodo de cuatro semanas. Los
resultados (en ng / ml) se tabulan a continuacin:
Ejemplo:
1
2
3

Media
6.3
23.7
51.8

SD
0.63
2.06
3.37

CV%
9.8
8.7
6.5

RECUPERACIN
Se prepararon muestras sobrecargadas adicionando cantidades definidas de cortisol
a tres muestras de saliva de paciente (1:1). Los resultados (en ng / ml) se tabulan a
continuacin:
Muestra
1 no cargada
+ 1.0
+ 10
+ 100
2 no cargada
+ 3.0
+ 30
+ 100
3 no cargada
+ 3.0
+ 10
+ 30

Resultado
Observado.
6.28
4.14
9.05
61.85
8.03
6.05
20.64
52.20
6.98
5.38
8.76
19.00

Result
Esperado
3.64
8.14
53.14
5.52
19.02
54.02

% de
recuperacin
113.7
111.2
116.4
109.6
108.5
96.6

4.99
8.49
18.49

107.8
103.2
102.8