Planta Piloto de

Ciencia y Tecnologa de los Alimentos

Prcticasanlisisqumicodelosalimentos

PRCTICA4:ANLISISDEPROTENAS
1.DETERMINACINDELAPROTENABRUTAPORELMTODODEKJELDAHL.
1.1.FUNDAMENTO:
En los anlisis de rutina se suele determinar el contenido de nitrgeno total y expresar el
conjunto de sustancias nitrogenadas como % de nitrgeno total o como porcentaje de
protenas. La estimacin del contenido de protenas de los alimentos a partir de la
determinacin del contenido de nitrgeno total no siempre es correcta pero en general el
contenido de compuestos nitrogenados no proteicos es pequeo comparado con el de las
protenasenlamayoradelosalimentos.
En1883elinvestigadordansJohannKjeldahldesarrollelmtodomsusadoenlaactualidad
para el anlisis de protenas (mtodo Kjeldahl) mediante la determinacin del nitrgeno
orgnico. En esta tcnica se digieren las protenas y otros componentes orgnicos de los
alimentos en una mezcla con cido sulfrico en presencia de catalizadores. El nitrgeno
orgnicototalseconviertemedianteestadigestinensulfatodeamonio.Lamezcladigerida
seneutralizaconunabaseysedestilaposteriormente.Elamoniacoliberadoesarrastradopor
destilacinyrecogidoenunasolucindecidobrico.Losanionesdelboratoasformadose
titulan con HCl estandarizado para determinar el nitrgeno contenido en la muestra. Las
etapasgeneralesdelmtodoson:
A.DIGESTIN:sellevaacaboconH2SO4enpresenciadeuncatalizadorycalor:

(1)Protena+H2SO4catalizadores(NH4)2SO4

calor

B. NEUTRALIZACIN Y DESTILACIN: neutralizacin del (NH4)2SO4 digerido con una base

fuerte(disolucindeNaOH,35%)seguidadeunadestilacinsobreunvolumenconocidodeun
cidofuerte(disolucindecidobricoal4%):

(2)(NH2)SO4+2NaOH2NH3+Na2SO4+2H2O

(3)NH3+H3BO3(cidobrico)NH4+H2BO3(inborato)

C.VALORACIN:Elaninborato(proporcionalalacantidaddenitrgeno)estituladoconHCl
estandarizado:

(4)H2BO3+H+H3BO3

1.2.REACTIVOSYMATERIALNECESARIOS,MUESTRAS:
y
y
y
y
y
y

cidoSulfrico9598%
NaOH,solucin35%
Indicadormixto,especialparatitulacionesdeamoniaco
CatalizadorKjeldahl
cidobrico,solucinal4%
HCl0,31N
1

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y
y
y
y

Unidaddigestora(BlocDigest)
Colector/Extractordehumos
DestiladorProNitroIII
Buretaparavaloracin

Muestras
y Harinadetrigo
y Lecheenpolvo
y Salchichafrankfurt

1.3.PROCEDIMIENTO:
A)Digestin:
Pesar 1 g de muestra perfectamente molida y homogeneizada e introducirlo en un tubo de
digestin.Aadiraltuboconmuestra5gdecatalizadorKjeldahl(1pastillas),10mLdecido
sulfricoal9598%.
Colocar los tubos de digestin con las muestras en el Blocdigest con el colector de humos
funcionando.Realizarladigestinaunatemperaturade400Cyuntiempode30minutos.
Dejar enfriar la muestra a temperatura ambiente. Dosificar lentamente 50 ml de agua
destiladaen cadatubodemuestra (concuidadoy dejandocaerelagualentamente porlas
paredesdeltubo).Dejarenfriarlamuestraatemperaturaambientedurante5minutos.
B)Neutralizacinydestilacin:
Aadir25mLdecidobricoenunmatrazerlenmeyerde250mLy2o3gotasdeindicador
mixto.Colocarelerlenmeyerenlaalargaderadelrefrigeranteteniendolaprecaucindeque
staquedesumergidadentrodeladisolucindecidobrico.
Colocareltuboconlamuestraenelladoizdodeldestilador.
Unavezcolocadoseltubodemuestrayelerlenmeyerconelcidobrico,dosificarunos40mL
deNaOH(indicarenelequipolacantidaddeNaOH)einiciarladestilacin.
La destilacin debe prolongarse el tiempo suficiente para que se destilen un mnimo de 150
mL,aproximadamentede5a10minutos.
c)Valoracin:
Valorarconcidoclorhdrico0,31Neldestiladoobtenido,hastaquelasolucinviredeverdea
violeta.
Calcularel%deprotenaaplicandolassiguientesecuaciones:

%Nitrgeno=

1,4x(V1V0)xN
P

%Protena=%NitrgenoxF
2

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Donde:
P=pesoengdelamuestra
V1=volumendeHClconsumidoenlavaloracin(mL)
N=normalidaddelHCl
V0=volumendeHClconsumidoenlavaloracindeunblanco(mL)
F= Factor de conversin para pasar de contenido en nitrgeno a contenido en protenas. La
mayoradelasprotenascontienenun16%deN2,demodoqueelfactordeconversines6,25
(100/16=6,25),perosehanobtenidoempricamenteotrosfactoresdeconversinenfuncin
delamateriaprimautilizada.

Factoresdeconversindenitrgenoaprotenaparadiversosalimentos

FACTOR
Huevosocarnes
6,25
Productoslcteos
6,38
Trigo
5,70
Otroscerealesysemillasoleaginosas
6,25
Almendras
5,18
CacahuetesynuecesdelBrasil
5,46
Otrosfrutossecosderbolynuezdecoco
5,30

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2.MTODODEBIURET
2.1.FUNDAMENTO
Cuando los iones cpricos se acomplejan, bajo condiciones alcalinas, con los enlaces
peptdicos(desustanciasquecontengan,almenos,dosenlacespetdicos,comolasprotenas)
seproduceuncolorvioletapurpreo,cuyaabsorbanciapuedeserdeterminadaa540nm.La
intensidaddelcolor(oabsorbancia)esproporcionalalcontenidoenprotenasdelamuestra.
Este mtodo es utilizado para determinar las protenas contenidas en los cereales, carne,
protenasdelassemillasdesojaycomoensayocualitativoparaelpienso.Sepuedeutilizaras
mismo,paramedirelcontenidoenprotenadelosextractosdeprotenas.
2.2.MATERIALYREACTIVOSNECESARIOS,MUESTRA
y
y

y
y

Disolucinpatrndealbminasricabovina(BSA,4mg/ml)
ReactivodeBiuret:sulfatodecobre,NaOHytartratodesodioypotasio,elcualseusapara
estabilizarelincpricoenladisolucinalcalina.
Muestras:
Lactosuerobovino
SolucinBSA6mg/ml

2.3.PROCEDIMIENTO
Sedaninstruccionesparaelanlisisporduplicado:
1. Preparar las soluciones estndar. Para ello, se prepara una solucin de albmina
srica bovina de 8 mg /ml (Pasar 48 mg de albmina y disolverlos en 6 ml de agua
destilada) y haciendo las diluciones que se indican a continuacin. Los tubos
contendrnde0a8mg/mldealbmina.

Albminasricabovina(mg/ml)

ml
disolucin
patrn
albmina

de

Blanco

0.5

0.25

0.5

3.75

3.5

de

mL de agua
destilada

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2. PrepararsolucionesdelasmuestrasdelactosueroyBSA

Muestras
1/4

1/2

Neta

Muestras

mlaguadestilada

3. Incubarlassolucionesestndarodelamuestra.Aadirporduplicadoalostubosde
ensayo1mldelassolucionesestndarodelamuestray1.5mldelReactivodeBiuret
eincubara37Cdurante30minutos.
4. Leerlaabsorbancia:Utilizarelcerodelasolucinestndarparahacerelblanco.Leer
laabsorbanciadelosestndaresydelasmuestrasa560nm.Tomarlalecturadelos
tubos de la curva de calibrado desde la concentracin inferior a la superior y
seguidamente,lasdelasmuestrasdelactosuero.
5. Calcular la recta de calibrado: Con los datos de absorbancia obtenidos con las
soluciones estndar, construir una curva de calibrado y determinar la ecuacin de la
recta
6. Determinar la concentracin de protena de la muestra: Calcular el contenido en
protena de las soluciones de las muestras de lactosuero utilizando la recta de
calibrado.

3.ESPECTROFOTOMETRAULTRAVIOLETA
Medirlaabsorbanciaa280nmdelassolucionesdeBSA(Neta,1/2,1/4,1/8y1/16).
Representarlaabsorbanciafrentealaconcentracin.
4.COMENTAR
Comentar los resultados obtenidos para las soluciones de BSA por los dos mtodos
usadosenfuncindelaprotenaquesehapesado.