Universidad de Carabobo

Facultad de Ciencias de la Salud

Escuela de Ciencias Biomdicas y Tecnolgicas
Departamento de Microbiologa
Asignatura: Inmunologa

Clulas del Sistema Inmune. Tinciones

Introduccin
El Sistema inmunitario (SI) est integrado por clulas, tejidos y rganos, a travs de los cuales
cumple con la funcin de defensa contra agentes agresores exgenos y endgenos como
microorganismos y molculas reconocidas como extraas. Una de las actividades del bioanalista
en el laboratorio clnico, es la identificacin y cuantificacin de las clulas del SI en muestras
biolgicas (sangre, orina, lquido cefalorraqudeo, moco nasal, heces, entre otras) con la finalidad
de

diagnosticar

una

enfermedad

(infecciosa,

inmunodeficiencia) y controlar su evolucin.

autoinmune,

por

hipersensibilidad

Esta tarea se ve facilitada por la aplicacin de

diferentes tcnicas de coloracin para aumentar el contraste entre las distintas clulas y resaltar
sus caractersticas diferenciales, ya que las clulas observadas directamente al microscopio son
incoloras y con el mismo ndice de refraccin.

La exanimacin microscpica comienza con la realizacin de un frotis o extendido sobre una

lmina portaobjeto, el cual debe someterse, en algunas ocasiones, a fijacin para posteriormente
aplicar el procedimiento de coloracin.
La fijacin es el proceso por el cual se conservan y preservan en su posicin las estructuras
internas y externas de las clulas para obtener preparados duraderos que conservan la estructura
morfolgica y qumica que presentaban las clulas y tejidos en estado vivo. La fijacin qumica
puede realizarse con sustancias qumicas, que varan segn el procedimiento tintorial que se
aplicar posteriormente, son ejemplos el metanol (empleados para fijar frotis que sern sometidos
a la tincin de Gram y de Giemsa), el formol y la acetona fra. La fijacin fsica, emplea calor (la
llama de un mechero) como agente fijador. La manera en la que actan los fijadores, sea fsico o
qumico, es por inactivacin de las enzimas y desnaturalizacin de protenas. Las cualidades de
un buen fijador son: accin rpida, alto poder de penetracin, conservar las estructuras celulares y
permitir procedimientos posteriores tales como la coloracin.
Los colorantes son sustancias que confieren color a otros cuerpos y se define a la coloracin
como el procedimiento mediante el cual un cuerpo toma color por la accin del colorante y no se
destie despus del lavado con un solvente. El color adquirido por un cuerpo se puede explicar
por varias teoras. La teora qumica admite que el colorante se une a una sustancia coloreable
(tejidos o clulas) formando sales insolubles, mientras que la teora fsica sostiene que es un
fenmeno de adsorcin. En el laboratorio, los colorantes ms usados son los sintticos (colorantes
de anilina), estos son sales que poseen un grupo cromforo, grupos con dobles enlaces
conjugados que dan color al colorante y pueden unirse a las clulas o tejidos mediante enlaces
inicos, covalentes o hidrfobos.

Colorantes cidos o aninicos: cuando el cido es el responsable del color y se unen a

estructuras con carga positiva, coloreando el citoplasma. Ejm.: eosina rosa de bengala y fucsina
cida). Colorantes bsicos o catinicos: se caracterizan porque la base o grupos con carga
positiva proporciona el color, se unen a estructuras de carga negativa y colorean el ncleo celular.
Ejm.: azul de metileno. Colorantes neutros: cuando la base y el cido son coloreados (tien el
ncleo de un color y el citoplasma de otro. Ejm: eosinato de azul de metileno. La coloracin
puede ser simple (un solo colorante), como la del leucograma fecal, que emplea azul de metileno
y diferencial o combinada (dos o ms colorantes), como la tincin de Gram, Ziehl-Neelsen y
pancrmica cuando en un solo bao colorante actan todos los colorantes neutros que se
necesitan (Giemsa, Wright, Pappenheim).

En la prctica diaria del Bioanalista, estos procedimientos de coloracin se aplican sobre un

extendido o frotis, los cuales son delgadas pelculas de la muestra biolgica a estudiar, tales
como: sangre, lquido sinovial, heces, moco nasal, esputo, entre otras. Algunas coloraciones,
como la de Giemsa, requieren la fijacin del frotis, el cual es un procedimiento que preserva la
estructura morfolgica y qumica de las clulas y provocan la desnaturalizacin de las protenas
del citoplasma, siendo el metanol, el fijador ms empleado para tal fin.

Para la coloracin de frotis de sangre perifrica y mdula sea, se usan colorantes tipo
Romanowsky, estos consisten en una mezcla de eosinato de azul y violeta de metileno. El azul de
metileno colorea la cromatina y las sustancias azurfilas, mientras que el violeta de metileno es el
responsable de la coloracin metacromtica de granulaciones basfilas. Los colorantes tipo
Romanowsky son inactivos cuando estn disueltos en metanol y al agregar agua, precipitan y es
cuando actan, volvindose inactivos de nuevo, cuando han precipitado totalmente. La tincin de
Wright y Giemsa son ejemplos de coloracin tipo Romanowsky.

Otras tinciones en las que se observan clulas del Sistema Inmune y del epitelio son las tinciones
dde Gram y Ziehl-Neelsen (cido-alcohol resistencia)

Objetivos:
1. Realizar frotis o extendidos y aplicar la tcnica de coloracin apropiada para sangre, moco
nasal, heces u otras muestras disponibles.
2. Reconocer e identificar las clulas del Sistema Inmunitario:

Sangre y otras muestras biolgicas

teidas con Giemsa o Wright: Neutrofilos

(PMN), eosinfilos, basfilos, linfocitos y monocitos

Heces teidas con azul de metileno o Gram: PMN y mononucleares.

Moco nasal teido con tincin de Hensel: eosinfilos, PMN y mononucleares

Muestras biolgicas teidas con Gram: PMN, mononucleares y bacterias Gram positivas
y/o negativas.

Muestras biolgicas teidas con Ziehl-Neelsen: PMN, mononucleares y bacilos acidoalcohol resistentes y bacterias no cido alcohol resistentes.

Actividades del facilitador:

1. Comentar la importancia de las tcnicas de coloracin en el diagnstico y control de las
enfermedades en el ejercicio del Bioanlisis
2. Demostrar el procedimiento para la realizacin de extendidos o frotis en lminas y
laminillas.
3. Relacionar las variaciones leucocitarias con diversas patologas
Actividades del estudiante:
1. Realizar extendidos de sangre obtenida por puncin capilar y venosa
venosa,, moco nasal, moco
fecal y otras muestras biolgicas.
2. Teir los extendidos o frotis de:
a. Sangre
angre con la tincin de Wright y Giemsa
b. Moco nasal con tincin de Gram y Hensel
c. Moco fecal con azul de metileno, Gram y Wright/Giemsa
d. LCR, orina y otras muestras biolgicas con Gram y Wrigth/Giemsa.
3. Reconocer las clulas del SI en sangre, moco fecal, nasal y otras muestras biolgicas.

Preparacin de frotis o extendidos

Para la realizacin de frotis, se deben usar lminas y laminillas limpias, desengrasadas con
solucin jabonosa y alcohol 95%.

Sangre: .Se
Se recomienda usar sangre capilar o una gota de sangre sin anticoagulante para evitar
la alteracin de la morfologa celular
celular. Hay dos formas de realizar el frotis, con
on lminas portaobjeto
o con laminillas cubreobjetos. Se deja secar
secar y se procede a la tincin con Giemsa. El
procedimiento con Wright no requiere fijacin.
fijacin.de sangre

Frotis en lmina portaobjeto:

1. Coloque la lmina sobre el mesn y deposite un gota de sangre (10 ul aproximadamente)
2. Tome
me una segunda lmina y coloque sobre la gota. La sangre se distribuir por capilaridad
3. Deslice la segunda lmina de manera uniforme hasta el otro extremo de la lmina del
mesn y deje secar. (Fig.1)

Frotis con laminillas cubreobjeto:

1. Sostenga entre el pulgar y el dedo ndice, una laminilla y deposite la gota de sangre en el
centro de la misma
2. Coloque la otra laminilla sobre la que contiene sangre, de tal manera queden formando
una estrella
3. Separe las laminillas por desplazamiento en direcciones opuesta (laminilla superior hacia
la izquierda y la otra hacia la derecha). Cuidando de no levantar las laminillas, deje secar
(Fig.2)

1 laminilla
Laminilla

deslizar
deslizar

gota de sangre

2 laminilla

Fig.2

Orina:
Para aplicar la tincin de Gram, se

realiza el extendido con orina sin centrifugar en una

lmina portaobjeto. Se fija con calor o metanol (se deja secar) y se tie con Gram.
Si se requiere realizar un recuento diferencial, se centrifuga la orina, se realiza el extendido con
el sedimento y se aplica la tincin de Giemsa (previa fijacin con metanol) o de Wright (no
necesita fijacin).
LCR:
Para el estudio citolgico del LCR, como parte del estudio citoqumico o del cultivo, se
emplea el sedimento, ya sea para aplicar una tincin Giemsa o Wright, Gram o Ziehl-Neelsen.
Procedimiento del extendido:
Centrifugar el LCR a baja revolucin por 5 min (el tiempo puede variar segn las normas de
procedimientos estandarizadas).
Descartar el sobrenadante para el estudio qumico y tomar el sedimento con pipeta Pasteur o
automtica.
Colocar la gota del LCR sobre una lamina y extender suavemente haciendo un valo pequeo.
Dejar secar
Fijar con metanol si se aplica la tincin de Giemsa o Gram. Tambin se puede fijar al calor
cuando se aplica la tincin de Gram o Ziehl-Neelsen.
Aplicar el procedimiento tintorial.
El anlisis de LCR es considerado una emergencia mdica, y la vida del paciente puede depender
de ese resultado. Cuando el LCR debe ser cultivado, el resultado de la tincin de Gram es un
dato de suma importancia que el mdico le solicitar rpidamente al Bioanalista del rea de
Bacteriologa, para aplicar la terapia antibacteriana adecuada y garantizar la vida del paciente.
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Heces:
El frotis de las heces se realizar a aquellas muestras diarreicas que presenten moco y/o sangre.

Procedimiento del extendido:

Tomar una pequea porcin del moco o de la seccin con sangre con un aplicador de madera;
en caso de que al muestras sea lquida, usar una pipeta Pasteur desechable.
Colocar sobre una lmina portaobjeto y extender haciendo un valo. Dejar secar.
Aplicar el azul de metileno (no requiere fijacin previa del extendido), tincin de ZiehlNeelsen o Kinyoun (para la identificacin de Cryptosporidium e Isospora) o Gram. Las tinciones
de Gram y Kinyoun si requieren fijacin.
Secreciones y muestras en Hisopos:
Muestras nasales (incluyendo aquellos destinados a la investigacin de eosinfilos con la
tincin de Hensel), secreciones vaginales, uretrales, oculares, ticas y de heridas son ejemplos de
muestras que pueden ser tomadas con hisopos. Estas muestras pueden estar destinadas al
cultivo, as que primero se siembran en los medios de cultivo apropiados y por ltimo se realiza el
extendido.
Procedimiento del extendido:
Tomar el hisopo y girar sobre la lmina, hasta hacer un extendido de 2 cm aproximadamente.
Dejar secar, fijar (de ser necesario) y teir.
Otros lquidos biolgicos:
Procedimiento para lquido seroso:
Centrifugar el lquido, el sobrenadante se emplea para el estudio qumico y con el
sedimento se realiza el extendido.
Tomar el sedimento con pipeta Pasteur o automtica y colocar el volumen del lquido en la
lmina.
Extender la muestra en la lmina hasta hacer un valo
Secar al aire el extendido y fijar, si el procedimiento tintorial lo amerita.
Aplicar la tincin de Giemsa, Wright, Gram, Ziehl-Neelsen para el recuento diferencial de
clulas.

Coloracin de Wright para sangre perifrica y otros lquidos biolgicos

No requiere fijacin previa
1. Realizar el frotis y dejar secar
2. Cubrir el frotis con solucin colorante de Wright (7 gotas) por 2 minutos (en esta etapa
ocurre la desnaturalizacin de las protenas por accin del metanol)
3. Colocar agua destilada (7 gotas), sople para mezclar hasta la formacin de un brillo
metlico (en esta etapa ocurre la coloracin)
4. Dejar actuar por 3 minutos
5. Lavar con agua y dejar secar
5

6. Colocar una gota de aceite de inmersin sobre el frotis teido y seco y colocar sobre la
gota una lmina o laminilla.
7. Observar al microscopio de campo claro con objetivo de 40X.

Resultados de la coloracin de Wright

En una buena tincin, el frotis debe presentar un color rosado a simple vista.
Microscpicamente:
1. Los hemates (glbulos rojos): son de color rosado
2. Los ncleos de los leucocitos: azul prpura
3. El citoplasma de los leucocitos neutrfilos maduros: rosado plido
4. El citoplasma de los linfocitos: azul claro o azul intenso (clulas plasmticas o linfocitos
reactivos)
5. El citoplasma de monocitos es azul-gris
6. Las granulaciones:
a. Neutrfilas: lila (granulaciones finas)
b. Eosinfilas. Naranja
c. Basfila: azul-negro o violeta ( son granulaciones gruesas)
d. Azurfilas: prpura-rojizas

Polimorfonuclear neutrfilo: citoplasma rosado, granulaciones finas prpura en

el citoplasma (como un punteado), ncleo muy lobulado azul prpura

Basfilo: ncleo bilobulado azul prpura (oculto por los grnulos) y citoplasma con
gran cantidad de grnulos negros

Eosinfilo: ncleo bilobulado azul purpura, citoplasma lleno de granulaciones

naranja

Linfocitos: ncleo compacto, azul prpura y citoplasma azul celeste

Monocitos: ncleo arrionado, laxo azul prpura, citoplasma azul gris

Coloracin de Giemsa
1. Realizar el frotis y dejar secar
2. Fijar con metanol en cantidad suficiente para cubrir el frotis. Fijar por 1 min
3. Eliminar el exceso o espere a que se evapore el metanol
4. Cubrir el frotis con solucin colorante de Giemsa durante 5 min
5. Lavar con agua y deje secar
6. Colocar una gota de aceite de inmersin sobre el frotis teido y colocar una lmina o
laminilla
7. Observar al microscopio con objetivo de 40X

Con la coloracin de Giemsa se observan muy bien las granulaciones acidfilas y basfilas, los
leucocitos (ncleo, citoplasma y granulaciones) se observan de manera similar a la coloracin de
Wright.
La observacin al microscopio ptico de frotis de sangre perifrica teidos con estas coloraciones
forma parte del hemograma o hematologa completa y ella permite realizar un recuento diferencial
de los leucocitos (frmula relativa) que contribuye al diagnstico de procesos patolgicos
infecciosos o de otra naturaleza.

Interpretacin:
El valor de leucocitos en el hombre oscila entre 5.000-10.000 clulas /mm3, en recin nacidos de
10.000 25.000 mm3 y en nios de 1 ao de 6.000 18.000/mm3

Valor en % de leucocitos

Valor absoluto de leucocitos /mm3

Neutrfilos

40 - 75

2.000 - 7.000

Eosinfilos

1-6

0 - 450

Basfilos

0-1

0 - 200

Linfocitos

20 - 45

1.500 - 4.000

Monocitos

2 - 10

200 - 800

Las leucocitosis (aumento en la concentracin de leucocitos) fisiolgicas se pueden encontrar

en: recin nacidos y nios de 1 ao de edad, al final del embarazo, en el parto y puerperio,
durante el esfuerzo fsico violento, miedo, emociones intensas y en el calor extremo y altura.

Leucocitosis:

Infecciosa: infecciones por bacterias y virus

No infecciosa: dolor intenso, cirugas, posthemorragia, quemaduras extensas, neoplasias,

leucemias, infarto al miocardio e intoxicaciones

Leucopenia (disminucin en la concentracin de leucocitos):

Infecciones por brucela y fiebra tifoidea

Infecciones virales: varicela, sarampin, dengue, gripe

Infecciones por protozoarios: malaria, kala-azar, tripanosomiasis

Algunas micosis: histoplasmosis

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Condiciones en las que ocurren alteraciones en las concentraciones de glbulos rojos:

Neutrofilia (incremento de neutrfilos, >10x109/litro): infecciones agudas bacterianas,
hongos, virus, procesos inflamatorios y traumatismo.
Neutropenia (disminucin de neutrfilos, <2x109/litro): infecciones bacterianas, virales
(gripe, mononucleosis, hepatitis, rubeola), por protozoarios (toxoplasmosis), enfermedades
autoinmunes (Lupus eritematoso sistmico).
Linfocitosis (incremento de linfocitos, >4,0 x 109/litro): fisiolgica (del 4to. mes de vida al 4to
ao de vida), en infecciones agudas (mononucleosis, tosferina, sarampin, rubela,
parotiditis) o crnicas (tuberculosis, brucelosis, sfilis).
Linfopenia (disminucin de linfocitos, <1,5x109/litro): inmunodeficiencias (de clulas B y T),
quimioterapia y corticoterapia.
Monocitosis (incremento de monocitos, >10%): infecciones bacterianas (listeriosis,
tuberculosis, sfilis, brucelosis, endocarditis bacteriana sub-aguda), Lupus eritematoso
sistmico, colagenosis vascular, enfermedad de Hodgkin, carcinoma de ovario, mama,
estmago y radioterapia.
Eosinofilia (incremento de esosinfilos, >0,35 x109/litro): parasitosis por helmintos, alergias,
afecciones dermatolgicas (psoriasis).
Basofilia (incremento de basfilos), tiene escaso inters, puede observarse en casos de
leucemia y policitemia vera

Investigacin de eosinfilos en moco nasal: coloracin de Hensel

El aumento de eosinfilos no se limita a la sangre perifrica, tambin los eosinfilos tisulares
resultan un hallazgo importante en los procesos alrgicos. La investigacin de eosinfilos en moco
nasal es un procedimiento rpido y fcil para evidenciar la eosinofilia tisular. Se le conoce como
citologa nasal o citograma nasal y segn el tipo celular predominante, se puede establecer un
diagnstico diferencial, por ejemplo, abundantes neutrfilos con bacterias incluidas, hace pensar
en un proceso de etiologa infecciosa bacteriana.

Procedimiento:
1. Dividir la lmina portaobjetos en dos e identificar como: I (fosa nasal izquierda) y D (fosa
nasal derecha)
2. Limpiar las fosas nasales del paciente: pedir que sople sobre un papel toalla (otras
muestras adecuadas son esputo y secrecin bronquial)
3. Raspar suavemente la mucosa nasal con un aplicador con algodn estril (uno para cada
fosa nasal)
4. Realizar el extendido haciendo giros sobre la lmina, deslizando suavemente para no
romper las clulas.
5. Fijar con metanol, cubriendo todo el frotis durante 1 minuto
6. Eliminar exceso de metanol o dejar que se evapore
7. Cubrir el frotis con eosina durante 15 min
8. Lavar con agua
8

9. Decolorar con metanol 1 min

10. Contrateir con azul de metileno 1 min
11. Lavar con agua
12. Decolorar con metanol 1 min
13. Lavar con agua y secar
14. Colocar una gota de aceite de inmersin sobre el frotis y colocar una laminilla
15. Observar con objetivo de 40X.

Lo ideal es contar 100 clulas y expresar el resultado como porcentaje de cada tipo celular
encontrado.

Interpretacin:

Negativo

< 5%

Leve

5 - 10%

Moderado

10 - 50%

Abundante

> 50%

Investigacin de leucocitos en heces: Leucograma fecal

La diarrea se caracteriza por el incremento en la frecuencia de las evacuaciones (>3 al da), con
alteracin en la consistencia (generalmente lquidas), asociadas o no a sntomas generales
(fiebre, escalofrio, nauseas y clicos). El conocimiento de los sntomas clnicos, signos (leucocitos
en la materia fecal, sangre oculta y eosinofilia),aumentan la posibilidad de identificar el agente
etiolgico y aplicar una terapia adecuada. El leucograma fecal permite identificar de una manera
rpida y fcil la presencia de polimornucleares (PMN) con una sensibilidad y especificidad del
75%. En diarreas de origen bacteriano (Salmonella, Shigella, E. coli, Campylobacter, etc.) y por el
protozoario Entamoeba histolytica, hay presencia de moco y PMN por una intensa respuesta
inflamatoria, mientras que en las diarreas de origen viral, estn ausentes estas clulas.
En casos de enfermedad inflamatoria intestinal, como la colitis ulcerosa (afeccin de la mucosa
del colon), tambin se pueden encontrar PMN.

Procedimiento:
1. Realizar un extendido delgado en una lmina. Tomar el rea con moco y/o sangre en las
heces. Dejar secar
2. Cubrir con azul de metileno por 5 min.
3. Lavar con agua. Dejar secar
4. Colocar una gota de aceite de inmersin sobre el extendido y cubrir con una laminilla
5. Observar al microscopio con objetivo de 40X: las clulas pueden ser polimorfonucleares
(PMN) (ncleos de color azul oscuro segmentados o multilobulares con citoplasma claro) o
mononucleares (1 ncleo azul oscuro y citoplasma claro)

PMN

Mononucleares

Referencias Bibliogrficas:
1. Di Fiore Mariano S. H. Diagnstico histolgico. Editorial Ateneo. Argentina.
2. Gua de trabajos prcticos de Hematologa. Escuela de Bioanlisis. Universidad de
Cararbobo. 2001.
3. Mckenzie SB. Hematologa clnica. 2da. Ed. Manual Moderno. Mexico. 2000.
4. Prescott L, Harley JP, Klein DA. Microbiologa. 5ta. Ed. McGraw Hill Interamericana.
Mexico. 2004.

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