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BR/EQ
VOLUME 36, NMERO 2, 2011

BIOSSENSOR AMPEROMTRICO PARA DETERMINAO DE

PERXIDO DE HIDROGNIO EM LEITE
Vitor Paulo Andrade da Silva1, Carlucio Roberto Alves1, Rosa Fireman Dutra2, Juliano Elvis de
Oliveira3, Davide Rondina4, Roselayne Ferro Furtado5
1

Departamento de Qumica, Universidade Federal do Cear, CEP 60740-000, Fortaleza-CE. E-mail:

vitorvolt@hotmail.com
2
Departamento de Engenharia Biomdica, Universidade Federal de Pernambuco
3
Departamento de Cincias e Engenharia de Materiais, Universidade Federal de So Carlos
4
Departamento de Veterinria, Universidade Estadual do Cear
5
Embrapa Agroindstria Tropical, Fortaleza-CE. E-mail: roselayne@cnpat.embrapa.br

Resumo:
______________________________________________________________________________
Um biossensor amperomtrico foi desenvolvido para deteco de perxido de hidrognio em
amostras de leite. O biossensor foi construdo a partir da imobilizao de enzima peroxidase
sobre eletrodo impresso de carbono. Parmetros de otimizao visando um melhor desempenho
do biossensor foram avaliados. O biossensor apresentou linearidade no intervalo de 5,0 a 40,0
mol L-1 de H2O2 em tampo fosfato. Em amostras de leite sem diluio, os limites de deteco e
quantificao foram de 0,42 mol L-1 e 1,39 mol L-1, respectivamente. O biossensor mostrou-se
uma alternativa sensvel e de baixo custo na deteco de H2O2 em amostras adulteradas de leite.

Palavras-chave: Peroxidase de raiz forte, eletrodo impresso, glutaraldedo, biossensor

1. Introduo

Ecl. Qum., So Paulo, 36 ,2011 143

A adio de perxido de hidrognio ao leite se reporta ao seu efeito antibacteriano e

sua funo de dissimulao das ms condies higinico-sanitrias de obteno, conservao
e/ou transporte do leite. Em contato com o leite, a degradao do perxido de hidrognio
promove a oxidao da espcie qumica tiocianato (SCN-) (componente natural do leite) em
outra espcie denominada hipotiocianato (SCNO-) que tem efeito antibacteriano ou
bacteriosttico [1]. Neste sentido, a adoo dessa prtica por produtores objetiva o
prolongamento da vida til do leite por eliminar ou inibir o desenvolvimento de bactrias
deterioradoras deste produto.
O mtodo de determinao de perxido de hidrognio recomendado pela Legislao
brasileira envolve titulao com permanganato de potssio e possui limite de deteco de 300
ppm. A utilizao de biossensores possibilitaria a deteco dessa substncia com limites de
deteco bastante menores, alm da praticidade e rapidez das anlises. Os biossensores
constituem uma alternativa rpida e conveniente para medidas analticas convencionais no
monitoramento de substncias qumicas e bioqumicas e em processos de fermentao e na
indstria de alimentos [2-3].
A peroxidase de raiz forte (HRP) atualmente usada em uma grande variedade de
sistemas analticos e de diagnsticos importantes em laboratrios clnicos, com grande potencial
de uso no desenvolvimento de biossensores. A aplicao dessa enzima para determinao de
substncias como a glicose, cido rico e colesterol em fluidos biolgicos, como sangue, plasma
e urina tem sido adotado satisfatoriamente [4].
As enzimas peroxidases podem ser classificadas em relao ao seu grupo prosttico
(stio ativo) em hmicas ou no-hmicas. Pertencente classe das hmicas, citamos a peroxidase
de raiz forte, utilizada neste trabalho. As hmicas apresentam um grupo heme ou
ferroprotoporfirina, formado por um on Fe3+ coordenado a uma protoporfirina IX. Esse grupo
catalisa reaes de hidrlise envolvendo o on ferro [5,6,7]. Quando a enzima peroxidase est
imobilizada na superfcie de um eletrodo, os intermedirios oxidados da enzima, Composto-I e
Composto-II, podem ser reduzidos para voltarem ao seu estado nativo por dois processos [8]
sendo um deles, a transferncia de eltrons mediada. Na transferncia mediada de eltrons a
enzima recebe eltrons de uma substncia doadora (mediador). A enzima ento regenerada e o
mediador, agora oxidada, reduzido por eltrons provenientes do eletrodo [9]. No presente
trabalho a hidroquinona foi escolhida como mediador eletroqumico do sistema.

Ecl. Qum., So Paulo, 36 ,2011 144

A tecnologia de screen-printing, conhecida tambm como silk-screen, tem sido

empregada com sucesso na fabricao de eletrodos [10]. Esta tcnica possibilita a produo em
larga escala de eletrodos a um baixo custo, com elevada reprodutibilidade, o que garante um
potencial de automao com timo custo-benefcio [11]. Outra vantagem do uso dessa tecnologia
a possibilidade de construo de eletrodos descartveis.
Nesse estudo, o eletrodo de trabalho consistiu de um eletrodo impresso com tinta
comercial condutora de carbono. As tintas de carbono so compostas basicamente por partculas
de grafite, solvente e um agente aglutinante. Na aplicao de sensores, so importantes, pois
geram baixas correntes de fundo e permitem trabalho em ampla janela de potencial [12, 13].
A etapa de incorporao do biocomponente ao eletrodo crucial no desenvolvimento
de um biossensor [14]. A imobilizao pode afetar a conformao da enzima, e assim sua
estabilidade, ou fazer com que os stios ativos se tornem menos acessveis para a difuso de
substratos. Sendo assim, o mtodo de imobilizao deve ser compatvel com a biomolcula que
est sendo imobilizada, com a superfcie do sensor ou matriz na qual est sendo imobilizada e
com o meio onde o sensor ser utilizado. Nesse trabalho foi utilizado o glutaraldedo, um
reagente bifuncional, para a imobilizao da enzima superfcie do eletrodo, onde, um grupo
aldedo de uma extremidade da molcula se ligou ao eletrodo e o outro grupo se ligou enzima.
O objetivo deste trabalho foi desenvolver um biossensor amperomtrico descartvel
de baixo custo para a deteco de perxido de hidrognio em amostras de leite. O desempenho
do biossensor foi avaliado em amostras de tampo contendo perxido de hidrognio e em
amostras de leite adulterado previamente no laboratrio com perxido de hidrognio, no intuito
de melhor estabelecer comparaes entre o funcionamento do mesmo em condies
experimentais e prticas.
2. Materiais e mtodos

2.1. Reagentes
Cloreto de potssio foi adquirido da Reagen e o cloreto de sdio da Dinmica. O
hexacianoferrato(III) de potssio, o glutaraldedo 25% (m/v), a hidroquinona e o perxido de
hidrognio 30% (m/v) foram obtidos da Vetec. A enzima peroxidase de horseradish Sigma
Type VI foi adquirida da Sigma Aldrich. O nitrognio utilizado para a remoo do oxignio do
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eletrlito suporte foi conseguido da White Martins com grau de pureza de 99,9%. A tinta
condutora de carbono utilizada na construo do eletrodo impresso foi adquirida da Eletrodag.
A folha de acetato que serviu como suporte do eletrodo impresso era da marca Apollo. Todos
os outros reagentes qumicos utilizados foram de grau analtico. As solues tampo fosfato que
foram utilizadas como eletrlito suporte foram obtidas pela mistura das solues de Na2HPO4 0,1
mol L-1 e de NaH2PO4 0,1 mol L-1. Todas as solues foram preparadas com gua deionizada.
2.2. Preparao dos eletrodos impressos
A impresso dos eletrodos foi feita com a deposio da tinta condutora de carbono
Eletrodag sobre a superfcie de folha de acetato pelo mtodo casting no intuito de simular a
tcnica industrial de screen-printing. Nesse mtodo, a tinta forada a passar atravs de uma
tela ou molde vazado para ser depositada sobre um substrato plano. O desenho, definido pelas
partes abertas da tela, reproduzido no substrato.
Os eletrodos foram feitos com rea geomtrica de 0,78 cm2 e largura da trilha igual a
2,0 mm. Aps o processo de impresso, foram levados estufa a 80C por uma hora para a
secagem da tinta. Em seguida, aplicou-se a eles uma camada parcial de adesivo de PVC que
definiu a rea para ser a superfcie do eletrodo e a rea a ser usada como contato eltrico.
Os eletrodos impressos (EI) foram submetidos a uma srie de 10 ciclos em
voltametria cclica com potenciais de inverso de -600 mV e +600 mV a velocidade de varredura
igual a 100 mV s-1 em tampo fosfato 0,1 mol L-1 pH 6,0. De acordo com BODOKI et al (2008)
[15], esse procedimento contribui tambm para uma diminuio da hidrofobicidade da
superfcie.

2.3. Preparao do biossensor

Os EI foram imersos durante uma hora em soluo de glutaraldedo (GA) 2,5% (m/v) e,
posteriormente imersos por uma hora em soluo de enzima peroxidase de raiz forte (HRP) 1 mg
mL-1. A soluo de HRP consistia de HRP solubilizada em tampo fosfato 0,1 M pH 6,5. Ao
final de cada procedimento os EI foram lavados com gua deionizada para a remoo de
excessos e molculas fracamente adsorvidas.

Ecl. Qum., So Paulo, 36 ,2011 146

2.4. Instrumentao
Uma clula eletroqumica de 10 mL com eletrodo auxiliar de platina, eletrodo de
referncia de Ag/AgCl e eletrodos impressos foi utilizada para as medidas voltamtricas e
amperomtricas em PotenciostatoGalvanostato Autolab PGSTAT302N. As solues foram
purgadas com nitrognio por 10 minutos antes de cada ensaio.

2.5. Caracterizao e otimizao da resposta do biossensor

Os parmetros de resposta do biossensor EI-GA-HRP estudados foram o efeito do
potencial de trabalho, efeito do pH, concentrao do mediador, concentrao enzimtica,
estabilidade do biossensor e caracterizao superficial do biossensor.

2.6. Caracterizao superficial do biossensor

A caracterizao microscpica da superfcie dos eletrodos impressos e da superfcie
do biossensor foi realizada mediante emprego de um microscpio eletrnico de varredura ZEISS
modelo DSM-960, operando com acelerao de voltagem de 5kV.
2.7. Validao do biossensor em amostras de leite comercial longa vida (UHT)
A validao do biossensor foi realizada em amostras de leite comercial longa vida
(UHT), diludas na proporo de 1:100, 1:10 e 1:2, e em leite no diludo. As diluies foram
feitas em tampo fosfato 0,1 mol L-1 pH 6,5 e adicionado de hidroquinona 30 mol L-1 (Eapl = 250 mV vs. Ag/AgCl).
Os intervalos de confiana para os limites de deteco e de quantificao do
biossensor foi calculado utilizando o teste t de Student com nvel de confiana de 95%.
3. Resultados

3.1. Preparao e otimizao do biossensor

Para preparar a soluo de enzima, foi escolhido o tampo fosfato, pois, dentre os
analisados, este proporcionou melhor resposta para o sinal do biossensor na presena de perxido
de hidrognio utilizando HRP nos trabalhos desenvolvidos por Rosatto (2001) e [7] Mendes
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(2008) [16]. O pH da soluo tampo utilizada nos ensaios iniciais foi 6,0, valor ideal para a
HRP segundo recomendaes do distribuidor da enzima (Sigma Aldrich).
A Figura 1 indica as curvas voltamtricas obtidas para o EI, EI-GA e EI-GA-HRP,
em tampo fosfato 0,1 mol L-1 contendo hidroquinona 25 mol L-1 e H2O2 80 mol L-1 com
velocidade de varredura igual a 50 mV s-1. Podemos observar que EI e EI-GA possuem curvas
com perfis semelhantes, com picos de reduo e oxidao para a hidroquinona em torno de -100
e 500 mV, respectivamente. Uma curva bastante caracterstica para o biossensor EI-GA-HRP
tambm pode ser vista. O pico em torno de -250 mV estaria relacionado reduo eletroqumica
da hidroquinona que foi oxidada no processo de regenerao da HRP [9, 17-18].
1,5
1,0
0,5

i / A

0,0
-0,5
-1,0
-1,5
-2,0
-2,5
-0,6

-0,4

-0,2

0,0

0,2

0,4

0,6

E / V vs. Ag/AgCl
Figura 1 Curvas voltamtricas para EI (), EI-GA (----) e EI-GA-HRP () em tampo
fosfato 0,1 mol L-1 pH 6,0 contendo hidroquinona 25 mol L-1 como mediador e 80 mol L-1 de
perxido de hidrognio. Velocidade de varredura: 50 mV s-1.
Ensaios de cronoamperometria foram realizados para avaliar a influncia do
potencial aplicado, efeito do pH, concentrao do mediador e concentrao enzimtica na
resposta do biossensor. A Figura 2a indica que a corrente de reduo aumentou medida que o
potencial variou de -100 a -250 mV, a partir de onde praticamente no se altera. Ento, o
potencial selecionado para os ensaios subseqentes foi -250 mV. Potenciais relativamente altos
devem ser evitados para diminuir a probabilidade de outras espcies qumicas indesejadas em
soluo sofrerem processo oxirredutivo, e assim, prejudicarem a leitura eletroqumica. O
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perxido de hidrognio pode ser oxidado em eletrodo de platina ou carbono a valores de

potencial entre 300 e 600 mV [19]. Dessa forma, a utilizao de mediadores eletroqumicos
vantajosa, pois o potencial de trabalho do eletrodo enzimtico determinado pelo potencial de
oxirreduo do mediador. CAMACHO et al (2007) [20], fazendo experimentos com peroxidase
imobilizada em eletrodo de ouro modificado com -ciclodextrina e utilizado hidroquinona como
mediador, definiu em seu estudo -250 mV vs. Ag/AgCl como potencial de trabalho mais
apropriado.
O pH do meio afeta os grupos ionizveis da estrutura enzimtica, por isso, a resposta
eletrocataltica do biossensor enzimtico bastante influenciada pela variao de pH. A Figura
2b indica um aumento na corrente de reduo com o aumento do pH, sendo mximo em 6,5. O
pH de 6,5 foi adotado para os estudos posteriores, sendo este tambm prximo ao pH natural do
leite.
A Figura 2c indica a influncia da concentrao do mediador hidroquinona na
resposta do biossensor. H um aumento de corrente catdica com o aumento da concentrao de
hidroquinona de 5 a 25 mol L-1 e acima desse valor, torna-se praticamente constante. Isto
ocorre, porque em baixas concentraes de hidroquinona, a resposta do biossensor depende da
concentrao do mediador (mediador-dependente) [16].
A avaliao da resposta amperomtrica do biossensor em funo da concentrao de
enzima HRP demonstrada na Figura 2d. Observou-se um incremento significativo de corrente
quando a concentrao de enzima aumentada de 0,5 para 1,0 mg mL-1. A partir de 1,0 mg mL-1
at 2,0 mg mL-1 h pouca variao de corrente. Sendo assim, a concentrao de 1,0 mg mL-1 foi
considerada satisfatria, sendo utilizada nos ensaios posteriores.
(a)

1,0

1,00

0,8

0,95

0,6
0,4

(b)

1,05

ipc / A

ipc / A

1,2

0,90
0,85

0,2

0,80
-350 -300 -250 -200 -150 -100
Eapl / mV (vs. Ag/AgCl)

5,5

6,0

6,5

7,0

7,5

pH

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0,8

(d)

1,4

(c)

1,2
1,0

ipc / A

ipc / A

0,6
0,4
0,2

0,8
0,6
0,4
0,2

0,0
0

10 15 20 25 30 35 40
[Hidroquinona] / M

0,5

1,0

1,5

2,0
-1

[HRP] / mg mL

Figura 2 Ensaios cronoamperomtricos em tampo fosfato 0,1 mol L-1 pH 6,5 na presena de
hidroquinona 25 mol L-1 e H2O2 100 mol L-1 para determinao do efeito do potencial (a),
influncia do pH (b), Influncia da concentrao do mediador hidroquinona (c), influncia da
concentrao da enzima HRP (d) na resposta do biossensor.

3.2. Estabilidade do biossensor

O biossensor mostrou boa estabilidade em 50 ciclos consecutivos de varredura
(Figura 3). Aps o primeiro ciclo, verificou-se que 96,3% da resposta inicial do biossensor foi
mantida. Ao final de 50 ciclos, a resposta correspondeu a 90,3% da inicial. A perda de resposta
aps o primeiro ciclo de varredura (cerca de 3,7%) indica que foras de adsoro fsica podem
estar envolvidas do processo de imobilizao enzimtica na superfcie do eletrodo, uma vez que
essas foras so de natureza fraca e, durante o processo de varredura, uma pequena parte da
enzima reticulada tenha sido lixiviada para a soluo.

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0.5
0.0

Respsota relativa / %

i / A

-0.5
-1.0
-1.5
-2.0
-2.5
-0.6

110
100
90
80
70
60
50
40
30
20

10

20

30

40

50

Nmero de ciclos

-0.4

-0.2

0.0

0.2

0.4

0.6

E / V (vs. Ag/AgCl)
Figura 3 - Estabilidade do biossensor avaliada em tampo pH 6,5 na presena hidroquinona 25
mol L-1 e H2O2100 mol L-1 usando voltametria cclica (50 ciclos) com potenciais de inverso
de -600 a 600 mV vs. Ag/AgCl. Velocidade de varredura: 50 mV s-1.

3.3. Caracterizao da superfcie do biossensor

A anlise da superfcie por MEV mostrou que os eletrodos impressos apresentaram
estruturas rugosas de partculas de carbono (Figura 4a). Estas estruturas rugosas promovem um
aumento da rea superficial do eletrodo contribuindo para o aumento do nmero de stios ativos
na superfcie de eletrodo, que por sua vez, contribuem para um aumento da cobertura de HRP.
Sendo assim, uma maior quantidade de H2O2 pode ser catalisada pela HRP. A Figura 4b mostra a
superfcie do eletrodo modificado. H uma grande reduo no nmero de sulcos na superfcie do
eletrodo impresso indicando que eles foram preenchidos de forma homognea durante a
reticulao do glutaraldedo com a HRP.

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Figura 4 - Micrografia por MEV do EI (ampliao de 5000 x). (a) sem imobilizao e (b) com
imobilizao de GA e HRP.

3.4. Curva analtica

A curva analtica do biossensor em tampo fosfato e em amostras de leite (Figura 5)
foi construda a partir da adio de H2O2, utilizando os valores otimizados dos parmetros
operacionais selecionados para o estudo.
Em tampo, a curva apresentou boa linearidade no intervalo de concentrao 5,0 a
60,0 mol L-1 de H2O2, com coeficiente de linearidade (R2) = 0,99. O limite de deteco (LD) foi
calculado como sendo trs vezes o desvio padro do branco dividido pelo coeficiente angular da
reta, e o de quantificao (LQ) como sendo dez vezes o desvio padro do branco dividido pelo
coeficiente angular da reta. Os valores para os limites de deteco e quantificao encontrados
foram de 0,41 mol L-1 e 1,4 mol L-1, respectivamente.
Em amostras de leite com e sem diluio, o biossensor apresentou linearidade no
intervalo de 5,0 a 40,0 mol L-1 de H2O2, apesar da grande ocorrncia de analitos interferentes
no leite (cidos graxos, protenas, vitaminas e outros). Em amostras de leite sem diluio, o
limite de deteco para H2O2 foi de 0,42 mol L-1 e o de quantificao foi de 1,39 mol L-1
bastante similar aos encontrados para as anlises em tampo.

Ecl. Qum., So Paulo, 36 ,2011 152

1,2
1,0

i / A

0,8
0,6
0,4
0,2
0,0
0

20 40 60 80 100 120 140

-1
[H2O2] / mol L

Figura 5 - Curva analtica do biossensor na deteco de perxido de hidrognio em: tampo

fosfato 0,1 mol L-1 pH 6,5 (


), leite com diluio de 1:100 (
), 1:10 (


), 1:2 (
) e sem
diluio (
). Todos adicionados de hidroquinona 30 mol L-1, Eapl = -250 mV vs. Ag/AgCl.

Podem ser observados a partir da Figura 6, os intervalos de confiana para os limites

de deteco e de quantificao, respectivamente, para o biossensor EI-GA-HRP em tampo
fosfato 0,1 mol L-1, leite nas diluies de 1:100, 1:10, 1:2 e sem diluio (adicionado de
hidroquinona 30 mol L-1, Eapl = -250 mV vs. Ag/AgCl). O teste t de Student foi usado para o
clculo dos limites de confiana com nvel de confiana igual a 95%.

Ecl. Qum., So Paulo, 36 ,2011 153

(a)

LD / M com NC = 95%

0,8
0,7
0,6
0,5
0,4
0,3
0,2
0,1
0,0

Tampo

1:100

1:10

1:2 Sem Diluio

Amostras de leite

(b)
LQ / M com NC = 95%

2,2
2,0
1,8
1,6
1,4
1,2
1,0
0,8
Tampo

1:100

1:10

1:2 Sem Diluio

Amostras de leite
Figura 6 - Intervalo de confiana para os limites de deteco (a) e de quantificao (b) do
biossensor para o H2O2 em tampo fosfato 0,1 mol L-1 pH 6,5, leite com diluio de 1:100, 1:10,
1:2 e sem diluio, calculado a partir de nvel de confiana igual a 95%.

Os resultados para os limites de deteco e quantificao considerando intervalo de

confiana igual a 95%, indicam que no h diferena significativa entre amostras de leite
diludas a 1:100 e 1:10. Da mesma forma, no h diferena significativa para as amostras de leite
diludo 1:2 e sem diluio. Sendo assim, recomendamos o uso do biossensor a partir da amostra
Ecl. Qum., So Paulo, 36 ,2011 154

sem diluio e caso alcance valores que saturem a linearidade da curva analtica, existindo a
inteno de quantificar o analito em questo, seja feita a diluio da amostra em tampo fosfato
na proporo de 1:10.
A equao de Michaelis-Menten usada para se calcular a atividade cataltica de
uma enzima, e pode ser algebricamente rearranjada para a Equao 1, chamada Lineweaver
Burk, que relaciona valores de corrente e concentrao de substrato,
(1)

onde Is corrente de estado estacionrio aps a adio de H2O2, Imx corrente mxima, obtida
aps a saturao da curva, Km a constante de Michaelis-Menten, c a concentrao de H2O2 na
soluo. Baseado na curva analtica obtida na resposta do biossensor em soluo tampo,
construiu-se um grfico considerando-se 1/Ipc em funo de 1/c, onde foi obtida uma reta com
inclinao positiva de coeficiente angular igual a Km/IMx com intercepto em 1/IMx (Figura 25).
A partir da Figura 25 e utilizando-se a Equao 10, obteve-se Km 48 M, considerado, quando
comparado na literatura, um valor de alta capacidade cataltica [21].

4. Concluses

O biossensor apresentado neste trabalho de fcil construo e bastante sensvel na

deteco de perxido de hidrognio em amostras de leite sem diluio.
Esse dispositivo mostrou ser uma ferramenta til na anlise de adulterao de leite
por perxido de hidrognio, representando uma alternativa promissora para os atuais mtodos de
anlise recomendados pela Anvisa.
Agradecimentos

Os autores agradecem ao CNPq, Embrapa e Capes pelo suporte financeiro.

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Abstract: An amperometric biosensor was developed for detection of hydrogen peroxide in milk
samples. The biosensor was constructed from the immobilization of peroxidase on printed
carbon electrode. Optimization parameters were evaluated in order to obtain better performance
of the biosensor. The biosensor showed linearity in the range 5.0 to 40.0 mol L-1H2O2 in
phosphate buffer. Milk samples without dilution reported the detection limit for H2O2 of 0.42
mol L-1 and quantification of 1.39 mol L-1.The biosensor could be a sensitive and inexpensive

alternative for the detection of H2O2 in adulterated milk samples.

Keywords: Peroxidase radish, screen printed, glutaraldehyde, biosensor

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