FACULTAD DE CIENCIA Y TECNOLOGA

Licenciatura en Biotecnologa

Laboratorio de Procesos Biotecnolgicos

Prctica 3
Extraccin y caracterizacin de protenas de almacenamiento del grano de
amaranto (Amaranthus hypochondriacus L.)

Equipo
Arellano Perdomo Paulina
Prez de Len Winter Jorge Emmanuel
Valladares Tovar Jos Miguel

6 semestre

M en B. Ral Reyes Bautista

26 de Mayo de 2016

Introduccin
La clasificacin de las protenas por su solubilidad fue desarrollada por Osborne
en el ao de 1924 y consiste en una serie de extracciones consecutivas con: agua,
solucin de sal diluida, solucin de alcohol y solucin de cidos o lcalis diluidos.
Usando esta secuencia de separacin, las protenas se pueden clasificar en
albminas, globulinas, gliadinas y gluteninas respectivamente (De la Vega, 2009).
En muchos casos se utilizan concentraciones variadas de sales neutras que
ejercen efectos pronunciados sobre la solubilidad de muchas protenas globulares.
A baja concentracin, las sales incrementan la solubilidad, fenmeno que recibe el
nombre de salting in, en el que los contraiones adicionales recubren las
numerosas cargas inicas de las molculas proteicas, con lo que se incrementa la
solubilidad de las protenas. Las sales de los iones divalentes tales como el
K2SO4 y el (NH4)SO4, son las ms eficaces en la solubilizacin (Huerta, 2005).
Desde los aos 60's, se ha desarrollado con gran xito la tcnica de la
cromatografa por exclusin (filtracin a travs de tamices moleculares,
cromatografa en gel), aplicada a diferentes objetivos tales como: separacin,
purificacin, o caracterizacin de biomolculas. Entre los materiales ms
comnmente utilizados como fase estacionaria para esta tcnica estn los geles
como el Sephadex, el Bio-Gel A y el Bio-Gel P. El Sephadex es un biopolmero de
dextrana de alto peso molculas, insoluble en agua y disolventes orgnicos, con
enlaces entrecruzados de epiclorhidrina que forman una red tridimensional
(Calcrcel y Gomez, 1998).

La separacin por esta tcnica, se basa en la diferencia en el tamao y la

forma de las molculas componentes de una mezcla. Las molculas que puedan
penetrar la estructura del gel sern retardadas en ste, mientras que aquellas
mayores que los tamaos del poro del gel sern excludas, por lo tanto, sern
arrastradas a travs de la columna por la fase mvil, eluyendo primero (Fischer,
2000).

Objetivos
Objetivo General
Conocer la clasificacin Osborn para la obtencin de protenas globulares del
amaranto de acuerdo con su solubilidad
Objetivos especficos
Determinar las principales protenas que constituyen al amaranto.
Retirar los principales componentes del amaranto para que no intervengan en la
separacin de protenas.
Comprehender los mtodos de separacin como: dilisis y cromatografa por
exclusin molecular para llevar a cabo una buena separacin de la protena
deseada.
Material y mtodo
Se realiz una molienda de 150g de amaranto; los cuales fueron tamizados a
0.25mM Una vez obtenido el tamao deseado, se tomaron los 150g de amaranto y
se pusieron a desengrasar con acetona (5mL por cada gramo de amaranto). Se
realizaron 3 cambios de la acetona por cada 24 horas.
Una vez pasados los 3 lavados, se esparci la harina en papel de aluminio y se
dej evaporar la acetona. Se tom la harina seca y se mezcl con las soluciones
de Na2SO4 al 10% y 5 % Los cuales se centrifugaron a 5,000 rpm durante 30

minutos. (Se mezclaron ambas soluciones debido a que era demasiada harina de
de amaranto y no tenamos la cantidad suficiente de cada sustancia para hacerla
por separado como se indic para la prctica).
Des pues se tom el sobrenadante y se precipito con per sulfato de amonio solido
al 75% y se dej solubilizar durante 15 minutos; una vez pasados los 15 minutos
se meti a centrifugar a 5,000rpm por 30 minutos.
Se tom el producto del saltingout y se prosigui a realizar la separacin de
protenas por solubilidad.
Utilizando agua como solvente realizo una dilisis para obtener albumina. Una vez
realizada la dilisis, se guard en refrigeracin la albumina obtenida.
Se realiz una segunda dilisis, para sacar la globulina con sulfato de sodio al
10% (que fungi como el solvente) Se guard en refrigeracin la globulina
obtenida.
Los residuos se mezclaron con etanol al 70% 1:100 y se centrifugaron a 5,000rpm
durante 30 minutos. Se guard en refrigeracin la prolina obtenida.
Los residuos fueron mezclados con TRIS-HCl a pH8 y se esperaron 30 minutos.
Se guard en refrigeracin las glutelinas obtenidas.
Se prosigui a realizar la hidrolisis de de todas las protenas obtenidas. En tubos
eppendorf se prepararon las mezclas para realizar la hidrolisis, las cuales estaban
compuestas de la siguiente manera: Protena 320L, Enzima 80 L (Alcalasa,
Protenas N y Pancreatina P) y 600 L de buffer de fosfatos a 0.1M con un pH de
7.2. Cada protena obtenida se realiz por triplicado con cada una de las
diferentes protenas. El triplicado se realiz para investigar el grado de hidrolisis en
diferentes temperaturas (30 C, 60 C y 90 C). Las que contenan alcalasa, se
pusieron a incubar a 50C, mientras que las que tenan Protenas N y Pancreatinas
P se incubaron a 37C.

Cuando termino el tiempo de incubacin, las muestras se metieron a ebullicin

durante 5 minutos con el fin de inactivarlas. Una vez inactivadas, se guardaron en
refrigeracin.
Se prepararon 2 litros de buffer de fosfatos a 0.5M con un pH de 7.2 el cual se
introdujo en el contenedor del sistema improvisado de flujo de buffer, para evitar
que se secara el sefadex de la columna que nos proporcion el profesor.
Se conect el sistema de flujo a la cromatografa de exclusin molecular y se
calcul el flujo adecuado, para una buena separacin de protenas.
Dado a que eran muchas protenas, solo se seleccionaron algunas de ellas para
correr en el gel. Se tomaron 500 L de la protena total y en cada tubo se
recolectaron 2mL (30 tubos en total). Se ley en el espectrofotmetro cada
muestra y se construy el cromatograma correspondiente. Este proceso se repiti
con cada protena a analizar.

Molienda de
150g de
amaranto.

Desengrasar
amaranto.

Solubilizar con
sulfato de sodio
y centrifugar.

Realizar hidrolisis
de proteinas por
triplicado

Separar
proteinas con
solvente
correspondiente.

Precipitar con
sultao de amonio
y centrifugar.

inactivar
proteinas con
ebullicion .

Correr y
recolectar
proteinas en
cromatografia de
exclusion
molecular.

Leer en
espectrofotometr
o a 280nm y
realizar
cromatogramas

Figura 1. Diagrama de flujo de la metodologa.

Resultados

A continuacin, se muestran los resultados obtenidos en la separacin de

protenas del amaranto despus de realizar las solubiliza iones necesarios y la
reaccin con el mtodo de Bradford. Podemos observar que se obtuvieron en
mayor cantidad las globulinas y glutelinas debido a que presentan una
absorbancia ms grande.

Protenas en el amaranto

Absorbancia (nm)

0.7
0.6
0.5
0.4
0.3
0.2
0.1
0

Absorbancia (595)

Protena

Figura 2. Protenas extradas del amaranto.

Todas las siguientes mediciones espectrofotomtricas se realizaron a una longitud

de onda de 280nm debido a que en esa longitud los grupos funcionales
aromticos de los aminocidos absorben fuertemente la luz. Se realiz el
cronograma de la fraccin de albumina donde se puede observar la elusin de la
protena a un volumen de 9 ml.

Albmina Total
2.5
2
1.5
Absorbancia (280nm)

1
0.5
0
0

10 20 30 40 50 60 70 80
Volumen (mL)

Figura 3. Cromatograma de Albmina Total

Se manifiestan los resultados de la hidrolosis enzimtica provocada en la albumina

por las tres distintas enzimas. Se puede observar que algunos picos de la elusin
coinciden, mientras que otros no lo hacen. Hay una gran similitud entre la alcalasa
y la proteinasa N, sin embargo, la pancreatina muestra un perfil de elusin muy
distinto.

Hidrlisis enzimtica de albmina

1.2
1

Absorbancia (280 nm)

0.8

Alcalasa

0.6

Pancreatina P

0.4

Proteinasa N

0.2
0
0

10 20 30 40 50 60 70

Fraccin de elucin (mL)

Figura 4. Cromatograma del hidrlisis enzimtica de albmina

Se realiz el cromatograma de la fraccin de globulina donde se puede observar la

elusin de la protena a un volumen de 42 ml

Globulina Total
3
2
Absorancia (280 nm)

1
0
0

10

20

30

40

50

60

70

80

mL

Figura 5. Cromatograma de Globulina total.

A continuacin, se muestran los cromatogramas de los diferentes tratamientos

enzimticos realizados sobre las globulinas obtenidas. Se pueden observar
diferentes picos que indican la presencia de algunos fragmentos y el orden de
elusin en el que fueron recolectados

Hidrolisis de Globulina

Absorancia (280 nm)

0.9
0.8
0.7
0.6
0.5
0.4
0.3
0.2
0.1
0
0

Alcalasa
Pancreatina P
Proteinasa N

10

20

30

40

50

60

70

mL

Figura 6. Cromatograma de Globulina hidrolizada.

Discusin

La separacin de protenas de acuerdo a la clasificacin de Osbourne debido a su

solubilidad, nos permite obtener 4 fracciones diferentes constituidas por
Albuminas, Globulinas y Prolinas. Las albuminas son protenas solubles en agua
debido a su gran contenido en aminocidos hidrofilicos por ejemplo la cistena y
estn ampliamente distribuidos en tejidos animales y vegetales. La globulina por
otro lado solubles en soluciones salinas con fuerza inica media permitiendo la
aparicin del fenmeno de salting in. Posteriormente tenemos a las prolaminas y
las glutelinas, las prolaminas son insolubles en el agua, pero si en solventes
orgnicos como el etanol, esto se debe a su alto contenido en aminocidos
hidrofbicos como la glutena y prolina, mientras que la glutelinas son solubles en
cidos o bases diluidos y solo se encuentran en vegetales (UNAD, 2007).
Existen diferentes especies de Amaranthus que se caracterizan por una
elevada produccin de granos cuyo contenido proteico oscila entre 14 y 19 %
(mayor que el de los cereales), de muy buena calidad nutricional Las principales
fracciones proteicas presentes en este grano son albminas (49-65 %), globulinas
(22-42 %) y glutelinas (14-18 %) (Seguna-Nieto y col., 1994)
Como podemos observar en la figura 2, se revis el contenido de las
fracciones mediante el mtodo de Bradford. Se obtuvo una mayor concentracin
de globulinas y de glutelinas, sin embargo, es necesario mencionar que de
albuminas se obtuvieron aproximadamente 25 mL mientras que en las dems de
10 a 15 mL. El mtodo de Bradford se fundamente en la unin del azul de
Coomasie a las protenas mediante enlaces covalentes (Fernndez y Galvn,
2000).
En la figura 3 se observa el perfil de elusin de la albumina obtenida de las
fracciones. Como se puede observar en el cromatograma se muestra que la
albumina, sali rpidamente durante la cromatografa de exclusin debido a que
es una molcula grande constituida por tres dominios diferentes y un peso
molecular de 67 kDa. (NIH, 2010) Se puede afirmar tambin una buena resolucin
ya que el pico representado en la grfica se observa de manera correcta.

La pancreatina, la proteinasa N y la alcalasa, son enzimas capaces de

hidrolizar protenas como la albumina rompiendo diferentes tipos de enlaces cada
una. En la figura 4 podemos observar los distintos perfiles de elusin de la
albumina despus de 90 minutos de incubacin y accin de la enzima. Tanto en la
proteinasa como en la alcalasa se observan picos de elusin similares durante los
primeros 40 minutos, pero no ocurre lo mismo con la pancreatina. Esto puede
deberse a que la pancreatina no es especfica para las protenas, sino que
contiene una mezcla de enzimas como lipasa y amilasa que pueden afectar
durante el hidrolisis (Axcan Pharma, 2006). La albumina est compuesta tambin
por 5 o 6 dominios lo que puede explicar la gran cantidad de picos de elusin. Es
necesario tambin considerar que la resolucin de la cromatografa no es la
adecuada debido a que muchos de los puntos estn unidos. Esto se puede deber
a un mal manejo del flujo durante la cromatografa (Braithwaite y Smith, 1985).
Las globulinas son protenas que a diferencia de la albumina son solubles a
concentraciones de sal muy bajas, debido a la constante dielctrica que
presentan. Las globulinas, se pueden dividir en alfa globulinas 1 y 2, beta
globulinas y gama globulinas. La amarantina es la protena de reserva mayoritaria
del amaranto y pertenece a la familia de las globulinas. Est constituida por
contiene dos subunidades unidas por un enlace desulfuro la bsica y la cida
(Arano y col., 2010). Como se observa en la figura 5 la cromatografa de exclusin
molecular muestra que las globulinas eluyen en un volumen mayor al de las
albuminas con lo que podemos asumir que tienen un peso molecular ms bajo.
Podemos observar que la cromatografa estuvo bien realizada ya que tiene una
buena resolucin de los puntos indicados.
Durante el hidrolisis del amaranto sucedi existen grandes picos de elusin
al principio que nos indican la presencia de que existen an fragmentos grandes
que no fueron posibles de degradar. Esto puede deberse a que muchas de las
globulinas sirven tambin como inhibidores de proteasas (Velarde, 2015). La
resolucin de la cromatografa es adecuada sin embargo es necesario mencionar

que durante estas cromatografas el flujo no fue constnte debido a que en el

principio de la elusin el tiempo entre cada gota no coincidan al mL/2 min.
Conclusiones
-

La clasificacin del mtodo de Osborn habla de cmo las protenas se

dividen segn su solubilidad: Albminas, Globulinas, Prolaminas y

Glutelinas.
El mtodo de hidrolisis enzimtica se basa en el rompimiento de protenas
hasta llegar a aminocidos por medio de enzimas proteolticas como por
ejemplo las utilizadas en el experimento: alcalasa, proteinasa y pancreatina.
Estas enzimas causaron que se obtuvieran diferentes volmenes de elucin

en la cromatografa de exclusin molecular.

Para una buena extraccin de protenas se requiere hacer una dilisis para
separar las protenas de inters de las molculas de bajo peso molecular

que contaminan a esta.

En ninguno de los casos se observa el hidrolisis total de las protenas de
amaranto en los cromatogramas, por lo que se sugiere dejar ms de 90
minutos la incubacin de la enzima para no tener residuos de pptidos

grandes
Otro mtodo que se puede utilizar es el SDS- PAGE, una tcnica en la cual
se puede conocer los pesos moleculares de las protenas deseadas, pero
para una buena separacin se requiere de SDS para desnaturalizar a la
protena eliminando estructuras terciarias y secundarias.

Referencias
-

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n_y__propiedades_fisicoqumicas.html

Anexos
Tabla 1. Fracciones extradas del amaranto
Protena
Albumina
s
Globulina
s
Prolinas
Glutelinas

Absorbanci
a (595)
0.13
0.629
0.256
0.635

Tabla 2. Absorbancia de albumina total.

mL
2
4
6
8
10
12
14
16
18
20
22
24
26
28
30
32
34
36
38
40
42
44
46
48
50
52
54

Absorbanci
a (280 nm)
0.361
0.658
1.506
2.184
1.896
1.53
1.08
0.882
0.691
0.549
0.5
0.216
0.161
0.115
0.088
0.195
0.05
0.047
0.038
0.025
0.028
0.08
0.02
0.02
0.013
0.059
0.009

56
58
60
62
64
66
68
70

0.017
0.024
0.029
0.055
0.037
0.011
0.018
0.017

Tabla 3. Absorbancias de la hidrolisis enzimtica de la albumina

mL

Alcalasa

2
4
6
8
10
12
14
16
18
20
22
24
26
28
30
32
34
36
38
40
42
44
46
48
50
52
54
56
58
60

0.289
0.385
0.224
0.202
0.186
0.284
0.171
0.277
0.115
0.103
0.092
0.082
0.092
0.173
0.073
0.064
0.075
0.067
0.067
0.056
0.182
0.045
0.453
0.231
0.094
0.054
0.131
0.071
0.059
0.124

Pancreatin
aP
0.998
0.536
0.698
0.385
0.652
0.23
0.226
0.532
0.789
0.707
0.647
0.707
0.622
0.65
0.536
0.425
0.475
0.424
0.408
0.324
0.476
0.357
0.563
0.355
0.424
0.35
0.342
0.42
0.34
0.451

Proteinasa
N
0.451
0.563
0.49
0.321
0.32
0.584
0.322
0.456
0.242
0.184
0.188
0.562
0.33
0.225
0.262
0.255
0.281
0.189
0.171
0.115
0.182
0.198
0.176
0.15
0.478
0.563
0.226
0.065
0.094
0.059

Tabla 4. Absorbancias de Globulina Total.

mL
2
4
6
8
10
12
14
16
18
20
22
24
26
28
30
32
34
36
38
40
42
44
46
48
50
52
54
56
58
60
62
64
66
68
70

Absorbanci
a (280 nm)
0.047
0.038
0.112
0.025
0.022
0.017
0.034
0.066
0.057
0.187
0.099
0.087
0.089
0.087
0.165
0.378
0.543
0.882
1.334
2.085
2.45
1.493
1.103
0.824
0.587
0.411
0.224
0.197
0.124
0.0098
0.096
0.044
0.051
0.035
0.065

Tabla 5. Absorbancias de Globulina Hidrolizada

mL
2
4
6
8
10
12
14
16
18
20
22
24
26
28
30
32
34
36
38
40
42
44
46
48
50
52
54
56
58
60

Alcalas
a
0.122
0.131
0.144
0.146
0.682
0.19
0.171
0.277
0.115
0.103
0.092
0.082
0.457
0.173
0.073
0.064
0.075
0.694
0.061
0.056
0.182
0.045
0.453
0.256
0.093
0.054
0.122
0.071
0.06
0.123

Pancreati
na P
0.408
0.411
0.698
0.385
0.652
0.23
0.226
0.532
0.788
0.144
0.093
0.152
0.099
0.65
0.228
0.116
0.109
0.094
0.408
0.324
0.476
0.088
0.563
0.355
0.072
0.35
0.16
0.162
0.145
0.102

Proteinas
aN
0.452
0.56
0.494
0.322
0.32
0.584
0.329
0.455
0.24
0.188
0.184
0.562
0.337
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