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BIOQUMICA

AMBIENTAL
Gua de Laboratorio

A. Vlez & R. Salas

Facultad de Ciencias Ambientales


Bioqumica Ambiental

BIOQUMICA AMBIENTAL
Gua de Laboratorio
Autores:
- Blgo. ARMANDO VLEZ AZAERO
- Mg. Blgo. RAMSES SALAS ASENCIOS

Ilustraciones:
- NICK SOTO

2015

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A.Vlez & R. Salas

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Bioqumica Ambiental

INDICE
1.

Informe de laboratorio

2.

Normas de laboratorio

3.

Espectrofotometra

4.

Anlisis cuantitativo de la actividad enzimtica de la amilasa salival

5.

Factores ambientales que afectan la actividad enzimtica

6.

Actividad enzimtica de la catalasa en suelos contaminados

7.

Cuantificacin de azucares reductores en plantas sometida a estrs


salino
Cuantificacin de protenas totales en plantas sometidas a estrs
abitico

8.
9.

Pigmentos fotosintticos asociados a cambios ambientales

10.

Respiracin celular. Alteracin por metales pesados

11.

Determinacin de triglicridos en microorganismos de origen lagunar

12.

Influencia de los xenobiticos en la integridad del ADN

13.

Bibliografa

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Bioqumica Ambiental

INFORME DE LABORATORIO
De forma prctica y concreta, un informe de laboratorio es una sntesis especfica de
las experiencias realizadas en cada sesin de laboratorio, y debe responder con
facilidad al qu, cmo y para qu se desarrollaron cada uno de los trabajos. Un
informe es de suma importancia, pues lejos de ser un documento formal, nos ayudar
afianzar nuestra capacidad analtica y a contrastar cada uno de los resultados con la
teora aprendida en clase, adems de modelar nuestro lenguaje tcnico y cientfico,
logrando cada vez una comunicacin ms fluida y eficaz.
La estructura principal de un informe de laboratorio es la siguiente:

Cartula
Su funcin es facilitar la identificacin del trabajo, por lo tanto el ttulo
deber ser el texto ms resaltante. Es importante colocar el logo de la
universidad, los autores, colaboradores y el ao en curso.

Introduccin
Esta seccin no debe abarcar ms de una pgina, y en ella debern estar
comprendidos: los objetivos, la problemtica y el marco terico referido
al tema, redactados de forma continua.

Materiales y mtodos
o Materiales
o Mtodos

Procedimientos

Resultados
Presentacin de grficas, tablas y datos obtenidos en cada experiencia,
con una explicacin (interpretacin) clara y precisa. Es necesario detallar
al mximo los productos de cada actividad realizada durante la prctica.

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Bioqumica Ambiental

Conclusiones
Esta seccin sirve para reafirmar los conocimientos de cada prctica en
funcin a los resultados. Las conclusiones son generales y pueden incluir
comentarios acerca de las destrezas y actitudes aprendidas, sin
embargo, debern presentarse como afirmaciones categricas.

Recomendaciones
Reportar incidentes y accidentes ocurridos en cada prctica, a fin de
evitar problemas futuros. Tambin es importante colocar algunas
sugerencias en los procedimientos que permitan realizar los trabajos
con mayor eficiencia.

Bibliografa
Todo trabajo prctico experimental requiere de una serie de soportes
bibliogrficos como: libros, revistas, notas, manuales, etc., los cuales
deben citarse de manera adecuada.
Ejm:

Vlez-Azaero,

Armando

&

Lizrraga-Travaglin,

Alfonso.

2013.

Diversidad de Carabidae (Coleoptera) asociada a la cuenca baja del


ro Lurn, Lima, Per. The Biologist-Lima, 11: 97-106.

Yllanes, Paola; Vlez-Azaero, Armando; Lozano, Sebastin. 2014.


Efecto fitotxico del plomo en plantas de mas hbrido Dekalv (Zea
mays) en suelo arenoso y limoso. The Biologist-Lima, 12: 337-348.

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Bioqumica Ambiental

NORMAS DE LABORATORIO

INTRODUCCIN
El trabajo en el laboratorio debe respetar un conjunto de medidas preventivas, cuya
finalidad es proteger a los operadores, de los riesgos inminentes de cada experiencia.
Por tanto, la seguridad en el laboratorio es una labor colectiva entre los estudiantes,
los docentes y el personal tcnico de apoyo. Los agentes potencialmente dainos para
la salud presentes en el laboratorio son los siguientes:

Agentes Biolgicos: virus, bacterias, hongos y parsitos.

Agentes fsicos y mecnicos: temperaturas extremas, radiaciones ionizantes,


conexiones elctricas defectuosas y/o inadecuadas e instrumentos daados o
rotos.

Agentes qumicos: Compuestos corrosivos, inflamables, comburentes,


irritantes, dainos para el ambiente, etc.

OBJETIVOS

Proteger al estudiante de la exposicin innecesaria contra agentes


potencialmente dainos (qumicos, fsicos y/o biolgicos) que puedan poner en
riesgo su salud.

Garantizar la integridad de la muestra contra la degradacin o contaminacin


cruzada.

Identificar los desechos txicos y almacenarlos en ambientes adecuados hasta


su eliminacin.

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NORMAS DE SEGURIDAD EN EL TRABAJO EXPERIMENTAL

Conocer el manejo de los accesorios y equipos a utilizar. No debe manipularse


ningn instrumento si no se le conoce.

El trabajo en el laboratorio debe realizarse con cuidado, precisin y bajo la


supervisin de un profesional competente.

A. PARA INGRESAR AL LABORATORIO

Est prohibido el ingreso a laboratorio sin el mandil correspondiente, el cual


deber ser largo y permanecer completamente abrochado.

Se prohbe el ingreso al laboratorio con bolsos, maletines o mochilas. Los


estudiantes y docentes debern adecuar sus pertenencias en los casilleros
ubicados en cada pasadizo.

Algunos equipos como computadoras y calculadoras estn permitidos, bajo la


entera responsabilidad de cada estudiante.

Revisar los antecedentes conceptuales y el protocolo de trabajo experimental


presente en la gua de prcticas de cada curso, donde adems cada estudiante
colocar la informacin pertinente a su grupo sanguneo, alergias, contactos en
casos de emergencia, entre otros.

El tiempo de tolerancia para cada una de las sesiones de prcticas ser de 10


minutos luego de los cuales, el estudiante no podr ingresar al laboratorio.

Revisar el estado de la mesa de trabajo, del material y de los equipos recibidos.


Reportar cualquier falla o irregularidad al responsable del laboratorio.

El

material se debe lavar y secar antes de ser usado.

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B. DURANTE EL TRABAJO DE LABORATORIO

Seguir las medidas de seguridad necesarias para la conservacin de cada


equipo y accesorios con el que se est trabajando, incluyendo a los bancos
metlicos, los cuales permanecern bajo las mesas cuando no sean usados.

Tomar slo las cantidades de reactivos necesarios para el trabajo experimental


y colocarlas en material de vidrio limpio y seco.

Etiquetar y rotular todos los recipientes donde se coloquen reactivos,


productos y residuos, indicando principalmente: nombre, concentracin y
fecha de preparacin.

Seguir las medidas de contingencia dadas por el

personal del laboratorio en caso de accidente.

No recibir visitas en el interior del laboratorio. Evitar las distracciones para no


ocasionar accidentes.

Informar al profesional responsable cuando se requiera abandonar


temporalmente el laboratorio, o reincorporarse.

No ingerir alimentos ni bebidas en el interior del laboratorio, a menos que lo


indique el protocolo.

No fumar en el interior del laboratorio. Todas las fuentes de fuego o calor


deben estar controladas.

C. AL CONCLUIR LA SESION

Disponer de los residuos y de los reactivos de la manera indicada por las


normas.

Los reactivos no usados no debern devolverse a los frascos

originales. Los frascos de reactivos puros deben regresarse al almacn.

Es obligacin de cada grupo de trabajo, el correcto lavado del material


utilizado, el mismo que ser entregado limpio y seco en orden y esperando su
turno.

Dejar limpio y seco el lugar de trabajo. Colocar los bancos junto a las mesas o
invertidos sobre stas.

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Bioqumica Ambiental

El mandil es de uso exclusivo para el laboratorio. Retirarse el mandil y


dems equipo de seguridad, guardarlo en una bolsa de plstico exclusiva para
este uso. El mandil deber lavarse al final de cada sesin.

MATERIAL DE USO OBLIGATORIO

Mandil largo (a la rodilla o pantorrilla) de algodn 100% y manga larga, con


botones de color blanco

Encendedor para mechero y/o cerillos

Franela de algodn limpia

Cinta para encubrir (masking tape) de 1.27 cm de ancho

Marcador indeleble, preferentemente negro

RECOMENDACIONES GENERALES:

No se debe probar ninguna sustancia qumica, pues la mayora de ellas son


txicas y/o venenosas. Observar y leer cuidadosamente cada etiqueta antes de
usar una sustancia.

No se debe oler directamente el contenido de un frasco porque muchas


sustancias lquidas emiten vapores txicos; estos deben llevarse a la nariz con
la agitacin de las manos.

Se debe tener cuidado al transportar los lquidos calientes o al calentarlos


porque algunos se proyectan.

Cuando se calienta un recipiente de vidrio o un tubo de prueba que contiene


una solucin, se debe tener la precaucin de orientar la boca del tubo hacia un
lugar en que no se encuentren otras personas, pues el lquido al hervir puede
causando lesiones muchas veces severas.

Cuando se calienta un material de vidrio debe tenerse en cuenta su calidad y su


resistencia a la temperatura. De preferencia debe tener marca reconocida.

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Bioqumica Ambiental

Todo residuo que queda en un recipiente o tubo de prueba debe ser arrojado a
un tacho o al lavatorio haciendo fluir gran cantidad de agua. No se debe arrojar
al suelo ni sacudir el tubo.

Al calentar un material de vidrio se debe verificar que no est rajado, porque


con el calor puede romperse provocando accidentes al operador.

ACCIONES A SEGUIR EN CASO DE ACCIDENTES E INCIDENTES

Si hubo inoculacin accidental, cortes o rasgado de piel, o alguna quemadura


por agente qumico, la persona afectada debe quitarse de inmediato el mandil
protector, lavarse las

manos y la zona afectada del cuerpo, aplicarse el

desinfectante tpico presente en el Botiqun del laboratorio y dirigirse a un


Servicio Mdico donde informar detalladamente la causa de la herida y sobre
los agentes infecciosos, qumicos o mecnicos implicados.

Si ocurriese una ingestin accidental de material o reactivo posiblemente


peligroso, la persona debe ser trasladada inmediatamente a un Servicio Mdico
despus de quitarse el mandil, informando al mdico de turno el reactivo
ingerido y seguir estrictamente las instrucciones.

Si hay una emisin de un aerosol posiblemente peligroso o la emanacin de


vapores txicos, todas las personas deben evacuar el laboratorio, informando
al responsable del mismo. Nadie podr entrar al ambiente afectado hasta que
los responsables lo indiquen, esperando que los aerosoles puedan salir y que se
depositen las partculas ms pesadas. Si es necesario, debe colocarse una
seal de prohibicin para no ingresar al Laboratorio.

Si se estuvo trabajando con muestras biolgicas posiblemente infectadas, las


cuales se derramaron accidentalmente, cubrir con papel peridico toda la zona
afectada, humedecer sobre el papel con fenol al 5% y dejar que este reactivo
acte durante 30 minutos como mnimo antes de limpiar el rea.

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Bioqumica Ambiental

PRACTICA N1
ESPECTROFOTOMETRIA

Lo

Lt
La

OBJETIVOS

Conocer el manejo adecuado de un Espectrofotmetro.

Determinar la concentracin de algunas sustancias en funcin a una curva de


calibracin.

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Bioqumica Ambiental

CONCEPTOS PREVIOS
Fotocolorimetra: _______________________________________________________
______________________________________________________________________________
Absorbancia: ____________________________________________________________
______________________________________________________________________________
Transmitancia: _________________________________________________________
______________________________________________________________________________
Espectro de absorcin: ________________________________________________
______________________________________________________________________________
Curva de calibracin: __________________________________________________
______________________________________________________________________________
Coeficiente de extincin molar: ______________________________________
______________________________________________________________________________

MATERIAL DE LABORATORIO

2 Balanzas de precisin
Azul de Metileno
Permanganato de Potasio
Agua destilada
24 tubos de ensayo
Frascos contenedores
2 Cucharilla-esptula
Papel platino

Guantes quirrgicos
3 Pipetas descartables
Papel toalla
4 Pisetas
Espectrofotmetro
2 Pipetas de 1ml
2 Pipetas de 5ml

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Bioqumica Ambiental
INTRODUCCION

Al pasar la luz blanca a travs de una solucin de una sustancia coloreada, se absorben
selectivamente las radiaciones luminosas de ciertas longitudes de onda. El color
resultante que se observa es el producto de la luz transmitida por la solucin, la que
llega a nuestros ojos. Esta propiedad puede ser aprovechada en el laboratorio de
Bioqumica para determinaciones cuantitativas, generando reacciones qumicas que
generen un color estable, cuya intensidad estara directamente relacionada con la
concentracin del soluto que se quiera analizar.
Estas determinaciones cuantitativas se basan en la Ley de Lambert, que establece que
la proporcin de luz incidente (Io) absorbida por el medio es independiente de su
intensidad y que cada estrato adicional de solucin absorbe una fraccin igual de la luz
que pasa a travs de ella (la absorcin de luz es directamente proporcional a la
longitud de la celda o tubo). Por otro lado, la Ley de Beer nos dice que la intensidad de
un haz de luz que recorre una cierta distancia a travs de una solucin es proporcional
a la concentracin de la solucin. Al combinar ambas leyes, se obtiene:

Log

Lo
A B C
Lt

Donde:
Lo

Intensidad de luz incidente

Lt

Intensidad de luz transmitida.

Coeficiente de Extincin Molar (constante para cada soluto a una


determinada longitud de onda).
Longitud o dimetro del recipiente atravesado por la luz.

Concentracin de la Solucin.

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Bioqumica Ambiental
La relacin Log (Lo/Lt) es conocida tambin como Densidad Optica (D.O.), Absorbancia
o Extincin y tiene valores que van de 0 a 2. Otra forma de medicin es la Tramitancia,
definida como el porcentaje de luz transmitida: %T = (Lt/Lo) x 100, con valores que van
de O a 100. Los valores de D.0. y %T son inversos.
Los fotocolormetros o espectrofotmetros son dispositivos que permiten medir la
absorcin de Luz por una sustancia. Bsicamente, poseen una clula fotoelctrica,
compuesta por un metal que por accin de la luz generan una corriente elctrica
proporcional a la intensidad de luz que incide sobre l (fenmeno fotoelctrico).
Todos los cuerpos (y tambin las soluciones) absorben luces de diferentes longitudes
de onda a diferente intensidad. La longitud de onda en la cual haya mxima absorcin
de luz (pico de absorcin) permite obtener valores de absorbancia an a bajas
concentraciones, por lo que un primer paso en el anlisis espectrofotomtrico est
relacionado con la obtencin de un espectro de absorcin (absorbancias de una misma
muestra a diferentes longitudes de onda) y la determinacin del pico de absorcin.

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Bioqumica Ambiental
PROCEDIMIENTO
EXPERIENCIA N1:

PREPARACIN DE SOLUCIONES

1. Preparar una solucin Stock de Permanganato de Potasio 1 % y una solucin


stock de Azul de Metileno 1%
2. A partir de cada solucin stock, realizar las siguientes disoluciones:
a. Permanganato de Potasio 1:10
b. Azul de Metileno 1:250
3. Con las disoluciones obtenidas, disponer las siguientes bateras:

Agua destilada (ml)


Solucin de Trabajo de
KMnO4 (ml)

Tubo B

Tubo 1

Tubo 2

Tubo 3

Tubo 4

4.8

4.6

4.2

0.2

0.4

0.8

Concentracin

Tabla.1. Batera de tubos con Permanganato de Potasio

Agua destilada (ml)


Solucin de Azul de
Metileno (ml)

Tubo B

Tubo 1

Tubo 2

Tubo 3

Tubo 4

4.5

4.6

4.8

4.9

0.5

0.4

0.2

0.1

Concentracin

Tabla2.Batera de tubos con Azul de Metileno

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Bioqumica Ambiental
Experiencia N 2: DETERMINACIN DEL ESPECTRO DE ABSORCIN
1. Utilizando el Tubo N3 y el tubo N1 de Permanganato de Potasio y Azul de
Metileno respectivamente, realizar las siguientes lecturas de Absorbancia en el
espectrofotmetro:
Longitud de Onda

Absorbancia

Absorbancia

(nm)

Azul de Metileno

Permanganato de Potasio

400
420
440
460
480
500
520
540
560
580
600
620
640

660

680

700

720

740

760

780

800

Tabla.3. Absorbancias a diferentes longitudes de onda

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Bioqumica Ambiental
2. Con los valores obtenidos en la Tabla, graficar en papel milimetrado y
determinar el pico de mxima absorcin, como se muestra en las siguientes
grficas:
0,7
0,6

Absorbancia

0,5
0,4
0,3
0,2
0,1
0
380

430

480

530

580

630

680

730

Longitud de Onda (nm)

Figura1. Espectro de Absorcin de Azul de Metileno


0,19
0,17
0,15
Absorbancia

0,13
0,11
0,09

0,07
0,05
0,03
0,01
-0,01
360

410

460

510

560

610

Longitud de onda (nm)

Figura2. Espectro de Absorcin de Permanganato de Potasio

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660

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Bioqumica Ambiental
EXPERIENCIA N3:

CURVA DE CALIBRACIN

1. Realizar lecturas de Absorbancia para cada tubo a la longitud de onda elegida


en la Experiencia N2 para cada tubo de ambas bateras.
2. Con los datos obtenidos, trazar una Grfica: Densidad ptica (eje Y) vs
Concentracin (eje X).
3. Esta grfica se denomina Curva de Calibracin y representa el rango de longitudes
de Onda en el cual la intensidad de la luz absorbida es directamente proporcional a
la Concentracin de una solucin. Utilizar esta Curva de Calibracin para calcular
la Concentracin de una muestra desconocida (Muestra Problema) propuesta por
el docente.
4. Adems de usar la Curva de Calibracin, se puede calcular la concentracin de una
muestra a partir de la Absorbancia de una Solucin de Concentracin exactamente
conocida (Solucin Standard):

MP

St DO(MP)
DO (St)

Donde:
MP

Muestra problema

St

Estndar

DO

Densidad ptica o Absorbancia

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Bioqumica Ambiental
RESULTADOS

Realiza la descripcin detallada de las actividades realizadas durante la


experiencia prctica

Los resultados pueden complementarse con figuras y tablas citadas en el


informe

CONCLUSIONES

Establece tus conclusiones en base a los resultados obtenidos en la prctica.

RECOMENDACIONES

Establece recomendaciones que podran mejorar los futuros trabajos.

CUESTIONARIO
1. Por qu es necesario conocer la longitud de Onda de mxima Absorcin?
2. Si se tuviera un tubo con slo agua destilada, qu parte de la Curva de
Calibracin estara representando?
3. Si una sustancia es incolora, eso quiere decir que no posee Absorcin de luz?
Explique.

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Bioqumica Ambiental

PRACTICA N2
ANLISIS CUANTITATIVO DE LA ACTIVIDAD ENZIMTICA
DE LA AMILASA SALIVAL

OBJETIVOS

Reconocer experimentalmente la accin de la amilasa salival.

Calcular la actividad de una enzima a travs de un tratamiento colorimtrico.

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Bioqumica Ambiental

CONCEPTOS PREVIOS
Actividad Enzimtica: _________________________________________________
______________________________________________________________________________
Amilosa: __________________________________________________________________
______________________________________________________________________________
Enlace -1,6: _____________________________________________________________
______________________________________________________________________________
Almidn sintasa: ________________________________________________________
______________________________________________________________________________
Amilopectina: ___________________________________________________________
______________________________________________________________________________
Isozima: __________________________________________________________________
______________________________________________________________________________

MATERIAL DE LABORATORIO

Espectrofotmetro
Bao Mara
8 Matraces Erlenmeyer
2 Pizetas
200ml Agua destilada
36 tubos de ensayo
4 Gradillas
100ml Almidn 1%
Beaker 100ml

100ml Suero Fisiolgico


Parafilm
50ml Alcohol yodado
100ml Buffer Fosfato pH 7
8 Baguetas
8 Pipetas de 20ml
12 Pipetas de 10ml
4 Pipetas de 5ml

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Bioqumica Ambiental
INTRODUCCION
Las enzimas son protenas que aceleran o disminuyen la velocidad de una reaccin
qumica dentro de la clula, sin sufrir alguna alteracin durante el proceso. Estas
molculas son sumamente especficas, y participan en la gran mayora de reacciones
qumicas que ocurren en los organismos vivos. Su presencia dentro del sistema
bioqumico reduce la energa de activacin de una reaccin, generando la formacin
de uno o ms productos a travs de un sustrato determinado con menor gasto
energtico. La accin enzimtica es dependiente de las condiciones del medio como:
temperatura, pH, concentracin de sustrato, etc., y son susceptibles a las variaciones
de estos componentes.
El acoplamiento correcto de una enzima y el sustrato generan el complejo EnzimaSustrato, donde la enzima transformar este componente en un producto de
terminado sin que ninguna parte de su estructura proteica se haya visto daada o
modificada al final de la reaccin. La parte estructural de la enzima que toma contacto
con el sustrato y hace el trabajo final es llamada SITIO ACTIVO. Los residuos de este
sitio estn en la conformacin tridimensional correcta como para que realicen el
trabajo enzimtico. La nomenclatura enzimtica sigue dos pautas:
a. Segn su sustrato: (sustrato-asa). Por ejemplo, lactasa, enzima que cataliza la
reaccin:
Lactosa

Glucosa + Galactosa

b. Segn su Funcin: (actividad-asa). Por ejemplo, desoxiribonucleasa, o DNAasa,


enzima que cataliza la reaccin
DNA

Monofosfatos de desoxirribonucletidos (dNMP)

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Bioqumica Ambiental
Las amilasas son isoenzimas que degradan molculas hidrocarbonadas complejas en
componentes ms pequeos. Estas enzimas son producidas por el pncreas exocrino y
las glndulas salivales para ayudar a digerir el almidn, pudindose encontrar tambin
en el hgado y en el revestimiento de las trompas de Falopio. La amilasa humana se
denomina -amilasa (endoamilasa) por su capacidad de hidrolizar los enlaces -1,4,
siendo el producto final de la accin de la enzima sobre el polisacrido la formacin de
dextranos, maltosa y algunas molculas de glucosa. Los enlaces -1,6 de los puntos de
ramificacin no se alteran.
La amilasa salival o ptialina tiene un papel secundario en la digestin de polisacridos
como el almidn, quiz participando tambin en eliminar los azucares de los dientes
(desechos). Esta enzima se puede inactivar fcilmente a pH 4.0, por lo que el tiempo
de accin sobre el almidn del alimento es reducido.
Fundamento (Mtodo de Caraway, 1959): En este mtodo, se mide la hidrlisis de un
sustrato de almidn por la -amilasa del suero, orina o saliva en condiciones
estandarizadas, midiendo la disminucin del color azul en el tubo problema despus
de aadir iodo, se comparan las lecturas colorimtricas con un testigo o blanco en el
cual no ha habido hidrlisis enzimtica. La unidad de actividad enzimtica de amilasa
se define como la cantidad de enzima que en las condiciones establecidas hidroliza 10
mg de almidn en 30 minutos, hasta no producirse color con el yodo.

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Bioqumica Ambiental
PROCEDIMIENTO
EXPERIENCIA N1:

PREPARACION DE LA MUESTRA

1. Agregar 60ml de agua destilada en un beaker de 100ml


2. Tomar un sorbo de agua destilada y realizar enjuagues dentro de la boca
durante cinco segundos
3. Devolver el agua al recipiente utilizado y rotularlo como muestra
4. Luego, disponer 2 matraces de la siguiente manera:

BLANCO

MUESTRA

NaCl 0.025 M

10 ml

10 ml

Sustrato de almidn 1 %

15 mI

15 ml

Buffer fosfato pH 7.0

10 ml

10 ml

Agua destilada

15 ml

13.5 ml

Pre-incubar: 37C/5 minutos


Homogenizar y extraer la muestra correspondiente al tiempo cero
Muestra

1.5ml

Tabla.3. Preparacin de la muestra

5. Incubar a 37C y extraer 5 ml de cada matraz a los tiempos siguientes: 1, 2, 4,


6, 8, y 10 minutos.
6. A estas muestras extradas, incluyendo el tiempo 0, agregar inmediatamente
7 ml de agua destilada y tres gotas de solucin de Yodo.
7. Mezclar por inversin y se deja en reposo por 10 min.
8. Determinar la absorbancia a una longitud de onda de 660nm.

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Bioqumica Ambiental
EXPERIENCIA N2:

CALCULOS

Los valores hallados en el matraz denominado BLANCO no deben cambiar a medida


que pasa el tiempo (no hay enzima), por lo que servir como control de la cantidad
de almidn inicial en el matraz de MUESTRA.
Los clculos se realizarn comparando la DO del Blanco, con la DO de la muestra en
cada unidad de tiempo, considerando la concentracin del Blanco como la cantidad
inicial de almidn en la muestra.
1. Graficar concentracin de almidn versus tiempo.
2. Luego, restar del Blanco la concentracin de almidn de cada una de las
muestras para obtener la cantidad de almidn que ha sido digerido. Con estos
datos, graficar la concentracin de almidn digerido versus tiempo.
3. Por ltimo, realizar restas de la cantidad de almidn digerido al primer minuto
con la de cero minutos, la de 2 minutos menos la de 1 minuto, la de 4 minutos
menos la de 2 minutos y dividirlo entre dos, la de 6 minutos menos la de 4
minutos y dividirlo entre dos, y as sucesivamente, para obtener valores de
actividad enzimtica (o velocidad enzimtica), expresados en cantidad de
almidn digerido por unidad de tiempo. Realizar una tercera grfica velocidad
enzimtica versus tiempo.

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Bioqumica Ambiental
RESULTADOS

Realiza la descripcin detallada de las actividades realizadas durante la


experiencia prctica

Los resultados pueden complementarse con figuras y tablas citadas en el


informe

CONCLUSIONES

Establece tus conclusiones en base a los resultados obtenidos en la prctica.

RECOMENDACIONES

Establece recomendaciones que podran mejorar los futuros trabajos.

CUESTIONARIO
1. Cmo se clasifican las enzimas? Por qu?
2. Por qu el modelo de llave - cerradura entre una enzima y el sustrato se ha
dejado de considerar actualmente?
3. Solo existen enzimas de naturaleza proteica? Explique.

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Bioqumica Ambiental

PRACTICA N3
FACTORES AMBIENTALES QUE AFECTAN LA ACTIVIDAD
ENZIMTICA

10

12

14

pH
OBJETIVO

Conocer

los

factores

ambientales

que

podran

alterar

el correcto

funcionamiento de una enzima.

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Bioqumica Ambiental

CONCEPTOS PREVIOS
Inhibidor enzimtico: __________________________________________________
______________________________________________________________________________
Suero Fisiolgico: _______________________________________________________
______________________________________________________________________________
pH: _________________________________________________________________________
______________________________________________________________________________
Buffer: ____________________________________________________________________
______________________________________________________________________________
Sustrato: __________________________________________________________________
_____________________________________________________________________________
Desnaturalizacin proteica: __________________________________________
______________________________________________________________________________

MATERIAL DE LABORATORIO

Buffer fosfato pH 6.9


Buffer fosfato pH 9.0
Buffer acetato pH 5.0
Buffer acetato pH 4.0
ClNa 0.025M
4 Pipetas 20mL
8 Pipetas 10mL
8 Pipetas 5mL

4 Gradillas
Parafilm
40 Tubos de ensayo
Espectrofotmetro
4 Goteros plasticos
Alcohol yodado
100mL Almidn 1%

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Bioqumica Ambiental
INTRODUCCION
Las enzimas o catalizadores biolgicos son protenas que aceleran la velocidad de las
reacciones qumicas sin alterar el equilibrio de la reaccin. Adems estas molculas no
modifican su estructura a lo largo del desarrollo. Las enzimas actan disminuyendo la
energa de activacin, de tal forma que aumenta el nmero de sustratos que se
encuentran en un estado favorable para la reaccin (estado de transicin o de
activacin).
La generacin de un producto determinado dentro de nuestras clulas se realiza en
funcin a un proceso, la necesidad de una serie de pasos para una reaccin, se
resuelve por la complejidad de las reacciones bioqumicas. De esta manera, algunas
reacciones endergnicas en una sola fase, se tornaran demasiado lentas, siendo
incompatibles con los sistemas biolgicos. Muchas reacciones exergnicas liberaran
demasiada energa, la cual se podra expresar en calor intenso que podra daar el
correcto funcionamiento celular. Por tal razn, ests reacciones

liberan energa

lentamente en cada proceso, de manera que esta energa sea utilizada sin perjudicar la
integridad celular. Los pasos consecutivos que ocurren en nuestro organismo y que
pueden reemplazar una sola reaccin qumica se denominan rutas metablicas.
La actividad enzimtica puede ser regulada, siendo activada o inactivada segn los
requerimientos celulares en un momento dado. Esta actividad tambin est
estrechamente controlada por factores ambientales dentro de la clula, tales como la
temperatura y el pH. Las enzimas siempre exhiben una temperatura y un pH ptimo,
caractersticas apropiadas para su funcionamiento. Por ejemplo, las enzimas en los
tejidos de mamferos siempre muestran temperaturas ptimas alrededor de los 37C,
mientras que las de los peces del rtico estarn cercanas a los 0C. Muchas enzimas se
desnaturalizan a 45C o ms, pero en otros organismos (termoflicos), la actividad
ptima se encuentra por encima de este lmite.

29
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Bioqumica Ambiental
PROCEDIMIENTO
EXPERIENCIA N1:

EFECTO DEL ION CLORURO

1. Preparar la siguiente batera:

Tubo 1

Blanco1

Tubo 2

Blanco2

Tubo 3

Blanco3

1.5mL

1.5mL

1.5mL

1.5mL

1.5mL

1.5mL

Almidn 1%

0.5mL

0.5mL

0.5mL

0.5mL

0.5mL

0.5mL

NaCl 2.3M

1mL

1mL

NaCl 5.0M

1mL

1mL

12.5mL

13mL

11.5mL

12.mL

11.5mL

12mL

0.5mL

Buffer fosfato
0.1 M
pH 6.9

Agua
destilada

Pre-incubar por 5 minutos


Enzima

0.5mL

0.5mL

Tabla.4. Efecto del Ion Cloruro

2. Incubar por 5 minutos a 37C


3. Agregar dos gotas de Solucin de Yodo y dejar reposar por cinco minutos
4. Medir la Absorbancia a 660nm en el espectrofotmetro
5. Graficar actividad enzimtica versus concentracin del ion Cloruro

30
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Bioqumica Ambiental

EXPERIENCIA N2:

EFECTO DE LA TEMPERATURA

1. Preparar la siguiente Batera:


Tubo

Blanco

Tubo

Blanco

Tubo

Blanco

Tubo

Blanco

0C

0C

20C

20C

37C

37C

100C

100C

1.5 mL

1.5mL

1.5 mL

1.5mL

1.5 mL

1.5mL

1.5 mL

1.5mL

NaCI 0.025 M

1.5 mL

1.5mL

1.5 mL

1.5mL

1.5 mL

1.5mL

1.5 mL

1.5mL

Almidn1%

0.5 mL

0.5mL

0.5 mL

0.5mL

0.5 mL

0.5mL

0.5 mL

0.5mL

10 mL

10mL

10 mL

10mL

10 mL

10mL

10 mL

10mL

Buffer fosfato
0.1M pH 6.9

Agua
destilada

Tabla.5. Efecto de la Temperatura

2. Pre-incubar por cinco minutos a las diferentes temperaturas establecidas


3. Agregar 0.5mL del preparado enzimtico (excepto a los Blancos)
4. Incubar a cada temperatura por cinco minutos
5. Agregar dos gotas de Solucin de Yodo, dejar reposar por 5 minutos
6. Medir la Absorbancia a 660nm en el espectrofotmetro. Graficar actividad
enzimtica versus temperatura

31
A.Vlez & R. Salas

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Bioqumica Ambiental

EXPERIENCIA N3:

EFECTO DEL PH

1. Preparar la siguiente Batera


Tubo 1

Blanco 1

Tubo 2

Blanco 2

Tubo 3

Blanco 3

1.5mL

1.5mL

1.5mL

1.5mL

1.5mL

1.5mL

NaCl 0.025 M

1.5mL

1.5mL

1.5mL

1.5mL

1.5mL

1.5mL

Almidn 1 %

0.5mL

0.5mL

0.5mL

0.5mL

0.5mL

0.5mL

Agua destilada

10mL

10.5mL

10mL

10.5mL

10mL

10.5mL

Buffer

Acetato

0.1M

pH 4.0
Buffer

fosfato

0.1

fosfato

0.1

pH 6.9
Buffer
pH 10.0

Tabla.6. Efecto del pH


2. Pre-incubar por cinco minutos a 37C
3. Agregar 0.5mL del preparado enzimtico a todos los tubos a excepcin de los
blancos e incubar por cinco minutos
4. Agregar dos gotas de Solucin de Yodo y dejar reposar por cinco minutos
5. Medir la Absorbancia a 660nm en el espectrofotmetro.
6. Graficar actividad enzimtica versus pH del medio.

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A.Vlez & R. Salas

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Bioqumica Ambiental

EXPERIENCIA N4:

EFECTO DE LA CONCENTRACIN DE ENZIMA

1. Preparar la siguiente Batera:


BLANCO

Tubo 1

Tubo 2

Tubo 3

Tubo 4

Tubo 5

1.5 Ml

1.5mL

1.5mL

1.5mL

1.5mL

1.5mL

NaCI 0.025 M

1.5mL

1.5mL

1.5mL

1.5mL

1.5mL

1.5mL

Almidn 1%

0.5mL

0.5mL

0.5mL

0.5mL

0.5mL

0.5mL

Agua destilada

10.5mL

10.4mL

10.2mL

10mL

9.5mL

8mL

0.5mL

1mL

2mL

Buffer fosfato 0.1 M


pH 6,9

Pre-incubar por 5 minutos a 37C


Preparado de Enzima

0.1mL

0.2mL

Tabla.7. Efecto de la concentracin de Enzima

2. Volver a incubar durante cinco minutos


3. Agregar tres gotas de Solucin de Yodo y dejar reposar por cinco minutos
4. Medir la Absorbancia a 660nm en el espectrofotmetro.
5. Graficar la actividad enzimtica versus concentracin de la enzima.

33
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Bioqumica Ambiental

EXPERIENCIA N5:

EFECTO DE LA CONCENTRACIN DE SUSTRATO

1. Preparar la siguiente Batera:


T-1

B-1

T-2

B-2

T-3

B-3

T-4

B-4

1.5

1.5

1.5

1.5

1.5

1.5

1.5

1.5

NaCl 0,025 M (mL)

1.5

1.5

1.5

1.5

1.5

1.5

1.5

1.5

Almidn 1 % (mL)

0.2

0.2

0.5

0.5

1.0

1.0

2.0

2.0

Agua destilada
(mL)

10.8

11.3

10.5

11.0

10

10.5

9.5

Buffer fosfato
0.1M pH 6,9 (mL)

Tabla.8. Efecto de la Concentracin Sustrato

2. Pre-incubar por cinco minutos a 37C y luego agregar 0.5mL del preparado
enzimtico a cada tubo a excepcin de los blancos.
3. Incubar por cinco minutos
4. Agregar tres gotas de Solucin de Yodo y dejar reposar por cinco minutos
5. Medir la Absorbancia a 660nm en el espectrofotmetro. Graficar actividad
enzimtica versus la Concentracin de Sustrato.
6. Calcular grficamente el Km y la Vmax del preparado de amilasa salival.

34
A.Vlez & R. Salas

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Bioqumica Ambiental
RESULTADOS

Realiza la descripcin detallada de las actividades realizadas durante la


experiencia prctica

Los resultados pueden complementarse con figuras y tablas citadas en el


informe

CONCLUSIONES

Establece tus conclusiones en base a los resultados obtenidos en la prctica.

RECOMENDACIONES

Establece recomendaciones que podran mejorar los futuros trabajos.

CUESTIONARIO
1. Por qu las enzimas reducen

la energa de activacin en una reaccin

qumica?
2. Explique la grfica de los dobles recprocos en funcin a la ecuacin de
Michaelis - Menten?
3. El 50% del azcar libre del maz, se convierte en almidn de 24 a 48hrs despus
de la cosecha, perdiendo su sabor dulce y caracterstico. Sin embargo el sabor
se podra mantener, si las mazorcas se sumergen en agua hirviendo, para luego
enfriarse en agua fra. Explique el mecanismo bioqumico de este proceso.

35
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Bioqumica Ambiental

PRACTICA N4
ACTIVIDAD ENZIMTICA DE LA CATALASA EN SUELOS
CONTAMINADOS

OBJETIVOS

Determinar la presencia de catalasa en diferentes muestras de suelo

Calcular la Actividad Enzimtica de la Catalasa en suelos contaminados

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Bioqumica Ambiental

CONCEPTOS PREVIOS
Coenzima: ________________________________________________________________
______________________________________________________________________________
Apoenzima: ______________________________________________________________
______________________________________________________________________________
Catalizador: _____________________________________________________________
______________________________________________________________________________
Grupo Hemo: _____________________________________________________________
______________________________________________________________________________
Peroxisomas: ____________________________________________________________
______________________________________________________________________________
Titulacin: _______________________________________________________________
______________________________________________________________________________

MATERIAL DE LABORATORIO
2 Balanzas de precisin
Permanganato de Potasio
( KMnO4 )
Agua destilada
cido Sulfrico ( H 2 SO4 )
Perxido de Hidrgeno
( H 2O2 )
Muestras de suelo
tamizado
Papel filtro

6 Soporte universal
6 Agitador magntico
6 Magnetos
4 Pizetas
6 Embudo
12 Matraz Erlenmeyer
Parafilm
6 Pipetas 50mL
12 Pipetas 5mL
6 Buretas

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Bioqumica Ambiental
INTRODUCCION

Las enzimas son protenas con actividad cataltica, favoreciendo las reacciones
qumicas de los procesos biolgicos. La actividad de la enzima ocurre sobre una
molcula en particular denominada sustrato, la cual finalmente queda transformada
en uno o varios productos. Para que ocurra la reaccin enzimtica, es necesario que el
sustrato se asocie de manera especfica con el sitio activo, regin que presenta una
forma totalmente complementaria con parte o todo el sustrato. Por tanto, la reaccin
queda descrita en la siguiente frmula para resaltar la necesidad de la formacin de un
complejo Enzima Sustrato, luego del cual se podr generar la reaccin qumica:
E+S [E-S] E+P

La actividad enzimtica puede cuantificarse en funcin de la cantidad de sustrato que


va desapareciendo por unidad de tiempo, o la cantidad de producto que va
apareciendo por unidad de tiempo. Debe tomarse en cuenta que, en muchos casos,
las enzimas necesitan de algn compuesto de naturaleza orgnica o inorgnica, el cual
acta como adyuvante, favoreciendo de manera significativa la generacin de la
reaccin. Estos compuestos reciben el nombre de cofactores enzimticos (si son de
naturaleza inorgnica) o coenzimas (si son compuestos orgnicos).
En el suelo, las enzimas son por lo general componentes intracelulares producidos por
los microorganismos, as como por los tejidos de las plantas, por lo que la presencia de
enzimas en el suelo se podra explicar por procesos de secrecin o de lisis celular. De
todas las enzimas liberadas por estos procesos, un pequeo porcentaje queda
inmovilizado y estabilizado en el suelo por algn tipo de agregacin o asociacin
(covalente o no covalente) con las partculas (orgnicas o inorgnicas) componentes
del suelo. Este pequeo porcentaje se explica por el hecho que generalmente ocurre
un fenmeno de lavado por efecto del agua de regado o lluvias o, en muchos casos,
por el hecho que las condiciones extracelulares del suelo (pH, fuerza inica,
temperatura, etc.) son totalmente agresivas para las enzimas, causando su
inactivacin, desnaturalizacin o degradacin.
38
A.Vlez & R. Salas

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Bioqumica Ambiental
La determinacin de la actividad enzimtica de suelos se encuentra relacionada
directamente con la biomasa microbiana, pudindose obtener datos acerca de su
calidad (dependiendo del tipo de enzima analizada) o de procesos como la
mineralizacin y humificacin de la materia orgnica, que brindan informacin acerca
de la conservacin y/o degradacin ambiental que puede estar ocurriendo, sobre todo
si el objetivo es conseguir un manejo ecolgico y sostenible del suelo. Los datos de
actividad enzimtica tambin podran utilizarse para analizar el grado en el cual se ve
afectado el suelo por los procesos de contaminacin y descontaminacin, ya que
reflejara la posibilidad de degradacin de compuestos txicos agregados por el
hombre. Por lo expuesto se puede concluir, que la determinacin de la actividad
enzimtica, junto con la cuantificacin de la biomasa microbiana, es un parmetro
mucho ms sensible para medir los cambios producidos en el suelo, producto del
manejo o la contaminacin.

En realidad, no se necesita identificar las especies

microbianas presentes, sino la actividad metablica que cumplen en este ambiente.


Las actividades enzimticas que pueden medirse en suelos pueden ser clasificadas
como generales, si es que la informacin obtenida nos da luz acerca de los procesos
microbianos globales (por ejemplo, la determinacin de deshidrogenasas y catalasas),
y especficas si es que los datos obtenidos brindan informacin respecto a reacciones y
funciones particulares (carbohidrasas, glucosidasa y galactosidasa para analizar el ciclo
del Carbono, fosfatasas para analizar el ciclo del Fsforo, ureasa y proteasas para el
ciclo del Nitrgeno, arilsulfatasa para el ciclo del Azufre, quitinasa, etc.).
La catalasa es una enzima que rompe el perxido de Hidrgeno para liberar Oxgeno
molecular y agua.
2H2O2 2H2O+O2

En realidad, se considera que esta actividad tiene que ver con dos tipos de enzimas
diferentes, las peroxidasas y las catalasas, aunque el ltimo trmino es mucho ms
genrico y describe mejor a las enzimas presentes en los microorganismos aerobios y
en la mayora de los anaerobios facultativos. En el suelo, la actividad catalasa depende
de muchos factores como la estacin, la vegetacin presente, el contenido de materia
39
A.Vlez & R. Salas

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Bioqumica Ambiental
orgnica y la profundidad del suelo. Tambin se ha observado que esta actividad
enzimtica disminuye en el suelo debido al tratamiento con

herbicidas, insecticidas y

nematicidas.
La determinacin de la actividad catalasa en suelo se medir utilizando el mtodo de
Johnson y Temple (1964), cuya base es la reduccin en medio cido del permanganato
de potasio debido al perxido de hidrgeno que queda en el suelo por accin de las
enzimas microbianas.

40
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Bioqumica Ambiental
PROCEDIMIENTO
EXPERIENCIA N1:

PREPARACIN DE MATERIALES

1. Muestra:
o Colectar una muestra de suelo. Tamizar (2mm) y colocarla en dos bolsas
de papel (0,5g en cada una)
o Conservar una bolsa, y someter la otra a la estufa, a una temperatura de
65C al menos dos horas previas a la prctica para obtener el Peso Seco
(SS)
2. Preparar cido sulfrico 1.5M:
o Medir 8mL de cido sulfrico concentrado y colocarlo en una fiola de
100mL
o Agregar agua destilada hasta la marca de aforo
3. Permanganato de Potasio 1%.
o Medir un gramo de Permanganato de Potasio y colocarlo en un matraz
Erlenmeyer de 250mL
o Agregar 80mL de agua, y llevar a una plancha de calentamiento con
agitador magntico.
o Someter la mezcla a una temperatura de 60C y agitar mediante un
magneto durante cinco minutos
o Filtrar el contenido en una fiola de 100mL y enrasar con agua destilada.
4. Perxido de Hidrgeno 1/100
o Agregar 1mL de una solucin de Perxido de Hidrgeno al 30% en una
fiola de 100mL y enrasar con agua destilada hasta la marca de aforo
o Preparar esta solucin inmediatamente antes de su uso

41
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Bioqumica Ambiental
EXPERIENCIA N2:

ANLISIS DE LA MUESTRA

1. Pesar 0.5 g de suelo tamizado


2. Colocarlo en un matraz Erlenmeyer y agregar 40mL de agua destilada
3. Tapar con parafilm y llevar al agitador magntico por un lapso de 30 minutos (a
una velocidad aproximada de 300 vueltas por min).
4. Agregar 5mL de solucin de perxido de hidrgeno
5. Tapar nuevamente y agitar exactamente por 10 min.
6. Aadir 5mL de cido sulfrico 1.5 M para detener la reaccin enzimtica y
estabilizar el H2O2 residual.
7. Filtrar.
8. Tomar 25mL del filtrado y titular lentamente con el permanganato de potasio
1%, con agitacin constante, hasta que se genere un color rosado permanente.
9. Preparar los siguientes controles:
o Control de perxido: Se prepara una batera exactamente igual,
remplazando el perxido de hidrgeno por 5 ml de agua destilada, el
suelo debe ser exactamente el mismo que se va a analizar.
o Control de suelo: Se prepara una batera exactamente igual, pero sin los
0.5 g de suelo.

42
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Bioqumica Ambiental
EXPERIENCIA N3:

CLCULOS

1. Para calcular la actividad de la catalasa del suelo, se emplea la siguiente


formula:

Actividad de la Catalasa =

(CS-(M-CP)) N 12
SS

Donde:
CS

: Gasto de Permanganato obtenido en el Control de suelo.

: Gasto de Permanganato obtenido en la muestra problema.

SS

: Peso seco del suelo (previo a la prctica, se toman 0.5 g de la muestra


de suelo hmedo, y se deja en estufa a 70C mnimo por 2 horas).

CP

: Gasto de permanganato obtenido en el Control de perxido.

: Normalidad exacta del permanganato de Potasio (se obtiene titulando


el permanganato con oxalato de sodio 0.1 N).

2. La actividad de catalasa se expresa en milimoles de perxido consumidos por


gramo de suelo seco y por hora (mmoles/g.h)

43
A.Vlez & R. Salas

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Bioqumica Ambiental
RESULTADOS

Realiza la descripcin detallada de las actividades realizadas durante la


experiencia prctica

Los resultados pueden complementarse con figuras y tablas citadas en el


informe

CONCLUSIONES

Establece tus conclusiones en base a los resultados obtenidos en la prctica.

RECOMENDACIONES

Establece recomendaciones que podran mejorar los futuros trabajos.

CUESTIONARIO
1. Por qu los organismos menos evolucionados como las bacterias, presentan la
enzima catalasa en el citoplasma?
2. Por qu se genera el perxido de hidrogeno en nuestro organismo?
3. Cul es la importancia del perxido de hidrgeno en el rea de Remediacin
Ambiental?

44
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Bioqumica Ambiental

PRACTICA N5
CUANTIFICACIN DE AZUCARES REDUCTORES EN
PLANTAS SOMETIDAS A ESTRS SALINO

CH 2OH

CH 2OH

H
OH

OH

CH 2OH

OH

OH

OH

OBJETIVOS

Reconocer experimentalmente la presencia de azucares reductores en


muestras vegetales

Determinar cuantitativamente la concentracin de azucares reductores

45
A.Vlez & R. Salas

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Bioqumica Ambiental

CONCEPTOS PREVIOS
Azcar reductor: ________________________________________________________
______________________________________________________________________________
Enlace glucosdico: _____________________________________________________
______________________________________________________________________________
Oligosacrido: ___________________________________________________________
______________________________________________________________________________
Cetona: ____________________________________________________________________
______________________________________________________________________________
Maltosa: __________________________________________________________________
______________________________________________________________________________
Pentosa: __________________________________________________________________
______________________________________________________________________________

MATERIAL DE LABORATORIO

Espectrofotmetro
Micromipeta 100l
Micromipeta 1000l
Centrifuga
4 Pizetas
Agua destilada
Estndar de carbohidratos
40 Tubos de ensayo 10mL
Papel filtro

4 Pipetas 1mL
Soporte universal
Embudo
Muestras: plantas de
tomate sometidas a estrs
salino
4 Gradillas
Mortero
Fehling A y B

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Bioqumica Ambiental
INTRODUCCION

Los carbohidratos tambin conocidos como azucares o glcidos, son compuestos de


carbono

polihidroxilados,

estructuralmente:

aldehdos

cetonas

simples

(monosacridos) o complejos (oligosacridos y polisacridos).


Los azcares simples se pueden clasificar por el grupo funcional que poseen, por lo
tanto si presentan un doble enlace al oxgeno en uno de los extremos de la cadena, el
azcar recibe el nombre de ALDOSA, por otro lado si el doble enlace al oxgeno no se
presentan en alguno de los extremos, el azcar recibe el nombre de CETOSA. Los
azcares de importancia biolgica y fisiolgica son aldosas en su mayora. Slo una
cetosa (la FRUCTOSA) tiene relevancia biolgica en los animales y el ser humano.
Los monosacridos tambin pueden clasificarse en funcin al nmero de carbonos de
su cadena, principalmente desde tres a siente componentes por cada estructura en
particular. Los carbohidratos de tres carbonos reciben el nombre de triosas como: el
GLICERALDEHIDO y la DIHIDROXIACETONA, con cuatro carbonos, TETROSAS, y as
sucesivamente PENTOSAS, HEXOSAS, y HEPTOSAS. Desde el punto de vista fisiolgico y
bioqumico, los azcares ms importantes son las hexosas dentro de las que
encontramos a la Glucosa, Fructosa y Galactosa adems de una pentosa denominada
Ribosa. Sin embargo, existen azcares de cuatro carbonos (Eritrulosa) y de siete
(Sedoheptulosa) que slo participan en el organismo como intermediario en la va de
las Pentosas.
Un tipo importante de estrs es generado por la salinidad, factor limitante para la
productividad agrcola, que afecta alrededor de 9 x 108 hectreas de la superficie
cultivable sobre la tierra. El estrs salino puede reducir el crecimiento de la planta por
dficit de agua, toxicidad por iones, desbalance por iones o por combinacin de estos
factores. Las plantas en estrs salino sufren de un complejo de sntomas con dos
principales componentes: el estrs hdrico y el estrs osmtico, debido a que una
elevada concentracin de sal en el medio genera una prdida de agua en las clulas
vegetales, una acumulacin interna de iones en niveles txicos, la reducida
47
A.Vlez & R. Salas

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Bioqumica Ambiental
disponibilidad de agua debido al efecto osmtico y una alteracin de la nutricin
mineral. En respuesta a este cuadro, las clulas de la planta responden de manera
diversa, expresando protenas especficas de respuesta al estrs (como la osmotina) o
acumulando compuestos osmoreguladores (osmolitos) tales como aminocidos y sus
derivados (principalmente prolina y betana), alcoholes polihidroxilados (como
manitol, arabitol y glicerol) y azcares (como sacarosa, rafinosa, glucosa y fructosa).
Estos mecanismos moleculares pueden estar relacionados a las adaptaciones
fisiolgicas que se observan, como el adelanto del tiempo de floracin, patrones
elevados del crecimiento relativo de la raz con respecto a la porcin area de la
planta, la generacin de una apariencia cerosa de las hojas, la habilidad de excluir sal
manteniendo el flujo hdrico a travs de la planta, y la capacidad de
compartamentalizacin de iones dentro de vacuolas. Estos mecanismos de respuesta
al estrs salino han sido observados en diversas familias de plantas de inters
econmico, sobre todo en las solanceas. Esta familia agrupa quiz a las principales
plantas de inters para el hombre, como por ejemplo la papa, el pimiento, el rocoto, el
tabaco y el tomate.

48
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Bioqumica Ambiental
PROCEDIMIENTO
EXPERIENCIA N1:

MUESTRAS

1. Lavar arena fina repetidas veces, hasta no observar burbujas


2. Desinfectar la arena con leja al 10%
3. Colocar la arena limpia sobre una almaciguera y agregar 20 semillas de tomate
por cada grupo, cuidando que el sustrato siempre se mantenga hmedo
4. Cubrir las bandejas con un plstico negro hasta que al menos hayan emergido
el 30% de las plntulas
5. Retirar el plstico y separar el 50% de las muestras
6. A partir de este momento regar un grupo de plntulas con solucin hidropnica
(Muestras control) y otro grupo con solucin hidropnica salina 125mM
(Tratamiento)
7. Mantener estos cultivos como mnimo por cuatro semanas previas a la clase

49
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Bioqumica Ambiental
EXPERIENCIA N2:

PROCESAMIENTO

1. Retirar por separado las plantas de tomate de ambos cultivos (Tratamiento y


Control)
2. Pesar un gramo de hojas de cada cultivo, lavarlas cuidadosamente y colocarlas
en un mortero
3. Homogenizar el material en 10mL de buffer fosfato 0.1 M pH 7,0 o en 10mL de
solucin salina vegetal hasta conseguir una muestra completamente lquida
4. Centrifugar a 3000 rpm durante 15 minutos y almacenar el sobrenadante

50
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Bioqumica Ambiental
EXPERIENCIA N3:

CUANTIFICACIN DE AZCARES REDUCTORES

1. Colocar 100L de cada sobrenadante en tubos de micro-centrifuga


(Tratamiento y Control)
2. Agregar 700L de agua destilada a cada tubo y homogenizar
3. Agregar 100L de Hidrxido de Bario a cada tubo y homogenizar por 30
segundos
4. Finalmente agregar 100L de Sulfato de Zinc, agitar y dejar en reposo por 5
minutos
5. Centrifugar a 6000rpm durante 10 minutos cada una de las muestras
6. Tomar 100L de cada sobrenadante y colocar en tubos de micro-centrfuga
7. Agregar 1000L de Reactivo enzimtico y mezclar por inversin
8. Reposar las muestras durante 10 minutos a temperatura ambiental
9. Leer absorbancias a 505nm
10. Determinar la concentracin de Glucosa en funcin a una curva de calibracin
entre 100g/mL y 500g/mL de glucosa

51
A.Vlez & R. Salas

Facultad de Ciencias Ambientales


Bioqumica Ambiental
RESULTADOS

Realiza la descripcin detallada de las actividades realizadas durante la


experiencia prctica

Los resultados pueden complementarse con figuras y tablas citadas en el


informe

CONCLUSIONES

Establece tus conclusiones en base a los resultados obtenidos en la prctica.

RECOMENDACIONES

Establece recomendaciones que podran mejorar los futuros trabajos.

CUESTIONARIO
1. Por qu algunas plantas elevan considerablemente la concentracin de
monosacridos y disacridos dentro de cada clula en respuesta a la salinidad
del medio ambiente?
2. Los factores ambientales afectan el metabolismo de los carbohidratos?
Especificar.
3. Cul es la relacin entra las lectinas y los carbohidratos?
4. Por qu son importantes los glucosaminglucanos?
5. Describa cuatro polisacridos que tengan importancia relevante en los
ecosistemas peruanos.

52
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Bioqumica Ambiental

PRACTICA N6
CUANTIFICACIN DE PROTENAS TOTALES EN PLANTAS
SOMETIDAS A ESTRS ABITICO

NH2

CH3

COOH
N

OBJETIVOS

Reconocer la presencia de protenas en muestras vegetales

Determinar cuantitativamente la concentracin de protenas totales

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Bioqumica Ambiental

CONCEPTOS PREVIOS
Enlace peptdico: _______________________________________________________
______________________________________________________________________________
Aminocido: _____________________________________________________________
______________________________________________________________________________
Pptido: ___________________________________________________________________
______________________________________________________________________________
Osmotina: ________________________________________________________________
______________________________________________________________________________
Protena: _________________________________________________________________
______________________________________________________________________________
Proteasas: ________________________________________________________________
______________________________________________________________________________

MATERIAL DE LABORATORIO
Centrifuga
Reactivo de Biuret
Estndar de protenas
totales
Agua destilada
12 Pipetas 1mL
4 Gradillas
40 Tubos de ensayo 10mL
Papel filtro

Mortero
Soporte universal
Espectrofotmetro
4 Pizetas
Embudo
Plantas de tomate
Cloruro de sodio (ClNa)
Arena fina
Leja

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Bioqumica Ambiental
INTRODUCCION
Las protenas son polmeros formados por unin de unidades llamadas aminocidos.
Los aminocidos son molculas simples que poseen un tomo de carbono central
alrededor del cual se asocian un grupo carboxilo, un grupo amino, un tomo de
hidrgeno y en el cuarto enlace, un grupo variable segn el tipo de aminocido. EL
carbono central se denomina carbono , y los grupos asociados directamente a l,
tendrn la misma denominacin.

Este carbono es asimtrico, en vista que este

carbono posee sus cuatro enlaces unidos a grupos diferentes. La asimetra del carbono
genera isomera ptica, por lo que los aminocidos pueden ser de tipo d o l. La
isomera ptica es definida fsicamente como la capacidad que tienen las molculas en
solucin acuosa de desviar la luz polarizada hacia la derecha o hacia la izquierda. Esta
capacidad est directamente relacionada con la disposicin espacial de los grupos
asociados al carbono . Todos los sistemas biolgicos utilizan l-aminocidos para la
sntesis de protenas.
Los aminocidos se unen entre s a travs de un enlace covalente denominado ENLACE
PEPTDICO, el cual se genera entre el grupo -carboxilo del primer aminocido con el
grupo -amino del segundo.

La cadena de aminocidos generada se denomina

PPTIDO, si la cadena posee hasta cien aminocidos. Cuando la cadena es mayor que
cien unidades, el nombre cambia a PROTENA.
Entre los aminocidos, existen algunos que poseen en su regin variable grupos amino
o carboxilo adicionales, los cuales les confieren cargas positivas o negativas, segn el
caso. Estas cargas permiten que la cadena de aminocidos se pliegue al generar
enlaces o atracciones entre s. Este tipo de atracciones generarn diferentes niveles
estructurales en las protenas. La ESTRUCTURA PRIMARIA est constituida por la
secuencia lineal de aminocidos, la cual est determinada segn la informacin
contenida en el gen respectivo.

Cuando ocurre la sntesis de protenas en los

ribosomas, la cadena de aminocidos va creciendo y va generando plegamientos


caractersticos debido a las interacciones entre ciertos grupos laterales de
aminocidos, que generan principalmente enlaces de hidrgeno, los cuales definen
55
A.Vlez & R. Salas

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Bioqumica Ambiental
formas caractersticas de la ESTRUCTURA SECUNDARIA, como el -HELICE y la HOJA
PLEGADA. En la primera, los aminocidos van girando hacia la derecha sobre un eje en
forma de tirabuzn, mientras que en la segunda, los aminocidos forman una cadena
quebrada en forma de zig-zag, asocindose por enlaces de hidrgeno con otra cadena
de similares caractersticas, generando un plano similar al de una hoja de papel
plegada en forma de abanico. La ESTRUCTURA TERCIARIA est formada por un mayor
plegamiento de estas estructuras secundarias, principalmente debido a fuerzas
hidrofbicas (los aminocidos no polares se juntan en un centro a fin de estar alejados
y sin contacto con el medio acuoso).

La estructura terciaria genera la forma

tridimensional final de las protenas, pudiendo ser principalmente de tipo GLOBULAR,


si la protena genera una forma esfrica, o FIBROSA si la cadena de aminocidos
mantiene una forma alargada interactuando con otras cadenas de aminocidos de
similar forma.
Algunas protenas estn compuestas por dos o ms subunidades, asociadas por
enlaces covalentes llamados puentes de disulfuro, en los cuales participan los grupos
sulfidrilo de dos cistenas.

Cada una de estas subunidades es una cadena de

aminocidos independiente, igual o diferente, llamado MONMERO.

Todas las

protenas tienen estructura terciaria, pero slo algunas llegan a tener estructura
cuaternaria, cuando para cumplir su funcin deben estar conformadas por dos o ms
monmeros.
Se define al estrs como cualquier alteracin de las condiciones ambientales que
pueda reducir o influir de manera adversa en el crecimiento o desarrollo de una
planta. Las respuestas al estrs son tpicamente complejas, afectando diversas partes
de la planta e involucrando incluso a hormonas de estrs como el cido abscsico y
etileno. Existen diferentes factores que pueden ser considerados como estresantes;
entre ellos podemos mencionar como los ms importantes, al estrs ambiental y al
estrs por minerales.
Un de las estrategias de algunas plantas en respuesta al estrs hdrico o salino en el
medio externo, es la movilizacin de carbohidratos a las vacuolas con las finalidad de
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A.Vlez & R. Salas

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Bioqumica Ambiental
reducir el rea de interaccin de los solutos, y evitar la prdida excesiva de agua, sin
embargo cada uno de los solutos requiere de transportadores muchas veces
especficos y estructuras que le permitan realizar este cambio fisiolgico y bioqumico.
Las molculas encargadas de este cometido son las protenas totales del medio celular,
las cuales van aumentar sus concentraciones en relacin directa con el nivel de estrs
al que se encuentre sometida cada planta en particular.

57
A.Vlez & R. Salas

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Bioqumica Ambiental
PROCEDIMIENTO
EXPERIENCIA N1:

MUESTRAS

1. Lavar arena fina repetidas veces, hasta no observar burbujas.


2. Desinfectar la arena con leja al 10%.
3. Colocar la arena limpia sobre una almaciguera y agregar 20 semillas de tomate
por cada grupo, cuidando que el sustrato siempre se mantenga hmedo.
4. Cubrir las bandejas con un plstico negro hasta que al menos hayan emergido
el 30% de las plntulas.
5. Retirar el plstico y separar el 50% de las muestras.
6. A partir de este momento regar un grupo de plntulas con solucin hidropnica
(Muestras control) y otro grupo con solucin hidropnica salina 100mM
(Tratamiento)
7. Mantener estos cultivos como mnimo por cuatro semanas previas a la clase.

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A.Vlez & R. Salas

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Bioqumica Ambiental
EXPERIENCIA N2:

PROCESAMIENTO

1. Retirar por separado una planta de tomate de cada cultivo (Control y


Tratamiento), teniendo cuidado de no romper las races.
2. Lavarlas cuidadosamente y colocarlas en un mortero.
3. Homogenizar con 10mL de agua o solucin salina hasta conseguir una muestra
completamente lquida.
4. Centrifugar a 5000 rpm por 10 minutos y almacenar el sobrenadante
(Homogenizado).

59
A.Vlez & R. Salas

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Bioqumica Ambiental
EXPERIENCIA N3:

CUANTIFICACIN DE PROTENAS

1. Rotular dos tubos de ensayo: C (control) y M (muestra)


2. Colocar 0,5mL de cada homogenizado en los tubos de ensayo respectivos y
agregar 1mL de reactivo de Biuret a cada uno, dejando reposar por 10 minutos
3. Realizar los siguientes controles:
4. Control de Muestra (CM)
o Colocar 0,5mL de agua destilada
o Agregar 1mL de reactivo de Biuret
5. Control de Biuret (CB1 y CB2)
o Colocar 0,5mL del homogenizado control en CB1
o Colocar 0,5mL del homogenizado muestra problema en CB2
o Agregar 1mL de agua en cada tubo
6. Realizar la lectura de la absorbancia a 595nm.
7. Para eliminar la interferencia en cada tratamiento considerar la siguiente
formula:

A (MP CB)
Donde:
A:

Absorbancia real

8. Con el uso de una curva de calibracin calcular la concentracin de protenas


expresadas en g de protena/g de peso hmedo, para lo cual preparar una
batera de tubos con estndares entre 1000 y 3000g de protenas totales.

60
A.Vlez & R. Salas

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Bioqumica Ambiental
RESULTADOS

Realiza la descripcin detallada de las actividades realizadas durante la


experiencia prctica

Los resultados pueden complementarse con figuras y tablas citadas en el


informe

CONCLUSIONES

Establece tus conclusiones en base a los resultados obtenidos en la prctica.

RECOMENDACIONES

Establece recomendaciones que podran mejorar los futuros trabajos.

CUESTIONARIO
1. Cmo se clasifican los aminocidos por el grupo R?
2. Cmo podran los aminocidos darnos evidencia de la historia de nuestro
planeta?
3. Cul es la importancia fundamental de las protenas en el medio ambiente?
4. Todas las protenas tienen estructura cuaternaria? Explique.

61
A.Vlez & R. Salas

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Bioqumica Ambiental

PRACTICA N7
PIGMENTOS FOTOSINTTICO ASOCIADOS A CAMBIOS
AMBIENTALES

OBJETIVOS

Determinar la concentracin de Clorofila-a y Clorofila-b en plantas de tomate.

Identificar la concentracin de clorofila total, y la proporcin de estos


pigmentos en las diferentes muestras.

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A.Vlez & R. Salas

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Bioqumica Ambiental

CONCEPTOS PREVIOS
Pigmentos: _______________________________________________________________
______________________________________________________________________________
Clorofila B: _______________________________________________________________
______________________________________________________________________________
Carotenoides: ____________________________________________________________
______________________________________________________________________________
Porfiniras: _______________________________________________________________
______________________________________________________________________________
Pirrol: _____________________________________________________________________
______________________________________________________________________________
Fotosintesis: _____________________________________________________________
______________________________________________________________________________

MATERIAL DE LABORATORIO

Balanza analtica
Espectrofotmetro
Acetona 80%
Agua destilada
Papel filtro
Soporte universal
Aro metlico
12 tubos de ensayo

4 gradillas
8 Pipeta 10mL
4 Pizetas
4 Embudos
4 Mortero
Plantas de tomate
estresadas con Pb
Plantas de tomate control

63
A.Vlez & R. Salas

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Bioqumica Ambiental
INTRODUCCION
Las plantas realizan el proceso de fotosntesis para formar molculas que le permitan
crecer o mantener sus reservas de carbohidratos principalmente, en base a la
absorcin de CO2, H2O y diversos nutrientes que obtienen directamente del suelo o de
algn rgano estructural de la planta. La fotosntesis es dependiente de algunos
factores ambientales como la temperatura, la intensidad lumnica y la cantidad de
agua disponible.
En la fotosntesis pueden distinguirse dos etapas o fases: La fase luminosa, en donde se
forman molculas de ATP y NADPH, y la fase oscura, donde se forman enlaces
covalentes entre los tomos de carbono mediante el ciclo de Calvin. Adems podemos
reconocer dos grupos de pigmentos fotosintticos ubicados en los tilacoides, los
pertenecientes al Fotosistema I, formado por clorofilas que absorben la luz a 700nm
por lo que son conocidas como P-700; y el Fotosistema II, formado por clorofilas que
absorben la luz a 680nm y son conocidas como P-680.
Los escenarios bioqumicos de la cadena de reacciones que transforman la energa
luminosa en energa qumica, son los cloroplastos, aunque podramos considerar
especficamente toda la hoja, debido a que este proceso se encuentra estrechamente
relacionado con los ndices de transpiracin a los que se encuentre sometida la planta
en un ecosistema en particular. El pigmento ms relevante en el proceso es la
Clorofila-a, la cual se encuentra relacionada de forma directa con la captacin de
energa lumnica, sin embargo la planta posee adems otros pigmentos secundarios
accesorios como los carotenoides y la clorofila-b. La funcin de estos pigmentos
accesorios parece estar relacionada con la foto-proteccin de los pigmentos de
clorofila-a.
Las clorofilas absorben la luz en longitudes de onda entre los 400nm y 700nm (Fig.3)
excepto el color verde que percibimos con nuestros sentidos en la gran mayora de
hojas y tallos de cada organismo vegetal. La clorofila se encuentra dentro de las
molculas denominadas Porfirinas, por tanto podra definirse como un tetra-pirrol
cuyo ncleo es un tomo de magnesio.
64
A.Vlez & R. Salas

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Bioqumica Ambiental
Las concentraciones de clorofila en cada planta mantienen un equilibrio constante en
el que se evidencia la presencia de Clorofila-a en un 75% y de Clorofila-b en un 25%.
Sin embargo esta proporcin puede sufrir alteraciones diversas originadas por algunos
factores ambientales como la salinidad excesiva, estrs hdrico y contaminacin por
metales pesados como el plomo, los que repercuten en la prdida o sustitucin de los
ncleos de magnesio particularmente. Por lo tanto la cuantificacin de la clorofila-a y
clorofila-b es empleada como un complemento para detectar alteraciones en el medio
ambiente, generalmente causados por contaminantes atmosfricos.

97
b

87
77
a

Absorbancia

67
57
47
37

27
17
7
-3

390

440

490

540

590

640

690

740

Longitud de Onda

Figura3. Espectro de absorcin de los pigmentos fotosintticos. a: Clorofila-a; b:


Clorofila-b; c: Carotenoides.

65
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Bioqumica Ambiental
PROCEDIMIENTO
EXPERIENCIA N1:

PREPARACIN DE LA MUESTRA

1. Lavar arena fina repetidas veces, hasta no observar burbujas.


2. Desinfectar la arena con leja al 10%.
3. Colocar la arena limpia sobre una almaciguera y agregar 20 semillas de tomate
por cada grupo, cuidando que el sustrato siempre se mantenga hmedo.
4. Cubrir las bandejas con un plstico negro hasta que al menos hayan emergido
el 30% de las plntulas.
5. Retirar el plstico y separar el 50% de las muestras.
6. A partir de este momento regar un grupo de plntulas con solucin hidropnica
(Muestras control) y otro grupo con solucin hidropnica con plomo 10mM
(Tratamiento)
7. Mantener estos cultivos como mnimo por cinco semanas previas a la clase.

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A.Vlez & R. Salas

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Bioqumica Ambiental
EXPERIENCIA N2:

EXTRACCIN DE PIGMENTOS

1. Medir 100mg de hoja proveniente de la muestra Control en una balanza


analtica, evitando en lo posible tomar en cuenta las nervaduras.
2. Anotar el peso exacto de la medida.
3. Repetir el proceso con las hojas de una muestra del Tratamiento.
4. Colocar las hojas en un mortero y triturar agregando 10mL de acetona al 80%.
5. Filtrar cada contenido en un tubo de ensayo: C (Control) y T (Tratamiento).
6. Medir las Absorbancias de cada tubo a las siguientes longitudes de onda:
663nm y 645nm, como lo indica la siguiente tabla.
7. Tomar como blanco, la solucin de acetona al 80%.

CONTROL TRATAMIENTO

663nm
645nm
Tabla9. Absorbancias de las muestras Control y Tratamiento
a dos longitudes de onda

67
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Bioqumica Ambiental
EXPERIENCIA N3:

CLCULOS

1. Con los datos obtenidos en la experiencia N2 realizar los clculos


correspondientes:

Clorofila b (mg/g hoja)=

Clorofila a (mg/g hoja)=

(22.9 xA645 ) (4.68xA663 ) x mL acetona


mg de hoja

(12.7 xA663 ) (2.6 xA645 ) x mL acetona


mg de hoja

2. Identificar la concentracin de Clorofila Total (Clorofila-a + Clorofila-b) y la


proporcin entre Clorofila-a y Clorofila-b.

68
A.Vlez & R. Salas

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Bioqumica Ambiental
RESULTADOS

Realiza la descripcin detallada de las actividades realizadas durante la


experiencia prctica

Los resultados pueden complementarse con figuras y tablas citadas en el


informe

CONCLUSIONES

Establece tus conclusiones en base a los resultados obtenidos en la prctica.

DISCUSIONES

El trabajo deber ser contrastado con otros experimentos similares citando las
referencias de forma correcta

RECOMENDACIONES

Establece recomendaciones que podran mejorar los futuros trabajos.

CUESTIONARIO
1.
2.
3.
4.

Cul es la importancia del ciclo de Calvin en las plantas?


Explique el metabolismo de las Porfirinas.
Cul es la importancia de la clorofila en el proceso fotosinttico?
Qu funcin cumple el magnesio en las molculas de clorofila?

69
A.Vlez & R. Salas

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Bioqumica Ambiental

PRACTICA N8
RESPIRACIN CELULAR. ALTERACIN POR METALES
PESADOS

Acetil-CoA

Citrato

Iso-citrato

Fumarato

Succinil-CoA

OBJETIVOS

Verificar la inhibicin del ciclo de Krebs por el plomo.

Comprobar una reaccin de Oxido-Reduccin mediante el azul de metileno.

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Bioqumica Ambiental

CONCEPTOS PREVIOS
Inhibidor: ________________________________________________________________
______________________________________________________________________________
Piruvato DH: _____________________________________________________________
______________________________________________________________________________
Acetil CoA: ________________________________________________________________
______________________________________________________________________________
Mitocondria: _____________________________________________________________
______________________________________________________________________________
NADH: _____________________________________________________________________
______________________________________________________________________________
Succinato DH: ____________________________________________________________
______________________________________________________________________________

MATERIAL DE LABORATORIO

Balanza de precisin
Agua destilada
Acetato de plomo
12 tubos de ensayo
Hgado de pollo
Mortero
4 Pipetas 1mL
Licuadora

4 Pizetas
4 Pipetas 10mL
Pipetas descartables
Succinato sdico 0,4M
Aceite vegetal
Buffer fosfato pH7
Azul de metileno 0.1%

71
A.Vlez & R. Salas

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Bioqumica Ambiental
INTRODUCCION

El metabolismo celular es la suma de todas las reacciones biosintticas y catablicas


que ocurren dentro de la clula. Las reacciones biosintticas utilizando la energa que
se genera dentro de la clula para formar nuevas molculas:
A + B + Energa Z
Las reacciones catablicas por otro lado degrada componentes o molculas con la
finalidad de producir energa en forma de ATP:
Z A + B + Energa
La energa liberada durante las reacciones catablicas es utilizada para generar
reacciones anablicas principalmente; los animales y otros organismos no
fotosintticos no pueden generar energa qumica a partir de la luz, por lo cual deben
consumir una energa "de segunda mano" a partir de los organismos auttrofos. El
carbono y el hidrgeno que se encuentran dentro de las molculas que se captan con
los alimentos sirven como combustible puesto que no se encuentran en su forma
termodinmicamente ms estable.

La forma ms estable del carbono en una

atmsfera de oxigeno es el C02 y del hidrgeno es el H2O.


Por tanto, las clulas obtienen energa a partir de azcares u otras molculas,
permitiendo a sus carbonos e hidrgenos combinarse con el oxgeno de la atmsfera
para producir CO2 y H20 (oxidacin biolgica). La oxidacin celular es similar a la
oxidacin que ocurre con los tomos de carbono durante la combustin, siendo la
diferencia de que no ocurre en una reaccin de un solo paso, sino utiliza la catlisis
producida por enzimas para tomar las molculas a travs de una gran serie de
reacciones que gradualmente envuelven la fijacin del oxgeno atmosfrico y la
produccin de agua. De esta forma, la energa liberada puede ser ms eficientemente
almacenada en una forma qumica til disponible para generar trabajo celular (ATP).
En el ser humano en reposo, prcticamente utiliza una cantidad de ATP equivalente a
la mitad del peso corporal. En el sentido biolgico, la oxidacin se refiere
72
A.Vlez & R. Salas

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Bioqumica Ambiental
principalmente a la remocin de electrones de las molculas orgnicas. En muchos
casos, la remocin de electrones tambin est acompaada por la liberacin de
protones:
3H20 + 3CH3CH2OH 3CH3COOH + 12 H+ + 12 eCuando una molcula acepta los electrones, se dice que se ha reducido:
RCHO + 2e- + 2H+

---------------> RCH2OH

El contenido energtico de una sustancia dada es mayor en su estado reducido que en


su estado oxidado por la energa de los electrones adicionales. Por tanto, la
combustin (u oxidacin) de los alimentos transforma a los carbonos e hidrgenos
presentes en las molculas captadas desde un estado rico en energa (forma reducida)
a C02 y H2O, donde se encuentran en su mayor estado de oxidacin. Cuando una
sustancia est oxidada, otra sustancia se reduce combinndose con los electrones
removidos.
CH4 CH30H H2C=O H2COOH CO2
En la respiracin celular, gracias al Ciclo de Krebs, el Succinato se transforma en
Fumarato por accin cataltica de la Deshidrogenasa Succnica

Succinato

Deshidrogenasa (SDH) una enzima que permite que se reduzca el FAD en FADH2 el
cual libera electrones que son capturados por el oxgeno molecular. La contaminacin
por metales pesados como el plomo inhibe en gran medida las enzimas del ciclo de
Krebs, reduciendo el poder reductor que esta ruta metaboliza ofrece para el
funcionamiento de la cadena de transporte de electrones y la produccin de energa
en los organismos superiores.

73
A.Vlez & R. Salas

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Bioqumica Ambiental
PROCEDIMIENTO
EXPERIENCIA N1:

RESPIRACIN CELULAR

1. Preparar un homogenizado de hgado de pollo al 10% en buffer fosfato 0.1 M


pH 7.4, utilizando una licuadora o directamente en un mortero.
2. Tomar 5 tubos de ensayo rotularlos correctamente y colocar los reactivos
indicados en el cuadro siguiente, mezclado cada uno de estos compuestos por
cinco segundos.

Succinato 0.4 M
Buffer fosfato pH 7.4

Tubo 1

Tubo 2

Tubo 3

Tubo 4

Tubo 5

0.5 mL

0.5 mL

0,5mL

0.5 mL

1 mL

1 mL

1 mL

1mL

1 mL

0.5 mL

0.5 mL

0.5 mL

0,5mL

0.5 mL

Agua destilada

8 mL

8 mL

7.5 mL

7mL

7.5 mL

Homogenizado de hgado

0.5 mL

0.5 mL

0,5mL

0.5 mL

Acetato de Plomo 10mM

0,5mL

Azul de metileno

Tabla 10. Batera de tubos de prueba. Experiencia de respiracin celular


3. Agregar 0,5mL del homogenizado de hgado en todos los tubos de prueba
excepto el Tubo 1.
4. Inmediatamente despus, agregar una capa de 0,5cm de aceite vegetal en
todos los tubos excepto el Tubo 5.
5. Tomar el tiempo que demora la decoloracin del azul de metileno en cada
tubo.
6. Explique los mecanismos de reaccin de cada tubo.

74
A.Vlez & R. Salas

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Bioqumica Ambiental

Fig.4. Niveles de reduccin de Azul de Metileno en funcin a la respiracin celular de


tejido heptico en cinco diferentes tratamientos

75
A.Vlez & R. Salas

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Bioqumica Ambiental
RESULTADOS

Realiza la descripcin detallada de las actividades realizadas durante la


experiencia prctica

Los resultados pueden complementarse con figuras y tablas citadas en el


informe

CONCLUSIONES

Establece tus conclusiones en base a los resultados obtenidos en la prctica.

RECOMENDACIONES

Establece recomendaciones que podran mejorar los futuros trabajos.

CUESTIONARIO
1.
2.
3.
4.
5.

Qu rutas metablicas forman Acetil CoA? Explique.


Cul es la funcin del Malonato?
Explique qumicamente el cambio de color del indicador (Azul de metileno).
Qu contiene el homogenizado de hgado?
Cmo acta el aceite en la experiencia realizada?

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Bioqumica Ambiental

PRACTICA N9
DETERMINACIN DE TRIGLICERIDOS EN
MICROORGANISMOS DE ORIGEN LAGUNAR

O
CH 2

O
CH

O
CH 2

OBJETIVOS

Extraccin de triglicridos en microorganismos de origen lagunar

Determinacin cuantitativa de triglicridos por mtodos colorimtricos

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Bioqumica Ambiental

CONCEPTOS PREVIOS
Triglicrido: _____________________________________________________________
______________________________________________________________________________
cido graso insaturado: _______________________________________________
______________________________________________________________________________
Molcula apolar: ________________________________________________________
______________________________________________________________________________
Enlace ster: _____________________________________________________________
______________________________________________________________________________
Configuracin CIS: ______________________________________________________
______________________________________________________________________________
Anfiptico: _______________________________________________________________
______________________________________________________________________________

MATERIAL DE LABORATORIO

Muestras de agua residual


Agua destilada
Cloroformo
Tubos de centrfuga
Cuchara-esptula
Pipeta 5mL
Centrifuga
Kit de triglicridos
Balde 4.5L

Soporte universal
Pipetas descartables
Aro metlico
Metanol
Micropipeta 100m
Micropipeta 1000 m
Estufa
Tubos de centrifuga 15mL

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Bioqumica Ambiental
INTRODUCCION
Los lpidos constituyen un grupo de molculas heterogneas, cuya principal
caracterstica es la insolubilidad en agua. Las funciones de estos compuestos son
igualmente diversas, presentndose como elementos estructurales, de transporte o
reserva energtica. Los cidos grasos son un grupo de compuestos de suma
importancia en la mayora de los lpidos, gracias a que determinan muchas veces el
comportamiento de stas biomoleculas. Los cidos grasos son cidos carboxlicos de
cadenas comprendidas entre los 436 carbonos, los cuales pueden presentar un
nmero determinado de dobles enlaces generalmente en la configuracin CIS. Los
cidos grasos que no presentan dobles enlaces toman el nombre de Saturados y se
encuentran principalmente en tejidos animales, por otro lado los cidos grasos que
presenten uno o ms dobles enlaces en sus cadenas toman el nombre de Insaturados,
y son encontrados principalmente en tejidos vegetales. Debido a la presencia de
dobles enlaces, los cidos grasos insaturados no presentan un alto ndice de
empaquetamiento, encontrndose en estado lquido a temperatura ambiental, sin
embargo los cidos grasos saturados tienen un ndice de empaquetamiento muy
superior que los convierte en slidos a temperatura ambiental.
Las clulas de los organismos vivos presentan membranas compuestas por una bicapa
lipdica con carcter anfiptico (hidrfono e hidrfilo) uno de los principales causantes
de la permeabilidad selectiva con respecto al medio extracelular. Los principales lpidos
presentes en la membrana estn agrupados en funcin a sus estructuras qumicas,
dentro de los que encontramos a los fosfolpidos (Glicerofosfolpidos y Esfingolpidos),
glucolpidos (Galactolpidos, Sulfolpidos y Esfingolpidos) y esteroles (Colesterol).
Por otro lado, tanto los tejidos animales como los vegetales presentan lpidos con
funciones de almacenamiento energtico y aislamiento, conocidos como Triglicridos.
Los triglicridos comprenden un grupo de lpidos muy simples, compuestos por un
alcohol denominado glicerol unido mediante enlaces de tipo ster a tres cidos grasos
de cadena variable, quienes determinan su nomenclatura.

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A.Vlez & R. Salas

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Bioqumica Ambiental
La eutrofizacin es un proceso provocado por un aumento excesivo de nutrientes en
un medio acutico

(lagos, mares, ros, etc.) principalmente nitrgeno y fosforo

(Residuos urbanos, industriales, agrcolas, etc.), como consecuencia de actividades


humanas. Entre las principales consecuencias podemos examinar un aumento
descontrolado de organismos como protozoarios y plantas que traen consigo la
disminucin del oxgeno disuelto en el agua, y el crecimiento de las poblaciones de
microalgas relacionadas al mal olor, disminucin de la entrada de luz, desplazamiento
y muerte de peces entre otros. Por tanto, los procesos de eutrofizacin pueden ser
determinados bioqumicamente, calculando la concentracin de triglicridos presentes
en los microorganismos de un medio acutico, utilizando solventes orgnicos
adecuados, que nos permitan desagregar las interacciones hidrfilas y los enlaces
entre los lpidos y protenas de membrana.

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PROCEDIMIENTO
EXPERIENCIA N1:

PREPARACIN DE LA MUESTRA

1. Identificar una laguna contaminada y registrar las caractersticas del contexto


2. Extraer un volumen aproximado de 1.5L de agua de una zona ubicada a un
metro o ms de la orilla
3. Colocar un litro del contenido en un tubo Imhoff, 12 horas previas al inicio de la
prctica
4. Colocar el precipitado en un tubo de centrifuga de 15mL
5. Centrifugar a 3000RPM durante 10 minutos y eliminar el sobrenadante

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EXPERIENCIA N2:

CUANTIFICACIN

1. Agregar 2mL de agua destilada y homogenizar


2. Agregar 4mL de Metanol y agitar durante dos minutos
3. Agregar 2mL de cloroformo y agitar durante dos minutos
4. Agregar 2mL de cloroformo, homogenizar y dejar en reposo durante un minuto
5. Agregar 2mL de agua destilada, homogenizar y dejar en reposo durante un
minuto
6. Centrifugar el contenido a 3000RPM durante 15 minutos
7. Extraer 2mL de la zona basal del tubo
8. Colocar en la estufa durante cinco minutos a 65 grados Celsius
9. Realizar la cuantificacin de triglicridos mediante el mtodo enzimtico:

BLANCO

ESTNDAR

MUESTRA PROBLEMA

ESTNDAR

0.1mL

MUESTRA PROBLEMA

0.1mL

1.0mL

1.0mL

1.0mL

REACTIVO ENZIMTICO

10. Incubar cinco minutos a 37C


11. Leer absorbancias a 520nm y determinar la concentracin de la muestra
problema

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RESULTADOS

Realiza la descripcin detallada de las actividades realizadas durante la


experiencia prctica

Los resultados pueden complementarse con figuras y tablas citadas en el


informe

CONCLUSIONES

Establece tus conclusiones en base a los resultados obtenidos en la prctica.

RECOMENDACIONES

Establece recomendaciones que podran mejorar los futuros trabajos.

CUESTIONARIO
1. Cules son las ventajas energticas de los lpidos frente a molculas como los
carbohidratos y protenas?
2. Cul es la importancia de los Sulfolpidos y Galactolpidos en las plantas?
3. Por qu los esfingolpidos pueden comportarse como fosfolpidos y
glucolpidos?
4. Dnde se encuentran principalmente los triglicridos en plantas y animales?

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PRACTICA N10
INFLUENCIA DE LOS XENOBITICOS EN LA INTEGRIDAD
DEL ADN

OBJETIVOS

Determinacin la integridad de la molcula de ADN mediante electroforesis

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CONCEPTOS PREVIOS
Xenobitico: _____________________________________________________________
______________________________________________________________________________
Epigentico: ______________________________________________________________
______________________________________________________________________________
Mutacin: ________________________________________________________________
______________________________________________________________________________
Electroforesis: ___________________________________________________________
______________________________________________________________________________
Microncleos: ___________________________________________________________
______________________________________________________________________________
Ribosa: ____________________________________________________________________
______________________________________________________________________________

MATERIAL DE LABORATORIO

Raicillas de cebolla
Agua destilada
Acetato de plomo
Tubos de micro-centrifuga
Cuchara-esptula
Pinzas de reloj
Cmara electrofortica
horizontal
Bistures

Buffer Tris pH 7.4


Tips amarillos y azules
Pipetas descartable
Micro-pipeta 100L
Micro-pipeta 1000 L
Tritn X-100
Lauril Sulfato

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INTRODUCCION
La degradacin del ecosistema debido a la polucin antropognica puede ser evaluada
a travs de anlisis qumicos y biolgicos. El anlisis qumico detecta la presencia y
concentracin de compuestos contaminantes en el ecosistema. El anlisis biolgico, o
bioensayo, evala la toxicidad de sustancias en los seres vivos y sus efectos fisiolgicos
y tambin genticos. Los efectos genticos pueden ser de dos tipos, por un lado, la
reaccin del organismo a la accin daina del contaminante, a travs de la activacin e
inactivacin de genes que le permita eliminar,

almacenar y/o transformar los

compuestos txicos a fin de continuar con su desarrollo. Por otro lado, se evala el
dao que genera el contaminante sobre el material gentico.

Este dao puede

reflejarse en mutaciones que cambien la expresin de diversos genes (pruebas de


mutagenicidad) o en dao fsico, lo cual se traduce en la fragmentacin del material
nuclear (microncleos y el ensayo cometa).
El ensayo cometa en condiciones alcalinas, o tambin llamado electroforesis de
clulas individuales, es una tcnica sensible que detecta en el ADN rompimientos de
cadena simple, sitios sensibles a accin alcalina, y sitios en donde han ocurrido
procesos incompletos de reparacin del ADN por escisin de bases. En cualquiera de
los casos, el quiebre de la estructura del ADN genera microfragmentos del material
gentico los cuales, al desarrollarse la electroforesis, migrarn hacia el polo positivo y,
de acuerdo al tamao de los fragmentos, tendrn diferente grado de movilidad,
generando una pequea estela dirigida hacia el polo positivo mientras que los
fragmentos ms grandes e incluso el material nuclear ntegro, presentarn una
movilidad mnima. Esa estela es la que genera entonces la apariencia de una cola,
cada vez ms pequea, de un cometa.

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PROCEDIMIENTO
EXPERIENCIA N1:

PREPARACIN DE LA MUESTRA

1. Colocar una cebolla sobre un beaker de 250mL con agua de grifo, 4 das previos
al desarrollo de la prctica (Figura 1). Seguir las mismas indicaciones para la
preparacin de una muestra control.

Figura 1. Muestra de cebolla (Allium cepa) en un medio de raz flotante.

2. Agregar 100mL de solucin de Acetato de plomo 10mM en la Muestra


Problema dos horas previas al desarrollo de la prctica.
3. Cortar los pices de 5 raicillas (meristemos apicales) y colocarlas en tubos de
micro-centrfuga (Control y Muestra Problema).
4. Triturar las raicillas hasta obtener una muestra homognea.
5. Agregar una gota de Lauril Sulfato y una gota de Triton X-100

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EXPERIENCIA N2:

ELECTROFORSIS EN GEL DE AGAROSA

1. Preparar dos placas Porta-objetos con gel de agarosa 0.5%, cuidando de


mantener en cada una de ellas un espacio en uno de los extremos donde se
colocar la muestra.
2. Colocar cada homogenizado en las placas con agarosa, agregar una gota de azul
de metileno 1% y sellar.
3. Lavar el exceso de colorante.
4. Introducir las placas en la cmara electrofortica cuidando que se encuentren
en el extremo negativo.

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RESULTADOS

Realiza la descripcin detallada de las actividades realizadas durante la


experiencia prctica

Los resultados pueden complementarse con figuras y tablas citadas en el


informe

CONCLUSIONES

Establece tus conclusiones en base a los resultados obtenidos en la prctica.

RECOMENDACIONES

Establece recomendaciones que podran mejorar los futuros trabajos.

CUESTIONARIO
1. Por qu los xenobiticos afectan la integridad del ADN?

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BIBLIOGRAFA

BRAVO N, MARCELO A. 2006. Gua de Prcticas de Biologa Celular. Universidad Nacional


Federico Villarreal. Lima-Per.
BRUCE A, et al. 2004. Biologa Molecular de La Clula. Cuarta Edicin. Ediciones Omega.
Barcelona-Espaa. 1463: 547-560; 983-1062.
CALDERON S. 1997. Biologa General. Manual de Laboratorio. Universidad Nacional
Mayor de San Marcos. Lima-Per.
Janeway C, et al. 2003. Inmunobiologa. El Sistema Inmunitario en condiciones de Salud
y Enfermedad. Segunda Edicin. Editorial Masson.
NELSON D, COX M. 2005. Lehninger. Principios de Bioqumica. Cuarta Edicin. Ediciones
Omega. 1119: 190-225.

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