INGENIERA EN BIOTECNOLOGA

LABORATORIO DE BIOLOGA CELULAR

INFORME N 2
PRTICA N 4 NRC: 1549

ESTUDIANTES:

Mara Emilia Roca Rojas

Zaskia Liseth Ynez Quisaguano
Kelly Gisselle Zagal Maisincho

1 TTULO DE LA PRCTICA:

Identificacin morfolgica y clasificacin de bacterias (procariotas) segn tincin

diferencial Gram, a partir de placas preparadas previamente, utilizando un microscopio
ptico de campo claro.

2 OBJETIVOS:

Evaluar con criterio y en forma grupal, la informacin investigada acerca

de la tincin Gram y clulas procariotes (bacterias).
Tomar correctamente muestras con materiales estriles respetando normas
de bioseguridad.
Realizar adecuadamente un frotis con la muestra seleccionada.
Aplicar metodologa de fijacin al calor (fsica) en base a bibliografa
confiable.
Discutir sobre la funcin de cada uno de los colorantes y reactivos
utilizados en la tincin Gram de bacterias en base a bibliografa cientfica.
Listar correctamente y en orden, cada uno de los reactivos de la tincin
Gram.
Emplear correctamente colorantes, reactivos y materiales para fijacin y
tincin bacteriana, respetando normas de bioseguridad y el medio
ambiente.
Manipular correctamente un microscopio ptico de campo claro,
respetando normas universales.
Identificar morfolgicamente y clasificar bacterias segn tincin
diferencial: Gram, a partir de muestras fciles de obtener en base a
bibliografa confiable.
Diferenciar correctamente entre bacterias Gram positivas y Gram
negativas.
 Discutir sobre las propiedades de la pared celular de las bacterias Gram
positivas y negativas para retener colorante, en base a bibliografa
confiable.
Mantener correctamente el cuaderno de laboratorio con investigacin
cientfica actualizada de la prctica y sus resultados.
Redactar correctamente un informe con uso de mtodo cientfico en base a
la prctica de laboratorio. (Karina Ponce, 2016)

3 INTRODUCCIN:

Todos los seres vivos estamos conformados por unidades muy pequeas, generalmente
invisibles a simple vista llamadas clulas. La clula es la unidad morfolgica y funcional de
todo ser vivo. La cual cumple funciones diversas, y es proactiva por si misma. (Prats,
2006)

Existen dos tipos de clulas fundamentales: procariotas y eucariotas.

Clulas procariotas:

Son las clulas que no tienen ncleo celular definido, su material gentico se encuentra
disperso en el citoplasma. Las clulas procariotas estructuralmente son las ms simples y
pequeas. (Peter N. Campbell, 2006)

Fig1.: http://www.areaciencias.com/celula-procariota.htm

Bacteria: es un microorganismo unicelular procariote que puede provocar enfermedades,

fermentaciones o putrefaccin en los seres vivos o materias orgnicas.

Las bacterias pueden vivir en cualquier hbitat las bacterias son organismos ms
abundantes del mundo: pueden convivir 40 millones de clulas bacterianas en apenas un
gramo de tierra. (Prats, 2006, pg. 33)
 Fig2.:http://microbiologyonline.org/about-microbiology/introducing-microbes/bacteria

Clasificacin de las bacterias segn su forma

Existen tantas bacterias a nuestro alrededor, son variadas y cumplen funciones

significativas.

Hay varios grupos de bacterias que pertenecen a la misma familia y que han evolucionado
de la misma bacteria aunque, de cualquier manera, cada tipo de bacteria posee
caractersticas propias que las particularizan la clasificacin de las bacterias segn su
forma. (Negroni, 2009)

Bacilos: bacterias con forma de barras

Tienen la forma de barras o varillas, suelen ser bacterias de tipo Gram positiva o negativa.
Los ejemplos ms populares son los de las bacterias de E.Coli y la salmonella, que
comnmente, tambin son las responsables de males como la intoxicacin por alimentos y
la fiebre tifoidea; podemos nombrar a dos de las bacterias ms peligrosas que existen: el
Bacillus anthracis, que causa la mortal enfermedad pulmonar del ntrax y el Clostridium,
que causa el botulismo, el ttanos y la gangrena.

Cocos: bacterias con forma de esferas

Su forma es esfrica, las bacterias conocidas como cocos tienen la capacidad de vivir como
clulas individuales o bien de enlazarse hasta forman cadenas y racimos. El Staphylococcus
y el Streptococcus son los dos tipos de bacterias ms comunes dentro de esta clasificacin y
ambas suelen ser Gram positivas, son perjudiciales; pueden causar infecciones en la piel,
intoxicacin alimenticia y tambin amigdalitis, entre otras cosas.

Espirilos: bacterias con forma de espirales

Los espirilos, como bien nos indica su nombre, poseen una marcada forma de espiral. stas
son bacterias Gram negativas y terribles para la salud. Un claro ejemplo es la Treponema,
que causa la enfermedad de transmisin sexual de la sfilis. (Negroni, 2009, pgs. 11-13)
 Fig3.:http://microbiologyonline.org/about-microbiology/introducing-microbes/bacteria

Tcnicas de tincin.

Fundamentos

El tamao de las bacterias resulta difciles de observar en el microscopio ptico. La

principal dificultad es la falta de contraste entre la clula y el medio que la rodea, el medio
ms simple de aumentar el contraste es la utilizacin de colorantes(tincin). Esto puede
emplearse para distinguir los tipos de clulas o para revelar la presencia de determinados
constituyentes celulares, tales como flagelos, esporas, cpsulas, paredes celulares, etc.
(Hernandez, 2002)

Las clulas generalmente son tratadas para coagular el protoplasma antes de teirlas, a
travs de la fijacin. Para las bacterias, la fijacin por el calor es lo ms corriente, aunque
tambin puede fijarse con sustancias qumicas como formaldehido, cidos y alcoholes. La
fijacin produce habitualmente el encogimiento de las clulas Despus de la fijacin, se
aade el colorante, tratando despus ste con el agente fijador, y siguiendo inmediatamente
el proceso de tincin.; la tincin, por el contrario, hace que las clulas aparezcan mayores
que lo que son realmente, de manera que las medidas de las clulas que han sido fijadas o
teidas no pueden realizarse con mucha precisin. (Negroni, 2009)

La mayora de los colorantes son compuestos orgnicos que tienen alguna afinidad
especfica por los materiales celulares. Muchos colorantes utilizados con frecuencia son
molculas cargadas positivamente (cationes) y se combinan con intensidad con los
constituyentes celulares cargados negativamente, tales como los cidos nucleicos y los
polisacridos cidos. Ejemplos el azul de metileno, el cristal violeta y la safranina. Otros
colorantes son molculas cargadas negativamente (aniones), esos colorantes incluyen la
eosina, la fucsina cida y el rojo Congo. Otro grupo de colorantes son sustancias
liposolubles; los colorantes de este grupo se combinan con los materiales lipdicos de la
clula, usndose a menudo para revelar la localizacin de las gotculas o depsitos de grasa.
Un ejemplo de colorante es el negro Sudn. (Forbes, 2009)

Algunos colorantes teirn mejor slo despus de que la clula haya sido tratada con otra
sustancia qumica, que no es un colorante. Esta sustancia se denomina mordiente; un
mordiente habitual es el cido tnico. El mordiente se combina con un constituyente celular
y lo altera de tal modo que ahora s podr atacar el colorante.

La tincin negativa es un modo satisfactorio de aumentar el contraste de las clulas en la

microscopia ptica, pero su mxima utilidad est en revelar la presencia de cpsulas
alrededor de las clulas bacterianas. (Cavallini, 2005)

Los mtodos de tincin son de gran utilidad, pero deben usarse siempre con precaucin, ya
que pueden conducir a errores. Las molculas de colorante forman en ocasiones
precipitados o agregados que parecen estructuras celulares autnticas, pero que son
formaciones completamente artificiales inducidas por el mismo colorante. (Paredes Salido
Fernando, 1994, pgs. 22-23)

http://bagginis.blogspot.com/2016/02/nueva-guia-practica-del-laboratorio.html

Preparacin de un frotis

Sobre un portaobjetos de vidrio, limpio y seco, se coloca el material que se va a teir o se

hace rodar el hisopo con el que se tom la muestra. Una vez que el hisopo ha tocado la
superficie del portaobjetos, que no est estril, ya no puede ser empleado para inocular los
medios de cultivo. Este material es suspendido en una gota de agua o solucin salina
colocada sobre el portaobjetos. El material se frota directamente sobre el portaobjetos,
donde puede visualizarse con facilidad. El material colocado en el portaobjetos se deja
secar al aire o bien se pasa varias veces por la zona azul de la llama de un mechero de
Bunsen hasta que el vidrio est tan caliente que moleste al tacto pero no queme. (Paredes
Salido Fernando, 1994, pg. 21)
4 HIPTESIS:

El mtodo de tincin de Gram contribuye a la fcil y gil identificacin entre el carcter

positivo o negativo de una muestra y la vez la observacin de la forma y clasificacin de las
bacterias contenidas dentro de las diferentes sustancias a estudiarse. Estas observaciones
pueden brindar resultados alterados, debido a factores tales como: tiempo de la muestra,
practicar una mala toma o fijacin de la muestra, la alteracin del procedimiento de Gram.

5 MATERIALES, REACTIVOS, INSUMOS O EQUIPOS:

a) REACTIVOS:
Reactivos para tincin Gram: (Cristal violeta, lugol, alcohol-cetona y safranina)
Aceite de inmersin.
Agua destilada estril.
Agua del grifo.
Alcohol antisptico
Alcohol potable para mecheros (Karina Ponce, 2016).

b) BIOSEGURIDAD PERSONAL:
Mandil.
Guantes.
Mascarilla (Karina Ponce, 2016).

c) INSUMOS:
Placas portaobjetos.
Pipetas desechables.
Mecheros de alcohol.
Papel especial para limpieza de microscopios.
Algodn.
Fsforos o fosforera.
Palillos de dientes estriles.
Hisopos de madera estriles.
Pisetas con agua destilada.
Vaso de precipitacin 500ml.
Vasos de precipitacin 50ml.
Papel toalla.
Bandeja para tinciones (Karina Ponce, 2016).

d) EQUIPOS:
Microscopios pticos de campo claro (lente objetivo 100x) (Karina Ponce, 2016).

e) MUESTRAS:
 Muestras de la mucosa bucal de los estudiantes de la clase.
Superficies.
Soluciones u otras (yogurt, kfir, kumis, leche fermentada, reconstituyentes
bacterianos) y cultivos puros preparados en placas previamente.
Organismos: Bacterias presentes en flora normal, superficies, soluciones, placas
preparadas previamente (Karina Ponce, 2016).

6 PROCEDIMIENTO:

Toma, frotis y fijacin de muestras

a) Con un palillo estril se tom una muestra de la mucosa bucal, para lo cual se froto
la parte interna de la mejilla y/o entre los dientes. Y tras el uso del palillo se lo
desecho en recipiente correspondiente, en este caso para objetos cortopunzante.
b) El docente o ayudante de ctedra preparo soluciones a partir de diferentes muestras
facilitadas todos los estudiantes correspondientes a la materia y aula.
c) Con la ayuda de un hisopo exprimido, se tom muestras de las soluciones
preparadas.
d) Se realiz un frotis y se expandi cada una de las 3 muestras seleccionadas sobre
diferentes porciones de la superficie de una misma placa portaobjetos, tomando y de
cierta manera memorizando el orden de las muestras para evitar confusiones, se
rotul con lpiz en el esmerilado la placa para identificarla de mejor manera.
e) Se fijo la muestra por medio del mtodo de calor, pasando la placa portaobjetos
varias veces por la llama azul del mechero, cuidando de no sobrecalentarla y as
evitar eliminar las especies de estudio; hasta completar las veces necesarias para
fijarla correctamente.
Tincin Gram
a) Se depositar la placa con la muestra previamente fijada sobre la bandeja para
tinciones.
b) Se aplic sobre la muestra, el primer reactivo de la tincin Gram; cristal violeta o
violeta de genciana, cubrindola totalmente y esperando por 1 minuto (puede variar
el tiempo a 40 segundos si el reactivo es concentrado).
c) Sobre la bandeja de tinciones, se lav con agua la placa desde una piceta o pipeta
desechable, para eliminar el exceso de Cristal violeta.
d) Se aplic el segundo reactivo de la tincin Gram: Lugol, cubriendo toda la muestra,
durante 1 minuto
e) Se lav con agua desde una piceta o pipeta desechable, para eliminar el exceso de
lugol.
f) Se aplico decolorante (alcohol-cetona), cubriendo la muestra durante unos segundos
y para eliminarlo se uso agua desde una piceta, como en los procesos anteriores, se
repiti este proceso varias veces, hasta que dej de salir el color violeta.
g) Se lav con agua desde una piceta o pipeta desechable.
h) Se aplic el colorante de constaste: Safranina, cubriendo la muestra, durante 30
segundos.
 i) Se enjuag la muestra con agua desde una piceta o pipeta desechable.
j) Se sec la placa, usando la llama azul del mechero, para acelerar el proceso de
secado.
k) Se Coloc una gota de aceite de inmersin en la placa preparada en clases y en las
facilitadas por el docente.
l) Se observo al microscopio directamente con lente objetivo 100x (ya que solo se
observar procariotes). Para ello se coloc el lente objetivo 100x moviendo el
revlver del microscopio, se subi la platina hasta que el lente objetivo qued
sumergido en el aceite de inmersin. Se procedi a retroceder el micromtrico
observando por los oculares, hasta observar con nitidez la muestra. Se ajust luz,
condensador y diafragma obteniendo el mejor enfoque posible, de acuerdo a quienes
observbamos.
m) Se identific la morfologa de las bacterias presentes y se las pudo clasificar segn
especifica la tincin Gram (Karina Ponce. 2016).

7 RESULTADOS Y OBSERVACIONES:

BACIL

BACILOS Y

Lactobacilus
En esta muestra, se pudo apreciar gran
cantidad de bacterias Gram positivas, esto
queda denotado, debido a la coloracin
caracterstica en la estructura de estas
bacterias, el color violeta. A su vez se
reconoci formas de las bacterias, tales
como bacilos.
Yogurt X
En esta muestra, igualmente se pudo
apreciar gran cantidad de bacterias Gram
positivas, esto queda denotado, debido a
la coloracin caracterstica en la
estructura de estas bacterias, el color
violeta. en ella tambin se reconoci
estructuras como cocos sus variedades.
Como se puede apreciar, la saturacin en
esta muestra, deja un poco limitada la
observacin de las estructuras deseadas.
 estreptoco
Yogurt Alpina
En esta muestra, se pudo apreciar gran
cantidad de bacterias Gram positivas;
aunque en ella se las visualiza con mayor
detalle, debido a sus agrupaciones, en este
caso estraptococos. Tambin se diferenci
estructuras tales como levaduras.
cocos
estreptoco
Reconstituyente bacteriano
En esta muestra, se pudo apreciar gran
cantidad de bacterias Gram positivas, de
estructura caracterstica de bacilos y
ciertos cocos y sus variaciones, algo muy
normal en varios reconstituyentes
bacterianos.
BACIL
diplococ
Kefit
En esta muestra, se pudo apreciar gran
cantidad de bacterias Gram positivas, esto
se debe a que este tipo de fermento, es
secretado por un tipo de hongos que
viven en leche, en ella se observan
grandes agrupaciones de bacilos Gram
positivos.
estreptococ
Yogurt
En esta muestra, se pudo apreciar gran
cantidad de bacterias Gram negativas;
esto es totalmente falso, pues esta
muestra da la impresin de a simple, estar
conformada por organismos de tendencia
negativa. Pero al estudiar su composicin
se la puede determinar como positiva. E
aqu la demostracin de lo sucedido con
cultivos viejos.
BACIL
 Yorgut Kumis
En esta muestra, se pudo apreciar gran
cantidad de bacterias Gram negativas,
nuevamente este resultado, es incorrecto,
pues su estructura es la de una sustancia
que contiene en ella gran cantidad de
bacterias positivas. E aqu se puede
evidenciar lo que puede generar el haber
hecho una mala fijacin o tincin de la
misma. Y a la vez un exceso de la sust.
diplococo
Yogurt
En esta muestra, se pudo apreciar gran
cantidad de bacterias Gram positivas,
aunque su apreciacin resulta un poco
difcil de captar, se demuestra que la
saturacin de una sustancia, tambin puede
producir confusiones.
cocos
estreptococo
Muestra:
En esta muestra, se pudo apreciar bacterias En esta muestra, se pudo apreciar gran
Gram negativas, esto queda denotado, cantidad de bacterias Gram negativas,
debido a la coloracin caracterstica en la esto queda denotado, debido a la
Yogurt
En esta muestra, se pudo apreciar
nuevamente bacterias Gram positivas,
aunque el resultado de la misma parezca
demostrar lo contrario, esto nuevamente
es para demostrar que los cultivos viejos
suelen presentar datos errneos al
momento de ser observados, debido a
cuestiones estructurales.
cocos
diplococos
Leche cortada
En esta muestra, se pudo apreciar
bacterias Gram positivas, aunque en este
caso la muestra resulto ser escaza. En ella
podemos observar algo diferente a lo
observado anteriormente, esta muestra
contiene un microorganismo, que
anteriormente al proceso de fijacin y
tincin se encontraba vivo, dentro de un
medio en el cual poda ser relacionado al
nuestro.
ESTRECTOSBA
Muestra:
 estructura de estas bacterias, el color rosa.
Dentro de ella, justamente en la aguja se
observa una estructura de los cocos, es este
caso una largo streptococo.
coloracin caracterstica en la estructura
de estas bacterias, el color rosa. En ella
tambin se observaron estructuras tales
como las de las diferentes formas de las
bacterias. a pesar de ser de cultivos
viejos, aun puede ser identificada
correctamente.

8 DISCUSIN DE RESULTADOS:

Se pudo observar que atravez de la ticion Gram las bacterias se tien de diferente color
tal que las Gram positivo se teian de color morado por la violeta de genciana mientras
que las Gram negativo eran del color de la safranina y permitieron observar claramente
la estructura de cada una de ellas.

Se logro identificar las bacterias Gram positivo por su color y forma definida tenan
formas como cocos, diplococos, bacilos, estafilococos mientras que las Gram negativo
no se observaban claramente; ms que su color.

9 CONCLUSIONES:

Por medio de la prctica, se adquiri destreza dentro de la toma de muestras as

como los adecuados procesos y componentes, tanto para una buena fijacin, as
como para la aplicacin del mtodo de tincin de Gram.
Las bacterias Gram positivas adoptan el color violeta caracterstico, debido a su
estructura, especialmente a la capa de peptidoglucano, pues impide que el color del
cristal de violeta con la accin del lugol, desaparezca. Radicando la diferencia de
los dos tipos de bacterias, bsicamente en la estructura.
La tincin de Gram facilita la diferenciacin entre bacterias Gram positivas o Gram
negativas, por medio de la coloracin de las mismas; siempre y cuando se hayan
realizado los procesos correctos, as como el uso de todos los reactivos indicados.
Las diferentes formas de las bacterias; as como ciertos microorganismos; pueden
ser visualizados siempre en estas practicas, sin importar el tipo de tincin a
realizarse, si no del tipo de sustancia a estudiarse.
Los cultivos viejos, suelen tergiversar los resultados, por su condicin de estructura,
pues los reactivos propios de la tincin Gram no tienen el mismo efecto que en los
cultivos recientemente extrados.
El realizar una mala fijacin o colocar exceso de sustancia, difcil o impide la
visualizacin y diferenciacin de este tipo de estructuras y su negatividad o
positividad.

10 RECOMENDACIONES:
 Realizar las fijaciones, as como tinciones con sumo cuidado.
Evitar colocar exceso de sustancia a observarse.
Prestar atencin y tratar de diferenciar de la mejor manera los resultados, cuando se
trabaje con cultivos viejos.
Tener en cuenta siempre las normas de bioseguridad.

11 BIBLIOGRAFA

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Microbiologa de alimentos. Programa de Nutricin. Mexico: UACJ.

Cavallini, C. (2005). Bacteriologa General: Principios Y Prcticas de

Laboratorio. Costa Rica: Editorial Universidad de Costa Rica.

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Panamericana.

Hernandez, C. (2002). Fundamentos de Epidemiologa: El Arte Detectivesco de

la Investigacion Epidemilogica. Costa Rica: EUNED.

Negroni, M. (2009). Microbiologa Estomatolgica. Espaa: Ed. Mdica

Panamericana.

Paredes Salido Fernando, F. M. (1994). Microbiologa clnica prctica. Cadiz:

Servicio Publicaciones UCA.

Prats, G. (2006). Microbiologa clnica. Barcelona,Espaa: Ed. Mdica

Panamericana.

12 WEGRAFIA:
http://biologiamedica.blogspot.com/2010/09/bacterias-gram-positivas-y-
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http://www.vix.com/es/btg/curiosidades/2011/06/30/clasificacion-de-las-
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http://es.wikihow.com/hacer-una-tinci%C3%B3n-de-Gram
http://es.viva-read.com/article/qu-hace-acetona-alcohol-a-una-tincin-de-gram
http://www.microinmuno.qb.fcen.uba.ar/SeminarioTinciones.htm
http://www.vix.com/es/btg/curiosidades/2010/12/31/%C2%BFdonde-viven-las-
bacterias