INFORME FINAL

PROYECTO 1401

Recoleccin, aislamiento e identificacin de cepas de bacterias nativas

de Jutiapa y Chimaltenango, del gnero Rhizobium kguminosarum biovar
phaseo, para el aprovechamiento de la fijacin biolgica de nitrgeno
en el cultivo de frijol.

Unidad ejecutara: ICTA/FODECYT

-
Perodo: Enero 2003 Enero 2004

Investigsaores
Ing. Agr. Juan Jos Soto Dominguez
Inga Agra. Alma Maritza Garca Chacln

Guatemala, mayo 2004

 RECONOCIMIENTO

Tesista Srita. Claudia Lorena Cmanza Melndez

Por su apoyo en la fase de microbiologa

Laboratorio de Anlisis h4icrobiolgicos y de Referencia

Facultad de Ciencias Qumicas y Farmacia
Universidad de San Carlos de Guatemala
Por permitir el uso de sus instalaciones para este proyecto

Ing. Agr. Edgar Edgardo carrillo

Por su colaboracin en la etapa de campo
 INDICE

.
No de rden No.Pgina
.
1 INTRODUCCION .....................................................-....................................
01
2. ANTECEDENTES.......................................................................................... O1
3. OBJETIVOS.................................................................................................... 08
4. HIPOTESIS.....................................................................................................08
5. METODOLOGIA. ..............-................. ....................................................... O8
5.1 Reconocimiento preliminar de reas............................................................ 09
5.2 Contacto con agricultores y visitas de campo..............................................09
. de ndulos.................................................................................. 10
5.3 Recoleccion r

5.4 Preparacin de muestras de ndulos in situ...............-..-................,..........10

5.5 Aislamiento de los rizobios de los ndulos...................................................10
5.6 Identificacin de Rhizobium leguminosarum biovarphaseoli ....................... 10
..
5.7 Preservacion de la cepas ................................................................................ 11
5.8 Toma de muestras de suelo......................................................................... 11
5.9 Anlisis de suelos...........................................................................................11
5.10 Trabajos de gabinete...................................................................................12
6. RESULTADOS............................................................................................... 12
6.1 Resultados de microbiologa..,............... .....................................................12
6.2 Resultados del muestreo de suelos...............................................................15
7. CONCLUSIONES ......................................................................................... 25
8. RECOMENDACIONES ............................................................................... 26
9. BIBLIOGRAFIA
.
10 ANEXOS
11.FOTOGRAFIAS
 RECOLECCION, AISLAMIENTO E IDENTIFICACION DE CEPAS DE
BACTERIAS NATIVAS DE JUTIAPA Y CHIMALTENANGO DEL GENERO
Rhizobium leguminosarum, biovarphaseoli, PARA EL APROVECHAMIENTO DE
LA FIJACION BIOLOGICA DE NITROGENO EN EL CULTIVO DE FRIJOL

Ing. Agr. Juan Jos Soto Domnguez *

Inga. Agra. Alma Maritza Garca Chacln*

RESUMEN

La ejecucin del proyecto se realiz a travs de la recoleccin, aislamiento e identificacin

de cepas de Rhizobium nativas de nuestro pas y la ubicacin de zonas geogrficas donde
existe mayor disponibilidad de las mismas, con el propsito de aprovechar la capacidad
que poseen de formar asociaciones simbiticas con las leguminosas.
Con el aprovechamiento de la fijacin biolgica de nitrgeno se tiene un beneficio social al
reducir los costos de produccin, ya que la misma influye directamente en la baja del
consumo de fertilizantes qumicos nitrogenados, y un beneficio ambiental al evitarse la
contaminacin de los recursos suelo y agua causada por las fuentes qumicas de nitrgeno.
El objetivo principal del proyecto fue el de aislar e identificar cepas de bacterias nativas de
Rhizobiurn de los departamentos de Jutiapa y Chimaltenango.
Como resultado se obtuvieron 111 muestras de ndulos de las cuales se lograron aislar 64
cepas, que segn su reaccin el laboratorio nos indica que son bacterias sospechosas de
pertenecer al gnero Rhizobium; segn su reaccin 4, no pertenecen al gnero rhizobium y
36 fueron negativas. Las bacterias sospechosas fueron sometidas a prueba de infectividad
en 6 diferentes diluciones y en medio estril para observar su infectividad en semillas
desinfestadas de frijol de la variedad ICTA Hunap.
De las 64 cepas aisladas, nicamente se comprob que 21 cepas sospechosas, s pertenecen
al gnero Rhizobium leguminosarum biovar phaseoli, ya que el resto se vio afectada por
problemas de contaminacin por hongos en las semillas y por falta de tiempo en el proyecto
no fue posible realizar nuevas infecciones con las cuales hubiramos obtenido un mayor
nmero de cepas.
Se realizaron determinaciones de macro y micronutrimentos, potencial de hidrgeno,
contenido de materia orgnica y clase textura1 a 11 1 muestras de suelo, determinndose
que los suelos donde se efectuaron los muestreos de suelo y ndulos son suelos con buena
fertilidad. Para textura se determin que para el departamento de Jutiapa los suelos son
predominantemente de textura arcillo y franco arcillo arenosa, y para Chimaltenango las
texturas predominantes fueron franco arenosa y franco arcillo arenosa.
Segn anlisis estadstico, solamente se encontr correlacin entre el contenido nutricional,
el pH y el contenido de materia orgnica, dentro de las muestras de suelo donde crecieron
los ndulos de donde se aisl cepas de Rhizobium leguminosarum biovarphaseoli.

* Investigadores de ICTA
Con esta investigacin se desea despertar una mayor conciencia del papel que juega la
fijacin simbitica del nitrgeno atmosfrico en la produccin de leguminosas, y por otra
parte, que sirva como fuente de referencia para la aplicacin de la tcnica cuyo objetivo
final es llegar al agricultor. Dado el carcter interdisciplinario del tema, profesionales de
diferentes especialidades estuvieron directamente involucrados en el mismo.

Palabras Claves: Rhizobium, frijol, fijacin biolgica, cepas, ndulos.

 1. INTRODUCCION

El frijol, (Phuseolus vulguris L.) denominado como Mesoamericano, tiene su centro de

origen en Guatemala y el Sur de Mxico y al igual que el Maz, han pasado por una serie
de procesos en su evolucin y domesticacin, tanto como el proceso morfolgico de la
planta, como su cultivo, a tal forma que actualmente en la mayora de los casos, stos se
han convertido en especies con bondades agronmica sobresalientes, principalmente para
el componente rendimiento, y estas slo se logran con grandes cantidades de fertilizante
qumico, lo cual viene a afectar dos aspectos, como lo son: el econmico, aumentando en
forma considerable los costos de produccin, principalmente en los ltimos aos que el
precio se ha incrementado considerablemente, afectando al pequeo y mediano agricultor.

El otro aspecto, quizs, sea el ms importante, es el dao que ocasiona al contaminar el

medio ambiente, principalmente a fuentes de aguas, tanto subterrneas, as como la que
provoca a ros, lagos y ocanos por escorrenta.

Dentro de las necesidades ms urgentes que se han determinado en pases en desarrollo,

est la de encontrar alternativas para una buena produccin de frijol, sin usar como fuente
de Nitrgeno, fertilizante qumicos. Una buena alternativa est en lograr una buena
simbiosis entre cepas de bacterias del gnero Rhizobium y genotipos de frijol (Phuseolus
vulguris L.)

2. ANTECEDENTES

En estudios anteriores efectuados por el ICTA y Facultad de Agronoma de la Universidad

de San Carlos de Guatemala, con apoyo de PNUD y del CIAT en Cali Colombia; se
evaluaron cepas de rhizobium provenientes de CIAT y del CIA de la Universidad Nacional
de Costa Rica, seleccionndose algunas cepas para las localidades donde se evaluaron, pero
el comportamiento de stas es bastante irregular, debido a mltiples factores,
a caractersticas de suelo, como: textura, composicin qumica y pH. As
como temperatura y precipitacin de 10s lugares donde se evaluaron.
Pero el principal aspecto, es lograr una buena simbiosis entre leguminosa-rhizobium
principalmente si este fuera con cepas nativas, puesto que estn viviendo en su mejor
medio y cualquier cepa que se introduzca no puede competir con ellas, principalmente por
su adaptacin al medio y por el nmero de bacterias que existen en el suelo. Sin embargo
algunas de las cepas nativas no son tan efectivas, mientras que otras son bastante
competitivas y efectivas. As como el papel que juega una planta receptiva que favorezca
la formacin de ndulos en mayor cantidad para facilitar la fijacin de nitrgeno del aire.

La fijacin de Nitrgeno ocurre por la asociacin simbitica que establece la planta con
algunas bacterias de la familia de las Rhizobiaceae; estas bacterias infectan las races de la
planta e inducen la formacin de ndulos radicales, en el interior de las cuales se realiza la
fijacin, con la intervencin de la enzima nitrogenasa, localizada en el interior de los
rizobios. Las bacterias le ceden el nitrgeno fijado a la planta y a su vez, sta le suministra
al ndulo los carbohidratos que provee la energa necesaria para el proceso de fijacin.

Por ser un proceso en el cual intervienen dos organismos diferentes - una planta
(leguminosa) y una bacteria (rizobio)- el estudio y manejo de esta asociacin simbitica
requiere del trabajo de agrnomos y microbilogos.

El nitrgeno est presente en los tejidos verdes de las plantas en concentraciones

relativamente altas (entre 1 y 4%), y en algunas semillas en concentraciones mayores, por
lo que se le considera un macronutriente primario, junto con el fsforo y el potasio.
Aunque, en general, los suelos minerales tienen contenidos totales de nitrgeno muy
superiores a los requeridos por los cultivos, casi todo este elemento se encuentra en forma
de materia orgnica y anualmente slo se mineraliza una pequea fraccin (1 a3% del
nitrgeno total (3). Debido a esta liberacin lenta del nitrgeno orgnico, el nitrgeno
frecuentemente se convierte en un elemento limitante para la produccin de cultivos.

La conversin N2 a la forma reducida tiene una elevada demanda de energa, debido a la

estabilidad del enlace triple de la molcula de N2. Esta energa se requiere como energa de
activacin, ya que la reaccin completa libera energa. La reduccin del N2 ocurre de dos
maneras: a nivel industrial, mediante el proceso de fabricacin de fertilizantes, o a nivel
biolgico. Por la fijacin de nitrgeno atmosfrico.

El proceso industrial utilizado para la fabricacin de fertilizantes nitrogenados, denominado

proceso de HABER-bosch, tiene una demanda de energa debido a los requerimientos de
hidrgeno, alta temperatura y presin. Por ejemplo, el requerimiento para producir una
tonelada de amonio es de aproximadamente 1000m2de gas natural o aproximadamente una
tonelada de petrleo (87 barriles) (1 8).

La fijacin bilogica de nitrgeno es un proceso que tambin implica una alta demanda de
energa, pero en este caso se obtiene de la radiacin solar en condiciones ambientales de
temperatura y presin. Esto es posible debido a la presencia de la enzima nitrogenasa,
catalizadora d e 1 a reaccin. d e aqu S e origina 1a i mportancia que t iene el proceso d e 1a
fijacin biolgica de nitrgeno para la agricultura y la necesidad de desarrollar una
tecnologa adecuada para maximizar el aprovechamiento de este recurso.

Aspectos importantes que hay que tomar en cuenta en este estudio, es la presencia de
algunos compuestos orgnicos e inorgnicos de nitrgeno inhiben la fijacin de N2. Esta
inhibicin puede ser en tres niveles: en el primero, se inhibe la actividad de la enzima
nitrogenasa; en el segundo se inhibe la sntesis de nueva enzima por el producto final de la
reaccin, el NH3, y por otros compuestos nitrogenados; y, en el caso de la simbiosis con las
leguminosas, ocurre un tercer nivel de inhibicin, ya que la presencia de N mineral inhibe
la formacin de ndulos radicales.

La familia Leguminosae es muy amplia, con alrededor de 750 gneros y una 20,000
especies, incluyendo plantas cultivadas, numerosos rboles, plantas herbceas y arbustos,
las cuales desempean una funcin importante en diversos ecosistemas. Las leguminosas
tienen una importancia particular en la alimentacin humana (granos) y animal (forrajes), al
igual que 1a e conomia d el nitrgeno d el S uelo, ya q ue 1a m ineralizacin d e S us r esiduos
constituye un aporte de nitrgeno disponible.
Las leguminosas se caracterizan por tener hojas compuestas, fmtos en forma de vaina y, la
mayora de ellas, ndulos radicales fijadores de nitrgeno.

Segn la clasificacin de (24), la familia Leguminosae consta de tres subfamilias:

Papilionoideae, con aproximadamente 400 gneros y 14,000 especies, entre las cuales se
encuentran casi todas las leguminosa de importancia agrcola. Son plantas herbceas,
raramente arbustos o rboles, la mayora de ellas forman ndulos fijadores de nitrgeno.
Entre sus gneros estn: Lupinus, Lotus, Arachis, Pisum, Phaseolus, Vigna, Glycine,
Centrosema, Pueraria, Stylosanthes.

Los rizobios son bacterias del suelo, caracterizadas por su habilidad para infectar las
leguminosas e inducir la formacin de ndulos fijadores de N2 en las races.

Hasta hace poco se consider que la familia Rhizobiaceae inclua dos gneros: Rhizobium
agrobacterium, sin embargo en el manual de Bergey (Jordan, 1984), el gnero Rhizobium
se subdividi en dos grupos, teniendo en cuenta la tasa de crecimiento la produccin de
acidez o alcalinidad en medios de cultivo levadura manitol (LM), la disposicin de los
flagelos, la composicin de la base del ADN y los gneros de plantas hospedantes con las
cuales establecen simbiosis: En el gnero Brasyrhizobium, se ubicaron las bacterias de
crecimiento lento, que producen alcalinidad en medio LM. Las bacterias de crecimiento,
rpido, que producen acidez en medio de cultivo LM, se clasificaron en el gnero
Rhizobium; en adelante se denominar con el nombre comn de "rizobios" a las bacterias
pertenecientes a los dos gneros.

La necesidad de combatir el hambre en el mundo, requiere bsicamente la estrategia de una

produccin de menor costo preservando al mismo tiempo los recursos naturales. Uno de los
medios ms importantes para poner en marcha esta estrategia es la nutricin integrada de
las plantas, y se espera que en los aos venideros los procesos biolgicos contribuyan
sustancialmente al logro de tal objetivo.
El Rhizobium es un gnero de bacterias que tienen la capacidad de formar ndulos en las
races de las leguminosas, sin embargo, no cualquier Rhizobium forma ndulos en
cualquier leguminosa, por esta razn el Rhizobiurn se clasifica en especies o grupos de
inoculacin segn las leguminosas que infecte. Los Rhizobium son bacterias del suelo y
sus diferentes especies existen en diferentes proporciones segn el tipo de suelo y las
leguminosas que se cultivan en l.

Para el aislamiento y caracterizacin de Rhizobium del suelo es necesario utilizar la

leguminosa hospedera. Si el suelo contiene el Rhizobium especfico para una leguminosa,
al sembrar la leguminosa formar ndulos. Entonces es posible extraer el Rhizobium
especfico de esos ndulos.

Influencia del ambiente sobre la fijacin biolgica de nitrgeno

Existe una gran diversidad de factores ambientales que influyen directamente en la eficacia
de la simbiosis Rhizobium-leguminosa, en la fijacin de nitrgeno, entre ellos se pueden
mencionar los siguientes:

Nitrgeno inorgnico: La presencia de nitrgeno inorgnico en el suelo, procedente de

fertilizantes inhibe la fijacin de nitrgeno. El tamao de los ndulos y su cantidad es
menor cuanto existen niveles relativamente altos de nitrato y amonio. Por otro lado bajas
concentraciones de nitrgeno inorgnico estimula la nodulacin (19).

pH del Suelo: En la mayona de leguminosas la infeccin de Rhizobium no ocurre en pH

menores a 5. El crecimiento de Rhizobium tambin se ve influenciado por pH bajos. Esta
inhibicin de la simbiosis en suelos cidos, se debe a la concentracin de iones hidronio, a
la toxicidad resultante del hierro y aluminio principalmente (3 1,19).

Temperatura: la temperatura ptima de crecimiento de Rhizobium es de 30 grados Celsius

(25).
Fsforo y potasio: son macronutrimentos esenciales para el crecimiento de la planta, por lo
que su presencia en el suelo se asocia con leguminosas vigorosas y de buen crecimiento

macronutrimentos: El cobalto estimula marcadamente la utilizacin de nitrgeno

atmosfrico por las leguminosas, se cree que esto se debe a que estimula la proliferacin y
metabolismo de Rhizobium dentro de la raz. Los micronutrientes son necesarios tanto para
la leguminosa como para Rhizobium, y por ende para una simbiosis efectiva (19,25).

Estudios realizados en Guatemala

En Guatemala, el primer estudio sobre Rhizobium fue realizado en 1974 por Aguilera, el
cual consisti en la evaluacin de 14 cepas de Rhizobium phaseoli en tres variedades de
frijol comn. De estas cepas evaluadas 8 fueron tradas del Centro Internacional de
Agricultura Tropical (CIAT) y 6 fueron cepas nativas de la coleccin del ICTA; algunas de
estas cepas nativas resultaron ser efectivas para las variedades de frijol estudiadas, en
cambio algunas cepas del extranjero no fueron efectivas, se piensa que se debe a las
condiciones ambientales diferentes (1).

En 1980, Pellecer evalo la eficiencia relativa que se produce en el rendimiento de grano, al

inocular dos variedades de frijol comn con cepas mixtas nativas comparadas con una cepa
estndar c omo c ontrol. Este e S u no d e 1os p rimeros e studios d e evaluacin d e n itrgeno
reportados en Guatemala. Se obtuvieron muestras de plantas de Jutiapa y Parramos, se
esterilizaron ndulos, a partir de ellos se prepararon suspensiones para inocular en los
terrenos de frijol. Las cepas mixtas nativas mostraron ser eficientes, resaltando aquella
proveniente del suelo de condiciones ms pobres (Parramos), sin embargo no superaron a la
cepa estndar CLAT 57. Es importante resaltar que en este estudio no se purificaron ni
identificaron las cepas nativas, ya que la evaluacin se realiz directamente de
suspensiones de los ndulos recolectados (27).

CENTRO cc
En 1982, Mndez evalu 9 cepas proporcionadas por el CIAT, de las cuales dos
(CIAT 390, 407) resultaron ser las ms eficientes para las variedades de fnjol utilizadas
(15)-

En 1 986, C ampos r ealiz u n n uevo e studio d e aislamiento d e R hizobium d e S uelos d e

Guatemala, Chimaltenango, Santa Rosa y Sacatepquez. Se muestrearon un total de 28
suelos, logrndose aislar 26 cepas. Primero se realiz muestre0 de suelos, posteriormente se
sembr semillas de frijol en bolsas que contenan las muestras de suelo recolectadas, luego
se evalu la eficiencia de fijacin biolgica de nitrgeno; y por ltimo se procedi a aislar
las cepas de los mejores ndulos obtenidos (6). Posterionnente en un estudio realizado por
Miyares, se analizaron trece de las cepas nativas aisladas, su evaluacin se realiz a nivel
de invernadero en jarras de Leonard, seleccionndose 4 cepas efectivas para las variedades
de frijol negro Quetzal y Jutiapan (22).

En 1988, Contreras evalu en campo cuatro cepas de Rhizobium del CIAT, este estudio fue
realizado en conjunto con la facultad de agronoma, el Instituto de Ciencia y Tecnologa
Agrcola (ICTA) y el CIAT. Dos cepas son procedentes de Colombia y dos son nativas de
Guatemala aisladas por Aguilera en 1980. De las cuatro estudiadas la CIAT 632 present
buenos resultados, y mostr ser capaz de competir con los fertilizantes nitrogenados en la
variedad de fnjol Quinak-ch (12).

Por ltimo en 1990, Carrillo evalu cuatro cepas procedentes del CIAT y las compar con
una cepa nativa; dicha cepa nativa present un rendimiento muy alto (7).

Adems se han realizado otros estudios sobre Rhizobium, relacionados con su produccin a
gran escala para uso comercial; el estudio en 1990, realizado por Castellanos se bas en
comparar e 1 cultivo continuo a gran e scala d e una c epa d e R hizobium p haseoli ( ICAITI
0063), que fue seleccionada en base a su respuesta a la fijacin biolgica de nitrgeno.
Obtenindose mayor beneficio con el cultivo continuo (8).
 3. OBJETIVOS

3.1 General
Aislar e identificar cepas nativas de Rhizobium en dos zonas productoras de frijol

3.2 Especficos
3.2.1 Aislamiento del Rhizobium legurninosarum procedente de ndulos de plantas de
frijol para la identificacin de cepas nativas de cada sitio muestreado.
3.2.2 Identificar las localidades con mayor variabilidad de cepas nativas del gnero
Rhizobium leguminosarum.
3.2.3 Determinar las caractensticas fsicas y qumicas de los suelos donde se realiz el
muestreo.

Hi = Se lograr aislar cepas del gnero Rhizobium

Hz = Las cepas aisladas de Rhizobium no pertenecen a Rhizobium leguminosarum biovar
phaseoli.

5. METODOLOGIA

Para la realizacin del proyecto de investigacin fue necesario colectar ndulos de plantas
de frijol, as como la toma de muestras de suelo de los sitios donde se colectaron los
mismos.

Los departamentos de Jutiapa y Chimaltenango son dos grandes reas productoras de frijol
por lo que se trabaj un total de 25 municipios: 13 municipios en Jutiapa y 12 municipios
en Chimaltenango. Dentro de los 25 municipios se ubicaron los puntos de muestreo, para
obtener al final 111 muestras colectadas tanto de ndulos procedentes de plantas de frijol
como de muestras de suelo.
Los Municipios muestreados fueron los siguientes:

JUTIAPA
Jutiapa, Quezada, El Progreso, Santa Catarina Mita, Asuncin Mita, Atescatempa,
Yupiltepeque, Moyuta, Agua Blanca, Comapa, Conguaco, Zapotitln y Jerez.

CHIMALTENANGO
Parrarnos, San Andrs Itzapa, San Martn Jilotepeque, Zaragosa, San Juan Comalapa,
Patzicia, Santa Cruz Balany, Patzn, Tecpn, Santa Apolonia, El Tejar y Chimaltenango.
Tanto el trabajo de laboratorio como de gabinete se desarroll en el Laboratorio de Suelo,
Agua y Planta del ICTA (Brcena, Villa Nueva), La Estacin Experimental del ICTA en
Chimaltenango, y el Laboratorio de Microbiologa de La Facultad de Ciencias Qumicas y
Farmacia de la USAC.

5.1 Reconocimiento preliminar de las reas

En un reconocimiento preliminar se seleccionaron los municipios donde se sembr el
cultivo de frijol del cual se extrajeron los ndulos, as como la seleccin del sitio para la
toma de muestras de suelo.

5.2 Contacto con Agricultores y visitas de campo

Para la realizacin del proyecto se hizo necesario contar con la colaboracin de los
agricultores productores de frijol, por lo que fueron visitados 243 agricultores, de los cuales
se logr una participacin de 125 agricultores, sin embargo por razones inherentes al tipo
de trabajo, como cambio de cultivo a sembrar, nicamente fue posible contar con 111 de
ellos para la colecta de muestras de ndulos que servirn para la fase de aislamiento e
identificacin de cepas de Rhizobiwn y la toma de muestras de suelo que sirvieron para la
identificacin de las caractersticas fisico-qumicas de los suelos donde creci el cultivo.
Adems se realizaron constantes visitas de campo con el propsito de identificar el estado
de crecimiento vegetativo del cultivo de frijol en las parcelas seleccionadas y poder as
llevar un control sobre el momento adecuado de muestre0 (etapa de inicio de floracin).
5.3 Recoleccin de Ndulos
Para la recoleccin de los ndulos que servieron para el aislamiento de Rizobios se
seleccionaron de 10 a 15 plantas vigorosas con hojas verdes y sanas, de las cuales se
tomaron alrededor de 50 ndulos vivos e intactos, preservndolos en frascos de vidrio con
material desecante (gel de slica) hasta su siembra en el Laboratorio de Microbiologa para
el aislamiento e identificacin.

5.4 Preparacin de muestras de ndulos in situ

Por ser necesaria la preservacin de los ndulos para su traslado al laboratorio, se procedi
despus de cada muestre0 a la separacin de las races de la parte vegetativa de las plantas
de fiijol, a la limpieza del nmero de ndulos presentes en cada una de las races de las
plantas muestreadas, identificacin, conservacin en slica gel y por ltimo a su
almacenamiento en hieleras para su traslado final al laboratorio. (ver foto 1)

5.5 Aislamiento de los Rizobios de los ndulos

Esta etapa se realiz en el Laboratorio de Microbiologa y la tcnica utilizada fue la descrita
por Vincent, Somasegaran (30,28) y El Centro Internacional de Agricultura Tropical (10 );
en la cual se procedi a rehidratar los ndulos por 24 horas, luego se desinfectaron con
Hipoclorito de calcio al 3 % y se sembraron en Agar manitol-levadura ms azul de
bromotimol. Las cajas se incubaron a 26 grados centgrados por 5 das. A las colonias
sospechosas s e 1es realiz 1a T incin d e Gram y 1 a p meba d e m ovilidad. Las c epas que
presentaron morfologa colonial caracterstica de Rhizobium, coloracin amarilla
(produccin de cido) y adems eran bacilos Gram negativo mviles, se consideraron como
bacterias sospechosas de Rhizobium leguminosarum biovar phaseoli. Estas cepas se
conservaron en tubos con agar manitol-levadura y aceite mineral. (ver foto 2)

5.6 Identificacin de Rhizobium leguminosarum biovarphaseoli

En e 1 Laboratorio d e S uelos S e realiz 1a fase de autenticacin d e l os cultivos a islados
mediante la infeccin de semillas de frijol (Phaseolus vulgaris) por las cepas aisladas. Para
ello se utiliz la tcnica de Nmero ms probable (NMP), realizndose seis diluciones y
cuatro repeticiones por dilucin. Adems se utiliz como control negativo una planta de
cuatro repeticiones por dilucin. Adems se utiliz como control negativo una planta de
Phaseolus vulgaris sin infectar. Se consider Rhizobium leguminosarum biovar phaseoli,
aquellas que fueron capaces de inducir a la nodulacin en las plantas de frijol comn.
(ver fotos 3, 4,5,6,7 y 8)

5.7 Preservacin de las cepas

Para conservar su estabilidad y viabilidad gentica se preservaran las cepas en tubos con
agar manitol-levadura y aceite mineral, en condiciones adecuadas de temperatura.
(ver foto 9)

5.8 Toma de muestras de suelo

En cada uno de los lugares donde se colectaron los ndulos se realiz un muestre0 de
suelos con el propsito de identificar las condiciones fisicas y qumicas donde se han
desarrollado los mismos.

Las muestras de suelo se trasladaron al Laboratorio de Suelo, Agua y Planta del Instituto de
Ciencia y Tecnologa Agrcolas (ICTA) para la determinacin de potencial de hidrgeno,
contenido de materia orgnica, clase textual, porcentaje de nitrgeno total, y contenidos de
fsforo, potasio, calcio, rnagnesio, cobre, hierro, manganeso y Cinc; de acuerdo a las
siguientes metodologas.

5.9 Anlisis de suelos

Para la determinacin de los parmetros involucrados se siguieron las siguientes
metodologas. (ver foto 10)

b
Determinacin -----
Potencial de Hidrgeno 1:2.5 en agua
-----

Contenido de Materia Orgnica

--

Anlisis Granulomtico ~ouvoucos

--A

Kjeldalh
Mehlich 1 (Colorimetna)
Mehlich 1 (EAA)
Mehlich 1 (EAA)
5.10 Trabajo de Gabinete

Registro de datos, anlisis de informacin, discusin de resultados, elaboracin de

informes parciales y final.

6. RESULTADOS

6.1 Resultados de Microbiologa

- --

MUESTRAS CANTIDAD
--- PORCENTAJE
Cepas sospechosas de Rhizobium aisladas de ndulos 64 58
Cepas no sospechosas de Rhizobium aisladas de ndulos 4 4
Muestras negativas 36 32
Muestras perdidas 7 6
TOTAL 111 1 O0

En la tabla No. 1 se puede observar que se aislaron 64 muestras de bacterias sospechosas de

pertenecer al gnero Rhizobium Zeguminosarum biovar phaseoli y 36 muestras de 111 fueron
negativas ( 32%).

TABLA NO, 2 CEPAS AISLADAS SOSPECHOSAS DE Rhizobium leguminosarum biovar

phaseoli PARTIR DE NDULOS.

MUESTRAS CANTIDAD PORCENTAJE

Cepas sospechosas de Rhizobium aisladas de ndulos ( ler anlisis) 48 75
Cepas sospechosas de Rhizobium aisladas de ndulos 12do anlisis) 16 25
TOTAL DE CEPAS -- 64 1O0

Las muestras negativas durante el primer anlisis de aislamiento, se sometieron a un segundo

anlisis. Inicialmente se recuperaron 48 cepas, y con el segundo anlisis 16 cepas ms. El
ndice de recuperacin se aument en un 25 %, por lo que se puede decir que el nmero de
anlisis realizados a las muestras aumenta la recuperacin de las bacterias (tabla No. 2).
 TABLA NO. 3 IDENTIFICACIN DE CULTIVOS SOSPECHOSOS DE Rhizobium leguminosarum
biovar phaseoli AISLADOS

DESCRIPCI~N CANTIDAD PORCENTAJE

Cepas de Rhizobium leguminosarum biovar phaseoli 21 33
Cepas sospechosas de Rhizobium leguminosarum
biovar ~haseolino infectivas 11 17
1 Cepas sin infectar 13 20
Cepas muertas 19 30
TOTAL DE CEPAS SOSPECHOSAS 64 1O0

De las 64 cepas de bacterias aisladas sospechosas de Rhizobium leguminosarum

biovar phaseoli, el 33% (tabla No. 3) se identific positivamente, pues fueron cepas capaces
de infectar la variedad de fijjol comn estudiada ( ICTA-HUNAPU). Estas 21 cepas que
infectaron el fnjol comn tienen alta probabilidad de ser Rhizobium leguminosarum biovar
phaseoli

El 17% (tabla No.3) no se identificaron como Rhizobium leguminosarum biovarphaseoli pues

no fueron infectivas en plantas de fiijol. Pueden existir cepas que se encuentren naturalmente
en simbiosis con el frijol, pero que su capacidad de infeccin sea limitada. Otro aspecto que
puede afectar es la variedad de fnjol utilizada, ya que puede ser que no sea la ptima para
estas cepas que fueron negativas.

TABLA NO. 4 NUMERO DE MUESTRAS ANALIZADAS DEL DEPARTAMENTO DE JUTIAPA

JUTIAPA
 TABLA NO. 5 NUMERO DE MUESTRAS ANALIZADAS DEL DEPARTAMENTO
DE CHIMALTENANGO

1 1 San Martn Jilotepeque 1 6 O O

1 ~atzn 2 2 1O 0
Tecpn 2 1 50
Patzicia 2 O O
Santa Polonia 2 pp
1 50
o o
Chimaltenango 1 O O
CHIMALTENANGO ( El Tejar 1 O O
Parramos 1 O O
San Andrs ltzapa 1 O O
Santa Cruz Balany 1 O O
Comalapa 3 O O
TOTAL 23 21 l

Del departamento d e Ju tiapa S e obtuvieron 1 7 c epas ( t abla N o. 8 ), 1os municipios d e m ayor

cantidad de cepas fueron Jutiapa y Santa Catarina Mita; del municipio de Jutiapa se analizaron
25 muestras y de estas 6 fueron capaces de infectar, por lo que se obtuvo el 24 % de positividad.
Por otro lado de Santa Catarina Mita se analizaron 15 muestras y de estas 6 fueron capaces de
infectar, por lo que en este municipio el porcentaje de positividad ( 40%) es mayor que Jutiapa.
Entonces se puede decir que el municipio donde existi mayor porcentaje de cepas de Rhizobium
es Santa Catarina Mita. Adems el tamao nodular de estas 6 muestras oscilaba entre 3-4 mm.
Lo que indica que son ndulos muy activos, y estas cepas podran resultar ser muy efectivas en la
fijacin biolgica de nitrgeno.

El resto de municipios (Comapa, Quezada, Agua Blanca y el Progreso) analizados presentaron de

1-2 cepas, debido a la cantidad de sitios muestreados.

En Chimaltenango, se recolect menos muestras por municipio, pues nicamente 23

corresponden a este departamento; de las cuales 5 cepas se probaron para infeccin, y cuatro de
estas fueron positivas, las cuales corresponden a Patzn, Tecpn y Santa Polonia.

lascepas ms infectivas fueron la 43, 41, 46, 23 y 31. Se dice que fueron las ms infectivas
debido a que nodularon en casi todas las diluciones y repeticiones realizadas. Estas cepas de
infectividad alta podran ser muy efectivas para la fijacin de nitrgeno. Aunque no siempre
existe relacin entre infectividad y efectividad. La cepa No. 41 fue aislada de la Aldea el
Quebracho 1, Santa Catanna Mita; la cepa 41 de La Barranca, Santa Catarina Mita; la cepa 46 de
El Ovejero 1, El Progreso; la cepa 23 de El Retiro 11, Quezada y la cepa 31 de La Lagunita 11,
Jutiapa.

Por otro lado el 34% de resultados negativos, se puede deber a los siguientes aspectos:
El hipoclorito de calcio es un desinfectante fuerte, que se utiliz para esterilizar la parte
externa de los ndulos, Si estos se encuentran daados, el hipoclonto de calcio
penetra matando las bacterias que se encuentran en su interior.
El tamao de los ndulos: 33 de las muestras negativas fueron ndulos con un dimetro
de 1-3 mm. Y segn Quispel y Martin los ndulos activos son de mayor tamao
Adems segn Quispel, las plantas pueden formar pseudondulos; estos ndulos falsos
se forman debido a la proliferacin de clulas corticales y epiderrnales; que ocurre con
Rhizobium incapaces de nodular al husped especificado y podra darse con ausencia
de bacteria.

6.2 Resultados del muestre0 de suelos

El objetivo de esta actividad es el de evaluar el efecto de las caractensticas fsicas y

qumicas del suelo sobre la formacin de simbiosis del cultivo de frijol (Phaseolus vulgaris
L.) con las bacterias del gnero Rhizobiurn 1 egurninosarurn, b iovar p haseoli. Trabajo
realizado conjuntamente con el estudio de aislamiento e identificacin de cepas de
Rhizobium.

Se analiz un total de ciento once muestras (11 1) procedentes de los departamentos de

Jutiapa y Chimaltenango. Dentro de las caractersticas qumicas del suelo, se procedi a
evaluar las condiciones nutricionales de los mismos, realizndose la determinacin del
contenido de macronutrimentos (potasio, calcio, magnesio, fsforo y nitrgeno), y
micronutrimentos (cobre, hierro, manganeso y cinc).
As mismo, fueron evaluados el potencial de hidrgeno (pH), contenido de materia
orgnica, contenido de arena, arcilla y limo y se les determin la clase textura1
correspondiente, obtenindose una amplia gama de valores por lo que fue necesario tomar
como referencia los diferentes rangos encontrados, segn la localidad muestreadas. (ver
tablas)

Dentro de los resultados obtenidos no se encontr ninguna tendencia que permitiera

apreciar alguna correlacin dentro de los parmetros evaluados y la presencia o ausencia de
bacterias del gnero Rhizobium leguminosarum, biovarphaseoli

TABLA NO. 6 RANGOS DE LOS MACRONUTRIMENTOS ENCONTRADOS EN

LAS MUESTRAS DE SUELOS DEL DEPARTAMENTO DE JUTIAPA

Como se aprecia en las tablas No.6 y No. 7 al analizar el contenido de calcio, magnesio,
potasio, fsforo y nitrgeno de cada uno de los suelos donde fueron colectadas las muestras
de ndulos, se encontr que se tenan rangos muy variables ya que los valores para calcio
estuvieron dentro de 0.2 a 23.5 cmolkg, para potasio de 0.01 2 cmolkg, magnesio 0.01 a
9.8 cmol/kg, fsforo de 1 a 243 mg/kg. y el rango del porcentaje para nitrgeno que segn
la literatura es uno de los factores determinantes estuvo del 0.05 a 0.4 %. En base a los
resultados anteriores, se dice que la fertilidad de la mayora de los suelos muestreados es
alta.
Es importante mencionar que tanto para el departamento de Jutiapa como para
Chimaltenango se mantuvo esta caracterstica de fertilidad

TABLA NO. 7 RANGOS DE LOS MACRONUTRIMENTOS ENCONTRADOS EN

LAS MUESTRAS DE SUELOS DEL DEPARTAMENTO DE CHIMALTENANGO

Municipio cmollkg Cmollkg cmollkg mglkg % nitrgeno

Calcio (Ca) potasio (K) magnesio fsforo (P) (N)
(Mg)
Santa Cruz Balany 2.44 - 6.21 0.24 - 0.3 0.03 - 0.07 22 - 37 0.08 - 0.13
Patzicia 3.19 - 4.69 0.04 - 0.64 0.05 - 0.07 11 - 12 0.14
Patzun 4.59 - 5.94 0.26 - 0.48 0.04 - 0.1 15-30 0.12 - 0.16
Tecpn 4.51 - 8.01 0.63 - 0.73 0.04 - 2.04 O1 - 08 0.15 - 0.18
Santa Apolonia 3.99 - 20.39 0.38 - 0.42 0.01 - 0.05 54 -101 0.16 - 0.24
'san Martn Jilotepeque 2.48 - 6.16 0.28 - 0.55 0.03 - 0.04 O1 - 10 0.08 - 0.2
Zaragosa 3.23 0.61 0.04 42 0.15
Comalapa 2.21 - 5.05 0.24 - 0.52 0.02 - 0.1 1 04-11 0.16 - 0.19
El Tejar 10.09 - 19.86 0.39 - 0.6 0.59 - 1.23 21 - 146 0.06 - 0.18
Parramos 7.14 0.01 0.24 14 0.07
San Andrs ltzapa 13.38 0.02 0.87 1O 0.04
Chimaltenango 8.85 0.29 0.54 21 O. 1

TABLA NO. 8 RANGOS DE LOS MICRONUTRIMENTOS ENCONTRADOS EN

LAS MUESTRAS DE SUELOS DEL DEPARTAMENTO DE JUTIAPA
En la tabla No. 8 se observa que los anlisis del contenido nutricional del suelo tienen los
siguientes rangos para el contenido de micronutrimentos en el departamento de Jutiapa
como sigue, cobre 0.1 a 12 mgkg, hierro 0.2 a 29.5 mgkg, manganeso de 0.02 a 80 mgkg
y cinc de 0.012 a 18 mglkg.

TABLA NO. 9 RANGOS DE LOS MICRONUTRIMENTOS ENCONTRADOS EN

LAS MUESTRAS DE SUELOS DEL DEPARTAMENTO DE CHIMALTENANGO

Municipio mglkg cobre mglkg hierro mglkg. mglkg cinc (Zn)

(Cu) (Fe) manganeso
(Mn)
Santa Cruz Balany 0.32 - 0.37 15.2 - 22.5 3.5 - 6.39 0.05 - 0.55
Patzicia 0.33 - 0.34 16.28 - 27.05 2.91 - 14.46 0.05 - 0.08
Patzn 0.38 - 0.4 10.82 - 29.58 -
9.75 31 .O4 0.1 1 - 2.95
Tecpn 3.82 - 4.16 9.97 - 15.08 15.05 - 24.57 0.08
Santa Apolonia 0.42 - 0.44 0.26 - 12.71 25.48 - 32.39 1.43 - 14.75
San Martn Jilotepeque 0.19 - 0.33 15.61 - 28.59 8.85 - 41.71 0.06 - 3.6
Zaragosa 0.32 22.1 7 10.93 2.23
Comalapa 0.36 - 0.4 20.24 - 22.84 9.64 - 22.48 0.06 - O1
,El Tejar 0.1 1 - 0.37 6.82 - 13.16 6.99 - 21.1 7 1.41 - 3.89
Parramos 0.4 5.79 0.01 0.23
San Andrs ltzapa 0.32 7.57 4.95 0.3
Chimaltenango 0.16 7.94 2.67 0.31

El anlisis del contenido nutricional del suelo para el departamento de Chimaltenango

report los siguientes rangos para el contenido de micronutrimentos como sigue, cobre 0.1
a 4 mgkg, hierro 0.2 a 29.6 mgkg, manganeso de 0.01 a 32 mgkg y cinc de 0.05 a 14.71
mgkg.

En base a los resultados anteriores, se dice que 1a fertilidad de la mayora de los suelos
muestreados es alta.
 TABLA NO. 10 RANGOS DE LOS VALORES PARA POTENCIAL DE
HIDR~GENO,CONTENIDO DE MATEFUA ORGNICA Y CLASE TEXTURAL
PREDOMINANTE EN LAS REAS MUESTREADAS EN EL DEPARTAMENTO
DE JUTIAPA

Municipio Potencial de % Materia Clase Textura1 predominante

hidrgeno (pH) Orgnica (M.O.)
Sta. Catarina Mita 4.67 - 6.72 1.21 - 7.93 Arcilloso
Jutiapa 4.8 - 8.09 1.48 - 7.93 Franco arcillo arenoso y arcillosos
Cornapa 4.75 - 7.34 1.88 - 6.72 Arcilloso
Moyuta 4.7 - 6.44 2.02 - 6.59 Arcilloso
Quezada 4.91 - 7.51 1.75 - 6.32 Franco arcilloso y franco arcillo arenoso
Conguaco 5.03 4.17 Arcilloso
Asuncin Mita 4.15 - 6.01 2.55 - 7.53 Franco arenoso y franco arcilloso
Zapotitln 4.99 - 5.69 2.02 - 4.71 Franco arcillo arenoso y arcillosos
Jerez
El Progreso 5.59 - 6.43 2.15 - 9.01 Franco arcillo arenosos
Agua Blanca 3.53 - 6.21 1-75 - 7.66 Franco arcilloso
Atescatempa 4.38 - 5.77 1-48 - 2.1 5 Franco arenoso
Yupiltepeque 5.85 - 5.98 1.48 - 6.72 Franco arenoso

TABLA NO 11. RANGOS DE LOS VALORES PARA POTENCIAL DE

H I D R ~ G E N OCONTENIDO
, DE MATERIA ORGNICA Y CLASE TEXTURAL
PREDOMINANTE EN LAS REAS MUESTREADAS EN EL DEPARTAMENTO
DE CHIMALTENANGO.

Municipio Potencial de % Materia Clase Textura1 predominante

hidrgeno (pH) Orgnica (M.O.)
Santa Cruz Balany 5.49 - 5.55 2.29 - 3.63 Franco arenoso
Patzicia 5.45 - 5.64 3.77 - 4.17 Franco arcillo arenoso
Patzn 5.68 - 5.82
Tecpn 5.5 - 6.32 4.03 - 4.17 Franco arcillo arenoso
Santa Apolonia 5.05 - 6.6 4.3 - 6.32 Franco arcillo arenoso
Zaragosa 5.05 4.17 Franco arenoso
Comalapa 4.94 - 5.39 3.23 - 4.98 Franco arcillo arenoso
San Martn Jilotepeque 4.76 - 6.32 2.69 - 3.63 Arcilloso
El Tejar 4.69 - 4.85 3.77 - 6.59 Franco arenoso y franco arcillo arenoso
Parramos 4.89 3.77 franco arenoso
San Andrs ltzapa 4.58 3.23 Franco arcillo arenoso
Chirnaltenango 4.8 4.84 franco arenoso
En las tablas No. 10 y No. 11 se muestran los rangos de los valores encontrados para el
potencial de hidrgeno, el contenido de materia orgnica y la clase textural predominante
tanto para el departamento de Jutiapa como para Chimaltenango respectivamente.

Estos resultados evidencian que para Jutiapa se reportaron valores de pH de 4.15 a 8.09, y
Chimaltenango de 4.6 a 6.6. Para el contenido de materia orgnica se tienen rangos de 1.2
% a 9% en Jutiapa y 2.2% a 6.6 % en Chimaltenango.

Para los municipios del departamento de Jutiapa , la clase textural predominante fue la
arcillosa, sin embargo se encontraron suelos franco arenosos, franco arcillosos, franco
arcillo arenosos segn el municipio muestreado.

Para los municipios del departamento de Chimaltenango se obtuvo que la clase textural
predominante fue la Franco arcillo arenosa, encontrndose tambin suelos con clase
textural de franco arenoso, franco arcillosos.

En la siguiente tabla (tabla No. 12) que corresponde a las caractersticas fisicas y qumicas
de los suelos donde se logr el aislamiento e identificacin de Rhizobium leguminosarum
biovarphaseoli, tenemos que para el departamento de Jutiapa, en el municipio de Asuncin
Mita el porcentaje de nitrgeno en el suelo estuvo dentro del rango de 0.1 % a 0.3 % ,
valor que corresponde a un moderado contenido de nitrgeno en suelo., el rango de pH se
mantuvo entre 5.1 a 6.7 y la clase textural predominante fue arcillosa, aunque tambin se
present la clase textural franco arcillosa. El contenido de materia orgnica en estos suelos
estuvo dentro del rango de 3% al 8 %, por lo que se le clasific de moderado a alto
 TABLA NO. 12 CARACTERIZACION FSICA Y QUMICA DE LAS NUESTRAS DE SUELO DONDE SE COLECTARON LAS
MUESTRAS DE NODULOS DE LOS CUALES SE AISL Rhizobium leguminosarum, biovarphaseoli .

CARACTERISTICAS FlSlCO QUlMlCAS DE LOS SUELOS DE DONDE SE AISLO RHlZOBlUM

DEPARTAMENTO DE .JTJAPA
Municipio Procedencia Ca K Mg Cu Fe Mn Zn P %N pH % Textura
M.O.
'sta.~ a t a r i n Mita
a La Cuesta del Guayabo 1 8.22 0.42 3.03 0.17 18.95
70.14 1.31 15 0.1 8 5.01 2.8 Franco arcilloso
ktSlcatarina
----- Mita El Limn 1 11.62 0.86 0.52 0.41 5.16 7.64 0.22 1 0.18 5.72 3.77 Arcilloso
. S ~ Catarina
~. Mita La Unin 8.07 0.15 0.05 0.39 8.9370.85 0.09 7 0.10 5.08 3.77 Arcilloso
".-.
ctl Catarina Mita La Barranca 11.09 0.71 0.03 0.43 4.414.02 0.18 6 0.1 1 6.72 2.69 Arcilloso
.,----
\ct, ratarina
---- Mita I E ~ Ouebracho
. 1 1 15.18 1 0.61 1 0.06 11.42 0.08 3 0.29 6.36 7.93 Arcilloso
sta. Catarina Mita El Quebracho 11 16.14 0.38 0.13 11.51 0.06 1 0.25 6.09 7.53 Franco arcillosos
I
Pozas de Agua - 11 1
7.83 I
0.28 I
0.07 19.02 0.21 40 0.21 5.59 6.59 Franco arcillo arenoso
OI DrnaTRSO
u1 I .u----
(pozas de Aeua a
11 1 15.21
- 1
1
0.48 1 0.01 24.52 0.92 25 0.34 6.43 9.01 Franco arcillo arenoso
El Progreso El Ovejero 1 5.04 ( 0.39 0.00 22.31 0.08 19 0.10 5.8 2.15 Franco arcillo arenoso
htiana Amavo Ingenio 1 7.72 1 0.31 0.02 21.32 1 0.02 1 17 1 0.10 1 6.4 1 2.02 1 Francoarcilloarenoso
Jutiapa IE~ Carrizal 1 546 1 0.69 1 0.06 27.04 1 0.04 1 1 1 0.11 1 5.97 1 2.55 1 Arcilloso
71itinna I ~ La
o Virgen 11 1 5.16 1 0.01 1 0.02 - 6.49 1 0.29 1 29 1 0.12 1 5.12 1 4.03 1
8
Franco arcillo arenoso
4.48 4.40 0.12 1 0.11 5.37 3.09 1 Arcilloso
La Lagunita
- 11 19.57 1.34 0.73 0.45 1.32 16.86 1.47 67 0.15 7.64 3.5 1 Arcilloso
Jutiapa Cantn Animas Lomas 1 20.38 0.53 0.00 0.46 0.56 24.76 0.88 221 0.24 7.3 5.38 Franco
Comapa Guachipiln 1 15.43 0.51 84.46 0.41 2.42 7.27 2.74 79 0.20 7.34 2.8 Arcilloso
quezada El Retiro 11 5.99 0.71 0.32 0.27 8.06 11.97 0.09 1 0.12 6.1 8 2.29 Arcilloso

CHIMALTENANGO
Municipio Procedencia Ca K Mg Cu Fe Mn Zn P %N pH % Textura
M.O.
Patzh Saquiy 5.94 0.48 0.04 0.38 29.58 31.04 0.11 15 0.16 5.68 3.63 Franco arcilloso
Patzun San Jay 4.59 0.26 0.10 0.40 10.82 9.75 2.95 30 0.12 5.82 3.36 Franco arenoso
Tecpn Chirijuy 8.01 0.73 2.04 3.82 9.97 15.05 0.08 1 0.15 6.32 4.03 Franco arcillo arenoso
Santa Apolonia La Mejorana 20.39 0.38 0.01 0.44 0.26 25.48 14.75 101 0.24 6.6 6.32 Franco arcillo arenoso
En la tabla No. 12 tambin se puede observar que para el municipio de Jutiapa se
obtuvieron rangos del porcentaje de nitrgeno clasificados como moderados (0.1% a
0.3%), pH en rangos de 6.4 a 7.3, y contenido de materia orgnica de 2% a 5% , suelos
predominantemente arcillosos, existiendo tambin suelos con textura franco arcillo
arenosos.

En el municipio de El Progreso, se determin que las cepas aisladas fueron de suelos

Franco arcillo arenosos, con alto contenido de materia orgnica, y pH de 5.5 a 6.5
(ligeramente cido). Las condiciones para Comapa y Quezada tambin fueron similares.

En general para el departamento de Jutiapa, se dice que se tienen suelos con caractersticas
apropiadas para el cultivo de fiijol y su estado nutricional es apto para su desarrollo.

Para el departamento de Chimaltenango se encontr que el rango de contenido de nitrgeno

en el suelo vari de 0.12 % a 0.24 % lo que represente un moderado contenido del
elemento en el suelo.

El rango de pH va de 5.6 a 6.6, y el contenido de materia orgnica de 3.3% a 6.3%, valor

considerado en la interpretacin de resultados de moderado alto a alto. La clase textura1
predominante en las muestras que presentaron aislamiento de Rhizobium fue franco arcillo
arenoso (2 muestras), franco arcilloso (1 muestra) y franco arenoso (1 muestra) .

El pH es uno de los factores que tienen un papel determinante en la relacin leguminosa-

rizobio ya que como se cita en la literatura, en la mayora de las leguminosas la infeccin
de Rhizobium no ocurre en pH menores a 5, tal y como se puede apreciar en (tabla 8) ya
que el valor ms bajo de pH reportado fue de 5.O1

Tanto para el departamento de Jutiapa como para el departamento de Chimaltenango, el

contenido de calcio en el suelo estuvo entre el rango de 5 a 20 mgkg., lo que indica que su
contenido es apropiado para el desarrollo del cultivo ya que las leguminosas son plantas
que demandan de mucho calcio para el proceso de nodulacin. Adems estimula el
crecimiento del sistema radicular y la formacin de ndulos en especies leguminosas

TABLA NO. 13 RESULTADOS OBTENIDOS DE LA CORRELACI~NENTRE EL

CONTENIDO NUTRICIONAL, POTENCIAL DE EIDRGENO Y MATERIA DE
LOS SUELOS DONDE SE COLECTARON LAS MUESTRAS DE NDULOS DE
DONDE SE AISLO Rhizobium legu bia(mphusmIi

Para el anlisis de correlacin se utiliz el coeficiente de correlacin de Pearson y se tom

para su interpretacin una sigdicancia del 5%. (tabla No. 13)
En eta tabla (tabla No. 13), se aprecia que existi una alta correlacin entre el contenido de
nitrgeno y el contenido de materia orgnica (0.01%), que prcticamente es una
correlacin perfecta (coeficiente de correlacin =1, significancia =0.00%).

En los resultados que se obtuvieron del contenido de materia orgnica (tabla 12), se
observ que el contenido de materia orgnica estaba de moderado a alto, y por estar
correlacionado directamente con el contenido de nitrgeno en el suelo, era de esperarse un
contenido del elemento de moderado a alto, por lo que el contenido de materia orgnica es
un ndice que permite estimar aproximadamente las reservas de nitrgeno y de fsforo en el
suelo y su comportamiento en la dinmica de nutrimentos.

Tambin existi una alta correlacin entre el elemento calcio y los elemento hierro, fsforo,
nitrgeno, cinc y el contenido de materia orgnica y potencial de hidrgeno. Sin embargo,
la correlacin de calcio con hierro es una correlacin inversa es decir, que al ir aumentando
el hierro la disponibilidad de calcio en el suelo es menor.

As mismo, se obtuvo alta correlacin del pH con el contenido de calcio, potasio, hierro, y
fsforo; siendo la correlacin entre pH y contenido de hierro inversamente proporcional, es
decir que conforme aumenta el pH en el suelo, la actividad del hierro disminuye.
En b ase a 1os resultados o btenidos ( pH 5.5 - 5.9), e 1p H del suelo es a propiado p ara 1a
mayora de los cultivos porque aqu las interferencias para la absorcin de los nutrimentos
esenciales es mnimo, tal y como se muestra en la correlacin del pH con el contenido de
calcio, potasio y fsforo.

Dentro de este anlisis tambin se obtuvo que el hierro y el manganeso estn

correlacionado significativamente (4.3%).
 7. CONCLUSIONES

Se logr colectar un total de 111 muestras de ndulos y de suelos en 25 municipios

de las dos zonas en estudio.
En los municipios de Jutiapa y Chimaltenango, se encontraron 21 cepas de
Rhizobium leguminosarum biovar phaseoli, pues fueron capaces de infectar a
plantas de fiijol comn en condiciones controladas de laboratorio.
La fertilizacin nitrogenada qumica adicionada al cultivo de frijol (Phaseolus
vulgaris) de donde se recolectaron los ndulos, no afect la formacin de los
mismos.
En el departamento Jutiapa en donde existi mayor porcentaje de cepas
identificadas fueron los municipios de Santa Catarina Mita (6 cepas) y el municipio
de Jutiapa (6 cepas).
Entre los posibles factores responsables del 34 % de aislamientos negativos se
pueden mencionar: el tamao nodular, la conservacin de ndulos, el efecto del
hipoclorito de calcio y el nmero de anlisis efectuados por muestra.
Las cinco cepas (43, 41, 46, 23 y 3 1) que presentaron alta infectividad pertenecen a
los municipios de Santa Catarina Mita, Jutiapa, Quezada y el Progreso del
departamento de Jutiapa.
Trece cepas presentaron alta contaminacin por hongos por lo que no existi
respuesta a la infeccin, lo que limit el avance del proyecto.
Se efectuaron 111 determinaciones para cada uno de los macro y micronutrimentos,
contenido de pH, contenido de materia orgnica y clase textual, obtenindose que
la mayora de las muestras mostraron una fertilidad de moderada a alta.
Las clase texturales predominantes en el departamento de Jutiapa fueron: arcilloso y
franco arcillo arenoso; mientras que en departamento de Chimaltenango fueron:
franco arenosos y franco arcillo arenosos.
Basndonos en los anlisis realizados de pH, se estableci que existan condiciones
apropiadas para el desarrollo de Rhizobium (pH mayores de 5).
El aislamiento de bacterias no estuvo correlacionado con el estado nutricional del
suelo donde fueron colectados los ndulos, sin embargo, si existi correlacin entre
el contenido nutricional del suelo, contenido de materia orgnica y potencial de
hidrgeno de las muestras de suelo de donde se logr el aislamiento de Rhizobium.

8. RECOMENDACIONES

Realizar estudios de caracterizacin a las 21 cepas identificadas como Rhizobium

leguminosarum biovar phaseoli, y poder as contar con una fuente orgnica que
sirva como una alternativa para disminuir el uso de frmulas qumicas nitrogenadas
en el cultivo de h j o l .
Que para las muestras donde no se obtuvo respuesta a la infeccin de plantas por
Rhizobium, se trabaje en lugares que cumplan con las condiciones de asepsia con el
propsito de evitar contaminacin por hongos.
Evaluar las cepas aisladas de bacterias del gnero Rhizobium leguminosarum,
biovarphaseoli en suelos arcillosos y de baja fertilidad, a efecto de observar su
potencial para fijar nitrgeno atmosfrico a nivel de invernadero y ensayos de
campo.
Las c epas a isladas debern c onservarse e n ampollas 1eofilizadas p ara a segurar S u
preservacin por perodos mayores de 3 meses.
Repetir los muestreos de sitios en los cuales no se logr el aislamiento de cepas.
Seguir muestreando las diferentes zonas frijoleras del pas.
 9. BIBLIOGRAFIA

1. Aguilera R. Evaluacin del efecto simbitico de 14 cepas de Rhizobium phaseoli en

tres variedades de frijol negro en Guatemala. Guatemala: Universidad de San
Carlos, (tesis de graduacin, Facultad de Agronoma) 1974. 39 p.
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Kenyan soils with contrasting pHs. Appl Environ Microbiol. 1995;61: 40 16-4021.
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10. ANEXOS
 ANEXO 1

Clasificacin por grupos de Rhizobium

Grupo 1: Rhizobium de crecimiento rpido, productores de cido con 2-6 flagelos

peritricales. Las colonias miden 2-4 mm. a los 3-5 das de incubacin en agar manitol-
levadura. Aislados de leguminosas de regiones templadas.

ESPECIE HUESPED
R. leguminosarum Phaseolus vulgaris
R. trifolii Medicago, Meliloti, Tregonella
R. phaseoli Trifolium

Grupo 11: Rhizobium de crecimiento lento, productoras alcalinas, con flagelos, las colonias
son menores de 1 mm de dimetro a los 5-7 das en placas de agar Manitol-levadura.
Nodulan leguminosas tropicales.

ESPECIE HUESPED
R. japonicum Lupinus, Ornithopus
R. Iipini Vigna, Desmodium, Archis, Centrocema, Stylosanthes, etc
Fuente: referencia No. 1
 ANEXO 2
Morfologa de Rhizobium obtenido directamente de ndulos

FORMA Recto
CONTORNO Redondeados
BORDES
TAMAO (ancho: LARGO) parejas, cadenas y en racimo
AGRUPACIONES negativo
REACCION GRAM 3-5 grnulos prpuras redondeados dentro
de la bacteria.
OTROS

ANEXO 3
Morfologa colonial de Rhizobium

Morfologa de las colonias de Rhizobium en agar manitol-levadura incubados a 30 grados

por tres das - - -

Tamao 2-4 mm de dimetro

Forma colonia circular
Pigmentacin blancas opacas leosas translcidas

Elevacin Elevadas o planas

Borde liso

Superficie lisa

Estructura amorfa

Consistencia viscosa
Fuente: referencia No. 1
 ANEXO 4

GUIA PARA LA INTERPRETACION DE ANALISIS DE SUELOS

CmoYKg. = RANGO
m e q 1 1 0 0 g suelo
MEDIO ALTO
4-20 >20

Mglkg. = ppm

1 % Materia 1 0.6-2.0 2.1-4.5 >4.5

pH cido neutro alcalino

1
5.6-6.5 6.6-7.3 7
1
.4-8.3 l
Fuente: Kass, D. Fertilidad de Suelos
 ANEXO 5

AISLAMIENTO DE Rhizobium
Los ndulos desecados se deben rehidratar antes de esterilizarlos. Colocar los
ndulos en vasos de precipitar pequeos con agua estril fna y dejar en el
refrigerador toda la noche para que la absorban.
Sumergir los ndulos intactos y sin dao 5-10 segundos en etanol al 95 %.
Transferirlos a una solucin de hipoclorito de calcio al 3 % y dejar por 4-6 minutos.
Lavar en 5 recipientes estriles con agua estril ( se pueden utilizar cajas de petri
plsticas).
Romper 1os n dulos e n una gota d e agua e stril e n una caja d e p etri. S embrar 1a
suspensin nodular en agar Manitol-levadura ms azul de bromotimol. Flamear
entre cada estiada.
Incubar a 25-30 grados centgrados en oscuridad, 4 a 10 das. Buscar colonias
aisladas tpicas de Rhizobium.
Aislar cada colonia diferente en agar levadura manitol ms azul bromotimol.
Incubar y observar diariamente la aparicin de colonias tpicas de Rhizobium.
o Azul de bromotimol: un color amarillo debido a la produccin de cido
de Rhizobium de crecimiento rpido.
Se deben leer 3-5 das despus para los de crecimiento rpido.
Realizar gram y montajes en fresco para observar movilidad.
Transferir a tubos de cultivo con caldo manitol levadura.
Incubar a 25 grados centgrados por 3-5 das.
 IDENTIFICACIN DE Rhizobium leguminosarum biovar phaseoli

La identificacin se realizar por medio de la infeccin de Phaseolus vulgaris por las

cepas aisladas.
Se utilizarn bolsas de crecimiento hechas de propileno aproximadamente de 16" 18
cm, con una hoja de papel adsorbente en el interior y un canal hecho del mismo
papel en el borde superior.
Colocar en el interior de la bolsa 50 m1 de solucin nutriente para planta.
Esterilizar la superficie las semillas:
o Seleccionar semillas de viabilidad buena, libres de dao; si se ha usado
pesticida, estas deben ser lavadas con agua y secadas con papel absorbente.
o Colocar las semillas en erlenmeyer autoclaveado y cubrirlo con una caja de
petri estril.
o Lavar las semillas en alcohol al 95% por 10 segundos, quitar alcohol.
o Agregar hipoclorito de calcio al 3% en volumen suficiente para cubrir todas
las semillas, mezclar y dejar 5 minutos. Descartar la solucin.
o Lavar con agua estril, 6 veces.
o Agregar suficiente agua y c olocar las semillas e n el r efrigerador para que
absorban el agua por 4 horas.

Trasladar aspticamente las semillas a una caja de petri que contenga dos lminas de
papel filtro esterilizado ( 20 semillas por caja de petri ).
Dejar las semillas 24 a 48 horas hasta que germinen
Seleccionar las semillas germinadas y de radculas de 1- 1.5 cm. de largo.
Colocar las semillas esterilizadas y pregerminadas en un en la bolsa de crecimiento,
con la raz en el interior de la bolsa.
Se dejan 5-7 das las plantas
PREPARACIN DEL INCULO: La tcnica utilizada para esto es la sugerida por
Vincent y Somasegaran
o Suspensin inicial: A partir del cultivo puro obtenido de las cepas aisladas
sospechosas de Rhizobium leguminosarum biovar phaseoli, tomar 10 asadas
de las colonias y colocarlas en 5 ml. de caldo manitol-levadura (ML).

o A partir de la suspensin inicial se realizarn seis diluciones 1 5 , seriadas,

con cuatro repeticiones para cada dilucin, de la manera siguiente:
Dilucin 1: lrnl de suspensin inicial para cada bolsa de
crecimiento ( 4 repeticiones).
Dilucin 5 : 1 m1 d el anterior + 4 m1 d e caldo M L. 1 m1 p ara
cada bolsa de crecimiento ( 4 repeticiones).
Dilucin 25: lml del anterior + 4ml de caldo ML. lrnl para
cada bolsa de crecimiento ( 4 repeticiones).
Dilucin 125: lrnl del anterior + 4ml de caldo ML. lrnl para
cada bolsa de crecimiento ( 4 repeticiones).
Dilucin 625: lrnl del antenor + 4ml de caldo ML. Iml para
cada bolsa de crecimiento ( 4 repeticiones).
Dilucin 3 125: lrnl del antenor + 4ml de caldo ML. lrnl para
cada bolsa de crecimiento ( 4 repeticiones).

Dejar 3 semanas con luz permanente las bolsas y observar la presencia de ndulos.
Se utilizaran como control positivo: una bolsa de crecimiento con nitrgeno
inorgnico. Y como control negativo: bolsa de crecimiento sin inocular.
Las cepas se conservarn en tubos con agar manitol-levadura y aceite mineral en la
superficie
11. FOTOGRAFIAS
FOTO 1. CONSERVACION DE NODULOS COLECTADOS

FOTO 2. AISLAMIENTO DE CEPAS DE RHIZOBIUM

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FOTO 3. DESINFESTACIQN DE LA SEMILLA DE W O L
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 FOTO 5. PREGERMINADO DE SEMILLAS

FOTO 6. BOLSAS DE CRECIMIENTO PARA COMPROBACION DE Rhizobium

leguminmarum biovar phasmli
FOTO 7. NODULOS DE Rhizobiurn leguminmararm biovarphaseoli

FOTO 8. NODULOS DE RIrizobUrm kguminmamm b i o v a r p h d i

 2
FOTO 9. CONSERVACION DE CEPAS

FOTO 10. INGRESO Y CODIFICACION DE MUESTRAS PARA ANALISIS DE

SUELOS.