5.

MICROBIOLOGA DEL ALIMENTO, SU FLORA MICROBIANA

La microbiologa de alimentos es una rama de la microbiologa que se encarga del

anlisis de la composicin microbiana de los alimentos, mediante tcnicas
estandarizadas que permiten la deteccin de diferentes agentes microbianos.

Esta disciplina asume el anlisis de aspectos positivos que tienen los microorganismos
sobre los alimentos, como la produccin de alimentos gracias a microorganismos y
tambin de aspectos negativos que tienen los microbios y la causa de enfermedades
hacia las personas que consumen alimentos contaminados con microorganismos.

Para determinar los microrganismos potencialmente presentes en la carne es

recomendable realizar anlisis microbiolgicos tomando en cuenta a los
microorganismos mas frecuentes encontrados en este tipo de productos como:

PARAMETRLS LIMITES
Escherichia coli 10 UFC/g
Coliformes totales 103UFC/g
Aerobios mesofilos 105UFC/g
Staphylococcus aureus 103UFC/g
Salmonella Ausencia en 25g
Clostridium perfingens 103UFC/g
Mohos y levaduras 104UFC/g
6. ANALISIS MICROBIOLOGICO PROPUESTO- PROTOCOLO DE ANALISIS
MICROBIOLOGICO (AGAR PCA, AGAR SBD, AGAR SS Y PETRIFIM)

6.1. MEDIO DE CULTIVO: Agar PCA ( PLATE COUNT AGAR (PCA) CROMOGENICO)

Es idneo para recuento total en alimentos (FIL, IDF, AOAC, APHA, ICMSF),
diferenciando las colonias, incluso las ms diminutas de las partculas y del medio.
Con este novedoso medio de MICROKIT, distinguir a simple vista las colonias rojas
de las partculas de muestra y del medio, agilizando los recuerdos sin desgastar su
vista.

I. AGAR PCA

Recuento de siembra de superficie.

MATERIAL

Placas Petri estriles 90 mm

Pipetas de 1 y 10 ml
Asa de siembra
Asas de vidrio estriles
Estufa de cultivo
Contador de colonia

COMPOSICIN:

AGAR NUTRITIVO DE RECUENTO (PLATE COUNT AGAR PCA)

Triptona 5g
Extracto de levadura 2.50g
Dextrosa 1g
Agar 12g
Agua destilada 1000ml

Disolver los ingredientes en agua por calentamiento. Ajustar el pH a 7, distribuir en

tubos o matraces y esterilizar en autoclave a 121 oC durante 15 minutos.

TECNICA:

1.- A partir de la serie de diluciones y por duplicado depositar con pipeta estril 1
ml de cada dilucin en otras tantas placas de Petri estriles de 90 mm de dimetro.

2.- Aadir a cada placa unos 15 ml de PCA previamente licuado y atemperado a

47 oC.

3.-El tiempo transcrito entre el momento de depositar las distintas diluciones en las
placas y verter sobre ellas el medio de cultivo no debe ser superior a 10minutos.
 Del mismo modo, no se superan los 20 minutos desde que se prepara la primera
dilucin de la serie de diluciones hasta que se verte el agar en la ltima placa.

4.- Mezclar perfectamente el medio e inoculo sobre la mesa de trabajo, haciendo

movimientos circulares con la placa a favor y en contra del sentido de las agujas
del reloj, y en forma de cruz, evitando al mismo tiempo que el medio impregne la
tapa. Dejar solidificar el agar de las placas sobre una superficie horizontal.

5.- Cuando se ha solidificado perfectamente el agar, se intervienen las placas y se

introducen en una estufa evitando que se apilen un exceso y que se entren en
contacto con sus paredes incubar a 31 +- 1 oC durante un periodo de 72 horas.

6.- Transcurrido el tiempo de incubacin se cuentan las colonias en aquellas

palcas que muestren entre 30 y 300 colonias aisladas. Las colonias se irn
marcando para evitar contarlas de nuevo.

Nota: El nmero total de colonias contadas multiplicado por el factor de dilucin de

la placa elegida da como resultado el recuento total delos grmenes por gramo o
mililitro de muestra analizada.

6.2. MEDIO DE CULTIVO: AGAR SBD

El agar dextrosa sabouranud se utiliza para cultivo y conservacin de hongos

patgenos y no patgenos particularmente dermatofitos, levaduras y microorganismos
acidoricos a partir de diversas muestras.

FORMULA EN GRAMOS POR LITRO DE AGUA DESTILADA

Agar 15.0
Dextrosa 40.0
Peptona especial 10.0

TECNICA:

1.- Rehidratar 65g del medio en un litro de agua destilada.

2.-Reposar de 10 a 15 minutos.

3.- Calentar agitando frecuentemente hasta el punto de a ebullicin durante 1 minuto

para disolverlo por completo.

4.- Esterilizar en autoclave a 121 oC durante 15 minutos.

5.- Enfriar aproximadamente a 45C.

6.- Vaciar 20ml en cajas Petri estriles.

7.- Conservar en refrigeracin a 2 a 8 oC.

6.3. MEDIO DE CULTIVO: AGAR SS

Es un medio de cultivo selectivo y diferencial. La selectividad de esta dada por las
sales biliares y el verde brillante, que inhiben el desarrollo de bacterias Gram
Positivas, de la mayora de los coliformes y el desarrollo invasor del Proteus spp.

Es diferencial debido a la fermentacin de la lactosa, y a la formacin del cido

sulfhdrico a partir del tiosulfato de sodio. El agar SS ( Salmonella-Siguella) permite el
crecimiento de microorganismos enteros. Este medio facilita la diferenciacin de
salmonella ya que sus colonias toman un pigmento negro en el centro.

Frmula (en gramos por litro)

Pluripeptona 5.0

Extracto de carne 5.0

Lactosa 10.0

Mezcla de sales biliares 8.5

Citrato de sodio 8.5

Tiosulfato de sodio 8.5

Citrato frrico 1.0

Agar 13.5

Verde brillante 0.00033

Rojo neutro 0.025

pH final: 7.0 0.2

TECNICA:
1.-Suspender 60 g del polvo por litro de agua destilada.

2.-Reposar 5 minutos y mezclar hasta homogeneizar. Calentar a ebullicin durante 2 o

3 minutos. NO ESTERILIZAR EN AUTOCLAVE.

3.-Enfriar a 45-50C y distribuir unos 20 ml por placa.

4.-Secar la superficie del medio unos minutos en la estufa.

6.4. LAS PLACAS 3M PETRIFILM

CARACTERISTICAS DEL PROCEDIMIENTO DE ENSAYO

Las placas petrifilm para el Recuento de Microorganismos Aerobios Mesofilos estn

diseadas para determinarlas poblaciones totales de bacterias aerobias.

Se basa en el crecimiento de colonias de la flora aerobia mesofila que lleva la muestra.

El diseo de esta placa presenta una pelcula con nutrientes y agentes gelificantes
soluble en agua y un indicador rojo de tetrazolio para brindar un mejor contraste y
facilitar el recuento.

Son un mtodo fiable para la deteccin de contaminacin microbiana ambiental.

DILUYENTES
Buffer de fosfatos de Butterfield`s ( buffer de fosfatos IDF 0.0425 g/L de
KH2PO4 ajustado a pH 7.2)
Agua peptonada al 0.1 %
Diluyente de `peptona sal (mtodo ISO 6579)
Solucin letheen libre de bisulfitos
Agua destilada.

HIDRATACION

Antes de usar las Placas Petrifilm MR para muestreo de aire o contacto directo,
hidratar las placas con 1 Ml del diluyente apropiado. Dejar que las placas hidratadas
permanezcan cerradas por un mnimo de 1 hr. Antes de usarlas. No es necesario que
el gel este solidificado completamente.

ALMACENAMIENTO

Almacenar las placas Petrifilm Mr hidratadas en bolsas plsticas selladas con cinta.
Proteger las placas de la luz (se puede usar el empaque original) y refrigerar de 2-8 0C
(36-46 0C). Las placas de recuento aerbico hidratadas pueden ser refrigeradas por un
mximo de 14 das. Otras placas Petrifilm MR hidratadas pueden ser refrigeradas por
un mximo de 7 das.

PREPARACION DE LA MUESTRA
HAMBURGUESA DE CARNE
1. Aspticamente pesar a lo menos (manteniendo relacin 1:10 con el diluyente) 10
0.1g de muestra representativa dentro de una bolsa estril Stomacher.
2. Agregar 90 ml de dilyente Butterfield`s Tamponado. Esta dilucin es denominada
10 -1 . No usar tampones que contengan citrato, bisulfito o tiosulfato con las placas
Petrifilm, ya que pueden inhibir su crecimiento.
3. Homogenizar la muestra en equipo Stomacher por 1 minuto a velocidad meda.
4. Luego depositar 1 ml de esta dilucin de acuerdo a lo descrito.
5. La siembra en duplicado queda a criterio del laboratorio, para lo cual se debe
repetir el procedimiento antes descrito.
6. A partir de la dilucin anterior tomar 1 ml y depositarlo en un tubo que contenga 9
ml de Diluyente Butterfield`s Tamponado. Esta dilucin es denominada 10 -2 .Con
estas dos diluciones se continua en el punto 5.3.3.
7. En caso de ser necesario, el laboratorio puede realizar ms diluciones sucesivas
con el objeto de obtener placas con recuentos contables.

PROTOCOLO DE TRABAJO

1. Rotular las placas Petrifilm con la identificacin de las muestras y la dilucin

correspondiente.
2. Colocar la placa Petrifilm Recuento de Microorganismos Aerobios Mesofilos en
una superficie plasma.
3. Levantar el film superior e inocular 1 ml de la dilucin decimal apropiada en el
centro del film inferior.
4. Bajar cuidadosamente el film superior encima de la muestra, evitando la formacin
de burbujas en el aire.
5. Colocar el aplicador con la cara lisa hacia arriba en el centro de la placa.
6. Presionar ligeramente el centro del aplicador para distribuir la muestra
uniformemente. Distribuir el inoculo por toda el rea de crecimiento del Petrifilm
antes de que se forme el gel. No deslizar el aplicador por el film.
7. Sacar el aplicador y esperar al menos un minuto para permitir que se solidifique el
gel.
8. Por cada dilucin existente siembre en una o dos placas.
9. Incubar las placas en posicin horizontal, cara arriba, en pilas de hasta 20 placas.
La incubadora debe estar humidificada.
10. Incubar las placas petrifilm Recuento de Microorganismos Aerobios Mesofilos por
48 3 hrs. A 35oC 1oC.

CLCULO Y EXPRESION DE LOS RESULTADOS

1.-Contabilizar todas las colonias rojas rojas de borde regular, independientemente

del tamao o intensidad del color.

2.- El rea de crecimiento circular del Petrifilm es aproximadamente de 20cm 2.

Pueden realizarse estimaciones en placas que contengan ms de 300colonias
contando el nmero de colonias en uno o ms cuadrados representativos y
obteniendo el promedio. Multiplicar dicho numero por 20para obtener el recuento total
por placa.

3.- Altas concentraciones de colonias en las placas ocasionara que toda el rea de
crecimiento se vuelva roja o rosada. Ocasionalmente, en placas demasiado cargadas,
el centro de la placa puede carecer de colonias visibles, pero pueden apreciarse
muchas colonias pequeas en los bordes. Cuando esto ocurre, diluir ms de la
muestra para obtener un recuento ms preciso.

4.- Algunos organismos pueden licuar el gel, pudindose producir una difusin que
oculte la presencia de otras colonias. Si la licuacin del gel interfiere con el recuento
debe realizarse un recuento estimado cortando las reas no afectadas.

5.- Tras la incubacin, las palcas pueden conservarse para recuentos posteriores en
congelacin a temperaturas bajo o igual a los -15 oC por un mximo de una semana,
para efectuar el conteo. Esto es solo para casos de emergencia, no se debe
establecer como procedimiento rutinario.