N dordre Ecole Nationale Suprieure Anne 2004

des Industries Agricoles et

Alimentaires

Ecole Doctorale
Agriculture Biologie et Sant

THESE

Prsente pour obtenir le grade de

Docteur de lENSIA
Spcialit : Sciences Alimentaires

Soutenue publiquement par

Audrey ALLION
Le 1er juin 2004

ENVIRONNEMENT DES BACTERIES

ET SENSIBILITE AUX BIOCIDES

- Mise au point dune technique rapide pour dterminer in situ

lefficacit bactricide dagents antimicrobiens

JURY :

Rapporteurs Madame N. Orange

Monsieur J.C. Darbord
Examinateurs Madame M.-N. Bellon-Fontaine
Madame L. Boulang-Petermann
Monsieur P. Giampaoli
Monsieur J. Criquelion
 Remerciements

Jadresse mes plus sincres remerciements Marie-Nolle Bellon-Fontaine,

Directeur de Recherche lUnit de Recherche en Bioadhsion et Hygine des
Matriaux (UBHM) de lINRA de Massy, pour mavoir accueillie au sein de son quipe et
pour mavoir fait lhonneur de diriger ce travail. Je lui suis reconnaissante pour la
confiance et le soutien permanent quelle ma tmoign dans cette collaboration ainsi que
pour ses comptences scientifiques et pdagogiques qui mont permis de mener bien ce
projet.

Je remercie galement trs sincrement Madame Nicole Orange, Professeur

lUniversit dEvreux et Monsieur Jacques Darbord, Professeur lUniversit Paris 5
pour lintrt quils ont bien voulu porter ce travail et davoir accept den tre les
rapporteurs.

Jadresse galement mes sincres remerciements Madame Laurence Boulang

et Monsieur Pierre Giampaoli davoir accept de participer ce jury de thse.

Je souhaite exprimer ma gratitude Messieurs Bertrand et Thierry Letartre

davoir encourag et soutenu ce projet, et de mavoir accueillie au sein de leur
entreprise.
Mes plus vifs remerciements vont galement Madame Franoise Durand pour
son soutien en microbiologie, Monsieur Gatan Rauwel pour son aide en chimie et
Monsieur Jacques Criquelion pour ses prcieux conseils et nos runions toujours
fructueuses.

Je ne saurais oublier toute lquipe de lUBHM. Toute ma reconnaissance va

Madame Josette Rault et Mademoiselle Margareth Renault pour leur compagnie dans le
bureau pendant ces annes de thse. Merci pour leur aide si prcieuse, leur gentillesse,
leur bonne humeur et leur patience, notamment dans la relecture assidue de ce
manuscrit.
Jadresse galement mes sincres remerciements Monsieur Romain Briandet
pour sa disponibilit et sa compagnie toujours trs agrable, Monsieur Thierry
Meylheuc pour mavoir fait partag son exprience de la dsinfection et pour nos
discussions toujours trs enrichissantes, Monsieur Jean-Marie Herry pour ses conseils
en analyse dimages et en informatique et pour mavoir initi lAFM. Que Mesdames
Florence Dubois et Murielle Natali soient remercies pour leur soutien, Madame Yvette
Monfils pour son assistance technique et sa bonne humeur, Monsieur Gilles Gerlot pour
sa disponibilit, Madame Francine Ppin pour sa gentillesse.
Merci Marie-Cline, Youness, Armel, Anglique, Isabelle, Carine, Olivier et plus
particulirement Abir Nazer pour leur solidarit dans le quotidien du thsard.
 Je souhaite exprimer mon amiti Natacha, Lionel, Sabrina, Suzane, Agns,
Peggy, Jean-Philippe, Mylne, Caroline, Sandrine, Herv, Katherine, pour mavoir couter
dlirer pendant des heures sur mes travaux.
Un grand merci galement mes parents, mon frre Romuald, Karine et
Azlie, mes beaux-parents, Valrie et Christophe pour leurs encouragements
affectueux pendant ces trois annes.
Enfin, je ddie ces travaux Laurent pour sa patience et sa comprhension
permanentes pendant ces annes de thse qui mont permis de faire aboutir ce travail.
TABLE DES MATIERES

PRESENTATION GENERALE 12
PARTIE I : ETUDE BIBLIOGRAPHIQUE 15
LA DESINFECTION 16
I. DEFINITION 16
II. MODES DACTION DES DESINFECTANTS 16
II.1. Notion de dsinfectant et dantiseptique 16
II.2. Choix de lagent antimicrobien 17
II.2.1. Rglementation 17
II.2.2. Activit bactricide 18
II.2.3. Dtermination de lactivit antibactrienne des dsinfectants 18
II.2.3.1. Sur cellules planctoniques 18
II.2.3.2. Sur cellules fixes 19
II.3. Mcanisme daction gnral 19

III. CLASSIFICATION DES PRINCIPES ACTIFS ANTIMICROBIENS 22

III.1. Produits action ltale non spcifique 22
III.1.1. Oxydants 22
III.1.2. Halognes et drivs 23
III.1.3. Acides et bases 23
III.1.4. Alcools 23
III.1.5. Aldhydes 24
III.2. Produits action ltale spcifique 24
III.2.1. Ammoniums quaternaires 24
III.2.2. Biguanides 26
III.2.3. Drivs Phnoliques 28

IV. SENSIBILITE BACTERIENNE AUX AGENTS ANTIMICROBIENS : NOTION DE RESISTANCE ET DE TOLERANCE 30

IV.1. Dfinition 30
IV.2. Rsistance intrinsque 30
IV.2.1. La paroi des bactries Gram positif 30
IV.2.2. La paroi des bactries Gram ngatif 31
IV.3. Rsistance acquise 32
IV.3.1. Rsistance acquise chromosomique 32
IV.3.2. Rsistance acquise plasmidique (ou extrachromosomique) 33

V. RESISTANCE LIEE A LETAT ADHERANT ET/ OU EN BIOFILM 34

V.1. Mcanisme gnral de ladhsion 34
V.2. Interactions physico-chimiques non covalentes 36
V.2.1. Interactions lectrostatiques 36

2
 V.2.2. Interactions non-lectrostatiques 38
V.2.2.1. Interactions de Lifshitz - van der Waals (LW) 38
V.2.2.2. Interactions Lewis acide-base (AB) 39
V.2.2.3. Interactions lies au mouvement Brownien(BR) 40
V.3. Evaluation de ladhsion des micro-organismes aux surfaces 40
V.3.1. Dnombrement des cellules viables cultivables 41
V.3.2. Observation in situ 41
V.3.2.1. Flore totale 41
V.3.2.2. Diffrenciation entre cellules viables et cellules mortes 42
V.4. Facteurs susceptibles de modifier ladhsion bactrienne 44
V.4.1. Caractristiques des cellules bactriennes 44
V.4.2. Caractristiques des supports solides 45
V.4.3. Caractristiques des fluides environnants 46
V.4.4. Prsence de matires interfrentes 46
V.5. Adhsion et rsistance aux agents antimicrobiens 47
V.5.1. Prsence du glycocalyx 47
V.5.2. Etat physiologique des cellules adhrentes 48
V.5.3. Localisation au sein du biofilm 49

VI. CONCLUSION 50
PARTIE II : MATERIELS ET METHODES 51
I. SOUCHES BACTERIENNES 52
I.1. Souches testes 52
I.2. Conditions de conservation 53
I.3. Conditions de croissance 54
I.3.1. Croissance sur milieu solide (TSA) 54
I.3.2. Croissance en milieu liquide (TSB) 54
I.3.3. Prparation des suspensions bactriennes 54
I.4. Caractrisation physico-chimique de la surface des cellules bactriennes 54
I.4.1. La mthode MATS (Microbial Adhesion To Solvents) 54
I.4.2. Dtermination de la charge de surface des bactries par micro-lectrophorse 56

II. SUPPORTS SOLIDES 57

II.1. Supports tests 57
II.2. Prparation des chantillons solides 57
II.3. Caractrisation physico-chimique de la surface des supports solides 57
II.3.1. Energie de surface des supports solides 57
II.3.2. Caractrisation de la surface des matriaux inertes par microscopie de force atomique (AFM :
Atomic Force Microscopy) 59

III. CONDITIONNEMENT DES SUPPORTS SOLIDES 59

III.1. Liquides de suspension 60
III.2. Solutions conditionnantes 60

3
 III.2.1. Solutions encrassantes (Adaptes de la norme NF EN 1276, 1997) 60
III.2.1.1. Solution protique modle 60
III.2.1.2. Souillure complexe 60
III.2.2. Principes actifs dsinfectants 60
III.3. Protocole de conditionnement 61

IV. ADHESION DES MICRO-ORGANISMES AUX SUPPORTS SOLIDES 61

IV.1. Tests dadhsion 61
IV.2. Dnombrement des cellules adhrentes 62
IV.2.1. Flore totale 62
IV.2.2. Flore viable cultivable 62

V. TESTS DE DESINFECTION SUR CELLULES PLANCTONIQUES 63

V.1. Agents antimicrobiens 63
V.2. Tests sur cellules planctoniques application de la norme NF-EN 1040 63
V.2.1. Activit bactricide des principes actifs 63
V.2.2. Tmoin de non - toxicit et de neutralisation 64

VI. TESTS DE DESINFECTION SUR CELLULES ADHERENTES MISE AU POINT DUN PROTOCOLE PERMETTANT
DEVALUER LACTIVITE BACTERICIDE DES DESINFECTANTS 64
VI.1. Activit bactricide des principes actifs 64
VI.2. Dnombrement des cellules viables cultivables 65
VI.3. Tmoin de toxicit et de neutralisation 65

VII. MISE AU POINT DUNE TECHNIQUE RAPIDE PERMETTANT DE DETERMINER IN SITU LACTIVITE BACTERICIDE
DES DESINFECTANTS 66
VII.1. Mise au point de la coloration sur cellules planctoniques 66
VII.2. Tmoin 67
VII.3. Test de dsinfection sur cellules planctoniques 67
VII.4. Coloration des cellules adhrentes 67

VIII. ANALYSE STATISTIQUE 68

PARTIE III : RESULTATS DISCUSSION 69
I. CONDITIONS DE CONSERVATION ET DE CROISSANCE DES SOUCHES BACTERIENNES 70
I.1. Impact sur les proprits physico-chimiques de surface des micro-organismes 70
I.1.1. Mobilit lectrophortique 70
I.1.2. Test MATS 73
I.2. Impact sur lactivit bactricide des dsinfectants 79
I.2.1. Test MATS 79
I.2.2. Activit antimicrobienne et dtermination de la Concentration Minimale Bactricide 82
I.2.2.1. Acide peractique (APA) 82
I.2.2.2. Chlorure de didcyl-dimthyl-ammonium (CDDMA) 85
I.2.2.3. Poly(hexamthylne-biguanide) (PHMB) 88
I.3. Conclusion 93

II. EVALUATION DE LACTIVITE BACTERICIDE DES DESINFECTANTS SUR CELLULES ADHERENTES 94

II.1. Protocole dadhsion microbienne aux surfaces 94

4
 II.1.1. Caractrisation nergtique de la surface des supports solides 95
II.1.2. Adhsion bactrienne 96
II.1.2.1. Flore totale adhrente 97
II.1.2.2. Dnombrement des cellules viables cultivables 100
II.2. Dsinfection des surfaces contamines 103
II.2.1. Pseudomonas aeruginosa 103
II.2.2. Staphylococcus aureus 104
II.2.3. Listeria monocytogenes 106
II.3. Conclusion 110

III. MISE
AU POINT DUN PROTOCOLE RAPIDE PERMETTANT DEVALUER IN SITU LA VIABILITE DES CELLULES
ADHERENTES 111
III.1. Protocole de coloration des cellules bactriennes 111
III.1.1. Choix des fluorochromes 112
III.1.2. Mise en place du protocole 113
III.1.2.1. Coloration des micro-organismes 113
III.1.2.2. Essais sur cellules planctoniques 113
III.1.2.3. Coloration sur cellules adhrentes 116
III.2. Application la dsinfection des surfaces 117
III.3. Conclusion 123

IV. FILMS PRIMAIRES ET QUALITE DE LEAU : IMPACT SUR LA BIOADHESION ET LA VIABILITE CELLULAIRE 124
IV.1. Dtermination des caractrisation physico-chimiques de surface de lacier conditionn ou non 124
IV.1.1. Conditionnement par un encrassement organique 125
IV.1.1.1. Influence de la qualit de leau 126
IV.1.1.2. Solution modle : la SAB 126
IV.1.1.3. Solution complexe : le lait 127
IV.1.2. Adsorption des agents antimicrobiens 128
IV.2. Impact sur le comportement bioadhsif et la viabilit des micro-organismes adhrents 130
IV.2.1. Molcules encrassantes 130
IV.2.2. Principes actifs antimicrobiens 132
IV.3. Application la dsinfection 134
IV.4. Conclusion 137

SYNTHESE GENERALE 138

CONCLUSION - PERSPECTIVES 144
REFERENCES BIBLIOGRAPHIQUES 146
ANNEXES 160

5
ABREVIATIONS UTILISEES

APA Acide peractique

CDDMA Chlorure de N, N-didcyl-N, N-dimthylammonium
CMB Concentration Minimale Bactricide
CMI Concentration Minimale Inhibitrice
DAPI 4,6-diamidino-2-phenylindole dihydrochloride
DO Densit optique
Energie de surface (mJ/m) ou tension de surface (mN/m) dun corps
- Caractristique lectron-donneur ou Lewisbase de la composante acide-base
de lnergie libre de surface.
+
Caractristique lectron-accepteur ou Lewisacide de la composante acide-
base de lnergie libre de surface
AB Composante polaire ou acide-base de lnergie de surface (mJ/m)
LW Composante apolaire ou de Lifschitz van der Waals de lnergie libre de
surface (mJ/m)
L. monocytogenes Listeria monocytogenes
L103575 Listeria monocytogenes 103575
L177P Listeria monocytogenes 177P
MATS Microbial Adhesion To Solvents
mN/m Millinewtons par mtre
PHMB Chlorure de poly(hexamthylne-biguanide)
P. aeruginosa Pseudomonas aeruginosa
PA22 Pseudomonas aeruginosa A22
P222P Pseudomonas aeruginosa 222P
PTFE Polyttrafluorothylne
SAB Srum Albumine Bovine
S. aureus Staphylococcus aureus
S53154 Staphylococcus aureus 53154
S221P Staphylococcus aureus 221P
Angle de contact ()
UFC Unit(s) formant colonie(s)
v/v Volume volume

6
TABLE DES ILLUSTRATIONS
TABLEAUX

Tableau I-1 : Concentrations minimales bactricides (CMB) en ppm, selon la longueur de la chane
carbone (Reverdy, 1995a). 25
Tableau I-2: Synthse du mcanisme de laction antibactrienne dantiseptiques et de dsinfectants.29
Tableau I-3 : Mcanismes possibles de rsistance plasmidique (McDonnell et Russell, 1999). 34
Tableau I-4 : Longueur donde, , dexcitation et dmission (nm) de quelques fluorochromes
frquemment utiliss (http://www.probes.com/handbook). 43
Tableau II-1 : Caractristiques et origine des souches bactriennes. 52
Tableau II-2 : Composantes van der Waals (LW), accepteur dlectrons (+) et donneur dlectrons (-
) de lnergie libre de surface des solvants utiliss pour le test MATS (Bellon-Fontaine
et al., 1996). 55
Tableau II-3 : Composantes van der Waals (LW), accepteur dlectron (+) et donneur dlectron (-)
de lnergie libre de surface des trois liquides utiliss dans la mthode des angles de
contact. 58
Tableau II-4 : Principes actifs et concentration dutilisation des dsinfectants. 61
Tableau II-5 : Maximum dabsorption et dmission des fluorochromes slectionns. 66
Tableau II-6 : Caractristiques des filtres utiliss pour les observation au microscope
pifluorescence. 67
Tableau II-7 : Observations au microscope pifluorescence (obj.x40) de la flore totale adhrente et
des cellules non viables avant et aprs dsinfection avec lacide peractique. 68
Tableau III-1 : Mobilit lectrophortique (M.E.) sur une gamme de pH allant de 2 9 pour chacune
des souches tudies en fonction des conditions de conservation ( 4 et 80C pendant
0, 1 et 2 mois ) et de croissance (TSA et TSB). 71
Tableau III-2 : Pourcentage daffinit aux solvants (CH: Chloroforme, HD : Hexadcane, D : Dcane
et A:E. : Actate dthyle) de S. aureus 53154 en fonction des conditions de
conservation et de croissance. 74
Tableau III-3 : Pourcentage daffinit aux solvants (CH : Chloroforme, HD : Hexadcane, D :
Dcane et A.E. : Actate dthyle) de P. aeruginosa A22 en fonction des conditions de
conservation et de croissance. 74
Tableau III-4 : Pourcentage daffinit aux solvants (CH : Chloroforme, HD : Hexadcane, D :
Dcane et A.E. : Actate dthyle) de L. monocytogenes 129P en fonction des
conditions de conservation et de croissance. 75
Tableau III-5 : Pourcentage daffinit aux solvants (CH : Chloroforme, HD : Hexadcane, D :
Dcane et A.E. : Actate dthyle) de L. monocytogenes 103575 en fonction des
conditions de conservation et de croissance. 75
Tableau III-6 : Concentration minimale bactricide (ppm) de lacide peractique en fonction de
lorigine et des conditions de croissance des souches bactriennes. 84
Tableau III-7 : Concentration minimale bactricide (ppm) de lammonium quaternaire en fonction de
lorigine et des conditions de croissance des souches bactriennes. 86
Tableau III-8 : Concentration minimale bactricide (ppm) de la PHMB en fonction de lorigine et des
conditions de croissance des souches bactriennes (ND : Non Dtermine). 90

7
Tableau III-9 : Angles de contact mesurs () leau, au formamide et au diiodomthane sur lacier
inoxydable AISI 316 et sur le PTFE. 95
Tableau III-10 : Observations au microscope pifluorescence (obj. x 10) des souches de collection
et sauvages adhrentes lacier inoxydable et au PTFE en fonction des conditions de
croissance. Les cellules sont colores lorang dacridine. 99
Tableau III-11 : CMB de chaque dsinfectant pour P. aeruginosa A22 et 222P en suspension en
fonction du milieu de croissance. 103
Tableau III-12 : CMB de chaque dsinfectant pour S . aureus 53154 et 221P en suspension en
fonction du milieu de croissance (ND : Non Dtermine). 104
Tableau III-13 : CMB de chaque dsinfectant pour L. monocytogenes 103575 et 177P en suspension
en fonction du milieu de croissance (ND : Non Dtermine). 106
Tableau III-14 : Observation en microscopie pifluorescence (obj x 40) de S. aureus 53154, L.
monocytogenes 103575 et P. aeruginosa A22 adhrentes lacier AISI 316 en
fonction des conditions de croissance. 116
Tableau III-15 : Adhsion de L. monocytogenes 103575, S. aureus 53154 et P. aeruginosa A22
lacier inoxydable, observation au microscope pifluorescence des cellules marques
avec le DAPI (flore totale). 121
Tableau III-16 : Angle de contact mesurs leau () et observations en AFM de lacier AISI 316
avant et aprs encrassement en fonction de leau utilise (osmose ou distille). 125
Tableau III-17 : Angle de contact leau () mesur sur lacier avant et aprs conditionnement par les
agents antimicrobiens. 129
Tableau III-18 : Adhsion (T : Nombre total de cellules adhrentes par cm) et viabilit (M : Nombre
de cellules mortes par cm) des souches de collection lacier encrass ou non
(observations au microscope pifluorescence obj. x40). 131

8
 FIGURES

Figure I-1 : Sites daction des molcules antiseptiques et dsinfectantes selon les micro-organismes
(daprs Crmieux et Freney, 1995). 21
Figure I-2 : Structure chimique des ammoniums quaternaires. 24
Figure I-3 : Formule chimique de la chlorhexidine. 26
Figure I-4 : Formule chimique du chlorure de poly(hexamthylne-biguanide). 27
Figure I-5 : Schma des interactions entre la poly(hexamthylne-biguanide) et la membrane
cytoplasmique (daprs Broxton et al., 1984). 28
Figure I-6 : Reprsentation schmatique des enveloppes des bactries Gram positif et Gram
ngatif (daprs Neidhardt et al., 1994). 31
Figure I-7 : Etapes de la formation de biofilms microbiens (adapt de Bellon-Fontaine et Briandet,
2000). 35
Figure I-8 : Structure de la double couche ionique (daprs Hiemez, 1997). 36
Figure I-9 : Reprsentation schmatique de la variation de potentiel en fonction de la distance de la
particule charge (daprs Adamson, 1990). 37
Figure I-10 : Formule chimique du DAPI (4,6-diamidino-2-phenylindole dihydrochloride) et de
lorang dacridine. 42
Figure I-11 : Formule chimique du iodure de propidium (a) et du bromure dthydium (b). 43
Figure I-12 : Reprsentation schmatique de la fluorescence avec excitation par lumire rflchie. 43
Figure I-13 : Schmatisation de la rsistance aux biocides des variants phnotypiques au sein des
biofilms (daprs Drenkard, 2003). 49
Figure II-1 : Coloration de Gram de S. aureus (a), L. monocytogenes (b) et P. aeruginosa (c). 52
Figure II-2 : Schma du protocole de conservation -80C. 53
Figure II-3 : Schma du protocole de conservation 4C. 54
Figure II-4 : Reprsentation schmatique du test MATS permettant la mesure de laffinit de cellules
microbiennes pour diffrents solvants. 55
Figure II-5 : Dispositif exprimental du ztamtre laser ztaphoremeter II. 56
Figure II-6 : Reprsentation de langle de contact () dune goutte dpose sur une surface solide. 57
Figure II-7 : Goniomtre G40 (Krss, Allemagne). 58
Figure II-8 : Reprsentation schmatique dun microscope de force atomique. 59
Figure II-9 : Schma du protocole dadhsion des micro-organismes aux surfaces. 62
Figure II-10 : Schma du protocole de dnombrement des cellules adhrentes. 63
Figure II-11 : Protocole du test de dsinfection sur cellules planctoniques (adapt de la norme
AFNOR NF-EN 1040). 64
Figure II-12 : Schma du protocole de dsinfection sur cellules adhrentes. 65
Figure II-13 : Schma de la double coloration. 66
Figure III-1: Mobilit lectrophortique pH 4 de S. aureus 53154 conserve 1 mois 4C en
fonction du mode de croissance. 73
Figure III-2: Mobilit lectrophortique pH 4 de S. aureus 53154 conserve 1 mois -80C en
fonction du mode de croissance. 73

9
Figure III-3: Analyse en composantes principales des proprits physico-chimiques de surface
(affinit aux solvants utiliss pour le test MATS et mobilit lectrophortique des
micro-organismes) de chaque souche cultive sur TSA ou en TSB T 0, T 1 et T 2
mois de stockage 4C et -80C. 77
Figure III-4 : Affinit des souches pour les solvants (CH : chloroforme, HD : hexadcane, D : dcane
et AE : actate dthyle) utiliss dans le test MATS en fonction des conditions de
croissance ( : TSA, : TSB). 80
Figure III-5 : Analyse en composantes principales des proprits physico-chimiques de surface
(affinit aux solvants utiliss pour le test MATS) des souches bactriennes en fonction
des conditions de croissance ( : TSA ; : TSB). 82
Figure III-6 : Courbes de destruction par lacide peractique des souches sauvages et de collection en
fonction des conditions de croissance (TSA : ; TSB : ). 83
Figure III-7 : Courbes de destruction par le chlorure de didcyl-dimthyl-ammonium des souches
sauvages et de collection en fonction des conditions de croissance (TSA : ; TSB :
). 85
Figure III-8 : Concentration Minimale Bactricide de lammonium quaternaire en fonction de
laffinit des cellules bactriennes pour le dcane (). 88
Figure III-9 : Courbes de destruction par la PHMB des souches sauvages et de collection en fonction
des conditions de croissance (TSA : ; TSB : ). 89
Figure III-10 : Relation entre les CMB dtermines pour la PHMB et le caractre hydrophobe de
surface des cellules microbiennes (Affinit lhexadcane). 92
Figure III-11 : Caractristiques nergtiques (mJ/m) de lacier inoxydable A316 ( ) et du PTFE ( ).
96
Figure III-12 : Comportement bioadhsif des souches cultives sur TSA ou en TSB la surface de
supports dacier inoxydable ou de PTFE. 97
Figure III-13 : Relation entre le nombre de cellules adhrentes dnombres et le nombre de micro-
organismes adhrents observs sur les chantillons dacier () et de PTFE (). 101
Figure III-14 : Courbes de destruction de P. aeruginosa A22 ( et ) et 222P (z et {) adhrentes
lacier aprs croissance sur TSA (symboles pleins) et en TSB (symboles creux). 103
Figure III-15 : Courbes de destruction de S. aureus 53154 ( et ) et 221P ( et ) adhrentes
lacier aprs croissance sur TSA (symboles pleins) et en TSB (symboles creux). 105
Figure III-16 : Courbes de destruction de L. monocytogenes 103575 ( et ) et 177P ( et )
adhrentes lacier aprs croissance sur TSA (symboles pleins) et en TSB (symboles
creux). 106
Figure III-17 : Observation au microscope pifluorescence (obj. x 40) de Listeria monocytogenes
10357 (A : Cellules en phase stationnaire de croissance; B : Tmoin de dsinfection ;
C : Test de dsinfection). 114
Figure III-18 : Dnombrement des cellules viables cultivables de S. aureus 53154, L. monocytogenes
103575 et P. aeruginosa A22 adhrentes lacier AISI 316 en fonction des conditions
de croissance ( : TSA, : TSB). 117
Figure III-19 : Evaluation de la viabilit des cellules de P. aeruginosa A22 et 222P adhrentes
lacier aprs contact avec 5000 ppm de chacun des dsinfectants. 118
Figure III-20 : Evaluation de la viabilit des cellules de S. aureus 53154 et 221P adhrentes lacier
aprs 5 minutes de contact avec 5000 ppm de chacun des dsinfectants. 119
Figure III-21 : Evaluation de la viabilit des cellules de L. monocytogenes 103575 et 177P adhrentes
lacier aprs 5 minutes de contact avec 5000 ppm de chacun des dsinfectants. 120

10
Figure III-22 : Caractristiques nergtiques de lacier ( S , LW, - et +) suite ladsorption
de molcules encrassantes en fonction de la qualit de leau : eau osmose (A) ou en
eau dure 20F (B). 126
Figure III-23 : Schma de ladsorption molculaire dune solution pure (a) et dune solution
complexe (b). 128
Figure III-24 : Caractristiques nergtiques de lacier (( S , LW, - et +) suite ladsorption
dagents antimicrobiens en fonction de la qualit de leau : eau osmose (A) ou eau
dure 20F (B). 129
Figure III-25 : Comportement bioadhsif ( : bactries totales ) et viabilit ( : cellules mortes) des
micro-organismes sur les supports conditionns avec les agents dsinfectants. 133
Figure III-26 : Influence du conditionnement de lacier AISI 316 par la SAB sur la sensibilit de S.
aureus 53154 la dsinfection avec la PHMB (% de cellules mortes). 134
Figure III-27 : Influence du conditionnement de lacier AISI 316 par la PHMB sur la sensibilit de S.
aureus 53154 la dsinfection avec la PHMB (% de cellules mortes). 135

11
PRESENTATION GENERALE

12
PRESENTATION GENERALE.

Lhygine des matriaux demeure une proccupation constante des industriels de lagro-
alimentaire (IAA) ainsi que des responsables du secteur hospitalier ou du personnel mdical.
En effet, la contamination microbiologique de la surface des quipements des ateliers des IAA
peut entraner une altration de laliment en contact gnrant ainsi dimportants problmes
conomiques coupls dventuels problmes de sant publique (Hood et Zottola, 1995).
Dans le domaine hospitalier, cest la contamination des dispositifs mdicaux par des bactries
pathognes (Man et al., 1998) qui peut tre lorigine dinfections nosocomiales plus ou
moins svres (Darouiche, 2001 ; Donlan et Costerton, 2002).

Actuellement et quel que soit le secteur impliqu, pour assurer un statut hyginique aux
matriaux en contact, des traitements de dsinfection sont rgulirement raliss. Outre
lutilisation de procds physiques (UV, traitement thermique), on peut, dans le cas
dappareils thermosensibles par exemple, utiliser des agents chimiques. Lefficacit de ces
agents reste toutefois variable dune application une autre. En effet, si prs de 100% des
cellules se trouvant ltat planctonique peuvent tre limines, ce rendement est moindre sur
des cellules adhrentes ou en biofilms.

Plusieurs hypothses peuvent tre avances pour expliquer cette diffrence de sensibilit
des bactries vis--vis de dsinfectants. Tout dabord, les tests utiliss pour valuer lactivit
antimicrobienne des agents dsinfectants restent aujourdhui bases sur lutilisation de
cellules microbiennes en suspension ou dposes et sches, conditions en fait trs loigns
de celles gnralement rencontres in vivo i.e. cellules adhrentes ayant ou non intgr une
matrice microbienne et synthtis des polymres exocellulaires. Cette variation de rponse
aux biocides peut galement tre lie des modifications physico-chimiques de la surface des
cellules microbiennes (Briandet, 1999), modifications pouvant tre dues un changement
dans leur physiologie (production de composs extra-cellulaires, morphologie, expression
gntique) ou encore leur histoire i.e. conditions de conservation et de mise en culture
(Briandet, 1999). Par ailleurs, les souches de collection recommandes dans les normes de
dsinfection ne prsentent gnralement pas de tolrance particulire aux dsinfectants et ne
refltent donc pas les problmes de rsistance retrouvs sur le terrain.

13
 Dans ce contexte et afin damliorer lefficacit de ses produits et/ou optimiser les
procdures dhygine qui y sont associes, il est apparu ncessaire de mettre en place des
mthodes tests permettant dvaluer rapidement et in situ lactivit dsinfectante de produits
commercialiss ou non, dans des conditions proches de la ralit, et notamment sur des
cellules adhrentes non dshydrates. A cette fin, quatre grandes tapes ont t dfinies :

I. Identification de souches cibles en fonction du secteur dactivit considr et

dfinition de conditions de conservation et de croissance des micro-organismes les mieux
adaptes au problme pos,

II. Mise au point dun protocole de dsinfection des surfaces contamines afin dvaluer la
concentration efficace en agent antimicrobien. Cette tape a ncessit dans une premire
phase la standardisation des essais dadhsion en conditions statiques sur supports
conditionns ou non, puis la dfinition des tests de dsinfection sur cellules fixes .

III. Mise en place dune technique rapide pour valuer in situ la viabilit cellulaire aprs :
- Mise au point du protocole de coloration, et
- Application la dsinfection sur cellules adhrentes.

IV. Influence de la qualit de leau et de la prsence dun film primaire sur la viabilit
cellulaire et sur la rponse la dsinfection.

Les rsultats obtenus chacune de ces tapes sont prsents dans la troisime partie du
prsent mmoire, la premire partie tant consacre une tude bibliographique sur la
sensibilit bactrienne vis vis des dsinfectants et la seconde la description des matriels et
mthodes utiliss. Lensemble de ce travail sinscrit dans le cadre dune convention CIFRE
impliquant les Laboratoires ANIOS (Lille-Hellemmes) et lUnit de recherche en
Bioadhsion et Hygine des Matriaux (INRA-Massy).

14
PARTIE I : ETUDE BIBLIOGRAPHIQUE

15
LA DESINFECTION

I. DEFINITION

La dsinfection est une opration au rsultat momentan, permettant dliminer ou de

tuer les micro-organismes et/ou dinactiver les virus indsirables ports par des milieux
inertes, en fonction des objectifs fixs (Anonyme, 1998). Les traitements de dsinfection
visent donc assurer lhygine des matriaux afin de limiter voir empcher tout risque de
contamination microbienne.

Cette destruction des germes indsirables ports par des matriaux inertes peut se faire soit
par des procds physiques (chaleur, ultra-sons, irradiation) ou chimiques (dsinfectants) soit
par une combinaison des deux (Russell, 1991). On peut nanmoins noter que pour des
appareils thermosensibles tels que les endoscopes dans le secteur mdical ou encore certaines
lignes de production en industrie alimentaire, seuls des traitements chimiques peuvent tre
appliqus, justifiant la place prpondrante des agents antimicrobiens dans nombre
doprations de strilisation ou de pr-dsinfection de supports inertes.

II. MODES DACTION DES DESINFECTANTS

II.1. NOTION DE DESINFECTANT ET DANTISEPTIQUE

Sous le terme dagent antibactrien sont regroupes diffrentes molcules dorigine

biologique, hmisynthtique ou de synthse. Leur utilisation pour la thrapie des infections
bactriennes (antibiotiques) ou encore pour la dsinfection des matriels et milieux inertes
(antiseptiques et dsinfectants) est directement relie leur toxicit plus ou moins slective.

Les antibiotiques sont, sensu stricto, des agents antimicrobiens dorigine biologique. Ils ont
une activit ltale slectivement dirige contre les micro-organismes, ce qui en fait des
mdicaments des infections systmiques (Block, 1977). A loppos, les antiseptiques et les
dsinfectants sont des agents antimicrobiens chimiques dont la toxicit est brutale et peu
slective vis vis des cellules eucaryotes et procaryotes. Leur emploi est donc limit soit un
usage externe in vivo (antiseptiques) soit une dsinfection des surfaces inertes

16
(dsinfectants) (Duval J., 1989). Nous nous intresserons plus particulirement au groupe des
molcules dsinfectantes.

II.2. CHOIX DE LAGENT ANTIMICROBIEN

Pour assurer une bonne dsinfection, le principe actif doit rpondre aux exigences
suivantes :
- large spectre dactivit et action durable,
- efficacit en prsence de rsidus de souillure,
- utilisation possible dans des conditions trs diffrentes de pH et de duret de leau,
- action non corrosive sur les supports,
- actif faible concentration,
- facilement rinable,
- ne prsenter aucun danger, aux concentrations dutilisation, pour le mtabolisme
humain,
- tre peu coteux.
Aucun produit dsinfectant ne runissant ce jour lensemble de ces proprits, le choix
du principe actif seffectue sur des critres lgislatifs puis en fonction du spectre dactivit
recherch et des critres spcifiques dutilisation (compatibilit avec les matriaux)
(Beerens, 1985).

II.2.1. Rglementation

Pour les surfaces en contact avec des aliments, lutilisation des agents antimicrobiens dans
les industries agro-alimentaires implique une inscription pralable sur une liste positive.
Larrt du 15 juin 1993 (Barbusiaux et al., 1993) modifiant et compltant larrt du 27
octobre 1975 relatif aux produits de nettoyage du matriel pouvant se trouver au contact des
denres alimentaires, prcise la liste exacte des molcules pouvant tre utilises pour des
oprations de dsinfection, ainsi que les molcules entrant dans la catgorie des agents de
surface cationiques.
Concernant le domaine hospitalier, les produits antimicrobiens utiliss pour la
dcontamination du matriel mdical sont galement inscrits sur une liste positive aprs
proposition et accord crit du fabricant. Les critres dinclusion dans cette liste sont bass sur
les normes franaises et europennes en vigueur i.e. Normes AFNOR Antiseptiques et
Dsinfectants srie NF T 72 et NF EN. Depuis 1999, ne sont pris en compte que les

17
produits dont la concentration dusage annonce par le fabricant est suprieure ou gale la
concentration active pour la norme la plus dfavorable (Socit Franaise dHygine
Hospitalire, 2003).

II.2.2. Activit bactricide

Dune manire gnrale, lactivit dun dsinfectant peut tre dfinie in vitro par deux
valeurs : la Concentration Minimale Inhibitrice (CMI), plus faible concentration du produit
inhibant totalement en 18 ou 24 heures la multiplication des micro-organismes, et la
Concentration Minimale Ltale (CML), plus faible concentration du produit capable de
dtruire un certain nombre de cellules microbiennes dans un temps dtermin (Joly, 1995). La
CML est dfinie pour chaque micro-organisme. Ainsi, selon lAFNOR, la bactricidie ou
Concentration Minimale Bactricide (CMB) est la plus faible concentration du compos
engendrant 5 rductions dcimales dune population initiale de 108ufc/mL en 5 minutes
20C. La dtermination de la CMB rpond des protocoles standardiss dcrits par la norme
T72-150 (Anonyme, 1987) ou plus rcemment par la norme NF-EN 1040 (Anonyme, 1997).
Cette mesure permet donc de connatre le spectre dactivit des dsinfectants afin de pouvoir
les slectionner en fonction de lusage souhait et du micro-organisme liminer.

II.2.3. Dtermination de lactivit antibactrienne des dsinfectants

Pour vrifier que les dsinfectants atteignent leur objectif, il est ncessaire de dterminer si
les bactries sont tues ou liminer sous leur action. Ainsi, le pouvoir bactricide dun agent
antimicrobien est gnralement valu partir dessais raliss in vitro. La ralisation de ces
tests de dsinfection est complexe car plusieurs paramtres doivent tre dfinis : choix des
germes, prparation des suspensions bactriennes, limination ou neutralisation du
dsinfectant. Diffrentes mthodes ont ainsi t dveloppes et certaines dentre elles sont
aujourdhui standardises. Nous avons choisi de ne prsenter que celles susceptibles de nous
intresser pour la suite de ltude.

II.2.3.1. Sur cellules planctoniques

Deux des normes les plus largement utilises pour dterminer lactivit bactricide dun
produit en labsence ou en prsence de substances interfrentes (albumine bovine et extrait de
levure, Ca2+, Mg2+) sont les normes NF EN 1040 et NF EN 1276. Les essais de dsinfection,
effectus sur 4 (activit bactricide spectre 4) ou 5 espces bactriennes diffrentes (activit

18
bactricide spectre 5), sont raliss selon la mthode dite de dilution-neutralisation. Aprs 5
min. 5s de contact 20C, lactivit bactricide du produit est stoppe par dilution de la
suspension bactrienne dans un neutralisant adapt pendant 5min. Le dnombrement des
cellules viables cultivables est alors ralis par ensemencement en glose nutritive.

II.2.3.2. Sur cellules fixes

A ce jour, aucune norme na t dveloppe pour tester lactivit bactricide dagents

antimicrobiens sur des cellules adhrentes ou en biofilms. La seule norme actuellement
disponible est la norme AFNOR NF EN 72-190, dite mthode des porte-germes
(Anonyme 1998). Elle permet de dterminer lactivit de dsinfectants, utiliss ltat liquide
et miscibles leau, sur des bactries fixes artificiellement (schage 45C pendant 30min.)
sur des supports non poreux de nature varie (verre de montre, acier, matires plastiques).
Aprs un temps de contact donn avec 0,2 mL de dsinfectant, les portes-germes sont
transfrs avec le produit dsinfectant dans 100 mL de liquide de rcupration, agits, gratts
et si besoin, soumis aux ultra-sons. Laction du dsinfectant est ensuite stoppe par une srie
de dilutions et de filtrations successives. Les micro-organismes viables et cultivables sont
alors dnombrs aprs ensemencement en glose nutritive.

Bien que lvaluation du taux de destruction des micro-organismes adhrents soit possible,
certaines bactries sessiles peuvent tre limines par les lavages successifs des supports
contamins. Il est noter que la dshydratation que subissent les cellules microbiennes peut
entraner lapparition dun stress hydrique induisant de potentielles erreurs
dinterprtation des rsultats. De plus, cette technique nest pas applicable pour ltude de
lactivit bactricide des dsinfectants sur des cellules simplement adhrentes (quelques
heures dadhsion) ou en biofilms.

II.3. MECANISME DACTION GENERAL

Quelle que soit lentit microbienne considre et la molcule dsinfectante utilise, on sait
aujourdhui que laction des biocides peut se caractriser par les trois phases suivantes (Pieto
et Bardoneschi, 1988 ; McDonnell et Russell, 1999) :
i) adsorption du dsinfectant la surface de lenveloppe microbienne, phnomne de
nature physico-chimique dpendant notamment de la concentration et du mouvement
brownien des bactries.

19
ii) pntration de lagent antimicrobien dans la cellule. La solubilit, lionisation et
lencombrement strique des molcules antibactriennes sont des facteurs cl de cette
phase.
iii) action proprement dite du principe actif. Elle peut avoir lieu au niveau de diffrentes
cibles cellulaires possibles (Figure I-1), telle que la membrane cytoplasmique dont
laltration de structure provoque une dsorganisation du mtabolisme, une fuite de
substances, et la dgnrescence de la cellule et finalement sa mort ; ou encore le
cytoplasme et plus prcisment les protines cytoplasmiques, les acides nucliques ou
les ribosomes (Hugo, 1992).

20
 Figure I-1 : Sites daction des molcules antiseptiques et dsinfectantes selon les micro-organismes (daprs
Crmieux et Freney, 1995).

Ainsi, pour tre actif, lagent antibactrien doit pouvoir sadsorber sur lenveloppe
microbienne et la traverser. Ces phnomnes sont donc fortement dpendants dune part de la
composition de la paroi bactrienne et dautre part de la structure de la molcule dsinfectante
(Joly, 1995).

21
III. CLASSIFICATION DES PRINCIPES ACTIFS ANTIMICROBIENS

Comme indiqu prcdemment, ces agents antimicrobiens peuvent tre classs en deux
groupes i.e. les produits potentiellement ltaux et ceux, non ltaux, mais inhibiteurs de
croissance (Crmieux et Freney, 1995).

Le premier groupe se divise lui-mme en deux catgories :

- Les composs chimiquement trs ractifs tels que leau oxygne, les halogns, les
acides et bases fortes, les aldhydes, se caractrisant par une action brutale, rapide, temporaire
et souvent non spcifique.

Des composs chimiquement stables action plus spcifique. Ce groupe comprend entre
autres les ammoniums quaternaires, les drivs phnoliques, la chlorhexidine et ses drivs.

Les produits non ltaux mais seulement inhibiteurs de croissance comprennent

essentiellement les mtaux (mercuriels, drivs du cuivre, du zinc, de largent) et les
colorants.

Compte tenu des finalits dapplication choisies dans ce travail, nous nous intresserons plus
particulirement au premier groupe de produits.

III.1. PRODUITS A ACTION LETALE NON SPECIFIQUE

III.1.1. Oxydants

Les agents oxydants les plus utiliss sont lozone (O3), le peroxyde dhydrogne (H2O2) et
lacide peractique (CH3-CO-O-OH). Leur mode daction est bas sur la libration doxygne
entranant loxydation des systmes enzymatiques. Ainsi, les agents oxydants tel que lacide
peractique, agissent sur les lipides, les liaisons sulfures, les acides nucliques et les
systmes enzymatiques (Bartoli et Dusseau, 1995). Ils entranent une dsorganisation de la
membrane cellulaire (Maris, 1995).

Ces composs oxydant ont lavantage de prsenter un large spectre dactivit, une absence de
rsidus finaux, un faible pouvoir corrosif aux concentrations dusage et ils sont facilement
liminables par rinage. Ils sont cependant toxiques aux fortes concentrations et instables
pendant leur stockage.

22
 III.1.2. Halognes et drivs

Lun des composs les plus couramment utiliss comme dsinfectant en milieu industriel,
hospitalier, domestique ainsi que dans les collectivits est lhypochlorite de sodium. Il
possde une puissante activit dsodorisante ainsi quun large spectre dactivit sur les micro-
organismes (Trueman, 1971). Son activit bactricide est lie la libration de lacide
hypochloreux (HOCl) lors de sa dissociation dans leau. Cet agent antimicrobien pntre
facilement travers les parois et les membranes de cellules microbiennes. Il agit par un
mcanisme rapide doxydation gnrale entranant la dnaturation des protines (Maris,
1995). En consquence, larrt des ractions du mtabolisme conduit la mort cellulaire
(Trueman, 1971).

Lun des principaux inconvnients des solutions dhypochlorite de sodium est leur rapide
dgradation sous laction de la chaleur et de la lumire.

III.1.3. Acides et bases

Lefficacit de ces composs est lie aux concentrations en ions H+ et OH-. Les ions H+
agissent sur les liaisons aminoacides des acides nucliques, modifiant le pH cytoplasmique et
prcipitant les protines. Les ions OH-, en saponifiant les lipides membranaires, entranent la
destruction de ces structures (Maris, 1995).

III.1.4. Alcools

Lthanol, lisopropanol et le n-propanol sont les alcools les plus couramment utiliss,
particulirement en Europe. Leur activit antimicrobienne est rapide et large spectre incluant
notamment les formes vgtatives des bactries (dont les mycobactries), les virus et les
moisissures. Bien quils puissent inhiber leur sporulation et leur germination, ils ne sont pas
ltaux pour les spores bactriennes (McDonnell et Russell, 1999). Ils sont gnralement plus
actifs sur les bactries Gram ngatif que sur celles Gram positif (Crmieux et Freney,
1995).

Leur mcanisme daction est encore mal connu mais leur efficacit bactricide est
favorise en prsence deau (Hamilton, 1971). Ces agents antimicrobiens perturbent le
mtabolisme bactrien en induisant des lsions au niveau de la membrane et par dnaturation
des protines. Leur activit est optimale pour une concentration en alcool comprise entre 60 et

23
90%. Ils sont souvent utiliser en synergie avec dautres dsinfectants, et en particulier avec la
chlorhexidine.

III.1.5. Aldhydes

Le glutaraldhyde est laldhyde le plus couramment employ, en milieu hospitalier pour

des oprations de dsinfection basse temprature pour la strilisation des endoscopes et du
matriel chirurgical (McDonnell et Russell, 1999). Cette molcule antimicrobienne est active
sur les formes vgtatives et sporules des bactries ainsi que sur les virus. Cest un puissant
agent rducteur qui ragit de manire irrversible avec les groupements amins (R-NH2) des
protines cellulaires. Ainsi, en se liant, entre autres, ces groupements prsents la surface de
lenveloppe bactrienne, cet agent antibactrien inhibe les systmes enzymatiques et de
transport transmembranaire entranant ainsi la mort cellulaire ; il dnature galement les
acides nucliques par alkylation. Son activit est optimale pH alcalin (McDonnell et
Russell, 1999). Il est noter que la prsence de matires organiques diminue son efficacit
bactricide.

Les aldhydes ont lavantage de prsenter un large spectre dactivit et dtre peu corrosifs ;
leur point faibles rsident dans leur forte toxicit, leur action lente et leur difficult
dlimination par rinage.

III.2. PRODUITS A ACTION LETALE SPECIFIQUE

III.2.1. Ammoniums quaternaires

La structure chimique gnrale des sels dammonium quaternaire est prsente sur la figure
I-2. Les hydrognes sont substitus par des groupements alkyls (R), lanion (X-) est
gnralement un atome de chlore ou de brome.

Figure I-2 : Structure chimique des ammoniums quaternaires.

24
 Les ammoniums quaternaires sont des composs bipolaires comportant un ple
hydrophobe et un ple hydrophile charg positivement permettant la molcule de sadsorber
aux surfaces inertes. Ce caractre amphiphile donne ce type de molcules des proprits
dtersives en plus de son activit bactricide (Reverdy, 1995a). Ils sont gnralement plus
efficaces sur les bactries Gram positif que sur les bactries Gram ngatif ; ils nont pas
daction sur les mycobactries ni sur les formes sporules des bactries et sont fongicides
hauteur de 0,1% (v/v).

De part leurs proprits physico-chimiques, ces molcules peuvent sadsorber de manire

irrversible aux phospholipides et aux protines de lenveloppe bactrienne ; cette adsorption
entrane alors des changements de permabilit puis des lsions de la membrane
cytoplasmique conduisant une fuite des constituants cytoplasmiques (notamment les ions
potassium). leur balance hydrophile-lipophile dtermine par la longueur de la chane alkyle
est un facteur cl de leur efficacit. Ainsi, lactivit est maximale pour les molcules en C14
et minimale pour celles qui contiennent 8 et 18 atomes de carbones (Tableau I-1).

Nombre de carbone CMB CMB CMB

S. aureus S. typhosa P. aeruginosa
8 300 4500 6000

12 45 40 120
14 15 12 40

16 30 25 200

18 450 60 1000

Tableau I-1 : Concentrations minimales bactricides (CMB) en ppm, selon la longueur de la chane carbone
(Reverdy, 1995a).

Lefficacit bactricide des ammoniums quaternaires est galement dpendante du pH, leur
maximum dactivit se situe pH neutre et sont inactives aux pH 3,5.
Ils sont gnralement employs comme dtergents / dsinfectants dans les industries agro-
alimentaires. Il est noter que dans les laiteries, seul le chlorure de didcyl
dimthylammonium est autoris (Barbusiaux et al., 1993). Dans les hpitaux, ils sont souvent
utiliss en solution alcoolique. Ils peuvent galement tre employs comme conservateurs
dans les produits cosmtiques. (Reverdy, 1995a).

25
Leur faible toxicit, leur stabilit et leur caractre non corrosif en font des dsinfectants de
choix. Cependant, leur efficacit bactricide est attnue par la prsence de matires
organiques et par leau dure (Merianos, 1991).

III.2.2. Biguanides

Cette famille est compose entre autres de la chlorhexidine et des polyhexamthylnes

biguanides (PHMB), polymres forms de groupes biguanides lis par des chanes
hexamthylne. Ce sont des substances cationiques.
La chlorhexidine (ou 1,6 dichlorophnyl diguanohexane) (Figure I-3) est probablement lun
des biocides les plus utiliss dans les produits antiseptiques.

Figure I-3 : Formule chimique de la chlorhexidine.

La chlorhexidine en solution aqueuse est active sur la majorit des formes vgtatives des
bactries Gram positif et ngatif (Hugo et Russell, 1992), mais na pas dactivit
antimicrobienne sur les mycobactries ni sur les spores. Lorsque la concentration est faible
(20 50 mg/L), il y a altration de la membrane cytoplasmique par dsorganisation de la
bicouche lipidique provoquant la fuite des constituants cytoplasmiques de faible poids
molculaire donnant ainsi la cellule laspect de fantme . A forte concentration
(suprieure 100 mg/L), il y a prcipitation et coagulation du cytoplasme (Maris, 1995). Afin
datteindre sa cible i.e. le cytoplasme, elle traverse la membrane externe ou la paroi
bactrienne par diffusion passive (McDonnell et Russell, 1999). Son efficacit bactricide,
dpendante du pH, est optimale entre pH 5,5 et 7. Il est noter que le calcium et le
magnsium ainsi que les matires organiques diminuent son action ltale.

Les sels de poly(hexamthylne-biguanide) (PHMB) (Figure I-4), quant eux, sont utiliss
dans les industries alimentaires ainsi que pour la dsinfection des piscines. Les solutions
commerciales sont des mlanges htrodisperses de PHMB dont le poids molculaire moyen
est de 3 kDa (McDonnell et Russell, 1999).

26
 Figure I-4 : Formule chimique du chlorure de poly(hexamthylne-biguanide).

Comme la chlorhexidine, la PHMB est active sur les bactries Gram positif et Gram
ngatif et nest pas sporicide. La PHMB a pour cible les membranes bactriennes
(cytoplasmique et externe). En formant des domaines avec les phospholipides acides de la
membrane bactrienne (Figure I-5), cet agent antimicrobien entrane une modification de la
permabilit membranaire ainsi quune altration de certaines enzymes qui y sont associes.

Ainsi, McDonnell et Russell (1999) ont dcompos laction de la PHMB sur E. coli en
plusieurs tapes :

i) rapide attraction de la PHMB aux surfaces bactriennes charges ngativement et

adsorption spcifique aux composs contenant des phosphates,

ii) dstabilisation de lintgrit membranaire ; la PHMB est alors attire vers la

membrane interne,

iii) liaison de la PHMB aux phospholipides membranaires, couple une

augmentation de la permabilit membranaire (fuite des ions K+),

iv) et enfin, perte des fonctions membranaires et prcipitation des constituants

intracellulaires entranant la mort cellulaire.

27
 Figure I-5 : Schma des interactions entre la poly(hexamthylne-biguanide) et la membrane cytoplasmique
(daprs Broxton et al., 1984).

III.2.3. Drivs Phnoliques

Ces antimicrobiens sont actifs sur les bactries Gram positif et Gram ngatif mais nont
pas dactivit ltale sur les spores. Ils agissent sur la membrane cellulaire et inactivent les
enzymes cytoplasmiques par formation de complexes instables. Aux faibles concentrations,
les constituants cellulaires sont librs dans le milieu extrieur; aux fortes concentrations, il y

28
a dnaturation des protines et lyse de la membrane cellulaire (Maris, 1995). Leur efficacit
est dpendante du pH et de la prsence de matires organiques (Freney, 1995).

Ainsi, selon la molcule considre, lactivit bactricide peut affecter diffrents

constituants cellulaires. De plus, et comme mentionn prcdemment, lefficacit des
diffrentes molcules dsinfectantes peut varier en fonction des micro-organismes i.e. en
fonction de la structure et de la composition cellulaire ainsi quen fonction de la physiologie
des cellules microbiennes.

Produit Utilisation Mode daction Cibles

Lipides, liaisons sulfures,

Oxydants Dsinfection Oxydation acides nucliques et systmes
enzymatiques

Antisepsie
Halognes et drives Oxydation gnrale Protines
Dsinfection

Prcipitation des protines par Liaisons aminoacides des

Acides Dsinfection
modification du pH. acides nucliques,

Saponification des lipides

Bases Dsinfection Membranes cellulaires
membranaires

Antisepsie
Alcools Dnaturation des protines Protines
Dsinfection

Aldhydes Dsinfection Agent rducteur Protines, ARN et ADN

Dsinfection Permabilisation de la
Ammoniums quaternaires Phospholipides membranaires
Antisepsie membrane cytoplasmique

Antisepsie Modification de la
Biguanides Membranes bactriennes
Dsinfection permabilit membranaire

Formation de complexes Membrane cellulaire et

Drivs phnoliques Antisepsie
instables enzymes cytoplasmiques

Tableau I-2: Synthse du mcanisme de laction antibactrienne dantiseptiques et de dsinfectants.

29
IV. SENSIBILITE BACTERIENNE AUX AGENTS ANTIMICROBIENS : NOTION DE

RESISTANCE ET DE TOLERANCE

IV.1. DEFINITION

Daprs Joly (1995), une population microbienne est dite rsistante un antiseptique ou
un dsinfectant lorsque la Concentration Minimale Bactricide (CMB) de ce produit vis vis
de la population considre est significativement plus leve que les CMB de ce produit vis
vis de la plupart des populations microbiennes.

Deux types de rsistance aux antimicrobiens peuvent alors tre distingues : la rsistance
intrinsque et la rsistance acquise.

IV.2. RESISTANCE INTRINSEQUE

La rsistance intrinsque ou naturelle est une caractristique inne et stable des cellules
appartenant une espce microbienne ou un groupe despces vis vis dun antimicrobien.
Etant stable, elle permet de dfinir le spectre dactivit dun biocide i.e. ensemble de micro-
organismes naturellement sensibles ou rsistants un antimicrobien ou groupe
dantimicrobiens donn.

Comme mentionn prcdemment, la structure et la composition de la surface des micro-

organismes jouent un rle important dans leur rsistance naturelle.

IV.2.1. La paroi des bactries Gram positif

Si lon considre la paroi des bactries Gram positif, reprsente Figure I-6, on peut noter
quelle est principalement constitue de la murine (ou peptidoglycane), elle-mme forme de
chanes polysaccharidiques linaires dont lunit de base est une alternance rgulire de deux
sucres amins, la N-actyl glucosamine (NAG) et lacide N-actylmuramique (NAM) lis
un peptide (Hancock, 1991). Ce peptidoglycane assure la rigidit de la cellule et reprsente 30
50% du poids sec de la paroi cellulaire. A cette murine, sont associs, en quantit moindre,
dautres polymres disperss, en particulier des acides teichoques, tichuroniques et
lipotichoques et des protines de surface (Neidhardt et al., 1994).

30
 Flagelle

Pili

Capsule
(Variable)

Membrane externe

Murine
Priplasme

Membrane cytoplasmique

Gram positif Gram ngatif

Figure I-6 : Reprsentation schmatique des enveloppes des bactries Gram positif et Gram ngatif (daprs
Neidhardt et al., 1994).

IV.2.2. La paroi des bactries Gram ngatif

La paroi des bactries Gram ngatif (Figure I-6), gnralement plus mince, est, quant
elle, constitue du peptidoglycane, recouvert dune membrane externe dans laquelle peuvent
sinsrer des protines, des lipoprotines et des lipopolysaccharides (LPS) (Hancock, 1991 ;
Neidhardt et al., 1994). La partie polysaccharidique des LPS, extrmement hydrophile, est
oriente vers lextrieur des cellules. Il est noter que certaines bactries Gram ngatif
peuvent savrer tre trs hydrophobes, caractre reli la prsence de protines de surface.

Par consquent, les diffrences de composition de lenveloppe bactrienne entre bactries

Gram positif et Gram ngatif mais galement au sein dune mme espce bactrienne
entranent une sensibilit variable des micro-organismes aux agents dsinfectants. Ainsi,
lenveloppe des bactries Gram positif ne possde pas de rcepteurs spcifiques ou de
permases facilitant la pntration des biocides dans les cellules (Russell, 1991). Concernant
les bactries Gram ngatif, la membrane externe de la paroi peut jouer un rle de barrire
vis vis des agents chimiques (Joly, 1995). Il est noter que chez les bactries Gram
ngatif, les petites molcules antimicrobiennes hydrophiles pourront pntrer dans les cellules
par la voie hydrophile via les porines (Hancock, 1998) alors que les composs lipophiles tels
que les ammoniums quaternaires emprunteront la voie hydrophobe (diffusion travers la
membrane par les lipides et le lipopolysaccharide) (Joly, 1995).

31
 La cible de la plupart des antiseptiques et des dsinfectants tant la membrane
cytoplasmique, la rsistance intrinsque peut donc tre corrle avec son degr de protection.
Ainsi, la prsence dune enveloppe externe (bactrie Gram ngatif), dune couche de cires
(mycobactries) ou de tuniques sporales augmentera gnralement la rsistance des cellules
microbiennes aux dsinfectants (Joly, 1995 ; Reverdy, 1995b).

Il est noter que la rsistance naturelle des bactries aux biocides peut galement tre due la
prsence de systmes enzymatiques tels que la catalase ou la super oxyde dismutase chez E.
coli permettant de dtruire lagent oxydant avant que la dgradation bactrienne nait eu lieu
ou participant aux mcanismes de rparation cellulaire. Dautres systmes enzymatiques i.e.
pompes defflux, permettent le rejet des agents dsinfectants hors de la cellule (Russel,
1997).

IV.3. RESISTANCE ACQUISE

La rsistance acquise est due un vnement imprvisible qui, au sein dune espce, a
pour consquence lapparition dune ou plusieurs souches ayant une rsistance plus leve
un antimicrobien (Joly, 1995). Une slection de cette souche est ainsi possible quand les
concentrations dutilisation habituelles du produit sont infrieures la concentration active.
Ce phnomne tant connu, il est donc surveill.

Cette rsistance est le rsultat de modifications gntiques soit sur le noyau de la cellule
(rsistance acquise chromosomique) soit apportes par un plasmide (rsistance acquise
plasmidique). Ces mutations gntiques peuvent alors se traduire par des volutions
biochimiques du micro-organisme dterminant ainsi lintensit et la spcificit de la
rsistance.

IV.3.1. Rsistance acquise chromosomique

Il sagit dune mutation stable et hrditaire dun gne du chromosome et le produit du

gne mut est ainsi lui-mme modifi. Gnralement, la rsistance est acquise lorsque la
mutation concerne un ou plusieurs gnes structuraux de la cellule, codant soit pour un lment
cible de lantimicrobien, soit pour un lment de fixation ou de pntration du dsinfectant.
Ainsi, le mcanisme biochimique de base de la rsistance chromosomique bactrienne peut

32
tre li une modification de la membrane cellulaire empchant ainsi la fixation et la
pntration du produit (Joly, 1995).

De nombreuses tudes (Reverdy, 1995a, Jones et al., 1989 ; Thomas et al., 2000 ; Lundn
et al., 2003) ont montr que la croissance dune souche sensible avec des concentrations
subltales dun dsinfectant pouvait entraner lacquisition dune rsistance cet
antimicrobien. Cette diminution de sensibilit saccompagne gnralement dune volution de
lenveloppe bactrienne et plus particulirement de la composition lipidique membranaire des
bactries Gram ngatif (Mchin et al., 1999 ; Langsrund et al., 2003 ; Tabata et al., 2003) et
des bactries Gram positif (To et al., 2002).

Ces variations de composition de la paroi cellulaire (teneur en acides gras, lipides,

protines) peuvent ainsi engendrer une volution des proprits physico-chimiques de surface
des micro-organismes i.e. hydrophobie, charge de surface (Loughlin et al., 2002) entranant
donc une modification des interactions entre cellules microbiennes et agents antimicrobiens
(Sakagami et al., 1989).

Cependant, cette rsistance peut tre rversible (Jones et al., 1989). Il sagit alors dun
phnomne adaptatif gouvern par des gnes chromosomiques.

IV.3.2. Rsistance acquise plasmidique (ou extrachromosomique)

Les micro-organismes ayant acquis une rsistance extrachromosomique hbergent des

plasmides R (facteurs de rsistance) vhiculant des gnes dont le produit confre la rsistance
un ou plusieurs antimicrobiens. Ce phnomne, frquent et vari, a t largement tudi
dans le cas des antibiotiques. Des plasmides induisant une augmentation de rsistance
certains agents dsinfectants (ammonium quaternaire, chlorhexidine, bromure dthydium et
acridines) ont galement pu tre mis en vidence chez des souches responsables dinfections
nosocomiales (Russell, 1997).

Ainsi, chez des souches de S. aureus rsistantes la mticilline (MRSA), les gnes qac A,
qac B, qac C et qac D ports par un plasmide pSK ont t mis en vidence. Ils codent pour la
rsistance aux ammoniums quaternaires ainsi que pour la chlorhexidine (McDonnell et
Russell, 1999). Le produit de ces gnes est une protine provoquant lefflux de lagent
antimicrobien. Par leur capacit de transfert entre bactries, cette rsistance peut tre tendue
dautres micro-organismes ; cependant, la prsence de ce plasmide na t constat que chez
les staphylocoques (Russell, 1997).

33
 Dautres mcanismes biochimiques de rsistance bactrienne tels que linactivation de
lagent antimicrobien (cas des sels de mercure) et laltration de la surface cellulaire
(modification de la synthse des protines de la membrane externe des bactries Gram
ngatif) (Russell, 1997), peuvent galement tre lis ces plasmides (Tableau I-3).

Agents chimiques Mcanismes de rsistance

Sels de Chlorhexidine Efflux augment
Ammoniums Quaternaires Efflux augment
Inactivation par la formaldhyde dshydrognase
Formaldhyde
Modifications de surface des cellules microbiennes
Drivs de largent Diminution de la pntration
Sels dacridine Efflux augment
Bromure dthidium Efflux augment
Sels de mercure Inactivation
Tableau I-3 : Mcanismes possibles de rsistance plasmidique (McDonnell et Russell, 1999).

V. RESISTANCE LIEE A LETAT ADHERANT ET/ OU EN BIOFILM

Dans la plupart des environnements, les bactries existent le plus souvent au sein de
biofilms. Les communauts bactriennes ainsi formes peuvent tre considres comme des
refuges vis vis des phnomnes de comptition, de prdation et des conditions
environnementales dfavorables (Korber et al., 1995). Ce mode fix confre donc aux micro-
organismes des avantages particuliers tels quun apport plus important de molcules nutritives
venues sadsorber sur les surfaces, une modification de lactivit mtabolique, la cration
dune micro-zone favorisant les changes, et comme voqu prcdemment un effet
protecteur des exopolysaccharides muqueux produits aprs ladhsion (Ashter et al. , 1990 ;
Bellon-Fontaine et al., 1991).

V.1. MCANISME GNRAL DE LADHSION

Comme schmatis sur la figure I-7, la formation dun biofilm mature sur une surface
seffectue gnralement selon les quatre tapes successives suivantes (Busscher, 1995) :

34
 1 - transport des cellules vers le support solide par sdimentation (due aux forces de
gravit), mouvement Brownien (mouvement perptuel alatoire), turbulence du liquide de
suspension ou encore motilit des micro-organismes (cas des bactries cilies ou flagelles)
(Korber et al., 1995).

2 - adhsion initiale, par interactions physico-chimiques entre micro-organismes et

support rcepteur (Busscher et Weerkamp, 1987 ; van Loosdrecht et al., 1990 ; An et
Friedman, 1997).

3 - consolidation de ladhsion par lintermdiaire dinteractions molculaires plus

spcifiques entre le micro-organisme et le support (An et Friedman, 1995). Les structures
polymriques permettant ces interactions molculaires sont la capsule, le slime, le glycocalyx,
les exopolymres, les fimbriae ou pili.

4 - colonisation de la surface. Cette colonisation rsulte de la multiplication des

micro-organismes. La croissance et la division des micro-organismes sont possibles
principalement grce aux nutriments i.e. protines adsorbes linterface solide-liquide (van
Loosdrecht et al., 1990). Les bactries adhrant la surface scrtent des polymres
extracellulaires (EPS) ou glycocalyxe qui emprisonnent les bactries et les nutriments dans
une matrice (Brading et al., 1995). Cette couche muqueuse et les bactries forment ainsi un
biofilm (Korber et al., 1995).

T ransport

Armel Salan

A dhsion initiale A dhsion

C onsolidation C olonisation

Figure I-7 : Etapes de la formation de biofilms microbiens (adapt de Bellon-Fontaine et Briandet, 2000).

Ladhsion est donc ltape cl de la contamination des matriaux. Comme mentionn

prcdemment, la bioadhsion est le rsultat dinteractions physico-chimiques non covalentes
entre les macromolcules prsentes la surface des cellules microbiennes et le support

35
rcepteur. Ces interactions non covalentes comprennent les interactions lectrostatiques (EL),
van der Waals (LW), Lewis acide-base (lectron-donneur/lectron-accepteur) (AB) ainsi que
les interactions lies au mouvements brownien (BR) (van Oss et al., 1988).

V.2. INTERACTIONS PHYSICO-CHIMIQUES NON COVALENTES

V.2.1. Interactions lectrostatiques

Immerge dans un fluide, une particule, une bactrie ou une surface plane, acquiert une
charge de surface provoque par ladsorption ionique ou lionisation des groupements chargs
prsents en surface (James, 1991). On observe alors une accumulation de contre-ions dans la
zone entourant la particule, accumulation qui se traduit par la formation dune double couche
lectrique (Figure II-2.).

Figure I-8 : Structure de la double couche ionique (daprs Hiemez, 1997).

La premire couche ou couche de Stern (approximativement de lpaisseur dun ion) est
constitue dions fortement adsorbs sur la surface. Dans cette rgion, le potentiel () est
inversement proportionnel la distance de sparation avec la surface (Figure II-3). La
seconde couche, dite couche diffuse, stend jusqu la phase liquide. Dans cette zone, lexcs
de contre-ions diminue progressivement lorsquon sloigne de la surface charge, jusqu
retrouver lquilibre ionique de la phase aqueuse. Dans cette couche, le potentiel () dcrot
exponentiellement avec la distance (Figure II-3).

36
 Figure I-9 : Reprsentation schmatique de la variation de potentiel en fonction de la distance de la particule
charge (daprs Adamson, 1990).

Les interactions lectrostatiques intervenant entre la surface dun micro-organisme et la

surface rceptrice sont dues au recouvrement de la double couche ionique associ aux
groupements chargs prsents la surface des deux corps (Rutter, 1980). Cette interaction est
rpulsive pour deux corps portant des charges de surface de mme signe et attractive dans le
cas contraire.

Lnergie libre due aux interactions lectrostatiques (GEL) entre une sphre de rayon R et
une surface plane, peut tre obtenue par la relation suivante (Visser, 1976) :

GEL= R 02 ln [1+exp(-l)] [2]

o l est la distance mesure partir du bord extrieur de la sphre ; 0, le potentiel de

surface ; , la constante dilectrique du milieu liquide et 1/ la longueur de Debye.

Le potentiel 0 (ou potentiel de surface de la particule) nest pas directement mesurable,

mais on peut le dterminer via la mesure du potentiel zta () (potentiel lectrocintique la
surface de friction de la couche limite par des mthodes lectrocintiques i.e. lectrophorse
par la relation :

( )
0 = 1+ z exp (z)
a
[3]

avec :

1 kT
4 e
= [4]
i
v i2 n i

37
1/ correspond la longueur de Debye (paisseur de la couche ionique diffuse)
et z : distance entre la surface de la particule et la surface de friction,
a : le rayon de la particule,
: la constante dilectrique du milieu liquide,
vi : la valence de chaque espce ionique,
ni : le nombre dions de chaque espce par cm3 de liquide,
e : la charge de llectron,
k : la constante de Boltzmann,
T : la temprature absolue (K).

GEL tant fonction de la grandeur 1/, cette nergie dinteraction diminue

progressivement avec une augmentation de la force ionique du liquide de suspension, jusqu
devenir ngligeable dans les liquides de force ionique leve.

De plus, en considrant lexpression [2], il est noter que GEL diminue

exponentiellement avec la distance de sparation (l) entre les deux corps.

V.2.2. Interactions non-lectrostatiques

V.2.2.1. Interactions de Lifshitz - van der Waals (LW)

Leffet cumulatif de ces diffrentes interactions est group sous le terme dinteractions
Lifshitz van der Waals dans le cas dun systme macroscopique (Lifshitz, 1955).

Lnergie dinteraction lie aux forces de van der Waals entre deux corps 1 et 2, plongs
dans le vide, est dfinie par lquation de Dupr (1869) :

G12LW =12LW 1LW 2LW [5]

La tension interfaciale lie aux forces de van der Waals entre ces deux corps, est donne
quant elle par la relation (Good, 1960) :

(
12LW = 1LW 2LW )2
[6]

soit
12LW = 1LW + 2LW 2 1LW 2LW [7]

La combinaison des quations [5] et [7], permet dobtenir lnergie dinteraction due aux
forces de van der Waals :

G12LW =2 1LW 2LW [8]

38
 Ainsi, quelles que soient les valeurs de 1LW et LW
2 (composantes van der Waals de la

tension de surface des corps 1 et 2), G 12

LW
est ngative, indiquant une attraction entre les
deux corps.

Dans le phnomne dadhsion de cellules microbiennes, trois corps sont gnralement en

prsence ; il faut alors dterminer lnergie dinteraction entre le micro-organisme (1) et le
support (2) immergs dans un liquide (3). Dans ce cas, lquation de Dupr peut alors
scrire :
LW = LW LW LW
G132 12 13 23 [9]

En dveloppant les valeurs de tensions interfaciales laide de lquation [7], on obtient :

LW = LW + LW 2 LW LW LW LW +2 LW LW LW LW +2 LW LW
G132 1 2 1 2 1 3 1 3 2 3 2 3 [10]

soit :
G132
LW = 2 (
3LW 1LW )( LW
2 3LW ) [11]

Dans ce cas, G 132

LW
est positif (interaction rpulsive) pour 1LW < 3LW < LW
2 ou

1LW > 3LW > LW

2 et ngatif dans les autres cas (interaction attractive). Dans le cas de deux
corps immergs dans un liquide, il peut donc exister, sous certaines conditions, des
interactions rpulsives lies aux forces de van der Waals.

V.2.2.2. Interactions Lewis acide-base (AB)

Lnergie dinteraction lie aux forces acido-basiques de Lewis G12AB entre deux corps 1
et 2 plongs dans le vide peut galement tre dcrite par lquation de Dupr :

G12AB=12AB1AB 2AB [12]

van Oss et al. (1988) expriment la tension de surface lie aux interactions Lewis acide-base
dun corps i par la relation :

AB =2 + [13]

et la tension superficielle lie aux interactions Lewis acide-base entre deux corps 1 et 2 par
la relation :

(
12AB =2 1+ 2+ )(
1 2 ) [14]

39
o + reprsente le paramtre accepteur dlectrons et le paramtre donneur dlectrons

de la tension superficielle des corps 1 et 2.

En combinant les quations [12], [13] et [14], on obtient :

(
G12AB =2 1+ 2 + 1 2+ ) [15]

G12AB est toujours ngatif, traduisant ainsi une attraction entre les deux corps plongs dans le
vide.

Lexpression de lnergie dinteraction entre deux corps 1 et 2 immergs dans un liquide 3

(cas de ladhsion microbienne) peut tre dfinie par :

AB = AB AB AB
G132 12 13 23 [16]

En introduisant les valeurs dveloppes des tensions de surface lie aux forces Lewis
acide-base laide de lquation [14], on obtient :

( (
AB =2 +
G132 3 ) ( )
1 + 2 3 + 3 1+ + 2+ 3+ 1+ 2 1 2+ ) [17]

Il est important de souligner quen fonction des valeurs + et - des trois corps en prsence,
G132
AB
peut prendre des valeurs ngatives (attraction) ou positives (rpulsion).

V.2.2.3. Interactions lies au mouvement Brownien(BR)

Chaque molcule ou particule, immerge dans un milieu liquide, est dote dune nergie
libre brownienne (BR) de 3/2 kT (van Oss, 1996), k tant la constante de Boltzmann et T la
temprature absolue en degrs K. A condition que lnergie dattraction entre les molcules
ou particules immerges dans le liquide soit infrieure 3/2 kT, lnergie libre brownienne
maintient les molcules en solution ou en suspension.

Toutes les entits immerges dans un liquide tant dotes dune nergie BR de 3/2 kT,
cette contribution joue le plus grand rle pour les particules de faible surface de contact. En
effet, de par leur taille, elles sont moins susceptibles dinteragir avec les autres molcules par
le biais dinteractions LW, AB ou EL.

V.3. EVALUATION DE LADHESION DES MICRO-ORGANISMES AUX SURFACES

Ladhsion des micro-organismes aux surfaces est ralise par mise en contact dune
surface rceptrice avec une suspension microbienne titre. Aprs un temps de contact dfini,

40
le support solide est rinc afin dliminer les cellules microbiennes simplement dposes .
Les micro-organismes adhrents sont alors dnombrs.

V.3.1. Dnombrement des cellules viables cultivables

Pour dnombrer les cellules viables adhrentes, il faut les dcrocher du support solide soit
par traitement aux ultra-sons soit en grattant les surfaces. Les micro-organismes ainsi
rcuprs sont alors ensemencs en glose nutritive et incubs, gnralement leur
temprature optimale de croissance. Cette technique ne permet cependant de dterminer que
les formes viables et cultivables (Heidelberg, 1997). De plus, il est noter que la remise en
suspension des cellules dcroches implique une dilution et augmente ainsi le seuil de
sensibilit de cette mthodologie. Dautres techniques doivent donc tre mises en uvre afin
de complter ltude du comportement bioadhsif des micro-organismes aux surfaces.

V.3.2. Observation in situ

Lobservation microscopique des surfaces contamines permet de dterminer la flore

adhrente totale (micro-organismes viables - cultivables, viables non cultivables et mortes)
ainsi que sa rpartition sur les matriaux. Il est noter que lutilisation du microscope
transmission nest possible que pour des matriaux transparents tels que le verre ou le
polystyrne. De nombreux matriaux tant opaques, dautres outils microscopiques doivent
alors tre employs. La microscopie pifluorescence est donc trs largement utilise en
microbiologie.

V.3.2.1. Flore totale

De nombreux colorants sont disponibles pour lnumration de la flore totale. Parmi ceux-
ci, lorang dacridine et le DAPI (4,6-diamidino-2-phenylindole dihydrochloride) (Figure II-
10), sont les plus couramment employs.

41
 DAPI Orang dacridine

Figure I-10 : Formule chimique du DAPI (4,6-diamidino-2-phenylindole dihydrochloride) et de lorang

dacridine.

Le DAPI se lie spcifiquement lADN alors que lorang dacridine peut se fixer
lADN et aux ARN cellulaires (Mc Feters et al., 1995).

Il est noter que des techniques de marquage des cellules par des anticorps fluorescents
permettent galement de distinguer certaines espces bactriennes au sein de populations
plurimicrobiennes (Shapiro, 2000).

V.3.2.2. Diffrenciation entre cellules viables et cellules mortes

Afin de diffrencier les micro-organismes vivants et les micro-organismes morts, de

nombreux marqueurs de viabilit sont actuellement proposs (Langsrud et Sundheim, 1996 ;
Bunthof et al., 1999 ; Mortimer et al., 2000). Ces marqueurs de viabilit peuvent tre classs
en deux catgories (King, 2000) :

- indicateurs dune activit mtabolique : ces molcules en interagissant avec les

systmes enzymatiques cellulaires permettent la dtection du fluorochrome dans les
micro-organismes. Cest le cas notamment pour le chlorure de 5-cyano-2,3-ditolyl
ttrazolium (CTC) ou de la Rhodamine 123 (Lisle et al., 1999 ; Suller et Lloyd, 1999).

- indicateurs dintgrit membranaire tel que liodure de propidium ou encore le

bromure dthydium (Figure II-11). Ces marqueurs ne pntrent que dans les micro-
organismes dont la membrane est lse (King, 2000).

42
 (a) (b)

Figure I-11 : Formule chimique du iodure de propidium (a) et du bromure dthydium (b).

Compte-tenu de la diversit des molcules fluorescentes et des longueurs donde

dexcitation et dmission qui leur sont associes (Tableau II-4), le choix des filtres
permettant la slection de ces longueurs donde restent une des tapes cl de ladaptation des
microscopes pifluorescence chaque fluorochrome (Figure II-12).

Fluorochrome Excitation Emission Couleur mise

DAPI 358 461 Bleue

500 526 Verte (liaison lADN)

Orang dacridine
460 650 Orange (liaison aux ARN)

Iodure de propidium 535 617 Rouge

Bromure dthydium 518 605 Rouge

Tableau I-4 : Longueur donde, , dexcitation et dmission (nm) de quelques fluorochromes frquemment
utiliss (http://www.probes.com/handbook).

Oculaire

Filtre darrt
Lumire dexcitation
Source lumineuse Miroir
dichromatique Lumire fluorescente
Filtre
dexcitation

Objectif

Prparation

Figure I-12 : Reprsentation schmatique de la fluorescence avec excitation par lumire rflchie.

43
 Le filtre dexcitation permet de slectionner parmi les diverses longueurs donde de la
source lumineuse uniquement celle qui sert lexcitation de la fluorescence.

Le miroir dichroque rflchit le rayon dexcitation de courte longueur donde vers la

prparation, mais se laisse traverser par la fluorescence de longueur donde plus grande.

Le filtre darrt permet de stopper la lumire dexcitation, que la prparation rflchit et

renvoie vers lobjectif. Il est cependant parfaitement adapt aux rayons fluorescents
spcifiques de la prparation.

V.4. FACTEURS SUSCEPTIBLES DE MODIFIER LADHESION BACTERIENNE

Comme nous lavons prcdemment dcrit, la bioadhsion est dpendante de lnergie

dinteraction entre les corps en prsence i.e. micro-organismes, substrat rcepteur et fluide
environnant. Ainsi, tous les paramtres susceptibles de modifier ces interactions peuvent
potentiellement influencer ladhsion microbienne sur un support solide en milieu aqueux.

V.4.1. Caractristiques des cellules bactriennes

Larchitecture et la nature des groupements chimiques prsents la surface des cellules

microbiennes sont lorigine de leurs proprits physico-chimiques de surface (charge de
surface, caractre Lewis acide-base et van der Waals) (van der Mei et al., 1988 ; Hancock,
1991 ; Reid et al., 1999).

La charge de surface des bactries, gnralement lie aux groupements ioniss

(phosphates, carboxyliques, sulfates, amines) des macromolcules prsentes la surface des
bactries (Rijnaarts et al., 1995) dpend de leur environnement aqueux (Mafu et al., 1990). A
quelques exceptions prs (Jucker et al., 1996), les bactries sont gnralement charges
ngativement au pH physiologique.

Il est noter que la synthse de la plupart des constituants de la paroi cellulaire est
spcifique chaque souche et quelle peut voluer en fonction de ltat physiologique des
cellules (temprature de croissance, stade de croissance), en modifiant ainsi leurs proprits
physico-chimiques de surface et donc leur comportement bioadhsif (Mc Eldowney et
Fletcher, 1986b). Ainsi, les travaux de Garry (1997) et de Peng et al. (2001) ont mis en
vidence une adhsion diffrente des formes sporules de Bacillus comparativement aux
formes vgtatives.

44
 De plus, il semblerait que la capacit dadhsion des micro-organismes aux surfaces soit
dpendante de leur capacit synthtiser des polymres extracellulaires (Mafu et al., 1990 ;
Sasahara et Zottola, 1993). Cette caractristique est dautant plus importante que les cellules
sont soumises un flux hydrodynamique (Sasahara et Zottola, 1993 ; Vacheethasane et al.,
1998).
Enfin, la synthse dappendices exocellulaires (flagelles dans le cas de L. monocytogenes
et P. aeruginosa) peut faciliter le dplacement des micro-organismes favorisant ainsi le
contact avec les surfaces rceptrices. Vatanyoopaisarn et al. (2000) ont ainsi mis en vidence
une diminution dun facteur 10 du niveau dadhsion lacier inoxydable pour un mutant
flagelline (-) comparativement la souche sauvage L. monocytogenes NCTC 7973 cultive
22C.

V.4.2. Caractristiques des supports solides

Les micro-organismes parmi lesquels L. monocytogenes, peuvent adhrer une grande

varit de matriaux (Blackman et Franck, 1996) mais, en fonction des caractristiques de
surface de supports inertes, ce comportement bioadhsif peut varier. Ainsi, en tudiant la
bioadhsion dune espce marine de Pseudomonas diffrentes surfaces solides, Fletcher et
Loeb (1979) ont pu classer les supports inertes en trois groupes en fonction de leur
hydrophobicit de surface :

- le premier groupe comprend des polymres non-polaires.

- le second groupe est celui des polymres ayant des groupements polaires.
- le troisime groupe comprend les matriaux hydrophiles inorganiques.

Leurs rsultats montraient une relation inversement proportionnelle entre ladhsion

bactrienne et la mouillabilit des supports. Il est noter que pour des supports
hydrophiles chargs ngativement, ladhsion tait ngligeable et inversement pour ceux
chargs positivement. Leurs travaux mettaient ainsi en vidence limportance de la charge
lectrique des supports hydrophiles et limpact des interactions hydrophobes des polymres
sur l'adhsion bactrienne. De mme, Bellon-Fontaine et al. (1990) ont montr que ladhsion
de S. thermophilus variait en fonction du polymre synthtique utilis, et quelle tait relie
aux caractristiques physico-chimiques de surface des diffrents supports.

Il est noter quun traitement plasma (John et al., 1996) ou encore une simple procdure
de nettoyage (Boulang-Petermann, 1993), en modifiant les proprits physico-chimiques de

45
surface des matriaux inertes (hydrophobie, caractristiques Lewis acide-base ou encore
charge de surface), peuvent modifier ladhsion bactrienne.

V.4.3. Caractristiques des fluides environnants

Comme dcrit prcdemment, la force ionique du fluide environnant influence le

comportement adhsif des cellules bactriennes aux surfaces inertes (van Loosdrecht, 1989).
Ainsi, une concentration importante dlectrolytes ou la prsence de contre-ions polyvalents
induira une diminution des interactions lectrostatiques et donc ladhsion bactrienne sera
modifie (Piette et Idziak, 1992).

Outre la concentration, la nature des ions prsents dans le liquide de suspension peut
modifier ladhsion bactrienne. En effet, Mc Eldowney et Fletcher (1986) ont montr que la
nature et la valence des lectrolytes prsents dans le milieu de culture influenaient plus ou
moins fortement ladhsion de Pseudomonas fluorescens et Enterobacter cloacae la surface
de supports hydrophobes et hydrophiles.

Il est noter que le pH de la solution environnante peut galement avoir des rpercussions
directes sur ladhsion bactrienne en modifiant, entre autres les caractristiques lectriques
des diffrents corps en prsence. Fletcher (1988) a ainsi constat une augmentation de
ladhsion de Pseudomonas fluorescens au verre en milieu acide. Selon cet auteur,
labaissement du pH, en rduisant la dissociation des groupements anioniques, diminuerait les
rpulsions lectrostatiques existant entre les bactries et le support.

V.4.4. Prsence de matires interfrentes

Dans lenvironnement naturel des cellules microbiennes, des matires interfrentes tels que
des protines, des rsidus de produits de nettoyage, vont pouvoir sadsorber aux interfaces
solide/liquide et ainsi influencer le comportement bioadhsif des micro-organismes en
modifiant les proprits physico-chimiques de surface des supports solides (van Oss, 1996).
Les interactions responsables de la bioadhsion ne se feront alors plus entre les micro-
organismes et le support solide mais entre les bactries et les molcules adsorbes.

Ainsi, Al-Makhlafi et al. (1994) ont observ que ladsorption de -lactoglobuline sur des
surfaces de silice augmentait ladhsion de L. monocytogenes. En revanche, ladsorption de
srum albumine bovine (Allion, 2000 ; Chevallier, 2002 ; Rubio, 2002) ou de protines
dorigine laitire (Bower et al., 1998 ; Barnes, 1999) en modifiant les caractristiques

46
physico-chimiques de surface des matriaux (caractre hydrophile, Lewis acide/base) peut
diminuer ladhsion des micro-organismes aux surfaces rceptrices.

De plus, il est noter que ces matires interfrentes, prsentes dans le fluide environnant,
peuvent sadsorber la surface des cellules bactriennes et, en changeant leurs proprits de
surface, influencer leur comportement bioadhsif (Fletcher, 1976). Ainsi, la srum albumine
bovine, adsorbe la surface de Lactococcus lactis, entrane une diminution de lhydrophilie
de surface de cette souche et par consquent une rduction de son niveau dadhsion au verre.
(Allion, 2000).

Enfin, la synthse et lexcrtion de molcules tensioactives (biosurfactants) par certaines

espces bactriennes, en modifiant les caractristiques physico-chimiques des interfaces vont
galement pouvoir modifier ladhsion bactrienne (Meylheuc, 2000).

Compte tenu dun environnement diffrent comparativement ltat planctonique, cet tat
adhrant pourra alors entraner une volution du comportement physiologique des bactries et
notamment une augmentation de leur rsistance aux agents dsinfectants.

V.5. ADHESION ET RESISTANCE AUX AGENTS ANTIMICROBIENS

Diffrentes tudes (Best et al., 1990 ; Baillie et Douglas, 1998 ; Joseph et al., 2001 ; Aaron
et al., 2002 ; Campanac et al., 2002) ont montr que les micro-organismes adhrents ou en
biofilm pouvaient tre 10 1000 fois plus rsistants aux agents antimicrobiens que leurs
homologues planctoniques. La rsistance des biofilms aux agents antimicrobiens est
multifactorielle. Elle dpend notamment de la prsence et de la composition du glycocalyx, de
ltat physiologique des bactries ou encore de leur localisation des cellules au sein du
biofilm, facteurs dcrits ci-aprs.

V.5.1. Prsence du glycocalyx

Les biofilms bactriens sont caractriss par une proche juxtaposition des cellules entre
elles et gnralement par la prsence dune matrice exopolysaccharidique. Ce glycocalyx peut
avoir un rle protecteur en limitant laccs des antimicrobiens aux micro-organismes ou en
consommant les agents dsinfectants avant quils natteignent les cellules microbiennes
(De Beer et al., 1994). Ainsi, Samrakandi et al. (1997) ont observ que lefficacit bactricide

47
du chlore variait en fonction du contenu extracellulaire en polysaccharides de biofilms de E.
coli.

Cette efficacit moindre peut sexpliquer par une diffusion limite des dsinfectants au sein
des biofilms. En effet, Guiot et al. (2002) ont pu, par spectroscopie corrlation de
fluorescence, mettre en vidence une diffusion diffrente de particules de latex (de taille et de
charge de surface variables) dans des biofilms synthtisant peu (Lactococcus lactis) ou au
contraire beaucoup (Stenotrophonas maltophilia) dexopolysaccharides.

Anderl et al. (2000) ont quant eux tudi la diffusion de lampicilline et de la

ciprofloxacine au sein de biofilms de K. pneumoniae. Ils ont pu observer que lampicilline ne
pouvait pas diffuser dans les biofilms quand les cellules synthtisaient lenzyme de
dgradation de cet antibiotique (une -lactamase). En revanche, il est noter que mme si la
diffusion ntait pas gne pour le mutant dficient en -lactamase, ou pour la ciprofloxacine
quelle que soit la souche, ces agents antibactriens ntaient pas capables de tuer toutes les
cellules du biofilm. Ces rsultats suggrent donc que des mcanismes autres quune diffusion
limite puissent tre impliqus dans la rsistance des micro-organismes biofilms aux
agents antimicrobiens.

V.5.2. Etat physiologique des cellules adhrentes

Diffrentes tudes ont mis en vidence que ladhsion des micro-organismes aux surfaces
pouvait saccompagner dimportantes modifications phnotypiques des cellules microbiennes.
Ainsi, les travaux de Williams et al. (1999) et de Luppens et al. (2002) ont mis en vidence
une augmentation du temps de gnration des cellules de S. aureus suite leur adhsion ainsi
quune diminution de leur taille. Des tudes ont montr que cet tat fix entranait une
modulation de lexpression des gnes bactriens (Stanley et al., 2003) et par consquent une
variation de la synthse de nombreux constituants cellulaires. Ainsi, des protines de surface,
des exopolysaccharides (Davies et al., 1993, Lee et al., 1993 ; Takeo et al., 1994) peuvent
tre surexprims chez des cellules adhrentes. En revanche les cellules fixes synthtiseraient
peu ou pas certains appendices cellulaires tels que les flagelles, ncessaires leur mobilit
(McCarter et al., 1988). Laugmentation de rsistance la dsinfection des cellules adhrentes
comparativement aux cellules planctoniques peut alors tre lie une modification des
interactions entre les micro-organismes et les agents dsinfectants suite cette volution
phnotypique.

48
 V.5.3. Localisation au sein du biofilm

Les conditions environnementales la surface et au sein des biofilms sont diffrentes de

celles de la phase aqueuse. Ces diffrences concernent le pH, les concentrations en ions,
losmolarit, la viscosit, la disponibilit des nutriments et les changes gazeux (Prigent-
Combaret et Lejeune, 1999). En effet, loxygnation et la disponibilit en nutriments ne sont
pas quivalentes en tous points des biofilms bactriens. Ainsi, Xu et al. (1998) ont montr que
lactivit physiologique des cellules concidait avec le gradient doxygne tabli au sein dun
biofilm de P. aeruginosa. De mme, la disponibilit en nutriments, variant au sein des micro-
colonies, conduit galement une htrognit spatiale de lactivit mtabolique des
bactries (Huang et al.,1998). Les micro-organismes synthtisent donc leurs constituants
cellulaires en fonction de leur localisation au sein des biofilms et donc de leur temps de
gnration (Choo-Smith et al., 2001).

Si la sensibilit certains agents antibactriens est affecte par ce taux de croissance

cellulaire, les micro-organismes situs au centre des biofilms, ayant une croissance ralentie
comparativement aux cellules en priphrie pourront tre moins sensibles ces agents
bactricide (Walters III et al., 2003).

Ces variations phnotypiques ont galement pu tre mises en vidence diffrentes phases
du dveloppement des biofilms (Sauer et al., 2002). Ces multiples phnotypes bactriens au
sein des biofilms, en modifiant les interactions possibles avec les agents dsinfectants
pourront donc entraner une diminution de la sensibilit bactrienne.

Traitement antimicrobien Fraction rsistante Biofilm mature

Survie microbienne Croissance du biofilm

Figure I-13 : Schmatisation de la rsistance aux biocides des variants phnotypiques au sein des biofilms
(daprs Drenkard, 2003).

49
 Comme mentionn prcdemment, lactivit bactricide des agents antimicrobiens est
dpendante de la structure du biofilm. Ainsi la multiplication des phnotypes bactriens au
sein des biofilms coupl une diminution de laccs des dsinfectants aux cellules (problme
de diffusion, surface de contact entre les molcules dsinfectantes et les cellules plus faible)
pourra augmenter la rsistance des micro-organismes aux traitements de dsinfections. Une
fraction de la population microbienne pourra ainsi survivre et se multiplier entranant par
consquent des contaminations chroniques des matriaux (Figures I-7).

VI. CONCLUSION

Ladhsion des micro-organismes aux surfaces, facteur non ngligeable dans la rsistance
microbienne aux dsinfectants, est comme cette dernire dpendante de lespce bactrienne
considre mais galement de lorigine de la souche et de ses conditions de croissance.
Compte tenu des diffrents facteurs dcrits prcdemment, les micro-organismes adhrents
et/ou en biofilms sont trs difficiles liminer et sont donc une source rcurrente de
contamination des aliments dans le secteur agro-alimentaire et dinfection nosocomiales dans
le domaine hospitalier.

Or, comme nous lavons mentionn, il ny a pas de protocole standardis pour valuer
lactivit bactricide des dsinfectants sur cellules adhrentes et/ ou en biofilm. De plus, les
techniques actuellement disponibles pour tester le pouvoir bactricide de produits
antimicrobiens sont longues et lourdes mettre en uvre. Ainsi, afin damliorer lefficacit
des formulations antimicrobiennes, il semble donc essentiel dtablir i) un protocole
reproductible dadhsion et de ii) mettre en place une technique rapide dvaluation de
lactivit bactricide des dsinfectants in situ, protocole applicable dans des conditions
modles mais galement en prsence de matires encrassantes simulant les situations relles
dutilisation.

50
PARTIE II : MATERIELS ET METHODES

51
I. SOUCHES BACTERIENNES
I.1. SOUCHES TESTEES

Comme indiqu dans le tableau II-1, lensemble des travaux a t ralis avec 3 espces
bactriennes pathognes pour lhomme et frquemment rencontres dans le domaine mdicale
ou dans les industries agro-alimentaires : un coque coloration de Gram positive
(Staphylococcus aureus) (Figure II-1a), un bacille coloration de Gram positive (Listeria
monocytogenes) (Figure II-1b) et un bacille coloration de Gram ngative (Pseudomonas
aeruginosa) (Figure II-1c).

(a) (b) (c)

Figure II-1 : Coloration de Gram de S. aureus (a), L. monocytogenes (b) et P. aeruginosa (c).
(http://www.pasteur.fr/infosci/biblio/phototheque.html).

Coloration de
Identification Origine de la souche
Gram
- P. aeruginosa CIP A22 Institut Pasteur
- P. aeruginosa 222P Isolat clinique

+ S. aureus CIP 53154 Institut Pasteur

Isolat clinique
+ S. aureus 221P (rsistant la mticilline)

+ L. monocytogenes CIP 103575 Institut Pasteur

+ L. monocytogenes 129P Industrie Agro-Alimentaire
+ L. monocytogenes 177P Industrie Agro-Alimentaire

Tableau II-1 : Caractristiques et origine des souches bactriennes.

Trois souches de collection ont ainsi t utilises : L. monocytogenes 103575, P.
aeruginosa A22 et S. aureus 53154 (ces deux dernires souches servent dterminer lactivit
bactricide des produits utiliss comme dsinfectants selon lassociation franaise de
normalisation).

52
 A ces trois souches de collection a t ajoute, pour complter la premire partie de ce
travail, une souche sauvage psychrotrophe isole de lindustrie alimentaire, L. monocytogenes
129P.
Enfin, les tests de dsinfection sur cellules planctoniques et adhrentes ont t tendus trois
souches sauvages isoles du secteur agro-alimentaire ou mdical comme indiqu dans le
tableau II-1.

I.2. CONDITIONS DE CONSERVATION

Pour chacune de ces souches et conformment la norme NF EN 12353 (Anonyme, 2000),

deux types de stocks de travail ont t raliss, lun conserv -80C et lautre 4C.

Le stock -80C a t ralis par mise en suspension des micro-organismes dans du TSB
(Tryptone Soja Bouillon, Biomrieux, France) avant talement sur glose TSA (Tryptone
Soja Agar, Biomrieux, France). Aprs 24h dincubation 37C, le tapis bactrien ainsi
form tait rcupr dans 10 mL de solution cryoprotectrice (extrait de buf : 3 g/L, tryptone
digestion pancratique : 5 g/L et glycrol 150 g/L). La suspension bactrienne obtenue tait
alors dilue au 1/10me avec la mme solution cryoprotectrice puis incube 30 minutes 20C.
Elle tait ensuite rpartie par aliquotes de 200 L en cryotubes avant stockage -80C,
comme indiqu sur la figure II-2.

37C 24h 20C 30 min.

Rcupration du tapis
Suspension bactrien en solution
bactrienne Etalement sur TSA cryoprotectrice Stockage 80C

Figure II-2 : Schma du protocole de conservation -80C.

Le stock 4C tait quant lui obtenu partir de cultures bactriennes stockes -80C.
Un isolement tait ralis sur glose TSA avant dtre incub 24h 37C. Aprs formation
des colonies, les gloses taient conserves 4C (Figure II-3).

53
 37C 24h

Stock 80C Etalement sur TSA Stockage 4C

Figure II-3 : Schma du protocole de conservation 4C.

I.3. CONDITIONS DE CROISSANCE

I.3.1. Croissance sur milieu solide (TSA)

Les cultures de travail taient obtenues aprs 3 repiquages successifs de 24h 37C sur
glose en pente des micro-organismes conservs -80C ou 4C.

I.3.2. Croissance en milieu liquide (TSB)

Pour les croissances en bouillon nutritif, les cellules bactriennes (100 L du stock -80C
ou une colonie du stock 4C) taient remises en suspension dans 9 mL de TSB. Aprs 24h
dincubation 37C, 1 mL de ces suspensions bactriennes tait rensemenc dans 9 mL de
TSB strile puis incub 37C pendant 8h. La culture de travail tait obtenue par
ensemencement dun millilitre du second repiquage dans 100 mL de TSB suivi dune
incubation 37C jusqu atteindre la phase stationnaire de croissance.

I.3.3. Prparation des suspensions bactriennes

Les cultures bactriennes taient rcupres et laves par une succession de trois
centrifugations (7000g, 10 min., 4C) et de remises en suspension dans le liquide appropri
la technique mise en uvre i.e. NaCl 150 mM, NaCl 1,5 mM ou eau dure 20F (Annexe I).

I.4. CARACTERISATION PHYSICO-CHIMIQUE DE LA SURFACE DES CELLULES BACTERIENNES

I.4.1. La mthode MATS (Microbial Adhesion To Solvents)

Le caractre hydrophobe/hydrophile et les proprits Lewis acide-base des cellules

bactriennes ont t dtermines par la mthode MATS (Bellon-Fontaine et al., 1996). Cette
mthode est base sur la comparaison de laffinit dune souche pour un solvant apolaire et un
solvant monopolaire. Le solvant monopolaire peut tre acide ou basique (au sens de Lewis),
mais les deux solvants doivent possder la mme nergie libre de surface lie au caractre de
Lifshitz-van der Waals (Tableau II-2). Sur cette base, deux couples de solvants ont t

54
choisis : le couple chloroforme (Sigma), solvant accepteur dlectrons/ hexadcane (Sigma) et
le couple actate dthyle (Sigma), solvant donneur dlectrons/ dcane (Sigma).

Solvants LW (mJ/m) + (mJ/m) - (mJ/m)

Chloroforme 27,2 3,8 0

Hexadcane 27,7 0 0

Actate dthyle 23,9 0 19,4

Dcane 23,9 0 0

Tableau II-2 : Composantes van der Waals (LW), accepteur dlectrons (+) et donneur dlectrons (-) de
lnergie libre de surface des solvants utiliss pour le test MATS (Bellon-Fontaine et al., 1996).

Exprimentalement, 2,4 mL de suspension bactrienne ajuste une densit optique

denviron 0,8 (soit 109 UFC/mL) 400 nm (Ao) avec une solution de NaCl 150 mM taient
vortexs avec 0,4 mL de chacun des solvants pendant 2 minutes afin dobtenir une mulsion
(Figure II-4). Aprs 15 minutes de dcantation, la densit optique de la phase aqueuse (A1)
tait mesure 400 nm.

INRA-UBHM, Thierry Meylheuc

Solvant

Suspension bactrienne

Agitation Dcantation

A0 A1
Figure II-4 : Reprsentation schmatique du test MATS permettant la mesure de laffinit de cellules
microbiennes pour diffrents solvants.

Le pourcentage daffinit des bactries aux solvants tait dduit de la relation [1].

(
Affinit (%) = 1 A1 x 100
A0
) [1]

55
 I.4.2. Dtermination de la charge de surface des bactries par micro-lectrophorse

Les proprits lectriques des micro-organismes ont t values par des mesures de
mobilit lectrophortique des bactries dans du NaCl 1,5 mM sur une gamme de pH allant de
2 9. Le pH tait ajust par ajout de KOH ou de HNO3. Les mesures taient ralises sous un
champ lectrique de 50 Volts laide dun Ztamtre laser (CAD Instrumentation, France)
coupl un microscope BX 40 (Olympus, France) et un systme danalyse dimages (Figure
II-5).

Ordinateur

CAD Instrumentation, France

Camra
Microscope Sortiedu
Sortie du
Camra
INRA-UBHM, Thierry Meylheuc

liquide
liquide
Microscope

Laser
Laser

Entre
Entre du du
liquide
liquide

Figure II-5 : Dispositif exprimental du ztamtre laser ztaphoremeter II.

Le sens du dplacement des micro-organismes permet de dterminer le signe de leur

charge globale de surface alors que leur vitesse de dplacement (V) sous laction dun champ
lectrique (E) peut tre relie la mobilit lectrophortique (ME) selon lquation:

ME = V/E [2]

o V est exprime en m/s et E en V/m.

Afin de saffranchir de la mobilit autonome des cellules de P. aeruginosa (prsence de

flagelles polaires), un traitement de 15 minutes des cellules par une solution de formaldhyde,
la concentration finale de 0,7% (v/v) tait ralis pralablement la prparation des
suspensions bactriennes comme prconis par Bouttier et al. (1997).

56
II. SUPPORTS SOLIDES
II.1. SUPPORTS TESTES

Deux types de matriaux couramment employs dans le secteur mdical et dans les
industries agro-alimentaires ont t slectionns pour cette tude : un support moyennement
hydrophile, lacier inoxydable AISI 316 (Goodfellow, Angleterre) dont la composition est
donne en annexe et un matriau hydrophobe, le PTFE ou PolyTtraFluoroEthylne encore
appel Tflon (Goodfellow, Angleterre).

II.2. PREPARATION DES ECHANTILLONS SOLIDES

Avant utilisation, les chantillons taient nettoys par immersion dans un bain de RBS 35
(Socit des Traitements Chimiques de Surface, Lille) 2% (v/v) dans de leau chaude, sous
agitation douce pendant 15 minutes. Cette tape de nettoyage tait suivie de 5 rinages de 5
minutes dans de leau chaude et de 5 rinages de 5 minutes dans de leau osmose (Infilco,
Angleterre) temprature ambiante. Enfin, les chantillons taient schs sous hotte flux
laminaire pour viter tout risque de contamination.

Pour la prparation de lacier inoxydable, une tape prliminaire de dgraissage tait

ralise avec un mlange actone / thanol 50% (v/v).

II.3. CARACTERISATION PHYSICO-CHIMIQUE DE LA SURFACE DES SUPPORTS SOLIDES

II.3.1. Energie de surface des supports solides

Les caractristiques nergtiques de surface des supports plans ont t obtenues partir de
mesures dangles de contact par la mthode de la goutte pose (Figure II-6) laide dun
goniomtre (G40, Krss, Allemagne) (Figure II-7).

Liquide

Solide

Figure II-6 : Reprsentation de langle de contact () dune goutte dpose sur une surface solide.

57
 Figure II-7 : Goniomtre G40 (Krss, Allemagne).

Les angles de contact, , taient mesurs avec trois liquides purs de caractristiques
nergtiques connues (Tableau II-3) : leau distille (Infilco), le formamide (Sigma) et le
diiodomthane (Sigma). Lnergie de surface des supports S, ainsi que leurs composantes van
der Waals LW, donneur dlectrons (ou Lewis-base) - et accepteur dlectrons (ou Lewis-
acide) + taient dtermines partir de lquation de Young - van Oss (van Oss, 1988) :

LW LW + +
1+cos = 2 + + [3]
L
S L S L S L

Liquides LW (mJ/m) + (mJ/m) - (mJ/m)

Eau distille 21,8 25,5 25,5

Diiodomthane 48,5 0 0

Formamide 39 2,3 39,6

Tableau II-3 : Composantes van der Waals (LW), accepteur dlectron (+) et donneur dlectron (-) de
lnergie libre de surface des trois liquides utiliss dans la mthode des angles de contact.

Ainsi, connaissant les nergies de surface des trois liquides utiliss, les composantes LW,
+ et - du support ont pu tre calcules grce un systme de trois quations trois
inconnues.

58
 II.3.2. Caractrisation de la surface des matriaux inertes par microscopie de force
atomique (AFM : Atomic Force Microscopy)

La surface des chantillons solides a t tudie laide dun microscope force atomique
(Picoscan SPM, Molecular Imaging) schmatis sur la Figure II-8.

Le capteur est un ressort-lame (ou cantilever), encastr une extrmit et muni dune pointe
lautre. La lecture de la dflection du ressort seffectue par la mesure de la dviation dun
faisceau lumineux, mis par une diode laser, et rflchi par lextrmit du cantilever grce
une diode photolectrique segmente. La connaissance de lclairement reu par les diffrents
cadrans, pour une gomtrie donne, donne ainsi accs aux angles de dflection et de torsion
lextrmit du cantilever et donc aux dplacements du capteur sur la surface tudie.

Figure II-8 : Reprsentation schmatique dun microscope de force atomique.

Les images en mode contact ont t ralises force constante avec des pointes en nitrure
de silicium, la force applique tait ngligeable. La pointe touche donc la surface comme
dans un dispositif palpeur ; le dplacement du capteur permet ainsi dobtenir la topographie
de la surface tudie.

III. CONDITIONNEMENT DES SUPPORTS SOLIDES

Deux types de conditionnement ont t tests au cours de cette tude :

- un conditionnement avec des souillures organiques afin de simuler les

encrassements types du secteur agro-alimentaire ou du domaine mdical,

59
 - un conditionnement avec des agents antimicrobiens pour valuer limpact des
rsidus dagents de dsinfection sur la viabilit cellulaire, situation susceptible dtre
retrouve en labsence de procdures de rinage efficaces.

III.1. LIQUIDES DE SUSPENSION

Les diffrentes molcules utilises pour le conditionnement de surface des matriaux

taient mises en solution soit en eau distille soit en eau dure titre 20F (Annexe I).

III.2. SOLUTIONS CONDITIONNANTES

III.2.1. Solutions encrassantes (Adaptes de la norme NF EN 1276, 1997)

Lencrassement des surfaces solides a t ralis avec une solution protique modle, la
Srum Albumine Bovine (SAB) et avec une souillure organique complexe (le lait entier).

III.2.1.1. Solution protique modle

La srum albumine bovine a t choisie pour simuler non seulement des encrassements des
industries agro-alimentaires mais galement du secteur mdical. En effet, avec 76%
dhomologie de squence (Carter, 1994) la srum albumine bovine (Sigma, France, fraction
V, puret : 96% minimum) nous a permis de remplacer la srum albumine humaine (SAH),
pour lapplication mdicale, dont le cot est plus important. La solution protique tait
strilise par filtration sur filtre de porosit 0,22 m (Steriflip, Millipore, France) et utilise
une concentration de 1% (p/v).

III.2.1.2. Souillure complexe

Une solution 10% (p/v) de lait entier (Rgilait, France) dans de leau distille tait
prpare et strilise 5 min. 121C. Cette solution tait ensuite dilue afin davoir une
concentration finale de 1% (v/v) de lait reconstitu.

III.2.2. Principes actifs dsinfectants

Trois agents antibactriens commercialiss ont galement t utiliss pour le

conditionnement des supports solides. Ils appartiennent des familles chimiques distinctes et
sont couramment employs dans les formulations nettoyantes et/ou dsinfectantes. Il

60
sagissait de lOxy-Anios 5 (Laboratoires ANIOS, France), du Bardac 22-50 (Lonzagroup,
Suisse) et du Vantocil IB (Avecia, Angleterre). Les principes actifs de ces antimicrobiens sont
recenss dans le Tableau II-4.

Concentration dans Concentration

Nom Commercial Principe Actif la solution dutilisation
commerciale (p/p) (ppm)

Chlorure de N, N-didcyl-N, N-
dimthylammonium (CDDMA)
Bardac 22-50 50% 250

Chlorure de poly(hexamthylne-
biguanide) (PHMB)
Vantocil IB 5% 50

Acide Peractique (APA)

Oxy-Anios 5 5% 250
CH3-CO-O-OH
Tableau II-4 : Principes actifs et concentration dutilisation des dsinfectants.

III.3. PROTOCOLE DE CONDITIONNEMENT

Les chantillons solides taient immergs 1 heure 20C dans lune des solutions
conditionnantes. Aprs ce temps de contact, les molcules non adsorbes taient limines par
5 rinages successifs leau distille ou leau dure. Les chantillons ainsi conditionns
taient alors analyss, par mesures dangles de contact ou AFM, ou utiliss pour les essais
dadhsion des micro-organismes aux surfaces.

IV. ADHESION DES MICRO-ORGANISMES AUX SUPPORTS SOLIDES

IV.1. TESTS DADHESION

Les essais dadhsion en conditions statiques ont t raliss par sdimentation des
suspensions bactriennes (ajustes environ 108UFC/mL) pendant 3 heures 20C sur les
supports solides. Aprs ce temps de contact, les bactries non adhrentes taient limines par
cinq rinages successifs avec une solution de NaCl 150 mM strile (Figure II-9).

61
 INRA-UBHM, Thierry Meylheuc
NaCl 150 mM
(25mL)
3h
Suspension
Bactrienne 20C
1 3x108 ufc/ml

X 5
Figure II-9 : Schma du protocole dadhsion des micro-organismes aux surfaces.

IV.2. DENOMBREMENT DES CELLULES ADHERENTES

IV.2.1. Flore totale

Afin de pouvoir observer la totalit des cellules adhrentes aux supports rcepteurs i.e.
mortes, viables non cultivables et viables cultivables, nous avons utilis un fluorochrome
classiquement employ pour estimer la flore totale : lorang dacridine. En effet, ce colorant
se lie la fois lADN et lARN, quelle que soit lactivit mtabolique des micro-
organismes.

Exprimentalement, les bactries adhrentes taient colores par une solution dorang
dacridine (Sigma) 0,01% (m/v) pendant 15 minutes. Aprs un rinage avec du NaCl 150
mM strile, les chantillons taient schs sous hotte flux laminaire. Les surfaces colores
taient alors observes au microscope pifluorescence DMBL Leica (objectif x10). Le
microscope tait reli une camra CCD haute performance (Cohu, Japon) et un ordinateur
pour lacquisition des images (en noir et blanc) avec le logiciel OPTIMAS (Imasys, France).
Lensemble des images collectes a t analys avec le logiciel UTHSCSA Image Tool
(USA) afin dobtenir le pourcentage de recouvrement et la rpartition des bactries sur les
surfaces. Dix champs par chantillon de 2,8 cm ont t observs.

IV.2.2. Flore viable cultivable

Les dnombrements de la flore viable cultivable taient obtenus aprs immersion des
chantillons contamins dans 5 mL de NaCl 150mM et action des ultrasons (47MHz, Branson
1510, France) pendant 3 minutes suivis dune agitation mcanique de 30s. La suspension
bactrienne tait alors ensemence en glose TSA, selon la mthode des dilutions dcimales
suivie dune incubation de 48h 37C (Figure II-10).

62
 1ml 1ml

Ultra-sons (3 min)

Dilution -2
Dilution -1
Dilution 0
Bain ultra-sons
5 mL de NaCl 1,5.10-3M

Agitation
mcanique
30s

Dcrochement des Ensemencement

cellules adhrentes
Figure II-10 : Schma du protocole de dnombrement des cellules adhrentes.

V. TESTS DE DESINFECTION SUR CELLULES PLANCTONIQUES

V.1. AGENTS ANTIMICROBIENS

Les dsinfectants utiliss taient ceux prcdemment dcrits pour le conditionnement de

surface des supports solides (cf. III.2.2) i.e. lacide peractique (APA), le chlorure de
didcyl-dimthyl-ammonium (CDDMA) et le chlorure de poly(hexamthylne-biguanide)
(PHMB). Ils taient dilus avec de leau distille strile.

V.2. TESTS SUR CELLULES PLANCTONIQUES APPLICATION DE LA NORME NF-EN 1040

V.2.1. Activit bactricide des principes actifs

Exprimentalement, 1 mL de suspension bactrienne ajuste environ 108 ufc/mL (N) tait

mlang 9 mL de solution dsinfectante. Aprs 5 min. de contact 20C, 1 mL de ce
mlange tait transfr dans 9 mL de neutralisant et mis 5 min. 20C. Les dnombrements
des micro-organismes survivants (Na) taient raliss par la technique des dilutions dcimales
et ensemencement en glose TSA suivie de 48h dincubation 37C (Figure II-11).

63
 1 mL 2 x 1 mL

INRA-UBHM, Thierry Meylheuc

Dsinfectant : 9 ml

Neutralisant : 9 ml
5min. 5min.
20C 20C
Suspension
Bactrienne
1 3x108 ufc/mL

Figure II-11 : Protocole du test de dsinfection sur cellules planctoniques (adapt de la norme AFNOR NF-EN
1040).
V.2.2. Tmoin de non - toxicit et de neutralisation

1 mL de dsinfectant (ou 1 mL deau distille strile pour tablir la non-toxicit du

neutralisant) tait ajout 9 mL de solution neutralisante. Aprs 5 min. dinactivation, 1 mL
de suspension bactrienne ajuste 103 ufc/mL (Nv) tait ajout et plac 30 min. 20C. 1
mL de cette suspension tait ensemenc en glose TSA et incub 24 48h 37C. La
croissance des micro-organismes indique ainsi leffet protecteur de la solution neutralisante
contre les agents antimicrobiens, ainsi que son innocuit envers les cellules bactriennes. Les
dnombrements devaient donc tre suprieurs ou gaux 0,05 fois Nv. La mthode a ainsi t
valide avec un neutralisant contenant 1 g/L dhistidine (Sigma), 3 g/L de lcithine duf
(Sigma), 30 g/L de saponine (Sigma), 5 g/L de thiosulfate de sodium (Merck) et 30 g/L de
Tween 80 (Prolabo, France).
Les tests de dsinfection ont t raliss sur au moins trois cultures microbiennes
indpendantes (sur TSA ou en TSB) et avec des solutions de dsinfectants prpares
extemporanment.

VI. TESTS DE DESINFECTION SUR CELLULES ADHERENTES MISE AU POINT

DUN PROTOCOLE PERMETTANT DEVALUER LACTIVITE BACTERICIDE DES

DESINFECTANTS

VI.1. ACTIVITE BACTERICIDE DES PRINCIPES ACTIFS

Lactivit bactricide des dsinfectants tait teste selon un protocole inspir de la norme
NF-EN 1040. Exprimentalement, les supports contamins taient dposs dans des botes de
Ptri ( 55mm), puis recouverts de 10 mL de solution dsinfectante ( raison dune
concentration par bote de Ptri). Aprs 5 min. 5 s de contact, le dsinfectant tait limin et

64
remplac par 10 mL de neutralisant pour une phase de neutralisation de 5 min. 5 s (Figure
II-12).

5min. 5min.
20C 20C

Dsinfection Neutralisation

Figure II-12 : Schma du protocole de dsinfection sur cellules adhrentes.

VI.2. DENOMBREMENT DES CELLULES VIABLES CULTIVABLES

Comme indiqu prcdemment, les supports contamins taient immergs dans 5mL de
NaCl 150mM puis placs dans un bain ultrasons (47MHz, Branson 1510) pendant 3
minutes. Aprs une agitation mcanique de 30s, les dnombrements des cellules taient
effectus par ensemencement en glose TSA, selon la mthode des dilutions dcimales suivie
dune incubation de 48h 37C (Figure II-10). Les rsultats taient exprims en Log10
(ufc/cm).

VI.3. TEMOIN DE TOXICITE ET DE NEUTRALISATION

Pour chaque essai de dsinfection, 3 tmoins taient raliss. Un tmoin (N0) dterminant
la concentration en cellules prsentes lors du test de dsinfection ; un tmoin (Nt) vrifiant la
non-toxicit du neutralisant sur les cellules bactriennes et un tmoin (Nn) validant
linactivation du dsinfectant par le neutralisant.
N0 : les supports contamins taient mis en contact avec 10 mL deau distille strile la
place du dsinfectant.
Nt : 10 mL de neutralisant taient dposs sur les supports et laisss en contact pendant 10
min. 5 s.

Nn : 0,5 mL de dsinfectant (de la concentration la plus leve) taient mlang 9,5 mL de

neutralisant pendant 5 min. 5 s. Les chantillons solides taient ensuite immergs dans cette
solution pendant 10 min 5s.

65
VII. MISE AU POINT DUNE TECHNIQUE RAPIDE PERMETTANT DE DETERMINER
IN SITU LACTIVITE BACTERICIDE DES DESINFECTANTS

Pour valuer rapidement et in situ lactivit dsinfectante dagents antimicrobiens sur des
cellules adhrentes, nous avons employ la microscopie pifluorescence. Pour cela, deux
fluorochromes ont t utiliss : le DAPI (4,6-diamidino-2-phnylindole) (Sigma, France) qui
se fixe spcifiquement lADN des cellules bactriennes quelle que soit leur activit
mtabolique (cellules viables et non viables) ; et le SYTOX Green (Molecular Probe,
Interchim, France) qui ne pntre que dans les cellules dont la membrane cytoplasmique est
endommage (cellules non viables) pour se fixer lADN et lARN (Roth et al., 1997)
(Figure II-13). Les longueurs donde dexcitation et dmission de ces fluorochromes sont
regroups dans le tableau II-5.

DAPI

SYTOX Green

Cellule viable Cellule non viable

Figure II-13 : Schma de la double coloration.

Maximum Maximum Couleur

Fluorochromes
dabsorption dmission

SYTOX Green 504 nm 523 nm Vert

DAPI 345 nm 455 nm Bleu

Tableau II-5 : Maximum dabsorption et dmission des fluorochromes slectionns.

VII.1. MISE AU POINT DE LA COLORATION SUR CELLULES PLANCTONIQUES

Cette technique de coloration faisant lobjet dune mise au point, le protocole sera discut
en dtails dans la partie III : Rsultats - Discussion. Ici ne seront dcrites que les principales
tapes de cette technique de coloration.

66
 VII.2. TEMOIN
4 mL de suspension bactrienne (ajuste environ 108 ufc/mL) et 1 mL de solution
colorante taient mlangs et incubs temprature ambiante et lobscurit pendant 15
minutes. Afin dliminer les colorant en excs, les cellules bactriennes taient laves par une
centrifugation (7 000 g, 10 min, 4C) et remises en suspension dans une goutte dhuile de
montage afin dviter les problmes de palissement de la fluorescence. 10L de cette
suspension taient dposs sur une lame de microscope, recouverte dune lamelle couvre-
objet et immdiatement observe au microscope pifluorescence en utilisant les couples
filtre dexcitation/filtre darrt spcifiques de chaque fluorochrome (Tableau II-6).

Bande passante du Miroir

N de Filtre Filtre darrt Fluorochrome dtect
Filtre dexcitation dichromatique

1 340-380 400 425 DAPI et SYTOX Green

2 480 / 40 505 527 / 30 SYTOX Green

Tableau II-6 : Caractristiques des filtres utiliss pour les observation au microscope pifluorescence.

VII.3. TEST DE DESINFECTION SUR CELLULES PLANCTONIQUES

Les cellules bactriennes taient mises en contact avec de leau distille ou une solution de
dsinfectant 20 ppm dacide peractique selon le protocole dcrit prcdemment (cf. V-2.1).
Afin dliminer les matires interfrentes, les suspensions bactriennes taient centrifuges
7000g pendant 10 min (4C). Le culot bactrien tait alors remis en suspension dans 4 mL
NaCl 0,15M et color selon le protocole dcrit ci-dessus (cf. VII.1.2).

VII.4. COLORATION DES CELLULES ADHERENTES

Aprs adhsion et dans certains cas dsinfection, les chantillons contamins taient
recouverts avec la solution contenant les 2 fluorochromes et laisss en contact pendant 15 min
temprature ambiante et lobscurit. Aprs limination et rinage de la solution colorante,
les chantillons taient recouverts dhuile de montage puis dune lamelle couvre - objet.

Les bactries colores taient alors observes au microscope pifluorescence DMBL Leica
(objectif x40). Le microscope tait reli une camra CCD haute performance (Cohu, Japon)
et un ordinateur pour lacquisition des images (en noir et blanc) avec le logiciel OPTIMAS

67
(Imasys, France). Un mme champ tait observ en utilisant les couples filtre
dexcitation/filtre darrt des deux fluorochromes (Tableau II-6).
Lensemble des images collectes tait analys avec le logiciel UTHSCSA Image Tool
(USA) afin dobtenir le pourcentage de recouvrement et la rpartition des bactries sur les
surfaces. Ainsi, la comparaison des 2 images obtenues pour chacun des champs analyss a
permis destimer la population bactrienne morte par rapport la population totale (Tableau
II-7). Dix champs par chantillon ont t observs.

Flore totale Cellules mortes

Avant dsinfection

Aprs dsinfection

Tableau II-7 : Observations au microscope pifluorescence (obj.x40) de la flore totale adhrente et des
cellules non viables avant et aprs dsinfection avec lacide peractique.

VIII. ANALYSE STATISTIQUE

Des analyses de variance ANOVA ainsi que des analyses en composantes principales
(ACP) des rsultats ont t ralises avec le logiciel Statgraphics Plus pour Windows
(Manugistic, Rockville, Md).

68
PARTIE III : RESULTATS DISCUSSION

69
I. CONDITIONS DE CONSERVATION ET DE CROISSANCE DES SOUCHES

BACTERIENNES

I.1. IMPACT SUR LES PROPRIETES PHYSICO-CHIMIQUES DE SURFACE DES MICRO-

ORGANISMES

Afin de choisir les conditions de conservation et de croissance les mieux adaptes au

problme pos, nous avons test deux modes de conservation couramment utiliss et un
milieu de culture prsent sous deux tats physiques diffrents i.e. solide (agar) et liquide
(bouillon).
Les souches bactriennes slectionnes taient ainsi conserves en solution cryoprotectrice
-80C et sur glose 4C pendant 0, 1 et 2 mois. Les mesures de mobilit lectrophortique,
et les caractres hydrophobe/hydrophile et accepteur/donneur dlectrons taient dtermins
aprs croissance des bactries 37C sur TSA en pente ou en TSB.
Les essais ont t raliss avec trois micro-organismes de collection couramment
prconiss dans les normes de dsinfection (Pseudomonas aeruginosa A22, Staphylococcus
aureus 53154 et Listeria monocytogenes 103575) ainsi quavec une souche sauvage isole
dun site industriel (Listeria monocytogenes 129P).

I.1.1. Mobilit lectrophortique

Les rsultats des mesures de mobilit lectrophortique obtenus pour chacune des souches
slectionnes et les diffrentes conditions de conservation et de croissance testes sont
prsents dans le Tableau III-1.
Quelles que soient lespce microbienne considre et les conditions exprimentales
utilises (stockage et croissance), les souches prsentent une lectrongativit de surface sur
la gamme de pH tudie. Une variation dans les mesures de mobilit lectrophortique entre
les diffrentes souches tudies a cependant pu tre observe. Ainsi, bien que toutes les
cellules bactriennes soient charges ngativement, cette lectrongativit de surface est
moins importante pour S. aureus 53154 dont toutes les valeurs de mobilit lectrophortique
-
sont infrieures 2 x 10 8m.V-1.s-1.

70
 CROISSANCE TSA TSB

Stock 4C -80C 4C -80C

pH pH pH pH
P. aeruginosa A22

1,0 1,0 1,0 1,0

0,0 0,0 0,0 0,0

2 3 4 5 6 7 8 9 2 3 4 5 6 7 8 9 2 3 4 5 6 7 8 9 2 3 4 5 6 7 8 9
-1

-1,0 -1,0
M.E. 10 m.V .s

-1,0 -1,0
-1

-2,0 -2,0 -2,0 -2,0

-8

-3,0 -3,0 -3,0 -3,0

-4,0 -4,0 -4,0 -4,0

-5,0 -5,0 -5,0 -5,0

pH pH pH pH
1,0 1,0 1,0 1,0
S. aureus 53154

0,0 0,0 0,0 0,0

2 3 4 5 6 7 8 9 2 3 4 5 6 7 8 9 2 3 4 5 6 7 8 9 2 3 4 5 6 7 8 9
-1
M.E. 10 m.V .s

-1,0 -1,0 -1,0 -1,0

-1

-2,0 -2,0 -2,0 -2,0

-8

-3,0 -3,0 -3,0 -3,0

-4,0 -4,0 -4,0 -4,0

-5,0 -5,0
-5,0 -5,0

pH pH pH pH
L. monocytogenes

1,0 1,0 1,0 1,0

0,0 0,0 0,0 0,0

2 3 4 5 6 7 8 9 2 3 4 5 6 7 8 9 2 3 4 5 6 7 8 9 2 3 4 5 6 7 8 9
-1
103575
M.E. 10 m.V .s

-1,0 -1,0 -1,0 -1,0

-1

-2,0 -2,0 -2,0 -2,0

-8

-3,0 -3,0 -3,0 -3,0

-4,0 -4,0 -4,0 -4,0

-5,0 -5,0 -5,0 -5,0

L. monocytogenes 129P

pH pH
pH pH
1,0 1,0
1,0 1,0

0,0 0,0
0,0 0,0
2 3 4 5 6 7 8 9 2 3 4 5 6 7 8 9
2 3 4 5 6 7 8 9 2 3 4 5 6 7 8 9
-1

-1,0 -1,0
M .E. 10 m.V .s

-1,0 -1,0
-1

-2,0 -2,0 -2,0 -2,0

-8

-3,0 -3,0 -3,0 -3,0

-4,0 -4,0 -4,0 -4,0

-5,0 -5,0 -5,0 -5,0

Tableau III-1 : Mobilit lectrophortique (M.E.) sur une gamme de pH allant de 2 9 pour chacune des souches
tudies en fonction des conditions de conservation ( 4 et 80C pendant 0, 1 et 2 mois ) et de
croissance (TSA et TSB).

Par ailleurs et en accord avec les donnes dcrites par Mafu et al. (1990) et Briandet (1999),
les deux souches de Listeria monocytogenes sont trs fortement charges ngativement, avec des
valeurs gnralement suprieures 2.10-8m.V-1.s-1 sur la gamme de pH tudie. Enfin, les
cellules de P. aeruginosa A22 prsentent une importante lectrongativit de surface

71
sur la gamme de pH allant de 6 9. On peut observer quaux pH acides, les valeurs de
mobilit lectrophortique diminuent jusqu devenir presque nulles pH 2, charge de surface
probablement due la prsence de groupements carboxyliques et phosphates des
polysaccharides constitutifs de la paroi bactrienne (Rijnaart et al., 1995).

Si cette proprit lectrique reste stable pour la souche Gram ngatif slectionne, elle
volue nanmoins pour les trois germes Gram positif. Ainsi, nous pouvons observer une
augmentation significative (P<0,05) de la charge globale de surface des souches, en fonction
de la dure de stockage et ce, pour une temprature de conservation de 4C. Cet effet est
particulirement important pour les deux L. monocytogenes (P<0,05), espce bactrienne
pouvant crotre 4C (Seeliger et Jones, 1986; Papageorgiou et Marth, 1989). En revanche,
-80C, aucun effet significatif de cette dure de stockage na pu tre mis en vidence sur les
caractristiques lectriques de surface des diffrentes bactries testes (P>0,05).

Concernant les conditions de croissance des micro-organismes, en accord avec les donnes
obtenues par Kiers et al. (2001), un impact non ngligeable de ltat physique du milieu de
culture sur les proprits lectriques des trois bactries Gram positif peut tre not. Dans nos
conditions exprimentales, la culture des micro-organismes sur TSA conduit (en comparaison
une croissance en TSB) une augmentation de llectrongativit de surface pour S. aureus
53 154 et une diminution de cette proprit pour les deux L. monocytogenes.

Comme le montrent les mesures de mobilit lectrophortique reprsentes sur les figures
III-1 et III-2, nous avons galement remarqu que la nature du milieu de croissance avait un
impact sur lhomognit des proprits lectriques de surface des cellules bactriennes.
Ainsi, quelle que soit la temprature de stockage, la mobilit lectrophortique des cellules de
S. aureus 53154 cultives en TSB est comprises entre 1 et 0,6.10-8m.V-1.s-1 avec un
maximum 0.10-8m.V-1.s-1. En revanche, et suite une croissance sur TSA, les mesures de
mobilit lectrophortique des cellules de S. aureus sont situes entre 3 et 0.10-8m.V-1.s-1,
rparties en plusieurs groupes. Ces rsultats mettent donc en vidence des populations
bactriennes ayant des charges de surface diffrentes au sein dune mme culture, signe dune
population htrogne (htrognit pouvant tre relie des tats physiologiques
diffrents).

72
 TSB TSA

% cellules

% cellules
ME (10-8.m.V-1.s-1) ME (10-8.m.V-1.s-1)
Figure III-1: Mobilit lectrophortique pH 4 de S. aureus 53154 conserve 1 mois 4C en fonction du
mode de croissance.

TSB TSA

% cellules
% cellules

ME (10-8.m.V-1.s-1) ME (10-8.m.V-1.s-1)

Figure III-2: Mobilit lectrophortique pH 4 de S. aureus 53154 conserve 1 mois -80C en fonction du
mode de croissance.
I.1.2. Test MATS

Les rsultats des tests MATS sont regroups dans les tableaux III-2 I-5 pour
respectivement S. aureus 53 154, P. aeruginosa A22, L. monocytogenes 129P et 103575.
Quels que soient le mode, le temps de stockage ainsi que le milieu de culture utilis, P.
aeruginosa A22 est apparue fortement hydrophile (faible affinit lhexadcane et au dcane)
alors que les trois bactries Gram positif affichaient une hydrophilie de surface
intermdiaire (environ 50% daffinit aux solvants apolaires). Larchitecture et la nature des
groupements chimiques prsents la surface des cellules bactriennes dterminent les
proprits physico-chimiques de surface des micro-organismes (Hancock, 1991 ; Neidhardt et
al., 1994). Ainsi, laffinit ngligeable aux solvants apolaires de P. aeruginosa A22 pourrait
tre attribue la partie hydrophile des lipopolysaccharides prsents la surface des bactries
Gram ngatif alors que le faible caractre hydrophile des bactries Gram positif pourrait
tre reli aux acides lipotichoques, macromolcules hydrophobes, ancrs dans leur paroi.

73
 Temps Temps
Milieu Stock CH HD D AE Milieu Stock CH HD D AE
(mois) (mois)

0 74 2 2 1 00 27 6 0 98 1 64 7 61 7 13 10

+4C 1 70 5 1 2 00 26 1 +4C 1 98 2 77 10 79 8 40 28

2 66 9 54 23 24 5 2 97 2 74 11 74 11 56 30
TSA TSA
0 74 4 2,6 3 22 26 8 0 96 3 59 7 67 12 8 7

-80C 1 71 12 33 22 25 6 -80C 1 97 2 69 15 77 9 35 31

2 68 3 77 65 25 4 2 98 1 76 4 74 5 51 22

0 84 5 01 00 29 12 0 94 4 47 8 60 9 2 2

+4C 1 79 3 22 01 33 1 +4C 1 98 2 66 8 75 5 4 4

2 84 4 62 21 25 1 2 96 4 61 14 62 15 10 11
TSB TSB
0 83 3 00 00 31 10 0 97 4 45 6 69 9 1 1

-80C 1 81 4 11 00 28 7 -80C 1 98 3 68 9 72 10 12 10

2 74 5 42 12 26 3 2 96 3 58 15 69 18 8 8

74
Tableau III-3 : Pourcentage daffinit aux solvants (CH : Chloroforme, HD : Tableau III-2 : Pourcentage daffinit aux solvants (CH: Chloroforme, HD :
Hexadcane, D : Dcane et A.E. : Actate dthyle) de P. aeruginosa A22 en Hexadcane, D : Dcane et A:E. : Actate dthyle) de S. aureus 53154 en fonction
fonction des conditions de conservation et de croissance. des conditions de conservation et de croissance.
 Temps Temps
Milieu Stock CH HD D AE Milieu Stock CH HD D AE
(mois) (mois)

0 80 5 50 7 53 7 36 2 0 92 2 61 4 58 3 55 2

+4C 1 90 1 56 1 55 2 33 1 +4C 1 89 3 60 4 53 5 46 11

2 89 4 54 3 59 8 28 2 2 79 7 59 7 55 7 52 4
TSA TSA
0 76 5 53 7 58 6 36 1 0 89 7 67 8 66 10 36 3

-80C 1 85 1 54 4 57 1 34 1 -80C 1 94 3 75 4 72 7 30 5

2 88 3 59 6 59 10 28 3 2 84 3 64 9 54 10 42 12

0 78 5 43 2 43 5 21 4 0 81 7 51 4 47 3 60 4

+4C 1 79 4 49 6 48 4 23 3 +4C 1 73 5 40 6 34 5 38 4

2 82 3 44 5 45 4 20 3 2 63 6 26 8 23 6 35 4
TSB TSB
0 73 6 40 2 43 3 19 3 0 82 3 54 5 49 4 49 11

-80C 1 82 4 45 7 49 3 17 2 -80C 1 76 3 47 2 40 3 32 1

2 93 1 63 7 62 11 20 5 2 78 4 46 5 42 4 35 4

75
Tableau III-5 : Pourcentage daffinit aux solvants (CH : Chloroforme, HD : Tableau III-4 : Pourcentage daffinit aux solvants (CH : Chloroforme, HD :
Hexadcane, D : Dcane et A.E. : Actate dthyle) de L. monocytogenes Hexadcane, D : Dcane et A.E. : Actate dthyle) de L. monocytogenes 129P
103575 en fonction des conditions de conservation et de croissance. en fonction des conditions de conservation et de croissance.
 Dans le cas des L. monocytogenes et de P. aeruginosa, cette hydrophilie de surface est
associe un caractre Lewis acide-base plus ou moins marqu (forte affinit au chloroforme
et lactate dthyle en comparaison avec les solvants apolaires) alors que pour S. aureus,
elle est relie une proprit essentiellement Lewis-base.

Cependant, comme la charge de surface, ces proprits ne sont pas figes et peuvent
voluer en fonction de lenvironnement physique et chimique des micro-organismes.
En accord avec les donnes de mobilit lectrophortique, aucune variation significative de
ces proprits en fonction des conditions de conservation et de croissance na pu tre mise en
vidence pour les trois souches de collection (P>0,05). En revanche une volution est
observe pour la souche sauvage. Ainsi aprs deux mois de stockage 4C, Listeria
monocytogenes 129P est plus hydrophile notamment aprs une croissance en TSB. A cette
temprature, cette espce bactrienne est en effet capable de se dvelopper (Papageorgiou et
Marth, 1989) et dadapter sa physiologie en synthtisant par exemple des protines
spcifiques dacclimatation Caps (Cold acclimatation proteins) (Bayles, 1996) ou encore
en modifiant la composition en acides gras de sa membrane (Annous et al., 1997 ; Jones et
al., 1997). Les diverses adaptations de L. monocytogenes aux tempratures proches de zro
peuvent ainsi avoir des consquences importantes sur ses proprits physico-chimiques de
surface (Briandet et al., 1999) mais galement sur son pouvoir pathogne comme lont montr
Buncic et Avery en 1996.

A linverse, la conservation -80C en solution cryoprotectrice semble, tout au moins sur

une dure de deux mois, diminuer suffisamment le mtabolisme bactrien pour limiter les
volutions phnotypiques et conserver les proprits physico-chimiques de surface des micro-
organismes, rsultats en accord avec ceux obtenus par Briandet et al. (1999).

Les rsultats du test MATS montrent galement un impact non ngligeable de ltat
physique (solide ou liquide) du milieu de culture utilis sur les proprits physico-chimiques
de surface des souches Gram positif testes. En accord avec Ljungh et al. (1985), nous
avons pu noter quune croissance en bouillon augmentait significativement (P<0,05) le
caractre hydrophile des micro-organismes (en comparaison avec les donnes obtenues aprs
culture sur glose). La composition chimique des milieux de culture tant proche, les
diffrences de proprits physico-chimiques de surface observes pourraient donc tre
attribues au seul mode de culture utilis i.e. glose ou bouillon nutritif.

76
 De plus, le caractre Lewis-base des bacilles tudis, (proprit dtermine par la
diffrence daffinit entre le chloroforme et lhexadcane), est plus important pour les cellules
cultives en TSB que pour les bactries ayant eu une croissance sur TSA.

Lensemble des donnes obtenues pour les deux modes de croissance ainsi que pour les
diffrents temps et conditions de conservation des quatre souches bactriennes tudies a t
regroup dans une analyse en composantes principales (Figure III-3). Dans cette
reprsentation, laxe 1 (reprsentant 62,8% de la variation totale des donnes) est
positivement corrl avec laffinit au chloroforme et avec llectrongativit de surface des
cellules bactriennes. Laxe 2 (24,5% de la variation des donnes) est corrl avec leur
hydrophobie de surface.

L. monocytogenes 103575 (losanges)

L. monocytogenes 129P (cercles)
3

TSA T1
TSA
S. aureus 53154 2 T0 T2
T0 T2
T1 TT
22 T1 T2
T 1 T2
T1 T2
T1 T 0
1 T0 T0
T0 T0

Hydrophobicit
T1 T1
T1 T1 T1 TSB
T2 T2 T0 T0
0 T1 T0
T0 T2
Axe 2

-7 -6 -5
T0 -4 -3 -2 -1 0 1 2T 1 3 4 5
TSB
-1
T2

-2
T2
T1
T0 TSB
T1 T0
4C - TSA T1 T 2 T 2T 2
-3 T 0 T 1
-80C- TSA T1 TSA
P.aeruginosa A22
4C - TSB -4

-80C - TSB Axe 1

Mobilit lectrophortique

Figure III-3: Analyse en composantes principales des proprits physico-chimiques de surface (affinit aux
solvants utiliss pour le test MATS et mobilit lectrophortique des micro-organismes) de chaque souche
cultive sur TSA ou en TSB T 0, T 1 et T 2 mois de stockage 4C et -80C.

Dune faon gnrale et en accord avec des tudes rcentes (Briandet, 1999 ; Meylheuc,
2000), il apparat clairement que chaque espce bactrienne prsente des proprits physico-
chimiques de surface diffrentes des deux autres espces tudies (un groupe de donnes par
77
espce bactrienne) ; une variabilit intra-espce peut galement tre observe chez Listeria
monocytogenes.

Par ailleurs, et dans les conditions exprimentales testes, nous avons pu noter que les
caractristiques de surface des souches Gram positif voluaient en fonction des conditions
de conservation (dure et protocole de stockage) et surtout du mode de culture utilis.

En effet, cultives en bouillon nutritif, les cellules bactriennes sont considres comme
tant libres (cellules planctoniques) alors que sur glose elles peuvent tre apparentes
des cellules fixes . Ainsi, limage du dveloppement des bactries en biofilm, les
colonies bactriennes se dveloppant sur glose ne bnficient pas dun apport en lments
nutritifs et en oxygne homogne en tous points. Ce mode de croissance peut donc conduire
une htrognit spatio-temporelle de lactivit mtabolique des micro-organismes (Lai et
al., 1997 ; Huang et al., 1998 ; Choo-Smith et al., 2001 ; Sauer et al., 2002) et induire ainsi
une volution de la composition de leur paroi.

78
 I.2. IMPACT SUR LACTIVITE BACTERICIDE DES DESINFECTANTS

Comme nous lavons montr dans la prcdente partie, les conditions de conservation et de
croissance peuvent modifier les proprits physico-chimiques de surface des micro-
organismes, proprits largement impliques dans de nombreux phnomnes interfaciaux tels
que lagrgation cellulaire, ladhsion bactrienne, la formation de biofilm ou encore
ladsorption molculaire.

Sachant que la premire phase du mcanisme daction dun dsinfectant est son adsorption
la surface des cellules bactriennes (Pieto et Bardoneschi, 1988 ; McDonnell et Russell,
1999), nous avons cherch, dans cette seconde partie de ltude, valuer limpact de
conditions de croissance sur la sensibilit des cellules microbiennes laction de diffrents
dsinfectants, lments cl dans un processus doptimisation de lvaluation du pouvoir
bactricide des agents antimicrobiens.

A cette fin, les tests MATS et la dtermination des Concentrations Minimales Bactricides
(CMB) ont t raliss avec les souches de collection pralablement cites, Pseudomonas
aeruginosa A22, Staphylococcus aureus 53154 et Listeria monocytogenes 103575 ainsi
quavec une souche sauvage de chacune de ces espces : P. aeruginosa 222P, S. aureus 221P
et L. monocytogenes 177P.

Les principes actifs antimicrobiens slectionns, gnralement employs dans les

formulations dsinfectantes, ont quant eux t choisis dans des familles chimiques
diffrentes i.e. un oxydant (lacide peractique), un ammonium quaternaire (le chlorure de
didcyl-dimthyl-ammonium) et un sel de biguanide (le chlorure de poly(hexamthylne-
biguanide)).

I.2.1. Test MATS

Les composantes hydrophobe/hydrophile et accepteur/donneur dlectrons au sens de

Lewis ont t dtermines pour chaque souche bactrienne cultive sur TSA et en TSB, selon
les protocoles de conservation et de croissance pralablement retenus. Comme le montrent les
rsultats de la Figure III-4 et quelles que soient les conditions de croissance utilises, nous
avons confirm la variabilit des proprits physico-chimiques de surface entre les souches
bactriennes tudies (I-1).

79
 Souches de collection Souches sauvages
P. aeruginosa A22 P. aeruginosa 222P
100 100
A ffinit au x solvan ts (%

A ffinit au x solvan ts (%
80 80

60 60

40 40

20 20

0 0
CH HD D AE CH HD D AE

S. aureus 53154 S. aureus 221P

100 100

Af fin it a u x so lva nt s (%
80 80
Affin i t a u x s o lva n ts ( %

60 60

40 40

20 20

0 0
CH HD D AE CH HD D AE

L. monocytogenes 103575 L. monocytogenes 177P

100 100
Affinit a ux so lvan ts (%

Affinit a ux so lvan ts (%

80 80

60 60

40 40

20 20

0 0
CH HD D AE CH HD D AE

Figure III-4 : Affinit des souches pour les solvants (CH : chloroforme, HD : hexadcane, D : dcane et AE :
actate dthyle) utiliss dans le test MATS en fonction des conditions de croissance ( : TSA, : TSB).

Ainsi, les deux souches de P. aeruginosa sont apparues fortement hydrophiles (affinit
lhexadcane et au dcane infrieure 5% et 20% respectivement pour la souche de collection
et la souche sauvage), hydrophilie de surface associe un caractre Lewis acide-base marqu
(forte affinit au chloroforme, >70%, et lactate dthyle, >30%, en comparaison avec les
solvants apolaires).

En accord avec les rsultats prcdemment obtenus par Al-Masaudi et al. (1988), S. aureus
53154 affiche un caractre moyennement hydrophile (environ 60% daffinit aux solvants
80
apolaires) alors quune importante hydrophilie de surface peut tre observe pour S. aureus
221P, souche rsistante la mthicilline. Il est noter que le caractre hydrophile de ces
souches peut tre reli une caractristique Lewis acide-base pour la souche sauvage et une
composante essentiellement Lewis-base pour la souche de collection. Ces diffrences de
proprits physico-chimiques de surface pourraient tre lies des modifications de protines
de surfaces impliques dans le mcanisme de rsistance la mthicilline. En effet, la
rsistance cet antibiotique est gnralement lie des mutations dune ou plusieurs
protines de liaison aux pnicillines (PLP) qui sont en fait des protines de surface.

Une variabilit a galement t observe entre les souches de Listeria monocytogenes, en

accord avec les donnes de Briandet (1999), Giovannaci et al. (2000) et Meylheuc (2000).
Ainsi, L. monocytogenes 177P cultive en TSB affiche une hydrophilie de surface plus
importante que la souche de collection (respectivement 10 et 40% daffinit aux solvants
apolaires) et inversement aprs une croissance sur TSA. Quelles que soient les conditions de
croissance testes, lhydrophilie de surface de ces deux souches peut tre relie une
composante Lewis-base, caractristique plus marque pour L. monocytogenes 103575 que
pour L. monocytogenes 177P.

Lensemble des donnes obtenues pour les deux modes de croissance des six souches
bactriennes tudies a t regroup dans une analyse en composantes principales (Figure III-
5). Dans cette reprsentation, laxe 1 (reprsentant 60,3% de la variation totale des donnes)
est positivement corrl avec laffinit des micro-organismes aux solvants apolaires (dcane
et hexadcane) et donc avec leur hydrophobie de surface. Laxe 2 (29% de la variation des
donnes) est quant lui inversement corrl avec leur caractre Lewis-acide.

81
 2

S 53154 TSB
1,5
L 177P TSB

1
S 221P TSA
S 53154 TSA
0,5 L 103575 TSB
S 221P TSB
0
-2,5 -2 -1,5 -1 -0,5 0 0,5 1 1,5 2 2,5
-0,5 L 103575 TSA
P A22 TSA

P A22 TSB -1
L 177P TSA
P 222P TSB -1,5 P 222P TSA

-2

Hydrophobie
Figure III-5 : Analyse en composantes principales des proprits physico-chimiques de surface (affinit aux
solvants utiliss pour le test MATS) des souches bactriennes en fonction des conditions de croissance ( : TSA ;
: TSB).

Ainsi, quel que soit le micro-organisme tudi, nous avons pu confirmer que le milieu de
croissance utilis (bouillon ou glose) avait une nette influence sur lhydrophilie de surface
des cellules, phnomne dj observ dans la prcdente partie du prsent mmoire.

I.2.2. Activit antimicrobienne et dtermination de la Concentration Minimale

Bactricide

Les courbes de destruction obtenues pour chaque souche bactrienne tudie sont
prsentes sur les figures III-6, III-7 et III-9 et les CMB drives de ces courbes sont
regroupes dans les Tableaux III-6, III-7 et III-8 pour respectivement lacide peractique, le
chlorure de didcyl-dimthyl-ammonium et le chlorure de poly(hexamthylne-biguanide).

I.2.2.1. Acide peractique (APA)

Lacide peractique, molcule oxydante large spectre dactivit (Hugo et Russell, 1992),
a t test sur une gamme de concentrations allant de 2 20 ppm. Les valeurs des CMB
indiques reprsentent la moyenne dau moins trois tests de dsinfection raliss des jours
diffrents laide de solutions dsinfectantes prpares extemporanment.

82
 Souches de collection Souches sauvages
P.aeruginosa A22 P.aeruginosa 222P
9 9
8 8
7 7
6 6
Log10(ufc/mL)

5 5
4 4
3 3
2 2
1 1
0 0
0 10 20 30 40 50 0 10 20 30 40 50
[C] ppm [C] ppm

S. aureus 53154 S. aureus 221P

9 9
8 8
7 7
6 6
Log10(ufc/mL)

5 5
4 4
3 3
2 2
1 1
0 0
0 10 20 30 40 50 0 10 20 30 40 50
[C] ppm [C] ppm

L. monocytogenes 103575 L. monocytogenes 177P

9 9
8 8
7 7
6 6
Log10(ufc/mL)

5 5
4 4
3 3
2 2
1 1
0 0
0 10 20 30 40 50 0 10 20 30 40 50
[C] ppm [C] ppm

Figure III-6 : Courbes de destruction par lacide peractique des souches sauvages et de collection en fonction
des conditions de croissance (TSA : ; TSB : ).

Comme le montrent les courbes de destruction ralises avec cet antimicrobien, de faibles
concentrations en dsinfectant (infrieures 20 ppm) entranent une mortalit importante des
micro-organismes (>5Log10). La capacit de lacide peractique oxyder de nombreux
composs i.e. lipides, protines ou encore acides nucliques (Hoffman, 1971) et par
83
consquent, son action ltale non spcifique (Crmieux et Freney, 1995) en font un agent
bactricide trs efficace. Ainsi, except pour la souche sauvage S. aureus 221P cultive sur
TSA (seule souche non solvant-dpendante au test MATS), une concentration infrieure 10
ppm de principe actif est suffisante pour liminer en 5 minutes plus de 5Log10 des diffrentes
populations bactriennes initiales (Tableau III-6).

Souches de collection Souches sauvages

Milieu de croissance TSA TSB TSA TSB

P. aeruginosa 4 4 4 8

S. aureus 8 8 10 20

L. monocytogenes 8 8 8 8

Tableau III-6 : Concentration minimale bactricide (ppm) de lacide peractique en fonction de lorigine et des
conditions de croissance des souches bactriennes.

La plus forte activit bactricide de lacide peractique a pu tre observe sur la souche P.
aeruginosa A22; souche pour laquelle la CMB tait de 4 ppm de principe actif. Pour les deux
souches de Listeria ainsi que S. aureus 53154, la CMB tait de 8 ppm dagent antimicrobien.
S. aureus 221P semble, quant elle, moins sensible cet oxydant (CMB suprieure 8 ppm)
que les autres micro-organismes slectionns. Ainsi et conformment aux donnes
bibliographiques, lacide peractique prsente une activit bactricide faible concentration
sur les bactries Gram positif et Gram ngatif (Bartoli et Dusseau, 1995).
Ainsi, pour la majorit des souches utilises dans cette partie de ltude, les conditions de
croissance nont eu que peu dinfluence sur leur sensibilit vis--vis de cet agent bactricide
(Tableau III-6). En revanche, pour S. aureus 221P, souche la plus rsistante de ltude cet
antimicrobien, ltat physique (solide ou liquide) du milieu de culture a eu un impact sur sa
sensibilit vis--vis de lacide peractique. Ainsi, les cellules bactriennes cultives en TSB
sont apparues moins sensibles lAPA comparativement aux cellules cultives sur TSA.
Nanmoins et dans les conditions exprimentales testes, lanalyse statistique des rsultats
obtenus pour les diffrentes espces bactriennes, cultives sur TSA ou en TSB, na pu
montr dinfluence significative (P>0,05) des caractristiques physico-chimiques de surface
de ces micro-organismes sur lactivit bactricide de lacide peractique, petite molcule
hydrophile, capable de ragir avec la plupart des composs de lenveloppe bactrienne
(lipides, protines, systmes enzymatiques).

84
 I.2.2.2. Chlorure de didcyl-dimthyl-ammonium (CDDMA)

Le second agent bactricide test tait un ammonium quaternaire cationique couramment

utilis dans les formulations nettoyantes dsinfectantes.
Souches de collection Souches sauvages
P. aeruginosa A22 P. aeruginosa 222P
9 9

8 8
7 7
6 6
Log10(ufc/mL)

5 5

4 4
3 3

2 2
1 1
0 0
0 10 20 30 40 50 0 10 20 30 40 50
[C] ppm [C] ppm

S. aureus 53154 S. aureus 221P

9 9

8 8
7 7

6 6
Log10(ufc/mL)

5 5

4 4
3 3

2 2
1 1
0 0
0 10 20 30 40 50 0 10 20 30 40 50
[C] ppm [C] ppm

L. monocytogenes 103575 L. monocytogenes 177P

9 9
8 8
7 7
Log10(ufc/mL)

6 6
5 5
4 4
3 3
2 2
1 1
0 0
0 10 20 30 40 50 0 10 20 30 40 50

[C] ppm [C] ppm

Figure III-7 : Courbes de destruction par le chlorure de didcyl-dimthyl-ammonium des souches sauvages et de
collection en fonction des conditions de croissance (TSA : ; TSB : ).

85
 Comme lindiquent les courbes de destruction prsentes sur la Figure III-7, laction de
lammonium quaternaire sur les cellules bactriennes est plus progressive que celle de lacide
peractique. En effet, les pentes des courbes de dsinfection sont moins prononces i.e. les
pentes des courbes de destruction de S. aureus 53154 cultiv en TSB sont respectivement de
-1 pour lacide peractique et -0,2 pour lammonium quaternaire.

Souches de collection Souches sauvages

Milieu de croissance TSA TSB TSA TSB

P. aeruginosa 20 10 5 10

S. aureus 20 40 20 20

L. monocytogenes 20 20 20 10

Tableau III-7 : Concentration minimale bactricide (ppm) de lammonium quaternaire en fonction de lorigine
et des conditions de croissance des souches bactriennes.

Par ailleurs, les CMB pour lammonium quaternaire sont comprises entre 5 et 40 ppm de
principe actif (Tableau III-7), gamme de concentrations plus large que celle obtenue avec
lacide peractique. Ainsi, P. aeruginosa 222P, cultive sur TSA semble tre la souche la plus
sensible cet antimicrobien (CMB de 5 ppm dagent antibactrien) alors que la destruction
complte des cellules de S. aureus 53154 cultives en TSB ncessite 40 ppm de principe actif
soit une concentration 8 fois plus importante.

Il est noter que pour S. aureus 221P (souche sauvage), dont les proprits physico-
chimiques de surface (hydrophobicit et caractre Lewis acide-base) varient peu en fonction
des conditions de croissance, les CMB dtermines pour les deux modes de mise en culture
sont identiques (20 ppm). En revanche, pour S. aureus 53154 et P. aeruginosa 222P, dont
lhydrophobie de surface est influence par les conditions de croissance, nous avons observ
des CMB diffrentes selon le protocole de culture utilis. Ainsi, la destruction des cellules
plus hydrophiles (cultives en TSB), semble ncessiter une quantit plus importante de
CDDMA comparativement aux micro-organismes ayant une hydrophilie de surface moins
marque aprs une croissance sur TSA.

Cette variabilit des CMB peut donc tre attribue au mode daction plus spcifique de
lammonium quaternaire (Maris, 1995), comparativement celui de lacide peractique. Son
activit ltale pourrait tre plus fortement lie aux proprits de surface des micro-organismes

86
comme lindiquent McDonnell et Russell (1999). En 1988, Al-Masaudi et al. ont en effet mis
en vidence que les concentrations minimales inhibitrices de croissance en ctrimide et en
chlorure de ctylpyridinium pouvaient tre 2 4 fois plus importantes pour des souches de S.
aureus rsistantes la mticilline et ayant une hydrophilie de surface importante,
comparativement des souches sensibles cet antibiotique et ayant un caractre hydrophobe
de surface marqu telle que S. aureus 53154.

Jones et al. (1989) ont quant eux montr que les cellules de P. aeruginosa rsistantes aux
ammoniums quaternaires (dont le chlorure de didcyl-dimthyl-ammonium) taient plus
hydrophobes que les cellules sensibles, hydrophobie de surface lie une modification du
profil en acides gras membranaires. Les ammoniums quaternaires sadsorberaient donc en
plus grande quantit sur les bactries Gram ngatif prsentant une faible hydrophobicit de
surface (Nagai et al., 2003).

Ainsi les plus petites CMB de cet agent dsinfectant ont t dtermines pour les deux
souches de P. aeruginosa, souches prsentant une hydrophobie de surface ngligeable ; et les
CMB plus leves ont t obtenues pour les souches bactriennes affichant une hydrophobie
de surface plus importante i.e. S. aureus 53154 (souche de collection).

Le mode de croissance, en influenant les caractristiques de surface des micro-

organismes, peut galement avoir un impact sur la rsistance ce dsinfectant. Ainsi, la
culture sur glose (en comparaison une croissance en bouillon) entrane une augmentation
de la tolrance de P. aeruginosa A22 au CDDMA.
De mme, les cellules de L. monocytogenes 177P (souche sauvage) cultives en TSB,
prsentant une hydrophilie de surface marque, sont apparues plus sensibles que celles
cultives sur TSA prsentant une hydrophobie de surface plus importante. En revanche, nous
avons pu observer que les cellules de S. aureus 53154 (souche de collection) ou encore de P.
aeruginosa 222P (souche sauvage) cultives en TSB, plus hydrophiles que celles mises en
culture sur TSA, taient galement plus tolrantes ce dsinfectant.

Ainsi, en changeant les proprits de surface des micro-organismes, les conditions de

croissance influencent la ractivit des bactries vis--vis de cet agent antimicrobien (Figure
III-8) en modifiant par exemple les sites dadsorption des molcules dsinfectantes aux
cellules bactriennes. Une analyse de variance des CMB obtenues pour chaque souche
bactrienne en fonction des conditions de croissance a mis en vidence limpact significatif

87
(P<0,05) de la composante hydrophile/hydrophobe de surface des micro-organismes tudis
sur leur sensibilit vis--vis du chlorure de didcyl-dimthyl-ammonium.

50

45

40

35

30
CMB (ppm)

25
20

15

10

0
0 20 40 60 80 100
Affinit au Dcane (%)

Figure III-8 : Concentration Minimale Bactricide de lammonium quaternaire en fonction de laffinit des
cellules bactriennes pour le dcane ().

Cependant, outre ladsorption des antimicrobiens la surface des micro-organismes, il est

noter que dautres mcanismes tels que la diffusion des antimicrobiens travers la
membrane bactrienne suivant sa composition en acides gras (Nagai et al., 2003) ou encore la
prsence de pompes defflux (Russell, 1997) pourraient tre impliqus dans la rsistance des
cellules bactriennes aux ammoniums quaternaires.

I.2.2.3. Poly(hexamthylne-biguanide) (PHMB)

Le troisime agent antibactrien test appartient quant lui la famille des biguanides.
Cest galement un agent dsinfectant agissant sur la membrane bactrienne (McDonnell et
Russell, 1999). Contrairement aux dsinfectants prcdents, cest un mlange de molcules
polymrises (degr moyen de polymrisation : 12).

88
 Souches de collection Souches sauvages
P.aeruginosa A22 P.aeruginosa 222P
9 9

8 8
7 7

6 6
Log10(ufc/mL)

5 5
4 4

3 3

2 2
1 1

0 0
0 20 40 60 80 100 0 20 40 60 80 100
[C] ppm [C] ppm

S. aureus 53154 S. aureus 221P

9 9
8 8
7 7
6 6
Log10(ufc/mL)

5 5
4 4
3 3
2 2
1 1

0 0
0 20 40 60 80 100 0 20 40 60 80 100

[C] ppm [C] ppm

L. monocytogenes 103575 L. monocytogenes 177P

9 9

8 8

7 7

6 6
Log10(ufc/mL)

5 5
4 4
3 3
2 2
1 1
0 0
0 20 40 60 80 100 0 20 40 60 80 100
[C] ppm [C] ppm

Figure III-9 : Courbes de destruction par la PHMB des souches sauvages et de collection en fonction des
conditions de croissance (TSA : ; TSB : ).

89
 Comme on peut lobserver sur la figure III-9, les courbes de dsinfection obtenues pour la
PHMB sont biphasiques. De 0 20 ppm de principe actif, la destruction des cellules
bactriennes est proportionnelle la concentration en PHMB. Au-del de cette concentration,
il ny a pas daugmentation de lactivit bactricide de cet antimicrobien sur les souches
Gram positif. Cette diminution defficacit pourrait tre due une saturation des sites
dadsorption par la PHMB ou lencombrement strique de la surface cellulaire par cette
molcule.
Comme pour lammonium quaternaire et dautres molcules appartenant la famille des
biguanides (Reverdy, 1995), les CMB dtermines pour chaque souche en fonction des
conditions de croissance, prsentent une htrognit importante (Tableau III-8). Ainsi, aprs
une croissance en bouillon nutritif, la CMB de la PHMB pour P. aeruginosa A22 est de 10
ppm de produit actif alors que dans les mmes conditions, il faut 4 fois plus de matire active
pour obtenir une rduction logarithmique similaire de la population initiale de P. aeruginosa
222P. Nanmoins, et comme le montrent les rsultats de la Figure III-9, toutes les CMB nont
pu tre dtermines dans la gamme de concentrations teste. Des essais supplmentaires ont
donc t raliss avec des concentrations de principe actif suprieures conduisant une CMB
de 800 ppm pour L. monocytogenes 103575 cultive en TSB et de 400 ppm pour P.
aeruginosa 222P aprs croissance sur TSA. Les CMB de S. aureus 53154 cultive en TSB et
de L. monocytogenes 177P cultive sur TSA nont pu tre dtermines.

Souches de collection Souches sauvages

Milieu de croissance TSA TSB TSA TSB

P. aeruginosa 20 10 400 40

S. aureus 20 ND 80 20

L. monocytogenes ND 800 ND 80

Tableau III-8 : Concentration minimale bactricide (ppm) de la PHMB en fonction de lorigine et des
conditions de croissance des souches bactriennes (ND : Non Dtermine).

Comme pour le chlorure de didcyl-dimthyl-ammonium, un impact du mode de

croissance sur lactivit bactricide de la PHMB a pu tre mis en vidence. Les souches
sauvages Gram positif et les deux souches Gram ngatif sont apparues moins sensibles la
PHMB aprs une croissance sur milieu glos. Ainsi, une croissance sur TSA
(comparativement une croissance en TSB) peut multiplier la CMB dun facteur 2, 4 et 10,

90
respectivement pour P. aeruginosa A22, S. aureus 221P et P. aeruginosa 222P, diffrence de
sensibilit probablement lie lhtrognit des populations bactriennes et donc une
htrognit des caractristiques physico-chimiques de surface des micro-organismes
comme nous lavons vu prcdemment (I-1.1.).

Cultives sur TSA, les souches sauvages se sont rvles moins sensibles la PHMB que
les souches de collection (souches sur lesquelles sont tests et valids les produits
dsinfectants), diffrence de ractivit vis--vis des dsinfectants entre souches de collection
et souches sauvages probablement lie des variations de la composition lipidique de la
membrane cytoplasmique entre des souches issues du terrain et des souches de laboratoire.
La variabilit des proprits physico-chimiques de surface des bactries quelle soit inter
ou intra espce ou en fonction des conditions de croissance, peut entraner une modification
des interactions entre les molcules dsinfectantes et la surface cellulaire. En effet, la PHMB
interagit avec les groupements anioniques de la membrane externe des bactries Gram
ngatif, principalement avec les phospholipides acides (i.e. phosphatidylglycrol et
diphosphatidylglycrol) (Broxton et al., 1984). En consquence, une modification de la
composition lipidique de cette membrane externe peut entraner une volution de ladsorption
de cette molcule la surface des bactries et donc une CMB diffrente (Broxton et al, 1984 ;
Gilbert et al., 1990).

Lanalyse statistique des CMB en fonction des affinits aux solvants utiliss pour le test
MATS a mis en vidence leffet significatif (P<0,05) du caractre hydrophobe/hydrophile de
surface des cellules bactriennes tudies sur leur sensibilit la PHMB (Figure III-10).

91
 1100
1000
900
800
700
600
CMB (ppm)

500
400
300
200
100
0
0 20 40 60 80 100
Affinit (%)

Figure III-10 : Relation entre les CMB dtermines pour la PHMB et le caractre hydrophobe de surface des
cellules microbiennes (Affinit lhexadcane).

Ainsi, il semblerait que les cellules prsentant une hydrophobie de surface ngligeable soient
plus sensibles que les autres laction de ce dsinfectant aprs seulement cinq minutes de
contact. Les cellules affichant une hydrophobie de surface intermdiaires apparaissent quant
elles plus rsistantes, rsistance due de possibles interactions rpulsives proximit des sites
dadsorption de la PHMB.

92
 I.3. CONCLUSION

Cette premire partie de ltude nous a permis de montrer une volution des
caractristiques physico-chimiques de surface des souches tudies en fonction de la dure
de stockage et surtout en fonction de ltat physique du milieu de culture utilis (glose ou
bouillon nutritif), effet plus marqu pour les souches sauvages que pour les souches de
collection.
De plus, dans les conditions exprimentales testes, nous avons pu observer que la CMB
augmentait avec la taille et notamment avec la spcificit daction de la molcule
dsinfectante. Ainsi, lacide peractique, petite molcule hydrophile action
antimicrobienne non spcifique, est apparue comme tant le plus efficace avec des CMB
infrieures ou gales 20 ppm. Concernant les agents antimicrobiens action ltale plus
spcifique tests (lammonium quaternaire et le sel de biguanide), une nette influence des
conditions de croissance des bactries (milieu de culture solide ou liquide) a pu tre mise en
vidence sur leur activit bactricide. Nanmoins, aucune rgle gnrale corrlant milieu
de croissance (bouillon ou glose) et CMB de chaque dsinfectant test na pu tre tablie.
Enfin, nous avons galement pu noter que le choix des souches, de sensibilit variable
vis vis des dsinfectants, tait primordial afin de ne pas sur ou sous estimer les
concentrations efficaces des agents antimicrobiens, plus particulirement sur des souches
de terrain.

En consquence et sur la base des rsultats obtenus, nous avons choisi de poursuivre
ltude avec :

des souches bactriennes de collection et des isolats sauvages

les 2 protocoles de conservation et de croissance suivants :

Conservation des micro-organismes - 80 C (2 mois maximum) puis culture en

TSB 37 C (Protocole gnralement utilis dans les laboratoires de recherche).

Conservation des bactries 4C (une semaine maximum) puis ensemencement

sur TSA en pente et incubation 37C (Protocole de croissance des micro-
organismes selon les instructions des normes AFNOR).

93
II. EVALUATION DE LACTIVITE BACTERICIDE DES DESINFECTANTS SUR

CELLULES ADHERENTES

De nombreux travaux ont port sur la dtermination de lactivit bactricide des

dsinfectants et le principal test mis en uvre pour valider la bactricidie dun agent
antimicrobien est ralis sur des micro-organismes en suspension (protocole pralablement
utilis cf. -I.2). Cependant, ce test de dsinfection savre relativement loign des
conditions normales dutilisation des dsinfectants, notamment dans le cas des cellules
adhrentes aux surfaces, cas trs largement rencontrs dans de nombreux secteurs
dapplication.

Les protocoles standardiss actuellement prconiss pour tester lactivit bactricide

dagents antimicrobiens mettent en uvre des cellules dposes puis dshydrates (van
Klingeren et al., 1998) et non pas des cellules simplement adhrentes. De plus, les techniques
classiques de microbiologie utilises pour les tests de dsinfection ne permettent pas toujours
de dtecter les bactries viables - non cultivables, capable de sortir de cette phase de
dormance dans un environnement favorable leur croissance (Chumkhunthod et al.,
1998).

Ainsi, aprs avoir slectionner micro-organismes dtude et conditions de conservation et

de croissance, nous avons dans cette section cherch dfinir un protocole standardis et
reproductible permettant de tester lactivit bactricide dagents dsinfectants sur cellules
adhrentes.

II.1. PROTOCOLE DADHESION MICROBIENNE AUX SURFACES

Ladhsion des micro-organismes aux surfaces est un phnomne naturel qui sobserve
quels que soient le milieu de suspension (air ou liquide) et la nature du support rencontr
(matriaux inertes, tissus animaux ou vgtaux) (Bellon-Fontaine et Cerf, 1991). De
nombreuses tudes (Fletcher et Loeb, 1979 ; Busscher et al., 1984 ; Mafu et al., 1990 ;
Briandet, 1999) ont mis en vidence limplication des proprits physico-chimiques de type
van der Waals, Lewis acide-base et lectrostatiques des diffrents corps en prsence i.e.
micro-organismes, supports solides et fluide environnant, dans la mise en place de ce
processus bioadhsif. En consquence, tout facteur susceptible de modifier les proprits de
surface des bactries pourra modifier leur comportement bioadhsif.

94
 Ainsi, sur la base des donnes obtenues dans la prcdente tape, nous avons tudi
limpact des conditions de conservation et de croissance sur le comportement bioadhsif des
souches bactriennes pralablement caractrises (I.2.) deux surfaces modles i.e. lacier
inoxydable AISI 316 et le PTFE (PolyTtraFluoroEthylne). Ladhsion des cellules
bactrienne a t value par i) le dnombrement des cellules viables cultivables adhrentes et
par ii) lobservation in situ par microscopie pifluorescence des bactries adhrentes
(viables cultivables, viables non cultivables et mortes).

II.1.1. Caractrisation nergtique de la surface des supports solides

Les angles de contact mesurs (Tableau III-9) sur les chantillons solides avec trois
liquides purs de caractristiques nergtiques connues, coupls lquation de Youn-van Oss
(van Oss, 1988), nous ont permis de calculer lnergie de surface de ces matriaux (S), ainsi
que leurs composantes van der Waals (LW), donneur dlectron (ou Lewis-base) (-) et
accepteur dlectron (ou Lewis-acide) (+) (Figure III-11).
En accord avec des tudes antrieures, lacier inoxydable AISI 316 est apparu hydrophile
(langle de contact mesur pour leau est de 69), hydrophilie de surface lie un caractre
Lewis-base (- 14,9 mJ/m).
Concernant le PTFE, nous avons confirm son caractre hydrophobe ; Eau 113,
associe une nergie de surface faible S 16,4 mJ/m principalement due sa composante
de van der Waals de 16,1 mJ/m. Compte tenu des erreurs de mesures, ses composantes + et
- sont ngligeables.

Eau Formamide Diiodomthane

Acier A316 69 1,8 46,4 1,5 46,5 2,0
PTFE 113 1,0 97,5 3,3 82,7 0,1
Tableau III-9 : Angles de contact mesurs () leau, au formamide et au diiodomthane sur lacier inoxydable
AISI 316 et sur le PTFE.

95
 50

Energie de surface (mJ/m)

40

30

20

10

LW - + S
Figure III-11 : Caractristiques nergtiques (mJ/m) de lacier inoxydable A316 ( ) et du PTFE ( ).

II.1.2. Adhsion bactrienne

Les essais dadhsion ont t effectus en conditions statiques avec les micro-organismes
cultivs sur TSA et en TSB. Les dnombrements de la flore totale adhrente et des cellules
viables cultivables adhrentes ont t raliss aprs 3 heures de contact entre les suspensions
bactriennes et les chantillons dacier et de PTFE. La contamination totale des supports,
reprsente en Log10(nombre de cellules/cm), a t estime par observation des surfaces au
microscope pifluorescence et les cellules viables cultivables ont t dnombres par
ensemencement en glose. Les rsultats sont exprims en Log10(ufc/cm) (Figure III-12).

96
 9 9

8 8

7
Log10(ufc/cm) ou

7
Log10(cellules/cm)

Log10(ufc/cm) ou
Log10(cellules/cm)
6 6

5 5

4 4

3 3

2 2
TSA TSB TSA TSB TSA TSB TSA TSB
P. aeruginosa A22 P. aeruginosa 222P S. aureus 53154 S. aureus 221P

8
Log10(ufc/cm) ou

7
Log10(cellules/cm)

6
D Cellules viables cultivables sur lacier (Log10(ufc/cm))
5
D Cellules viables cultivables sur le PTFE (Log10(ufc/cm))
4
C Flore totale sur lacier (Log10(cellules/cm))
3

2 C Flore totale sur le PTFE (Log10(cellules/cm))

TSA TSB TSA TSB

L.monocytogenes L. monocytogenes
103575 177P
Figure III-12 : Comportement bioadhsif des souches cultives sur TSA ou en TSB la surface de supports
dacier inoxydable ou de PTFE.

II.1.2.1. Flore totale adhrente

Les diffrentes photographies obtenues ont permis de calculer les taux de contamination
des supports solides par les micro-organismes (Figure III-12) et dobserver la rpartition des
bactries sur ces surfaces (Tableau III-10).

Les niveaux de contamination calculs pour les bactries Gram positif montrent que ces
souches ont des comportements bioadhsifs diffrents vis vis des chantillons dacier et de
PTFE. En accord avec Chavant et al. (2002), une adhsion importante de L. monocytogenes
lacier inoxydable a pu tre note. Ainsi, en trois heures dadhsion, le taux de contamination
des coupons dacier par les Listeria, et plus particulirement L. monocytogenes 103575, est
denviron 8 Log10(cellules/cm) alors que la biocontamination du PTFE est infrieure cette
valeur denviron 1 Log10. Des rsultats similaires ont t observs pour les souches de S.
aureus et plus particulirement pour la souche sauvage i.e. 7,9 et moins de 2
Log10(cellules/cm) respectivement sur lacier et le PTFE pour S. aureus 221P cultive sur
glose en pente. Ces rsultats confirment limportance des proprits physico-chimiques de

97
surface des bactries et notamment du caractre hydrophile (van Loosdrecht et al., 1987) dans
le processus bioadhsif de ces micro-organismes.

En revanche, ladhsion de P. aeruginosa A22 aux deux surfaces solides apparat moins
affecte par les conditions de croissance utilises. Ainsi, quelles que soient les conditions de
croissance et la surface tudie, le taux de contamination du support rcepteur est compris
entre 7,2 et 7,8 Log10(cellules/cm). De mme, des niveaux dadhsion similaires lacier et
au PTFE peuvent tre nots pour P. aeruginosa 222P cultive sur TSA et en TSB.

Le tableau III-10 regroupe diffrentes observations microscopiques des souches sauvages

et de collection adhrentes lacier inoxydable AISI 316 et au PTFE pralablement cultives
sur TSA ou en TSB.

Mme si des taux de contamination similaires ont pu tre dtermins par analyse dimage,
par exemple pour S. aureus 53154 ou encore P. aeruginosa 222P, les champs observs
montrent un comportement bioadhsif diffrent en fonction du support rcepteur et des
conditions de croissance. En effet, pour des niveaux de recouvrements similaires, les bactries
peuvent tre rparties de faon homogne sur lchantillon solide ou former un rseau
dagrgats bactriens plus ou moins denses.

98
 Surface Acier PTFE

Conditions de culture TSA TSB TSA TSB

P. aeruginosa A22

P. aeruginosa 222P

S. aureus 53154

S. aureus 221P

L. monocytogenes 103575

L. monocytogenes 177P

Tableau III-10 : Observations au microscope pifluorescence (obj. x 10) des souches de collection et sauvages
adhrentes lacier inoxydable et au PTFE en fonction des conditions de croissance. Les cellules sont colores
lorang dacridine.

Les diffrences de rpartition des cellules la surface des matriaux peuvent tre lies
une comptition des interactions physico-chimiques entre les diffrents corps en prsence i.e.
milieu de suspension/bactries, bactries/bactries et bactries/surface, au moment du schage
des chantillons (Mougin et al., 2001). Plus prcisment, la formation dagrgats bactriens
pourrait rsulter dinteractions attractives plus faibles entre le support solide et les bactries
comparativement aux interactions entre le liquide de suspension et les bactries et les
bactries entre elles. Par ailleurs, comme lindiquent Mougin et Haidara (2002), les forces
capillaires impliques lors du passage de linterface liquide/air et au cours de la phase de

99
schage des chantillons solides pralablement leur observation, pourraient influencer
lorganisation des micro-organismes la surface des matriaux. Ensemble de rsultats
soulignant limportance des conditions exprimentales utilises.

II.1.2.2. Dnombrement des cellules viables cultivables

En accord avec des donnes bibliographiques (Fletcher et al., 1979 ; McEldowney et

Fletcher, 1986 ; Asther et al., 1989 ), nous avons observ que les souches hydrophiles
adhrent en plus grande quantit sur les surfaces hydrophiles et inversement, les cellules
hydrophobes adhrent en plus grand nombre sur les surfaces hydrophobes.. Ainsi, les
dnombrements obtenus pour les L. monocytogenes (souches hydrophiles), quel que soit le
mode de croissance utilis, montrent une adhsion plus importante lacier A316 (suprieurs
6 log10(ufc/cm)) en comparaison au PTFE (compris entre 4,5 et 6 Log10(ufc/cm)). Il en est
de mme pour S. aureus 221P avec des dnombrements suprieurs 6 Log10/cm pour lacier
et infrieurs 4 Log10/cm pour le PTFE.

Nanmoins, et comme la soulign Bellon-Fontaine (communication personnelle), au-del

de ce caractre gnral, il faut considrer les interactions Lewis Acide-Base ainsi que les
forces dadhsion susceptible de stablir entre les micro-organismes et la surface solide.
Ainsi, et malgr une hydrophilie de surface importante des cellules de P. aeruginosa A22 et
222P (affinit ngligeable aux solvants apolaires, cf. I.2.), nous avons observ peu ou pas de
diffrence dans le nombre de cellules adhrentes viables cultivables (comprise entre 6 et 7
log10/cm) entre lacier inoxydable et le PTFE pour ces deux souches prsentant un caractre
Lewis acide-base marqu. Outre lhydrophilie de surface des micro-organismes (Vanhaecke et
al., 1990), la prsence dappendices exocellulaires peut galement avoir un impact sur leur
adhsion aux surfaces : la prsence de flagelles permet aux micro-organismes dtre mobiles
(mobilit observe au microscope pour les souches de P. aeruginosa) ce qui facilitera alors
leur contact avec les surfaces solides et donc leur capacit adhrer; et la synthse de pili
pourra renforcer leur adhsion (OToole et al., 2000).

Nanmoins et comme le soulignent Vanhaecke et al. (1990) ou plus rcemment Gomez-

Suarez et al. (2001) ou encore Herry et al. (2003), en conditions statiques et aprs le
passage dinterfaces liquide-air , les dnombrements des cellules adhrentes ne refltent pas
toujours la variabilit de comportement bioadhsif une surface rceptrice de souches
bactriennes ayant des proprits physico-chimiques de surface diffrentes.

100
 Enfin, nous avons pu noter que les dnombrements des micro-organismes adhrents
obtenus par ensemencement en glose nutritive sont gnralement infrieurs aux taux de
contamination calculs partir des observations au microscope pifluorescence (Figure III-
13). Cette diffrence de dnombrement est comprise entre 0,5 et 2 Log10(cellules/cm) pour
lacier inoxydable et entre 1 et 3 Log10(cellules/cm) pour le PTFE.

8
Log10(cellules/cm)

5
2 3 4 5 6 7 8

Log10(ufc/cm)
Figure III-13 : Relation entre le nombre de cellules adhrentes dnombres et le nombre de micro-organismes
adhrents observs sur les chantillons dacier () et de PTFE ().

Dans les conditions exprimentales testes, plusieurs facteurs peuvent expliquer ces
diffrences de rsultats entre les dnombrements classiques et les observations au microscope
pifluorescence. Pour les observations microscopiques, une surestimation de la
contamination des surfaces est possible en raison de lemplacement des champs observs i.e.
au centre des chantillons solides, prsentant gnralement une contamination plus homogne
que les bords des chantillons solides.

Concernant la cultivabilit des cellules adhrentes, il est noter que ladhsion peut tre
considre comme un stress pour les micro-organismes, plus particulirement en absence
dlments nutritif, et entraner ainsi un ralentissement du mtabolisme bactrien (Williams et
al., 1999) voir une mortalit des cellules adhrentes.
La technique utilise pour dcrocher les cellules adhrentes peut elle-mme stresser les micro-
organismes et en consquence entraner une diminution du nombre de cellules viables

101
cultivables. En effet, mme si nous avons vrifi que le traitement aux ultra-sons navait pas
daction ltale pour des suspensions bactriennes aprs 3 heures 20C en NaCl 150mM (les
dnombrements taient similaires avant et aprs traitement), ils peuvent toutefois fragiliser les
cellules bactriennes dj stresses par ladhsion. Chaque tape implique dans les
dnombrements (transfert des surfaces entre les diffrents contenants, dilutions) peut
galement entraner une perte de cellules bactriennes. Enfin, les forces dadhsion tant
variables entre micro-organismes, il est possible que les ultra-sons permettent un meilleur
dcrochage des cellules mortes comparativement aux cellules viables, comme lindique
Bellon-Fontaine (communication personnelle).

Ainsi, couple aux techniques classiques de microbiologie, lobservation in situ de la

biocontamination des supports par microscopie pifluorescence, en dtectant la flore totale
adhrente (viables cultivables, viables non cultivables et mortes), permet une tude plus
complte du comportement bioadhsif des cellules bactriennes la surface de matriaux
inertes.

102
 II.2. DESINFECTION DES SURFACES CONTAMINEES

Aprs avoir dfini un protocole dadhsion reproductible, les essais de dsinfection ont t
raliss selon un protocole inspir de la norme NF EN 1040 et dcrit au paragraphe VI de la
seconde partie du prsent mmoire. Afin davoir suffisamment de cellules adhrentes
dnombrables par les techniques classiques de microbiologie (dcrochage et ensemencement
en glose nutritive), nous avons slectionn lacier inoxydable AISI 316 comme support
rcepteur.

II.2.1. Pseudomonas aeruginosa

Un rappel des CMB obtenues pour les tests de dsinfection raliss avec les cellules en
suspension de P. aeruginosa A22 et 222P est prsent dans le tableau III-11.

Milieu de Dsinfectant
Souche
croissance APA CDDMA PHMB
TSA 4 20 20
P. aeruginosa A22
TSB 4 10 10
TSA 4 5 400
P. aeruginosa 222P
TSB 8 10 40

Tableau III-11 : CMB de chaque dsinfectant pour P. aeruginosa A22 et 222P en suspension en fonction du
milieu de croissance.

La figure III-14 prsente les courbes de destruction de P. aeruginosa A22 et 222P obtenues
aprs dsinfection des chantillons dacier AISI 316 avec des solutions dacide peractique
(APA), de chlorure de didcyl-dimthyl-ammonium (CDDMA) ou de poly(hexamthylne-
biguanide) (PHMB).

APA CDDMA PHMB

9 9 9
8 8 8
7 7 7
Log10(ufc/cm)

6 6 6
5 5 5
4 4 4
3 3 3
2 2 2
1 1 1

0 0 0
0 1000 2000 3000 4000 5000 0 1000 2000 3000 4000 5000 0 1000 2000 3000 4000 5000
C (ppm) C (ppm) C (ppm)

Figure III-14 : Courbes de destruction de P. aeruginosa A22 ( et ) et 222P (z et {) adhrentes lacier

aprs croissance sur TSA (symboles pleins) et en TSB (symboles creux).

103
 Comparativement ltat planctonique, ltat adhrant des souches de P. aeruginosa
lacier inoxydable entrane une augmentation de leur rsistance la dsinfection
conformment aux donnes obtenues par Takeo et al (1994) et Campanac et al. (2002). Ainsi,
la destruction totale des cellules adhrentes na pu tre obtenue ni pour lammonium
quaternaire, ni pour la PHMB. Seule la concentration maximale dAPA, soit 5000 ppm, a
permis de tuer plus de 5 Log10 ufc/cm de P. aeruginosa 222P cultive en TSB, soit une
concentration 625 fois plus leve que celle efficace pour tuer les mmes cellules ltat
planctonique.

Ainsi et en accord avec les rsultats obtenus sur les cellules en suspension, lacide
peractique semble tre le produit permettant dliminer le plus de micro-organismes,
lammonium quaternaire a une activit intermdiaire et la PHMB est la molcule la moins
active. En effet, un maximum de 3 et de 2 Log10 ufc/cm de rduction de la population
cultivable ont t dnombrs respectivement pour le CDDMA et la PHMB alors que lAPA
entranait une rduction dau moins 4 Log10 ufc/cm de la population des cellules adhrentes
viables cultivables pour une concentration de 5000ppm de principe actif.

Une nette augmentation de rsistance (au minimum dun facteur 10) de ces deux souches
bactriennes lammonium quaternaire et la biguanide peut galement tre observe. Cette
rsistance pourrait tre lie un temps de contact trop court entre les molcules dsinfectantes
et les cellules bactriennes, ainsi qu la ractivit des agents antimicrobiens avec les
exopolymres bactriens synthtiss suite ladhsion bactrienne (Samrakandi et al., 1997).

II.2.2. Staphylococcus aureus

Le tableau III-12 est un rappel des CMB obtenues pour les tests de dsinfection raliss sur
S. aureus 53154 et 221P planctoniques.

Milieu de Dsinfectant
Souche
croissance APA CDDMA PHMB
TSA 8 10 80
S. aureus 53154
TSB 8 20 ND
TSA 10 10 80
S. aureus 221P
TSB 16 20 20

Tableau III-12 : CMB de chaque dsinfectant pour S . aureus 53154 et 221P en suspension en fonction du
milieu de croissance (ND : Non Dtermine).

104
 Les courbes de destruction de S. aureus 53154 et 221P obtenues aprs dsinfection des
chantillons dacier AISI 316 avec lacide peractique (APA), le chlorure de didcyl-
dimthyl-ammonium (CDDMA) et la poly(hexamthylne-biguanide) (PHMB) sont
prsentes sur la Figure III-15.

APA CDDMA PHMB

9 9 9
8 8 8
7 7 7
Log10(ufc/cm)

6 6 6
5 5 5
4 4 4
3 3 3
2 2 2
1 1 1
0 0 0
0 1000 2000 3000 4000 5000 0 1000 2000 3000 4000 5000 0 1000 2000 3000 4000 5000
C (ppm) C (ppm) C (ppm)

Figure III-15 : Courbes de destruction de S. aureus 53154 ( et ) et 221P ( et ) adhrentes lacier aprs
croissance sur TSA (symboles pleins) et en TSB (symboles creux).

Une destruction totale de la population bactrienne initialement prsente par les

dsinfectants tests tait obtenue gnralement pour les cellules en suspension (Tableau III-
12). En revanche, une radication totale des bactries sessiles na pu tre obtenue except
pour S. aureus 221P cultive en TSB avec une concentration de 500 ppm dacide peractique,
concentration toutefois 30 fois plus importante que celle utilise pour les cellules
planctoniques. Ainsi, en accord avec les travaux de Oie et al. (1996), ltat adhrant entrane
une augmentation de la rsistance des deux souches de S. aureus tudies aux dsinfectants.

Pour chaque antimicrobien test, des rductions minimales de 4 et de 4,45 Log10 (ufc/cm)
sont observes pour S. aureus 221P cultive respectivement sur agar et en bouillon nutritif,
alors que les rductions dcimales de la souche de collection sont au maximum de 3 Log10
(ufc/cm) pour lammonium quaternaire et la PHMB. Ainsi, quels que soient le mode de
culture et le dsinfectant test, la souche sauvage est apparue plus sensible que la souche de
collection la dsinfection, sensibilit probablement lie une diffrence de composition de
paroi, comme le suggrent les diffrence dhydrophobicit de surface des deux souches (cf.
I.2.). Il est noter que pour le CDDMA et la PHMB, les conditions de croissance pralable
ladhsion nont pas ou peu dinfluence sur la ractivit des cellules adhrentes vis vis des
dsinfectants.

De plus, et conformment aux tests de dsinfection raliss sur des cellules planctoniques
lacide peractique est apparu le plus efficace des trois dsinfectants tests. Le plus faible

105
pouvoir bactricide sur la souche de collection a pu tre not pour la PHMB. En effet, mme
une concentration de 5000 ppm, cet antimicrobien na entran aucune rduction de la
population adhrente de S. aureus 53154 cultive en TSB.

De mme que pour les Pseudomonas, la faible activit bactricide de lammonium

quaternaire et de la PHMB, ainsi que la stagnation du nombre de cellules tues par ces
dsinfectants peuvent tre lies un temps de contact trop court entre les dsinfectants et les
cellules bactriennes.

II.2.3. Listeria monocytogenes

Les CMB de chaque dsinfectant, en fonction des conditions de croissance de ces deux
souches en suspension sont rappeles dans le tableau III-13.

Milieu de Dsinfectant
Souche
croissance APA CDDMA PHMB
TSA 8 10 ND
L. monocytogenes 103575
TSB 8 20 800
TSA 8 20 ND
L. monocytogenes 177P
TSB 8 10 80

Tableau III-13 : CMB de chaque dsinfectant pour L. monocytogenes 103575 et 177P en suspension en fonction
du milieu de croissance (ND : Non Dtermine).

La figure III-16 prsente les courbes de destruction de L. monocytogenes 103575 et 177P

obtenues aprs dsinfection des chantillons dacier AISI 316 avec lacide peractique (APA),
le chlorure de didcyl-dimthyl-ammonium (CDDMA) et la poly(hexamthylne-biguanide)
(PHMB).

APA CDDMA PHMB

9 9 9
8 8 8
7 7 7
6 6 6
Log10(ufc/cm)

5 5 5
4 4 4
3 3 3
2 2 2
1 1 1
0 0 0
0 1000 2000 3000 4000 5000 0 1000 2000 3000 4000 5000 0 1000 2000 3000 4000 5000
C (ppm) C (ppm) C (ppm)

Figure III-16 : Courbes de destruction de L. monocytogenes 103575 ( et ) et 177P ( et ) adhrentes

lacier aprs croissance sur TSA (symboles pleins) et en TSB (symboles creux).

106
 Comme lindiquent les donnes du tableau III-13, une destruction totale des bactries en
suspension tait obtenue pour des concentrations minimales de 8 ppm pour lacide
peractique et de 20 ppm pour lammonium quaternaire (CDDMA). Dans le cas des cellules
adhrentes, cette destruction totale na jamais t observe mme pour des concentrations en
principe actif de 5000 ppm. Ladhsion induit donc une augmentation de la rsistance des
souches de L. monocytogenes aux dsinfectants, conformment aux donnes prcdemment
obtenues par Frank et Koffi (1990) et plus rcemment par Meylheuc (2000).

Si lon compare maintenant lactivit bactricide de chaque dsinfectant, en accord avec

les rsultats obtenus sur les cellules en suspension, lacide peractique est apparu le plus
efficace. Ds 5 ppm de matire active, une diminution de 3 Log10 de la population viable
cultivable adhrente de L. monocytogenes 103575 cultive en TSB a t observe. Des
concentrations, respectivement de 500 et 5000 de principe actif taient cependant ncessaires
pour obtenir une rduction de 5 Log10 de la population adhrente de L. monocytogenes
103575 et 177P.

Comme lont pralablement mis en vidence Mafu et al. (1990) ou encore Roy et al.
(1993), ladhsion augmente galement la tolrance des souches de L. monocytogenes aux
ammoniums quaternaires. Ainsi, une rduction de 3 Log10 des cellules sessiles a ncessit une
concentration dau moins 500 ppm de principe actif. Les cellules de L. monocytogenes 177P
adhrentes taient donc 250 fois plus rsistante au chlorure de didcyl-dimthyl-ammonium
que leurs homologues planctoniques.

Il est noter que conformment aux rsultats des tests de dsinfection sur cellules en
suspension, la PHMB est apparue nettement moins bactricide que les deux autres
dsinfectants. En effet, mme pour une concentration de 5000 ppm, la rduction maximale
des bactries adhrentes tait de 3,7 Log10 pour L. monocytogenes 103575 et de 2,5 Log10
pour L. monocytogenes 177P. En accord avec les donnes obtenues sur les cellules en
suspension, lactivit bactricide la plus faible a pu tre note pour les cellules cultives sur
TSA.

Nous avons pu observer que les conditions de croissance i.e. milieu solide ou liquide, nont
que peu dinfluence sur lactivit bactricide de lacide peractique. En revanche, le pouvoir
antimicrobien de lammonium quaternaire et de la biguanide apparat moindre sur les cellules

107
cultives sur TSA comparativement une croissance en TSB. Ainsi, la croissance sur milieu
glos en modifiant la synthse de divers constituants cellulaires (protines, acides gras)
pourrait protger les cellules bactriennes de ces deux dsinfectants.
Enfin, la faible activit bactricide de lammonium quaternaire et de la PHMB, mme aux
fortes concentrations de matire active (500 et 5000 ppm), pourrait tre attribue dune part
un temps de contact trop court entre les micro-organismes et les agents dsinfectants dont le
mode daction est plus spcifique que celui de lacide peractique (Crmieux et Freney,
1995), et dautre part une saturation plus rapide des sites de fixation possibles sur la paroi
bactrienne dont la surface de contact avec le liquide environnant est infrieure celle des
cellules planctoniques.

Mme si une nette augmentation de la tolrance des micro-organismes aux dsinfectants a

t observe suite leur adhsion lacier, leur activit bactricide suit la mme
hirarchisation . Ainsi, en accord avec les tests de dsinfection raliss sur cellules en
suspension, les rsultats obtenus au cours de cette tape ont montr que lacide peractique,
petite molcule chimique trs ractive (Hoffman, 1971) avait lactivit bactricide la plus
efficace des trois dsinfectants tests sur les micro-organismes adhrents lacier inoxydable
AISI 316. Dans nos conditions exprimentales, lammonium quaternaire, agent tensio-actif,
prsentait une activit ltale intermdiaire et la PHMB est apparue comme tant le
dsinfectant le moins efficace sur cellules adhrentes. Except pour lacide peractique, il est
noter quau del de 500 ppm, le nombre de rductions dcimales de la population
bactrienne stagne malgr laugmentation de la concentration en principe actif. Cette absence
defficacit des molcules dsinfectantes pourrait tre due un manque de sites dadsorption
possibles en raison de la plus petite surface des micro-organismes en contact avec le fluide
environnant comparativement aux cellules planctoniques.

En accord avec les travaux de Meylheuc (2000), ladhsion induit donc une augmentation
de la rsistance des micro-organismes aux principes actifs antimicrobiens. Comme mentionn
prcdemment, cette diminution de lactivit bactricide des molcules antimicrobiennes et
plus particulirement de lammonium quaternaire et de la biguanide pourrait tre attribue
un temps de contact trop court entre les micro-organismes et les agents dsinfectants dont le
mode daction est plus spcifique que celui de lacide peractique (Crmieux et Freney,
1995).

108
 Selon Frank et Koffi (1990), cette diminution de la sensibilit des bactries vis vis des
dsinfectants pourrait sexpliquer par une accessibilit moindre de la population bactrienne
adhrente, gnralement caractrise par des amas cellulaires, comparativement aux cellules
planctoniques individualises. De plus, une surface de contact diminue entre les molcules
dsinfectante et les bactries adhrentes peut galement expliquer cette augmentation de
rsistance aux dsinfectants (Ntsama-Essomba, 1996).

Ltat physiologique des cellules adhrentes influence aussi leur rsistance aux
dsinfectants (Mah et OToole, 2001). En effet, ladhsion des micro-organismes aux surfaces
inertes induit des modifications dans lexpression de diffrents composs cellulaires,
notamment des macromolcules de surface telles que des exopolymres, des curli (Davies
et al., 1993 ; Vidal, 1998 ; Sauer et Camper, 2001) pouvant :

- gner laccs des dsinfectants aux bactries

- interagir avec les molcules dsinfectantes et ainsi consommer le produit
antimicrobien (Glinas et Goulet, 1983).

De plus, ces variations physiologiques entre cellules planctoniques et adhrentes en

induisant des modifications des caractristiques nergtiques de surface des bactries
(Briandet, 1999 ; Campanac et al., 2002) peuvent influencer les interactions entre micro-
organismes et molcules dsinfectantes et en consquence la sensibilit des cellules
bactriennes aux agents antimicrobiens.

109
 II.3. CONCLUSION

La dfinition dun protocole standardis pour tester lactivit dsinfectante dagents

antimicrobiens sur cellules adhrentes nous a permis de :

montrer lexistence dune variabilit du comportement bioadhsif des diffrentes

souches tudies en fonction du support solide utilis i.e. acier inoxydable AISI 316 ou
PTFE, ainsi que des conditions de croissance.

valider le caractre reproductible des rsultats obtenus avec ce protocole.

et de confirmer laugmentation de la rsistance des micro-organismes aux
dsinfectants suite un tat fix .

Bien que facile mettre en uvre et permettant davoir une reproductibilit des rsultats,
ce protocole repose sur lutilisation de mthodes classiques de microbiologie lourdes et
ayant des dlais de rponse plus ou moins long. Nous avons donc cherch dans la suite de
ltude optimiser ce protocole, notamment dans le caractre in situ ainsi que dans les
dlais dattente des rsultats.

110
III. MISE AU POINT DUN PROTOCOLE RAPIDE PERMETTANT DEVALUER IN SITU
LA VIABILITE DES CELLULES ADHERENTES

III.1. PROTOCOLE DE COLORATION DES CELLULES BACTERIENNES

Pour dterminer le nombre de bactries viables adhrentes sur une surface, les mthodes de
microbiologie classiques bien que simples mettre en uvre restent coteuses, ncessitent
beaucoup de temps avant dobtenir les rsultats (temps de croissance des bactries) et ne
permettent gnralement pas de dtecter les micro-organismes croissance trs lente ou
viables non cultivables (VNC) pouvant exprimer leur pouvoir pathogne aprs avoir
rcupr leur caractre cultivable (Besnard, 2002).

Il savre donc ncessaire de dvelopper des mthodes permettant dune part ltude
microscopique du comportement adhsif des bactries aux surfaces inertes et dautre part la
diffrenciation entre les cellules mortes et viables suite des traitements de dsinfection, afin
damliorer lefficacit des formulations dsinfectantes.

Ainsi, aprs avoir i) montr linfluence des conditions de croissance et de conservation sur
les proprits physico-chimiques de surface des micro-organismes et leur sensibilit vis vis
des dsinfectants et ii) standardis un protocole conduisant une adhsion reproductible des
cellules microbiennes la surface de matriaux modles et lvaluation de lactivit
bactricide dagents antimicrobiens, nous nous sommes attachs, au cours de cette partie de
ltude, mettre en place une mthode rapide permettant dvaluer in situ la rpartition et la
viabilit des cellules adhrentes avant et aprs action dun dsinfectant.

Les supports solides utiliss tant opaques, lutilisation dun microscope pifluorescence
a t ncessaire. Afin que ce test soit applicable une large varit de micro-organismes, sans
avoir besoin de sondes nucliques spcifiques (technique FISH) ni de les modifier
gntiquement (insertion du gne de la Green Fluorescent Protein), les micro-organismes ont
t marqus laide de fluorochromes.

111
 III.1.1. Choix des fluorochromes

A lheure actuelle, de nombreuses molcules fluorescentes sont proposes en vue de

diffrencier micro-organismes vivants et micro-organismes morts (Lisle, 1999 ; King, 2000).

Ces fluorochromes peuvent tre :

- des substrats du mtabolisme bactrien librant une molcule fluorescente aprs

dgradation par les systmes enzymatiques microbiens,

- des molcules gnralement exclues par les cellules intactes mais pouvant pntrer
dans des cellules ayant leur membrane cytoplasmique lse et ainsi augmenter leur
fluorescence en sintercalant dans les bases de lADN microbien.

La premire catgorie de fluorochromes tant dpendante de lactivit enzymatique des

micro-organismes, la fluorescence mise risque dtre sous-estime suite des tats de stress
ou de dormance des bactries (Caruso et al, 2003).

Sachant que les trois dsinfectants utiliss (lacide peractique, le chlorure de didcyl-
dimthyl-ammonium et le chlorure de poly(hexamthylne-biguanide)) agissent sur lintgrit
membranaire (Maris, 1995), nous avons choisi dutiliser comme marqueur de viabilit, un
fluorochrome ne pntrant que dans les micro-organismes dont la membrane cytoplasmique
est dsorganise et donc permable ces molcules.

Nous nous sommes donc plus particulirement intresss un kit commercialis par la
socit Molecular Probe (Kit live/dead V-7023) permettant la distinction entre cellules viables
et cellules mortes mais galement de diffrencier bactries Gram positif et bactries Gram
ngatif dans le cas de cultures plurimicrobiennes.

Les marqueurs de viabilit de ce kit, utilisables simultanment, sont des agents intercalant
des acides nucliques i.e. le DAPI et le SYTOX Green.

Le DAPI ou 4,6-diamidino-2-phenylindole est une molcule de 350,3 Da se liant avec les

acides nucliques de lADN et de lARN. Il est traditionnellement employ pour lestimation
du nombre total de micro-organismes et trs couramment utilis pour les marquages
fluorescents multicolores. Le SYTOX Green, quant lui, ne pntre que dans les cellules dont
la membrane plasmique est altre pour se lier lADN (Roth, 1997).

112
 III.1.2. Mise en place du protocole

III.1.2.1. Coloration des micro-organismes

Pour chaque fluorochrome employ individuellement, des concentrations dutilisation

taient prconises par le fabricant. Pour le DAPI, elles sont de 3M pour les bactries en
suspension et de 300nM pour les bactries adhrentes. Pour le SYTOX Green, diffrentes
gammes de concentrations dutilisation sont proposes en fonction du micro-organisme tudi
(bactries ou cellules eucaryotes), elles sont comprises entre 0,5 et 5M pour des cellules
bactriennes en suspension. Ainsi, en fonction de la capacit du SYTOX Green pntrer
dans les micro-organismes, un ajustement de sa concentration tait ncessaire pour quun
excs de fluorochrome ne marque pas les cellules viables ; et inversement la concentration
choisie doit permettre de dtecter lensemble des cellules mortes.

Pour une utilisation simultane de ces 2 fluorochromes, une adaptation de leurs

concentrations a galement t ncessaire. En effet, li lADN, le SYTOX Green augmente
sa fluorescence dun facteur 500 (Lebaron, 1998 ; Roth, 1997) alors que celle du DAPI
naugmente que dun facteur 100 (Shapiro, 2000). Ainsi, la concentration en DAPI a d tre
augmente pour permettre sa dtection. Cette technique de coloration a dabord t teste et
valide sur cellules planctoniques avant dtre applique sur cellules adhrentes.

III.1.2.2. Essais sur cellules planctoniques

Les essais de colorations ont t raliss avec un mlange des deux fluorochromes dont les
concentrations taient comprises entre 1,43 28,6 M pour le DAPI et de 0,5 5 M pour le
SYTOX Green. Compte-tenu des difficults rencontres pour photographier les cellules en
suspension (rapide vanouissement de la fluorescence), nous ne prsenterons ici que les
photos des cellules colores avec les concentrations optimales de fluorochromes.

Les rsultats sont prsents sur la figure III-17. Les photographies prsentes concernent
un mme champ observ avec les filtres spcifiques de dtection de chaque fluorochrome (un
couple filtre dexcitation/filtre darrt pour chaque colorant).

113
 A B C
Dnombrements (ufc/mL) 108 ufc/mL 108 ufc/mL Pas de croissance

Cellules totales
(DAPI)

Cellules mortes
(SYTOX Green )

Figure III-17 : Observation au microscope pifluorescence (obj. x 40) de Listeria monocytogenes 10357 (A :
Cellules en phase stationnaire de croissance; B : Tmoin de dsinfection ; C : Test de dsinfection).

Comme le montre la figure III-17-A, pour les cellules bactriennes rcupres en dbut de
phase stationnaire de croissance ( 108 ufc/mL) et colores par une solution de DAPI et de
SYTOX Green (aux concentrations respectives de 14,3M et 0,5M), aucune fluorescence
na t observe la longueur donde dmission du SYTOX Green. Ainsi, toutes les
bactries, marques uniquement avec le DAPI, peuvent tre considres comme viables.

De mme pour les bactries mises en contact avec de leau distille en remplacement du
dsinfectant pour les tests de dsinfection (Figure III-17-B), toutes les cellules taient
marques avec le DAPI et aucun marquage avec le SYTOX Green na t dtect (Figure III-
17-B). Les ensemencements en glose nutritive ont par ailleurs confirm la stabilit du
nombre de cellules viables cultivables ( 108 ufc/mL).

Aprs laction de la solution dacide peractique (5 minutes de contact avec une solution
20 ppm), plus aucune croissance bactrienne na t obtenue aprs ensemencement en glose
TSA, indiquant ainsi la destruction totale des cellules de L. monocytogenes 103575 par ce
dsinfectant. Les observations au microscope pifluorescence ont quant elles montr que

114
lensemble des micro-organismes tait marqu avec le DAPI mais galement avec le SYTOX
Green, mettant ainsi en vidence leur perte de viabilit. Le marquage des micro-organismes
par le SYTOX Green tant en accord avec les dnombrements des cellules viables cultivables
obtenus aprs ensemencement en glose nutritive, ce fluorochrome semble donc tre un
marqueur de viabilit adapt notre tude.

Suivant les instructions du fournisseur, la concentration de SYTOX Green ncessaire la

dtection des bactries mortes doit tre comprise entre 0,5 et 5M, gamme de concentration
que nous avons test. Lebaron et al (1998) ont ainsi montr quune concentration de 1M de
SYTOX Green pouvait sous-estimer le nombre de cellules mortes, sous-estimation attribue
la dgradation des acides nucliques des bactries stresses (carence nutritionnelle de 46
jours) et donc une diminution de lADN disponible pour la fixation du SYTOX Green.
Dans nos conditions exprimentales, la concentration optimale en SYTOX Green utilise tait
la limite infrieure des recommandations du fabricant (0,5 M). En effet, lutilisation dune
concentration suprieure de ce fluorochrome sur cellules planctoniques entranait la coloration
de cellules viables (observation de bactries mobiles avec ce marqueur fluorescent). Par
ailleurs, le SYTOX Green mettant une fluorescence plus intense que le DAPI, et en accord
avec les rsultats de Fiksdal et Tryland (1999), une concentration de 14,3 M de ce dernier
tait ncessaire pour amliorer sa dtection.

Pour chaque souche tudie, les essais de marquage cellulaire ont donc t raliss avec
des solutions de fluorochromes dont les concentrations taient comprises entre 0,5 et 5 M
pour le SYTOX Green et entre 1,43 et 28,6 M pour le DAPI. La dtection optimale des deux
marqueurs fluorescents a ainsi t obtenue pour une concentration dutilisation de 0,5 M et
14,3 M respectivement pour le SYTOX Green et le DAPI sur une population bactrienne de
108 ufc/mL en suspension dans du NaCl 0,15 M.

115
 III.1.2.3. Coloration sur cellules adhrentes
De mme que pour les cellules bactriennes en suspension, un ajustement des
concentrations de chacun des fluorochromes tait ncessaire pour le marquage des bactries
adhrentes. Ainsi et afin dobtenir un contraste suffisant pour distinguer les deux marqueurs
fluorescents, sans sous ou surestimer le nombre de cellules mortes, des concentrations
respectives de 71,5 et 2,5M de DAPI et de SYTOX Green taient ncessaires, concentrations
dtermines de la mme manire que pour les cellules planctoniques mais sur des gammes de
concentrations allant de 0,5 5 M pour le SYTOX Green et de 14,3 143 M pour le DAPI.
Si la concentration dutilisation du SYTOX Green est en accord avec les recommandations du
fabriquant, en revanche pour le DAPI, un ajustement a d tre ralis. Ainsi, la concentration
en DAPI est plus de 200 fois suprieure celle prconise. Laugmentation de cette
concentration pourrait tre due un problme de diffusion du colorant jusquaux cellules
bactriennes ainsi qu une surface de contact moindre entre les bactries adhrentes et la
solution colorante comparativement aux cellules planctoniques.

Le tableau III-14 prsente les observations microscopiques de la biocontamination

dchantillons dacier inoxydable AISI 316 par S. aureus 53154, L. monocytogenes 103575 et
P. aeruginosa A22 en fonction des conditions de croissance pralables alors que la figure III-
18 recense les dnombrements obtenus aprs ensemencement en glose nutritive.

S. aureus 53154 L. monocytogenes 103575 P. aeruginosa A22

TSA

TSB

Tableau III-14 : Observation en microscopie pifluorescence (obj x 40) de S. aureus 53154, L. monocytogenes
103575 et P. aeruginosa A22 adhrentes lacier AISI 316 en fonction des conditions de croissance.

116
 1E+08

1E+07

1E+06

1E+05
ufc/cm

1E+04

1E+03

1E+02

1E+01

1E+00
S. aureus 53154 L. monocytogenes 103575 P. aeruginosa A22
Figure III-18 : Dnombrement des cellules viables cultivables de S. aureus 53154, L. monocytogenes 103575 et
P. aeruginosa A22 adhrentes lacier AISI 316 en fonction des conditions de croissance ( : TSA, : TSB).
Comme le montrent les observations microscopiques (Tableau III-14), cette technique de
double coloration nous a permis dobserver linfluence des conditions de croissance sur le
comportement bioadhsif des cellules bactriennes (conformment aux rsultats du II-1.)
mais galement sur la viabilit des cellules adhrentes. En effet, pour les deux souches
Gram positif, une mortalit (fluorescence verte) plus importante a t note pour les cellules
cultives en bouillon nutritif comparativement aux cultures sur milieu glos, rsultats en
accord avec les dnombrements bactriens obtenus aprs ensemencement en glose nutritive
(Figure III-18). Les protocoles de croissance peuvent donc entraner une physiologie
diffrente des bactries en fonction de leur environnement, et notamment leur adaptation
ltat adhrant.
Concernant P. aeruginosa A22, cultive sur TSA ou en TSB, la majorit des cellules
adhrentes fluorescent en vert (cellules mortes). Cette souche est donc apparue
particulirement sensible au stress li ladhsion.
De plus, sappuyant sur notre exprience, nous avons pu confirmer quen vitant la phase de
schage pralable aux observations microscopiques, la rpartition des micro-organismes la
surface des chantillons dacier inoxydable AISI 316 tait plus homogne.

III.2. APPLICATION A LA DESINFECTION DES SURFACES

Lobjectif de cette tape tait de valider le kit de viabilit mis en place dans ltape
prcdente pour tester lactivit bactricide des agents antimicrobiens sur cellules adhrentes.

117
 Les tests de dsinfection ont t raliss avec des solutions 5000 ppm dacide peractique
(APA), de chlorure de didcyl-dimthyl-ammonium (CDDMA) et de poly(hexamthylne-
biguanide) (PHMB).
Les observations ralises au microscope pifluorescence ont permis de dterminer le
nombre de cellules adhrentes viables (exprim en cellules/cm). Ces rsultats ont t
compars au nombre de cellules adhrentes viables cultivables (ufc/cm) dans les figures III-
19, III-20 et III-21 respectivement pour les souches de P. aeruginosa, S. aureus et L.
monocytogenes.

P. aeruginosa A22
Cellules viables cultivables Cellules viables

1E+08 1E+08

1E+07 1E+07

1E+06 1E+06
cellules/cm

1E+05 1E+05
ufc/cm

1E+04 1E+04

1E+03 1E+03

1E+02 1E+02

1E+01 1E+01

1E+00 1E+00
Tmoin APA CDDMA PHMB Tmoin APA CDDMA PHMB

TSA TSB TSA TSB

P. aeruginosa 222P
Cellules viables cultivables Cellules viables

1E+08 1E+08

1E+07 1E+07

1E+06 1E+06
cellules/cm

1E+05 1E+05
ufc/cm

1E+04 1E+04

1E+03 1E+03

1E+02 1E+02

1E+01 1E+01

1E+00 1E+00
Tmoin APA CDDMA PHMB Tmoin APA CDDMA PHMB

TSA TSB TSA TSB

Figure III-19 : Evaluation de la viabilit des cellules de P. aeruginosa A22 et 222P adhrentes lacier aprs
contact avec 5000 ppm de chacun des dsinfectants.

118
S. aureus 53154
Cellules viables cultivables Cellules viables

1E+08 1E+08

1E+07 1E+07

1E+06 1E+06

cellules/cm
1E+05 1E+05
ufc/cm

1E+04 1E+04

1E+03 1E+03

1E+02 1E+02

1E+01 1E+01

1E+00 1E+00
Tmoin APA CDDM A PHMB Tmoin APA CDDMA PHMB

TSA TSB TSA TSB

S. aureus 221P
Cellules viables cultivables Cellules viables

1E+08 1E+08
1E+07 1E+07
1E+06 1E+06
1E+05
cellules/cm

1E+05
ufc/cm

1E+04 1E+04
1E+03 1E+03

1E+02 1E+02
1E+01 1E+01
1E+00 1E+00
Tmoin APA CDDM A PHMB Tmoin APA CDDMA PHMB

TSA TSB TSA TSB

Figure III-20 : Evaluation de la viabilit des cellules de S. aureus 53154 et 221P adhrentes lacier aprs 5
minutes de contact avec 5000 ppm de chacun des dsinfectants.

119
L. monocytogenes 103575

Cellules viables cultivables Cellules viables

1E+08 1E+08
1E+07 1E+07

1E+06 1E+06

1E+05

cellules/cm
1E+05
ufc/cm

1E+04 1E+04

1E+03 1E+03

1E+02 1E+02

1E+01 1E+01

1E+00 1E+00
Tmoin APA CDDMA PHMB Tmoin APA CDDMA PHMB

TSA TSB TSA TSB

L. monocytogenes 177P

Cellules viables cultivables Cellules viables

1E+08 1E+08

1E+07 1E+07

1E+06 1E+06
cellules/cm

1E+05 1E+05
ufc/cm

1E+04 1E+04

1E+03 1E+03

1E+02 1E+02

1E+01 1E+01

1E+00 1E+00
Tmoin APA CDDMA PHMB Tmoin APA CDDM A PHMB

TSA TSB TSA TSB

Figure III-21 : Evaluation de la viabilit des cellules de L. monocytogenes 103575 et 177P adhrentes lacier
aprs 5 minutes de contact avec 5000 ppm de chacun des dsinfectants.

Comme le montrent les rsultats des figures III-19, III-20 et III-21, le nombre de cellules
viables cultivables est gnralement infrieur au nombre de cellules viables dtermin par
microscopie pifluorescence.

120
 Pour les tmoins de dsinfection cette diffrence de rsultats tait particulirement
marque pour P. aeruginosa A22 (souche de collection) (Figure III-19) i.e. 105 cellules
viables cultivables/cm et 106 cellules viables/cm. Cette souche Gram ngatif, sensible
labsence de matire organique dans le milieu environnant (van Klingeren, 1998), apparat
donc peu rsistante au stress de ladhsion.
De mme, pour les bactries Gram positif tudies (Figures III-20 et III-21) les
dnombrements des cellules viables cultivables taient galement infrieurs ceux obtenus
pour les cellules viables, plus particulirement pour les cellules pralablement cultives en
TSB. Ces souches sont donc apparues moins sensibles au stress de ladhsion aprs une
croissance sur milieu solide, conditions de culture pendant lesquelles les micro-organismes
peuvent tre apparents des cellules fixes . Ainsi, et en accord avec les donnes
obtenues prcdemment (cf. III-1.2.3), les conditions de croissance (milieu solide ou
liquide) influencent donc ltat physiologique des cellules adhrentes.

Aprs le traitement des supports contamins avec les trois dsinfectants, quelle que soit la
souche considre, une diminution de la population bactrienne viable a pu tre observe. Les
observations microscopiques ont galement permis de confirmer la plus faible activit
bactricide de la PHMB (comparativement lacide peractique et lammonium
quaternaire) sur cellules adhrentes, donnes comparables aux dnombrements des cellules
viables cultivables.

L. monocytogenes 103575 S. aureus 53154 P. aeruginosa A22

Tableau III-15 : Adhsion de L. monocytogenes 103575, S. aureus 53154 et P. aeruginosa A22 lacier
inoxydable, observation au microscope pifluorescence des cellules marques avec le DAPI (flore totale).

Ainsi, les dnombrements des cellules adhrentes par microscopie pifluorescence ont
mis en vidence une rsistance des micro-organismes adhrents vis vis des dsinfectants
plus importante que celle observe avec les techniques classiques de microbiologie

121
(dcrochage des cellules et mise en culture). Ce phnomne tait plus particulirement
marqu pour les souches formant des amas bactriens telle que P. aeruginosa A22 (Tableau
III-15). Plusieurs hypothses peuvent tre avances pour expliquer les diffrences de rsultats
obtenues entre les deux techniques utilises et plus particulirement :

- La prsence dagrgats bactriens. En effet, lutilisation dun microscope

pifluorescence ne permet pas dobserver les cellules au sein de ces amas et un biais peut
alors apparatre dans lanalyse des rsultats. Cette technique ne peut donc tre utilise que
pour des cellules adhrant en monocouche ; pour ltude de biofilms ou de dpts
tridimensionnel, lutilisation dun microscope confocale laser permettrait dtudier la viabilit
des cellules dans la profondeur des dpts et donc permettre des observations en trois
dimensions.

- La cultivabilit des cellules. Aprs les essais de dsinfection, nous avons pu observer
une perte de cultivabilit des micro-organismes aprs 5 minutes de contact avec les diffrents
dsinfectants alors que les rsultats obtenus avec les marqueurs de viabilit ont montr une
rduction moins prononce de la population bactrienne viable. En 1999, Caro et al. avaient
observ quun traitement UV, de 3 minutes, dune suspension de S. thyphimurium entranait
une importante diminution de la population cultivable (moins de 15% des cellules) alors que
93% de cette mme population avaient conserv son intgrit membranaire ainsi que son
activit mtabolique. Ainsi, un temps de contact court (5 minutes) entre micro-organismes et
dsinfectants nentranerait pas toujours une mort cellulaire mais plutt une perte de
cultivabilit des cellules bactriennes, perte susceptible dtre leve par des protocoles de
revivification adapts. Ainsi, lutilisation de fluorochromes ragissant avec diffrentes
fonctions cellulaires (chanes de transport des lectrons) pourrait tre envisage pour
tudier les diffrents tats physiologiques des cellules adhrentes.

- Aux diffrentes tapes ncessaires la ralisation des dnombrements des bactries

viables cultivables. En effet, ces dnombrements sont raliss aprs dcrochage des cellules
des supports rcepteurs sous laction des ultra-sons, agent pouvant dans certains cas amliorer
lefficacit de molcules antimicrobiennes (Pitt et al., 1994). De plus, la multiplication du
nombre dtapes intermdiaires (dilutions) avant les ensemencements en glose nutritive
peut augmenter la perte des micro-organismes viables cultivables.

122
 Ainsi, lutilisation de fluorochromes pourrait non seulement permettre dobtenir une
valuation rapide et in situ de lefficacit dun dsinfectant sur cellules adhrentes mais
galement une valuation de ltat physiologique des micro-organismes fixs .

III.3. CONCLUSION

Comme nous lavons indiqu dans notre prambule, lamlioration de lefficacit des
produits dsinfectants ncessite le dveloppement de mthodes tests permettant dvaluer
rapidement leur activit bactricide sur des micro-organismes adhrant aux surfaces
inertes. A cette fin, nous avons tabli un protocole permettant dobserver in situ la viabilit
des cellules adhrentes par microscopie pifluorescence. Cette technique simple et rapide
mettre en uvre permet dobtenir des rsultats dans la journe contrairement aux
techniques microbiologiques classiques ncessitant plus de temps.
Nanmoins, des diffrences entre les deux protocoles ont t observ. En effet, les
dnombrements des cellules viables cultivables obtenus par ensemencement taient
gnralement infrieurs ceux de la population viable dtermins par marquage
fluorescent, laissant supposer une diminution de la cultivabilit des micro-organismes lie
diffrents stress (ultra-sons) mais galement une perte de cellules viables cultivables
chaque tape du protocole de dnombrement par ensemencement en glose nutritive.

Ce protocole de coloration, applicable pour des cellules adhrentes en monocouches sur

supports inerts ayant montr sa validit, nous lavons utilis pour dterminer dans la
dernire partie du travail de thse linfluence de lenvironnement (duret de leau, film
primaire) sur la bioadhsion et la dcontamination des surfaces.

123
IV. FILMS PRIMAIRES ET QUALITE DE LEAU : IMPACT SUR LA BIOADHESION ET
LA VIABILITE CELLULAIRE

Tous les essais dadhsion des microorganismes aux surfaces ainsi que les tests de
dsinfection des cellules adhrentes ont t raliss jusqu prsent dans des conditions
modles (surface propre, fluide simple). Cependant, dans de nombreux secteurs dactivits,
les surfaces sont rarement exemptes de contaminants extrieurs (chimique, microbiologique)
de par leur pass et la nature des fluides environnants. En effet, quel que soit le domaine
dapplication (IAA ou secteur mdical), les surfaces sont gnralement en contact avec des
milieux complexes contenant des protines, des acides gras, des polysaccharides et soumis
des procdures de dsinfection et de rinages rguliers.

Ainsi, lencrassement des surfaces solides par des molcules organiques est un phnomne
invitable et le plus souvent indsirable (Wahlgren et Arnebrant, 1991), pouvant engendrer
une perte de fonctionnalit de lquipement. Cet encrassement des surfaces correspond
gnralement une adsorption molculaire la surface du matriau en contact, phnomne
dans lequel les protines jouent un rle prdominant (Garry, 1997).

Les surfaces sont galement rgulirement en contact avec des formulations nettoyantes et/ou
dsinfectantes contenant, entre autres, des tensioactifs et/ou diffrents principes actifs. Ces
molcules et macromolcules, galement capables de sadsorber sur les surfaces, sont donc
susceptibles de modifier les proprits physico-chimiques de surface de matriaux (Boulang-
Petermann, 1993).

Lobjectif de cette dernire partie de ltude tait donc dtudier limpact de ladsorption de
diffrentes molcules chimiques, encrassantes et antimicrobiennes, sur la surface de lacier
inoxydable AISI 316 et de la qualit de leau, osmose ou eau dure, sur la biocontamination
des surfaces et la viabilit des cellules adhrentes, mais galement sur leur rsistance aux
agents dsinfectants.

IV.1. DETERMINATION DES CARACTERISATION PHYSICO-CHIMIQUES DE SURFACE DE

LACIER CONDITIONNE OU NON

Les conditionnements de surface des chantillons dacier ont t raliss avec i) une solution
pure dune protine modle, la Srum Albumine Bovine (SAB), ii) une solution organique
complexe, le lait entier, et iii) les trois agents antimicrobiens pralablement utiliss dans les
essais de dsinfection (lacide peractique, le chlorure de didcyl-dimthyl-ammonium et le

124
chlorure de poly(hexamthylne-biguanide)). Le milieu de dilution des diffrentes molcules
conditionnantes tait leau osmose ou leau dure 20F.

IV.1.1. Conditionnement par un encrassement organique

Le tableau III-16 regroupe les angles de contact mesurs leau ainsi que les images
obtenues par AFM de lacier conditionn ou non avec les solutions encrassantes en fonction
du liquide de dilution.

Eau osmose Eau dure

Angle de contact leau Angle de contact leau
AFM AFM
() ()

Tmoin

69 1,8 57,4 11,8

SAB

59,8 12,7 56,7 13,7

Lait

62,3 5,1 49,5 5,7

Tableau III-16 : Angle de contact mesurs leau () et observations en AFM de lacier AISI 316 avant et aprs
encrassement en fonction de leau utilise (osmose ou distille).

Les angles de contact mesurs, leau, au formamide et au diiodomthane, coupls

lquation de Youn-van Oss (van Oss, 1988), nous ont quant eux permis de calculer
lnergie de surface de lacier AISI 316 (S), ainsi que ses composantes van der Waals (LW),
donneur dlectrons (ou Lewis-base) (-) et accepteur dlectrons (ou Lewis-acide) (+), avant
et aprs encrassement (Figure III-22).

125
 A B
60 60

50 50
Energie (mJ/m)

40 40

30 30

20 20

10 10

0 0
Tmoin SAB Lait Tmoin SAB Lait

Figure III-22 : Caractristiques nergtiques de lacier ( S , LW, et ) suite ladsorption de

- +

molcules encrassantes en fonction de la qualit de leau : eau osmose (A) ou en eau dure 20F (B).

IV.1.1.1. Influence de la qualit de leau

Avec des angles de contact mesurs leau respectivement de 57,4 et 69, lacier
inoxydable AISI 316 est apparu plus hydrophile aprs 1 heure dimmersion dans leau dure
20F comparativement leau osmose (Tableau III-17). Comme le montre la figure III-22,
cette augmentation dhydrophilie est lie une nette augmentation de la composante -
(donneur dlectrons) des chantillons. Les volutions de caractristiques nergtiques de
surface de lacier observes sont trs certainement dues aux ions prsents dans leau dure. En
effet, les ions sadsorbent gnralement spontanment une surface solide immerge dans
une solution de sels et peuvent ainsi en modifier les caractristiques lectriques de surface
(Briant, 1989). Ainsi, lacier tant charg ngativement (Boulang-Petermann, 1993), les
cations monovalents et divalents i.e. Na+, Ca2+ et Mg2+, pourront sadsorber et influencer les
interactions lectrostatiques entre les micro-organismes en suspension ainsi que les molcules
et macromolcules en solution et le support rcepteur. Cependant, laugmentation du caractre
lectron-donneur laisse supposer une stratification des ions adsorbs.

IV.1.1.2. Solution modle : la SAB

En accord avec des tudes prcdentes (Allion, 2000 ; Chevallier, 2002), les rsultats du
Tableau III-16 montrent une augmentation de lhydrophilie de surface du matriau suite
ladsorption de la SAB. En effet, les angles de contact mesurs leau taient respectivement
de 69 et 59,8 avant et aprs conditionnement en eau osmose ; volution dhydrophilie de
surface lie une augmentation du caractre donneur dlectrons de lacier (Figure III-22).

Il est noter que le recouvrement de lacier par la SAB nest pas uniforme. En effet, une
importante variation des angles de contact mesurs leau (cart-types suprieurs 10) a pu

126
tre constate. Cette htrognit dadsorption de la SAB a t confirme par les images
obtenues par AFM. Les molcules de SAB taient en majorit prsentes dans les joints de
grains ; refltant ainsi soit une adsorption prfrentiellement de cette protine dans les joints
de grain de lacier, soit un rarrangement des molcules adsorbes suite au passage des
interfaces liquide-air pendant les phases de rinage et de schage des chantillons.

En eau dure, nous avons not peu de variations des angles de contact mesurs leau entre
les chantillons dacier tmoin et lacier conditionn avec la protine (Tableau III-16) mais les
carts-types importants indiquent toutefois une surface htrogne. Il est noter que les
mesures dangles de contact ralises avec les trois liquides (eau, formamide et
diiodomthane) ont montr une hausse de lnergie de surface totale de lacier due une
augmentation de sa composante de van der Waals. Les images obtenues par AFM ont
confirm la prsence de molcules de SAB adsorbes aux supports dacier mais cette
adsorption est apparue plus parse que pour les essais dadsorption raliss en eau osmose.
Ainsi, comme la montr prcdemment Rubio (2002), les ions prsents dans les solutions
conditionnantes et dans leau de rinage, en modifiant la conformation de la SAB ainsi que les
proprits de surface des matriaux, peuvent influencer la quantit ainsi que la disposition des
molcules adsorbes la surface de lacier AISI 316.

De plus, ladsorption de la SAB tant proportionnelle la charge de surface des matriaux

(Fukuzaki et al., 1996 ; Krajewski et al., 1998), leur neutralisation par les ions prsents dans
leau dure peut, en occupant des sites potentiel de fixation de la protine, influencer
ladsorption de la SAB lacier inoxydable AISI 316.

IV.1.1.3. Solution complexe : le lait

Quel que soit le liquide de dilution utilis (eau osmose ou eau dure), un conditionnement
de surface de lacier AISI 316 par une solution de lait 1% entrane une augmentation de son
hydrophilie de surface. En effet, langle de contact mesur leau passe de 69 62 et de 57
49 respectivement pour leau osmose et leau dure. (Tableau III-16). Un conditionnement
de surface par une solution de lait entrane une augmentation de lhydrophilie de surface de
lacier essentiellement lie une hausse de sa composante de van der Waals de 36,2 40,6
mJ/m pour leau osmose et de 34,6 40,6 mJ/m pour leau dure (Figure III-22).

Le conditionnement des chantillons dacier par le lait entier est apparu plus homogne que
celui par la SAB. En effet, les cart-types des angles de contact mesurs sont denviron 5. De
plus, les images obtenues par AFM (Tableau III-16) ont montr que les constituants du lait

127
sadsorbaient aussi bien au niveau de la surface des grains que dans les joints de grains de
lacier; le dpt de lait est apparu plus important que celui de la SAB.

Les constituants du lait ayant des proprits diffrentes (point isolectrique, charge nette,
structure et stabilit en solution) (Alais, 1974), ils auront des niveaux dadsorption
variables (McGuire et Krisdhasima, 1991) ; ainsi, la -casine ayant un caractre amphiphile
marque et une structure dsordonne , aura une adsorption suprieure une protine
globulaire (-lactoglobuline) aux surface de chrome (Wahlgren et Arnebrant, 1991). Dans une
solution contenant plusieurs molcules et macromolcules, ladsorption molculaire,
dpendante des interactions avec les couches de molcules pralablement adsorbes (Tie et al,
2003) pourrait donc induire une augmentation du niveau dadsorption comparativement des
lments pris sparment (Figure III-23).

a b

Sel Lipide Polysaccharide Protine

Figure III-23 : Schma de ladsorption molculaire dune solution pure (a) et dune solution complexe (b).

Il est noter que la solution de lait reconstitue utilise est un mlange complexe de
molcules et macromolcules (globules gras, protines) mais galement de sels minraux
(Alais, 1974). De ce fait, les ions prsents dans les liquides de dilution et de rinage nont que
peu dinfluence sur ladsorption des composants du lait, contrairement la solution de SAB
(Tableau III-16).

IV.1.2. Adsorption des agents antimicrobiens

Le tableau III-17 regroupe les photos des angles de contact mesurs leau sur lacier
inoxydable AISI 316 conditionn ou non avec les agents antimicrobiens en fonction du
liquide de dilution utilise (eau osmose ou eau dure 20F).

128
 Eau osmose Eau dure

Tmoin 69 1,8 57,4 11,8

APA 67,1 7,1 53,8 5,3

CDDMA 71,1 7,2 58,4 9,6

PHMB 77 11,1 65,3 7,1

Tableau III-17 : Angle de contact leau () mesur sur lacier avant et aprs conditionnement par les agents
antimicrobiens.

Lnergie de surface de lacier AISI 316 (S), ainsi que ses composantes van der Waals
(LW), donneur dlectron (ou Lewis-base) (-) et accepteur dlectron (ou Lewis-acide) (+),
avant et aprs conditionnement par les dsinfectants sont reprsentes sur la figure III-24.

A B
60 60

50 50
Energie (mJ/m)

40 40

30 30

20 20

10 10

0 0
Tmoin APA CDDMA PHMB Tmoin APA CDDMA PHMB

Figure III-24 : Caractristiques nergtiques de lacier (( S , LW, et ) suite ladsorption

- +

dagents antimicrobiens en fonction de la qualit de leau : eau osmose (A) ou eau dure 20F (B).

Concernant le traitement de surface de lacier par les molcules antimicrobiennes, celui-ci

est apparu moins marqu que pour les solutions encrassantes.

Comme le montrent les rsultats du tableau III-17, et compte - tenu des cart-types, lacide
peractique et lammonium quaternaire dilus en eau osmose nont pas ou peu dinfluence
sur le caractre hydrophile de lacier AISI 316. Les cart-types des angles mesurs leau
tant suprieur 5, une htrognit de surface de lacier a t observe suite au contact

129
des supports solides avec ces deux dsinfectants. Il est noter que le caractre donneur
dlectron (-) de lacier augmente aprs une heure de contact avec lAPA en solution en eau
distille et diminue aprs une heure de conditionnement avec lammonium quaternaire dilu
dans de leau dure (Figure III-24). Ainsi, mme si les mesures dAFM nont montr aucune
diffrence entre les surfaces tmoins et les surfaces conditionnes (rsultats non montrs), les
mesures dangle de contact mettent en vidence une modification des surfaces aprs une heure
de contact avec lacide peractique et lammonium quaternaire. En effet, par leur structure, les
chlorures dammoniums quaternaires sont stables et peuvent sadsorber aux surfaces charges
ngativement, ce qui est gnralement le cas des aciers inoxydables (Boulang-Petermann et
al., 1995).

Concernant la PHMB, elle diminue lhydrophilie de surface de lacier (angles de contact

mesurs leau respectivement de 69 et 77 avant et aprs conditionnement avec cette
molcule) ; rduction de lhydrophilie de surface lie une diminution du caractre donneur
dlectron (-) de lacier (Figure III-24). Des rsultats similaires ont pu tre observs pour le
dsinfectant dilu en eau dure. Une diminution du caractre lectrons donneur de lacier a
donc pu tre observ aprs adsorption des deux molcules cationiques.

En accord avec des tudes prcdentes (Boulang-Petermann et al., 1994 ; Sinde et Carballo,
2000), nous avons donc mis en vidence une volution des proprits physico-chimiques de
surface de lacier inoxydable en fonction des molcules utilises dans les formulations
nettoyantes et/ou dsinfectantes, modification des caractristiques physico-chimiques de
surface pouvant influencer la biocontamination des matriaux (nombre et forces dadhsion)
et la viabilit des cellules adhrentes comme nous avons cherch lvaluer dans la dernire
partie de notre tude.

IV.2. IMPACT SUR LE COMPORTEMENT BIOADHESIF ET LA VIABILITE DES MICRO-

ORGANISMES ADHERENTS

IV.2.1. Molcules encrassantes

Le tableau III-18 prsente les rsultats obtenus partir des observations ralises au
microscope pifluorescence i.e. nombre de cellules adhrentes totales (T) et nombre de
cellules mortes (M) par cm.

130
 L. monocytogenes 103575 S. aureus 53154 P. aeruginosa A22

Tmoin

T : 2,3.107 T : 2,3.108 T : 2,9.107

M : 8,6.106 M : 1,0.106 M : 6,5.107

SAB

T : 1,4.104 T : 1,1.105 T : 2,7.104

M : 4,0.103 M : 2,6.103 M : 1,7.103

Lait

T : 2,6.104 T : 5,5.104 T : 3,1.104

M : 3,8.103 M : 1,8.103 M : 1,0.103

Tableau III-18 : Adhsion (T : Nombre total de cellules adhrentes par cm) et viabilit (M : Nombre de cellules
mortes par cm) des souches de collection lacier encrass ou non (observations au microscope
pifluorescence obj. x40).

Comme le montrent les images des micro-organismes adhrents colors avec la solution de
DAPI-SYTOX GREEN, le liquide de suspension a peu dinfluence sur ladhsion des cellules
bactriennes lacier inoxydable AISI 316. En effet, malgr limpact de la nature de leau de
rinage utilise sur les proprits physico-chimiques de surface de lacier inoxydable (cf IV-
1), leau dure utilise (dont la conductivit de 0,79 est infrieure celle du NaCl 0,15 M
prcdemment utilis) na que peu ou pas deffet sur le nombre de cellules adhrentes.

131
 En revanche, lencrassement organique de lacier par la SAB et le lait, ayant un impact
plus important que la qualit de leau sur les caractristiques physico-chimiques de surface de
lacier, modifie potentiellement le comportement adhsif des cellules bactriennes aux
supports solides.

Comme lavaient pralablement mis en vidence les quipes dAl-Makhlafi (1994) et de

Barnes (1999), un conditionnement des surfaces solides par la SAB et des protines de lait
induit gnralement une diminution du taux de biocontamination par les souches Gram
positif. Ainsi, malgr le faible impact du conditionnement par la SAB en eau dure sur les
proprits physico-chimiques de surface de lacier, le nombre de cellules adhrentes des trois
souches testes (L. monocytogenes 103575, S. aureus 53154 et P. aeruginosa A22) diminue
dun facteur 103 sur les surfaces encrasses avec la SAB ou les constituants du lait (Tableau
III-18) ; rsultats laissant supposer des forces dadhsion diffrentes entre micro-organismes
et supports pr-conditionns ou non.

En accord avec diffrentes tudes (Al-Makhlafi et al., 1994 ; Garry, 1997 ; Bower et al.,
1998, Allion, 2000), nous avons galement pu observer une rduction de la mortalit des
cellules adhrentes sur une surface encrasses. Cet effet tait plus particulirement marqu
pour P. aeruginosa A22 dont le nombre de cellules adhrentes mortes diminue dun facteur
10 suite ladsorption de matires organiques sur lacier (respectivement 1,1.104, 1,7.103 et
1,0.103 cellules/cm avant et aprs adsorption de la SAB et du lait pour des niveaux
dadhsion similaires). Ainsi, les molcules nutritives adsorbes peuvent servir de source
nutritive (Samuelsson et Kirchman, 1990 ; Bower et al., 1998) aux bactries adhrentes et
ainsi lever le stress nutritionnel.

IV.2.2. Principes actifs antimicrobiens

La figure III-25 prsente les rsultats dadhsion, exprims en Log10(cellules/cm) ainsi

que la viabilit des cellules adhrentes sur lacier trait avec les agents antimicrobiens.

132
 L. monocytogenes 103575
S. aureus 53154

Tmoin Tmoin

APA APA

CDDM A CDDMA

PHM B PHMB

4 5 6 7 8 9 4 5 6 7 8 9

Log10(cellules/cm) Log10(cellules/cm)

P. aeruginosa A22

Tmoin

APA

CDDMA

PHMB

4 5 6 7 8 9

Log10(cellules/cm)

Figure III-25 : Comportement bioadhsif ( : bactries totales ) et viabilit ( : cellules mortes) des micro-
organismes sur les supports conditionns avec les agents dsinfectants.

Dans nos conditions exprimentales, contrairement Sinde et Carballo (2000), les

traitements de surface de lacier par les diffrents dsinfectants sont apparus sans effet notable
sur le comportement bioadhsif des micro-organismes tudis (Figure III-25). En effet, les
taux de biocontamination sont gnralement similaires entre les surfaces conditionnes ou
non. Seule la pr-adsorption de la PHMB a influenc ladhsion de P. aeruginosa A22 sur
lacier. Ainsi, en diminuant la composante donneur dlectrons (Figure III-24) de lacier et
donc les interactions rpulsives entre cette souche (prsentant galement un caractre donneur
dlectrons marqu (cf. I-1)) et la surface rceptrice, la PHMB augmente ladhsion de P.
aeruginosa A22 au support solide.

Les rsultats prsents sur la figure III-25 montrent galement un nombre important de
cellules adhrentes mortes, rsultats variant peu ou pas entre les diffrents traitements de
surface des chantillons dacier inoxydable AISI 316 (supports propres ou pr-conditionns).
Dune part, ladsorption des molcules dsinfectantes la surface de lacier, comme dans le
cas de lammonium quaternaire par son ple hydrophile charg positivement, en les
immobilisant entrane alors une perte de lactivit bactricide des dsinfectants qui ne peuvent
plus pntrer les parois bactriennes. Par ailleurs, la prparation des chantillons solides

133
comprend une phase dimmersion dans une solution de RBS 35 2% (agent bactricide)
pendant 15 min. Les molcules de RBS 35 peuvent donc sadsorber la surface des supports
solides et avoir une activit ltale sur les micro-organismes adhrant, masquant ainsi lactivit
antimicrobienne des autres dsinfectants tests.

IV.3. APPLICATION A LA DESINFECTION

Ayant lever le stress nutritionnel, nous avons cherch voir limpact de cet encrassement
sur la rponse des bactries adhrentes aux dsinfectants. Pour cela, nous avons test la
PHMB, dsinfectant le moins efficace (II-2) une concentration de 5000 ppm sur S. aureus
53154, souche la moins sensible ce dsinfectant. Les figures III-26 et III-27 prsente les
rsultats des tests de dsinfection raliss sur les cellules de S. aureus 53154 adhrentes
lacier respectivement conditionn ou non par la SAB ou la PHMB.

Conditionnement

Adhsion

Dsinfection

Mortalit : 1,6% 47,5% 2,5% 68,7%

Figure III-26 : Influence du conditionnement de lacier AISI 316 par la SAB sur la sensibilit de S. aureus
53154 la dsinfection avec la PHMB (% de cellules mortes).

134
 Comme nous lavons prcdemment observ (cf III-1), et en accord avec des tudes
antrieures (Al-Makhlafi et al., 1994 ; Barnes, 1999), un conditionnement de surface par la
SAB (Figure III-25) induit une diminution du taux de biocontamination par S. aureus 53154
(respectivement 6,8.107 et 9,9.106 cellules/cm pour le tmoin et le support encrass avec la
SAB) alors que la PHMB adsorbe na pas dinfluence sur son adhsion lacier (Figure III-
27).

Conditionnement

Adhsion

Dsinfection

Mortalit : 1,6% 47,5% 4,5% 53,4%

Figure III-27 : Influence du conditionnement de lacier AISI 316 par la PHMB sur la sensibilit de S. aureus
53154 la dsinfection avec la PHMB (% de cellules mortes).

De plus, comme le montrent les rsultats des figures III-26 et III-27, nous avons pu observer
une faible mortalit des cellules adhrentes de S. aureus 53154 sur lacier conditionn avec la
SAB ou la PHMB (2,5 et 4,5% de la flore totale adhrente soit respectivement 2,5.105 et
3,3.106 bactries adhrentes mortes) comparativement lacier propre (1,1.106 cellules mortes
soit 1,6% des cellules totales adhrentes).

135
 Il est noter quaprs le traitement de dsinfection par la PHMB ; le pourcentage de la
population adhrente morte passe de 47,5% de la flore totale adhrente sur lacier non
conditionn respectivement 53,4% et 68,7% des bactries totales adhrentes sur lacier
conditionn avec la PHMB et la SAB. Ainsi, les deux conditionnements de surface amliorent
lactivit bactricide de la PHMB sur cellules adhrentes.

Laugmentation du pouvoir ltal de la PHMB peut certes tre due une diminution du
nombre de cellules adhrentes (il y a alors un ratio molcules dsinfectantes/cellules plus
important) mais aussi et surtout une modification de la physiologie des cellules adhrentes.
En effet, ladhsion microbienne aux surfaces, o peuvent se concentrer les nutriments, est
une stratgie de survie des micro-organismes. Les cellules bactriennes en mtabolisant les
protines adsorbes (Samuelsson et Kirchman, 1990 ; Bower et al., 1998) modifient leur
physiologie comparativement aux bactries adhrentes des surfaces exemptes de nutriments.
Ainsi, et en accord avec une tude prcdemment ralise sur Lactococcus lactis (Allion
2000), une conditionnement protique de la surface entrane une augmentation de la
population bactrienne viable adhrente. De ce fait, sachant que les biocides ont une meilleure
activit sur les cellules non stresses (Lisle et al., 1999), la PHMB tue plus de bactries
adhrentes.

Ainsi, les conditionnements de surface influencent non seulement le comportement

bioadhsif des micro-organismes aux surfaces mais galement leur activit mtabolique et
ainsi leur ractivit vis vis des molcules dsinfectantes.

136
 IV.4. CONCLUSION

Dans cette dernire tape du travail, nous avons mis en vidence limpact de la qualit
de leau (force ionique, nature des ions prsents) sur ladsorption de molcules la surface
de lacier, phnomne important car ayant un impact sur les forces dadhsion entre micro-
organismes et surface rceptrice.
De plus, nous avons montr que les molcules encrassantes adsorbes ont une influence
sur la viabilit des cellules adhrentes notamment sur P. aeruginosa A22, souche
bactrienne particulirement sensible labsence de matires organiques. Cependant, le
conditionnement de lacier par les principes actifs antimicrobiens a peu ou pas dactivit
bactricide sur les bactries adhrentes suite limmobilisation des agents dsinfectants
par leur groupement fonctionnel ou encore ladsorption du RBS 35 pendant la
prparation des chantillons dacier.
En revanche, il est noter que lencrassement des surfaces, notamment par des
protines, en modifiant la physiologie cellulaire amliore lactivit bactricide dun
dsinfectant, la PHMB, ayant peu defficacit bactricide sur cellules adhrentes en 5
minutes de contact.

137
SYNTHESE GENERALE

Le principal objectif de cette tude tait de mettre au point un protocole rapide permettant
de dterminer lactivit antimicrobienne de produits dsinfectants sur cellules adhrentes afin
damliorer lefficacit des formulations dsinfectantes et/ou doptimiser les procdures
dhygine qui y sont associes.

Pour atteindre cet objectif, quatre tapes ont t dfinies comme suit :

- Choix des modles microbiens et des protocoles de conservation et de croissance des

micro-organismes slectionns. Pour cela, nous avons tudi limpact de diffrentes
conditions de conservation et de croissance sur les caractristiques physico-chimiques de
surface de souches sauvages et de collection ainsi que sur leur sensibilit aux dsinfectants.

- Dfinition dun protocole dadhsion reproductible permettant de mettre en place un

test pour valuer lactivit bactricide dagents antimicrobiens sur cellules adhrentes ;
protocole reposant sur lutilisation de mthodes classiques de microbiologie.

- Optimisation de ce protocole, notamment dans le caractre in situ ainsi que dans le

dlai dattente des rsultats.

- Ce protocole optimis a ensuite t appliqu pour dterminer limpact de

lenvironnement des micro-organismes (duret de leau, prsence dun film primaire) sur leur
comportement bioadhsif et sur la viabilit des cellules fixes .

Afin de standardiser les protocoles de conservation et de croissance des souches

bactriennes pour la suite de ltude, il tait essentiel, dans un premier temps, de dterminer
limpact de ces protocoles sur i) les proprits physico-chimiques de surface des bactries et
ii) leur sensibilit des agents antimicrobiens. Pour cela, nous avons test diffrentes

138
conditions de stockage et de mise en culture sur des souches de collection ainsi que sur des
souches sauvages.

Considrant que la conservation des micro-organismes doit avant tout assurer leur survie
sur une priode de temps donne (Carvalho et al., 2003, Mihoub, 2003), plusieurs techniques
de stockage, bases sur la diminution de lactivit mtabolique des micro-organismes sont
proposes. Les micro-organismes peuvent tre lyophiliss, congels ( -20C, -80C ou -
196C) ou encore ensemencs sur glose et stocks 4C.

Bien quessentiels, ces principes fondamentaux restent aujourdhui et le plus souvent au libre
arbitre des exprimentateurs. Ainsi, certaines quipes conservent leurs souches 4C, dautres
-20C ou -80C et ce, sur des dures variant de quelques semaines plusieurs mois. Pour
palier cette diversit et faciliter la comparaison dessais inter - laboratoires, des organismes
de normalisation prconisent des protocoles standardiss. Ces protocoles reposent le plus
souvent sur la ralisation dun stock primaire congel et dun stock de travail pouvant tre
laiss 4C pendant plusieurs semaines (Anonyme, 2000a ; Anonyme, 2000b).

Cependant, sur la base des donnes obtenues, le stockage 4C sur glose nutritive ne devrait
tre utilis que pour des temps de stockage trs courts (infrieurs un mois) contrairement
la conservation -80C, notamment pour les bactries psychrotrophes.

Concernant les conditions de culture et notamment ltat physique du milieu nutritif utilis,
une mme variabilit peut tre rencontre. Il est aujourdhui clairement tabli que la
composition du milieu (Bonet et al, 1993 ; Horska et al, 1993), le pH (Briandet, 1999 ; Steiner
et Sauer, 2001) et la temprature dincubation (Vatanyoopaisarn et al., 2000) peuvent
influencer le mtabolisme bactrien (Ggi et al, 1991 ; Laurent et al., 2000) ainsi que les
proprits physico-chimiques de surface des micro-organismes (Hill et James, 1972 ;
Briandet, 1999 ; Santiago et al, 1999). En revanche, peu de travaux ont port sur limpact de
ltat physique du milieu de culture (i.e. solide ou liquide) sur ces proprits (Ljungh et al.,
1985 ; Bakholdina et al., 2001 ; Kiers et al., 2001).

Les travaux raliss dans le cadre de cette tude nous ont permis de mettre en vidence des
caractristiques physico-chimiques de surface diffrentes entre souches de collection et
souches sauvages mais galement de montrer une volution de ces caractristiques,
notamment de lhydrophilie de surface des souches bactriennes slectionnes, en fonction de
ltat physique du milieu de culture utilis (glose ou bouillon nutritif). Cet effet tait
nettement plus marqu pour les souches sauvages que pour les souches de collection.

139
En bouillon, les micro-organismes sont libres (cellules planctoniques) alors que sur glose
ils peuvent tre apparents des cellules fixes . A limage du dveloppement des cellules
en biofilms, les colonies bactriennes se dveloppant sur glose ne bnficient pas dun
apport en lments nutritifs et en oxygne homogne en tous points. Ce mode de croissance
peut donc conduire une htrognit spatio-temporelle de lactivit mtabolique des micro-
organismes (Huang et al.,1998 ; Lai et al., 1997 ; Choo-Smith et al., 2001 ; Sauer et al.,
2002,), et ainsi une volution de la composition lmentaire de paroi (Perrot et al., 2000).
Les micro-organismes cultivs sur TSA affichaient gnralement une hydrophobie de surface
plus importante que leur homologues cultives en TSB.

Ainsi, cette volution, vraisemblable rponse adaptative leur environnement chimique et

physique, pourrait modifier leur rponse laction dagents antimicrobiens ainsi que leur
comportement bioadhsif.

Sachant quau temps 0 de conservation, la temprature de stockage navaient pas

dinfluence sur les caractristiques physico-chimiques de surface des micro-organismes, nous
avons retenu pour la suite de ltude les deux modes de croissance suivants :

- Conservation des micro-organismes - 80 C (2 mois maximum) puis culture

en TSB 37 C (Protocole gnralement utilis dans les laboratoires de recherche).

- Conservation des bactries 4 C (une semaine maximum) puis

ensemencement sur TSA en pente et incubation 37 C (Protocole de croissance des
micro-organismes selon les instructions des normes AFNOR).

Ayant montr que les cellules bactriennes slectionnes et plus particulirement les
souches sauvages, prsentaient des proprits physico-chimiques de surface diffrentes en
fonction du modes de croissance choisi, nous nous sommes ensuite attachs valuer limpact
de ces conditions de culture sur leur rponse la dsinfection.

Les agents antimicrobiens sont gnralement classs selon leur molcule constitutive dont
la structure chimique, la charge et la taille dterminent leur activit sur les micro-organismes
(Russell, 1991) mais galement leur adsorption la surface des cellules microbiennes (Joly,
1995). Ainsi, nous avons choisi de tester lactivit bactricide de trois agents antimicrobiens
appartenant des familles chimiques diffrentes et gnralement employs dans les

140
formulations dsinfectantes i.e. un oxydant (lacide peractique), un ammonium quaternaire
(le chlorure de didcyl-dimthyl-ammonium) et un sel de biguanide (le chlorure de
poly(hexamthylne-biguanide)).

Nous avons pu observer, dans nos conditions exprimentales, une augmentation de la

concentration minimale bactricide avec la taille et la spcificit du mode daction de la
molcule dsinfectante. Ainsi, lacide peractique, petite molcule hydrophile action
antimicrobienne non spcifique, est apparu comme tant le plus efficace quelles que soient les
conditions de culture testes avec des CMB infrieures ou gales 20ppm. Concernant les
agents antimicrobiens action ltale plus spcifique tests (lammonium quaternaire et le sel
de biguanide), une nette influence des conditions de croissance des bactries (milieu de
culture solide ou liquide) a pu tre mise en vidence sur leur activit bactricide ; les micro-
organismes affichant une hydrophilie de surface ngligeable ncessitent des CMB plus leve.
De plus, des diffrences de sensibilit vis vis des dsinfectants entre les souches de
collection et les souches sauvages ont pu tre notes. Lorsque les souches de collection
apparaissent plus rsistantes que les sauvages, il peut alors y avoir une surestimation de la
quantit de produit utiliser entranant ainsi dventuels problmes cologiques lors de
dlimination des produits dsinfectants. En revanche, une rsistance plus importante des
souches sauvages testes comparativement celles utilises pour les normes de dsinfection,
notamment pour la PHMB, induira une sous-estimation de la quantit de produit utiliser.

Les micro-organismes soumis une concentration peu ou pas efficace pourront alors
sadapter au dsinfectant et leur limination sera alors plus difficile. Des souches
frachement isoles du terrain ou connues comme tant rsistantes aux agents
antimicrobiens devraient donc tre ajoutes aux tests de validation des dsinfectants
avant leur mise sur le march.

Aprs avoir tudi linfluence du milieu environnent (solide ou liquide) pendant la

croissance des cellules sur leur sensibilit aux dsinfectants, nous nous sommes intresss
ltat adhrant, mode de dveloppement gnralement rencontr dans lhabitat naturel des
micro-organismes, afin de mettre en place un protocole dadhsion reproductible.

Dans cette seconde partie de ltude, nous avons pu observer une volution du
comportement bioadhsif des cellules bactriennes en fonction du support solide utilis

141
i.e. acier inoxydable AISI 316 ou PTFE ; mais galement en fonction des conditions de
croissance testes.

Quelle que soit la technique de dnombrement des cellules adhrentes utilises (dcrochage et
ensemencement des cellules en milieu nutritif ou observation microscopique), le protocole
utilis pour raliser les essais dadhsion permettait dobtenir des rsultats reproductibles.

Afin davoir suffisamment de cellules adhrentes dnombrables par des techniques classiques
de microbiologie (dcrochage et ensemencement en milieu nutritif) pour la suite des
exprimentations, nous avons choisi dutiliser lacier inoxydable AISI 316 comme support
rcepteur pour les tests de dsinfection sur cellules fixes.

En accord avec des tudes antrieures, nous avons, dans cette seconde partie de ltude,
galement confirm laugmentation de la rsistance des micro-organismes adhrant aux
dsinfectants comparativement leurs homologues planctoniques.

Cependant, ce protocole, bas sur le dcrochage et la mise en culture des micro-

organismes, est lourd et long mettre en uvre. Ainsi, dans la troisime partie de ltude, il
est apparu ncessaire doptimiser ce protocole et ainsi de dvelopper une mthodologie
simple et rapide permettant dvaluer, in situ, lactivit bactricide des dsinfectants sur des
micro-organismes adhrant des surfaces inertes.

A cette fin, nous avons choisi dutiliser deux fluorochromes : le premier permettant de
diffrencier les micro-organismes viables des micro-organismes morts (SYTOX Green) et le
second marquant toutes les cellules quel que soit leur viabilit (DAPI). Le principe de cette
double coloration est bas sur lexclusion du SYTOX Green par les cellules dites intactes
et sur sa pntration dans les cellules dont la membrane cytoplasmique lse et donc mortes.

Cette technique a ainsi permis dobtenir des rsultats dans la journe alors que les techniques
classiques ncessitent de 24 48 h de dlai de rponse (temps de croissance de micro-
organismes ensemencs en glose nutritive). En accord avec les rsultats obtenus par
ensemencement en glose nutritive, cette technique a permis de montre laugmentation de
rsistance des bactries adhrentes aux dsinfectants comparativement aux cellules
planctoniques. Cependant, la prsence damas bactriens peut gner lanalyse des rsultats et
entraner une sous ou une surestimation du nombre de cellules mortes. Ainsi, ce protocole
nest utilisable que pour des cellules fixes en monocouche. Dautres outils danalyse, tel que

142
le microscope confocale laser, devront alors tre employs pour ltude de bactries
adhrant en amas ou en biofilms.

Il est noter que le nombre de cellules viables cultivables obtenu par ensemencement tait
gnralement infrieur celui de la population viable dtermin par la double coloration ;
diffrence probablement lie une diminution de la cultivabilit des micro-organismes suite
aux stess induit par la dsinfection (Caro et al, 1999). Ainsi, la technique de double coloration
in situ permet destimer lefficacit antimicrobienne des agents bactricides sur la population
adhrente totale en limitant le nombre dtapes intermdiaires (dcrochage, dilutions
successives) pouvant entraner une perte du nombre de micro-organismes cultivables.

Dans la dernire partie de ltude, cette technique a t applique des cas plus proches des
conditions relles dutilisation des dsinfectants i.e. prsence de matires encrassantes, duret
de leau. Nous avons ainsi montr que les molcules encrassantes adsorbes pouvaient avoir
un impact sur la viabilit des cellules adhrentes notamment sur P. aeruginosa A22, souche
bactrienne particulirement sensible labsence de matires organiques. Cependant, les
principes actifs antimicrobiens adsorbs pralablement ladhsion bactrienne nont eu que
peu ou pas dactivit bactricide sur les bactries adhrentes.
Enfin, il est important de noter quun conditionnement des surfaces, notamment par des
protines, en modifiant le mtabolisme des cellules adhrentes,t probablement en levant
le stress nutritionnel, a permis damliorer lactivit bactricide dun dsinfectant, la
PHMB, peu defficacit sur cellules adhrentes.

143
CONCLUSION - PERSPECTIVES

Comme indiqu prcdemment, la biocontamination des surfaces reste un problme

dactualit dans de nombreux secteurs dapplication et en particulier dans le domaine mdical
et les industries agro-alimentaires. Pour rduire ou liminer les germes indsirables (bactries
pathognes ou daltration), des actions curatives bases sur lutilisation dagents
antimicrobiens sont rgulirement pratiques avec une plus ou moins grande efficacit.
Optimiser ces actions demeure donc un enjeu majeur sur lequel les Laboratoires ANIOS et
lUnit de recherche en bioadhsion et hygine des matriaux de lINRA focalisent une partie
de leurs activits. Cette optimisation passe notamment par le dveloppement de nouvelles
formulations dsinfectantes, formulations dont il convient de tester lefficacit par une
mthode standardise, simple et rapide mettre en uvre, non seulement sur cellules
planctoniques mais galement sur cellules adhrentes (et non pas simplement dposes). Cest
pour dvelopper une telle mthodologie (jusqu prsent inexistante) que le travail ici
prsent a t ralis. Nanmoins et outre laspect appliqu, cette tude visait galement
comprendre limpact de paramtres environnementaux (conservation, croissance, tat libre ou
fix) sur la ractivit des cellules bactriennes vis--vis de molcules antimicrobiennes.

Dun point de vue applicatif, ayant montr que lusage de souches de collection associ
un mode de conservation et de croissance donn pouvait entraner une sous ou sur-estimation
de lactivit bactricide des molcules antimicrobiennes testes, nous recommandons lissue
de ce travail de raliser les tests de dsinfection sur des souches sauvages et de collection (
Gram positif et Gram ngatif) conserves -80C et cultives sur glose ou en bouillon
nutritif.

Concernant les essais dadhsion (essais prliminaires la dsinfection), il nous parat

aujourdhui important de les raliser sur supports hydrophobes et hydrophiles, dans un milieu
simple ou complexe et dliminer les germes simplement dposs par un rinage en eau
distille et/ou en eau dure (notamment lorsque lon veut simuler des situations relles ).
Les dnombrements microbiens quant eux devraient tre effectus in situ de faon limiter
les passages dinterfaces liquide/air et viter les stress physiologiques lis aux techniques
de dcrochage. Ces mmes recommandations peuvent tre prconises pour les essais de

144
dsinfection. Enfin et compte tenu des carts parfois observs entre dnombrements
classiques (aprs ensemencement en glose nutritive) et dnombrements par microscopie
pifluorescence, il nous semble aujourdhui important de poursuivre les travaux initis et
notamment dvaluer limpact dtapes de revivification (tapes couramment pratiques sur
cellules stresses) sur les rsultats de dnombrements de flore viable cultivable ayant
rsiste au stress de ladhsion et de la dsinfection. Lutilisation de fluorochromes
spcifiques de certaines fonctions mtaboliques ou encore la synthse de protines
fluorescentes (via linsertion du gne de la Green Fluorescent Protein par exemple) par les
bactries fixes pourraient galement permettre dvaluer leur activit physiologique et donc
de distinguer les cellules mortes, des cellules stresses, en phase de dormance, ou encore des
cellules viables cultivables. Il serait alors possible de dterminer limpact de ltat adhrent
sur le mtabolisme bactrien.

Par ailleurs, la technique de dnombrement in situ par microscopie pifluorescence, bien

que simple et rapide mettre en uvre, reste limite ltude de systmes en deux
dimensions i.e. adhsion cellulaire en monocouche. Pour tendre ce type de techniques des
systmes plus complexes impliquant des agrgats cellulaires et des biofilms, il suffit de
remplacer le microscope pifluorescence par un microscope confocale laser (MCL). En
outre, ce microscope pourrait nous permettre de suivre la diffusion de molcules
antimicrobiennes au travers ddifices bactriens plus ou moins complexes. Ces
exprimentations permettraient ainsi damliorer la comprhension des mcanismes daction
des molcules dsinfectantes sur cellules fixes .

De plus, cette technique de distinction entre cellules viables et cellules mortes pourrait tre
applique ltude de biofilms plurimicrobiens. Lajout de marqueurs immunochimiques
permettrait ainsi la diffrenciation entre bactries Gram positif et Gram ngatif et entre
diffrentes espces bactriennes. Il serait alors possible dobserver dune part la rpartition
des diffrentes espces bactriennes au sein de ces biofilms et dautre part les interactions
microbiologiques (comptition, commensalisme) entre espces bactriennes vis--vis
dagressions extrieures telles que des procds de dsinfection chimiques ou diffrents
traitements physiques (chaleur, UV).

Enfin, mme si cette technique a t labore pour valuer lactivit bactricide des
produits dsinfectants sur cellules adhrentes, elle pourrait galement tre utilise pour la
mise au point de nouveaux matriaux ayant un effet anti-adhsion et/ou antimicrobien pour
les industries agro-alimentaires ou le domaine mdical.

145
REFERENCES BIBLIOGRAPHIQUES

146
Aaron S.D., Ferris W., Ramotar K., Vandemheen K., Chan F. and Saginur R. 2002. Single and
Combination Antibiotic Susceptibility of Planktonic, adherent, and Biofilm-Grown Pseudomonas
aeruginosa Isolates Cultured from Sputa of Adults with Cystic Fibrosis. Journal of Clinical
Microbiology, 40, pp 4172-4179.

Alais C. 1974. Sciences du lait. Principes et techniques laitires.

Allion A. 2000. Etude de ladsorption protique aux interfaces solide-liquide : consquences sur
ladhsion bactrienne. Diplme dEtudes Approfondies en Sciences Alimentaires, ENSIA.

Al-Makhlafi H., McGuire J. and Daeschel M. 1994. Influence of Preadsorbed Milk Proteins on
Adhesion of Listeria monocytogenes to Hydrophobic and Hydrophilic Silica Surfaces. Applied and
Environmental Microbiology, 60, pp 3560-3565.

Al-Masaudi S.B., Day M.J. and Russell A.D. 1988. Sensitivity of methicillin-resistant Staphylococcus
aureus strains to some antibiotics, antiseptics and disinfectants. Journal of Applied Bacteriology, 65,
pp 329-337.

An Y.H. and Friedman R.J. 1998. Concise Review of Mechanisms of Bacterial Adhesion to
Biomaterial Surfaces. Journal of Biomed. Mater. Res. , 43, pp 338-348.

Anderl J.N., Franklin M.J. and Stewart P.S. 2000. Role of Antibiotic Penetration Limitation in
Klebsiella pneumoniae Biofilm Resistance to Ampicillin and Ciprofloxacin. Antimicrobial Agents and
Chemotherapy, 44, pp 1818-1824.

Annous B.A., Becker L.A., Bayles D.O., Labeda D.P. and Wilkinson B.J. 1997. Critical role of
anteiso-C15 : 0 fatty acid in the growth of Listeria monocytogenes at low temperatures. Applied and
Environmental Microbiology, 63, pp 3887-3894.

Anonyme. 1997. Norme AFNOR NF EN 1276. Antiseptiques et dsinfectants chimiques Essai

quantitatif de suspension pour lvaluation de lactivit bactricide des antiseptiques et des
dsinfectants chimiques utiliss dans le domaine agro-alimentaire, dans lindustrie, dans les domaines
domestiques et en collectivit.

Anonyme, 1998. Recueil de normes et rglementations : Antiseptiques et dsinfectants, Association

franaise de normalisation, AFNOR ed., Paris.

Anonyme. 2000a. Testing Disinfectants against Staphylococcus aureus. AOAC. Official Method
991.48.

Anonyme. 2000b. Norme AFNOR NF EN 12353. Antiseptiques et dsinfectants chimiques -

Conservation des souches microbiennes utilises pour la dtermination de lactivit bactricide et
fongicide.

Anonyme. 2001. Norme AFNOR NF EN 13697. Antiseptiques et dsinfectants chimiques Essai

quantitatif de surface non-poreuse pour lvaluation de lactivit bactricide et/ou fongicide des
dsinfectants chimiques utiliss dans le domaine agro-alimentaire, dans lindustrie, dans les domaines
domestiques et en collectivit.

Asther M., Bellon-Fontaine M.-N., Capdevila C., and Corrieu G., 1990. A thermodynamic Model to
Predict Phanerochaete chrysosporium INA-12 Adhesion to Various Solid Carriers in Relation to
Lignin Peroxidase Production. Biotechnology and Bioenginiring, 35, pp 477-482.

Baillie G.S. and Douglas L.J. 1998. Iron-Limited Biofilms of Candida albicans and Their
Susceptibility to Amphotericin B. Antimicrobial Agents and Chemotherapy, 42, pp 2146-2149.

147
Bakholdina S.I., Krasikova I.N., Buzoleva L.S., Shubin F.N., Soloveva T.F. 2001. Effects of culture
method and growth phase on free lipid composition of Yersinia pseudotuberculosis. Biochem. (Mosc),
66, pp 415-421.

Barbusiaux C., Saglio J.F., Chavarot A. et Berer G. 1993. Arrt du 15 juin 1993modifiant et
compltant larrt du 27 octobre 1975 relatif aux produits de nettoyage du matriel pouvant se
trouver en contact ave des denres alimentaires. Journal Officiel de la Rpublique Franaise, 20 juillet
1993.

Barnes L.M., Lo M.F., Adams M.R. and Chamberlain A.H.L. 1999. Effect of Milk Proteins on
Adhesion to Stainless Steel Surfaces. Applied and Environmental Microbiology, 65, pp 4543-4548.

Bartoli M. et Dusseau J.Y. 1995. Oxydants. Dans : Antisepsie et Dsinfection. Fleurette J., Fresney J.
et Reverdy M.E. (Eds.), Editions Eska, pp 305-314.

Bayles D.O., Annous B.A. and Wilkinson B.J. 1996. Cold stress Proteins Induced in Listeria
monocytogenes in Response to Temperature Downshock and Growth at Low Temperatures. Applied
and Environmental Microbiology, 62, pp 1116-1119.

Beerens H. 1985. Critres de choix des dsinfectants dans lindustrie alimentaire. Revue de lInstitut
Pasteur de Lyon, 18, 205-214.

Bellon-Fontaine M.-N., Mozes N., van der Mei H., Sjollema J., Cerf O., Rouxhet P.G. and Busscher
H.J. 1990. A comparison of thermodynamic approaches to predict the adhesion of dairy
microorganisms to solid substrata. Cell Biophysics,17, pp 93-106.

Bellon-Fontaine M.-N. et Cerf O. 1991. Mcanisme dadhsion des micro-organismes aux surfaces :
facteurs influant sur ladhsion. Industries agro-alimentaires, Jan-Fv, pp 13-17.

Bellon-Fontaine M.-N., Rault J. and Van Oss C. J. 1996. Microbial adhesion to solvents : a novel
method to determine the electron-donor/electron-acceptor or Lewis acid-base properties of microbial
cells. Coloids and Surfaces B : Biointerfaces, 7, pp 47-53.

Besnard V. 2002. Ltat viable non cultivable dun pathogne dintrt majeur en hygine des aliments
: Listeria monocytogenes. Etude de la physiologie, des conditions de retour ltat cultivable et de la
virulence. Thse de Doctorat, facult des Sciences et Technologies de Nantes. 242p.

Best M., Kennedy M.E. and Coates F. 1990. Efficacity of a Variety of Disinfectants against Listeria
spp. Applied and Environmental Microbiology, 56, pp377-380.

Blackman I.C. and Franck J.F. 1996. Growth of Listeria monocytogenes as a Biofilm on Various
Food-Processing Surfaces. Journal of Food Protection, 59, pp 827-831.

Block S.S. 1977. Definition of Terms. In: Disinfecion, Sterilisation and Preservation. Block S.S. (Ed),
Lea & Febiger (Philadelphia), pp 1025-1029.

Bonet R., Simon-Pujol M.D. et Congregado F. 1993. Effects of Nutrients on Exopolysaccharide

Production and Surface properties of Aeromonas salmonicida. Applied and Environmental
Microbiology, 59, pp 2437-2441.

Boulang-Petermann L. 1993. Etude physico-chimique et lectrochimique de ladhsion de

Leuconostoc mesenteroides et Streptococcus thermophilus des surfaces dacier inoxydable. Thse de
doctorat, Universit de Nancy I, 146p.

148
Boulang-Petermann L., Baroux B. et Bellon-Fontaine M.-N. 1994. Mcanismes dadhsion des
micro-organismes aux surfaces mtalliques : Nettoyabilit des surfaces dacier inoxydable. ndustries
agro-alimentaires, Octobre, pp 671-676.

Boulang-Petermann L., Doren A., Baroux B. and Bellon-Fontaine M.-N. 1995. Zeta Potential
Measurments on Passive Metals. Journal of Colloid and Interface Science, 171, pp 179-186.

Bouttier S.,. Linxe C., Bellon-Fontaine M.-N. and Fourniat J. 1997. Attachment of Salmonella
choleraesuis choleraesuis to Beef Muscle and Adipose Tissues. Journal of Food Protection, 60, pp
16-22.

Bower C.K., Daeschel M.A. and McGuire J.1998. Protein Antimicrobial Barriers to Bacterial
Adhesion. Journal of Dairy Science, 81, pp 2771-2778.

Brading M.G., Jass J. and Lappin-Scott H.M. 1995. Dynamics of Bacterial Biofilm Formation. In
Lappin-Scott H.M., Costerton J.W. (Eds), Microbial Biofilms, pp 15-45, University Press, Cambridge.

Briant J. 1989. Phnomnes dinterface, agents de surface : Principes et modes daction. Editions
Technip, Paris, 340p.

Briandet R. 1999. Matrise de lhygine des surfaces par la cration de biofilms Aspects physico-
chimiques. Thse de doctorat, Ecole Nationale Suprieure Agronomique de Rennes, Rennes, 170p.

Broxton P., Woodcock P.M., Heathly F. and Gilbert P. 1984. Interaction of some polyhexamethylene-
biguanides and membrane phospholipids in Escherichia coli. Journal of Applied Bacteriology; 57, pp
115-124.

Buncic S. and Avery S.M. 1996. Relationship between variations in pathogenicity and lag phase at
37C of Listeria monocytogenes previously stored at 4C. Letters in Applied Microbiology, 23, pp 18-
22.

Bunthof C.J., van den Braak S., Breeuwer P., Rombouts F.M. and Abee T. 1999. Rapid Fluorescence
Assessment of the Viability of Stressed Lactococcus lactis. Applied and Environmental Microbiology,
65, pp 3681-3689.

Busscher H.J., Weerkamp H.C, van der Mei H.C., van Pelt A.W.J. de Jong H.P. and Arends J. 1984.
Measurement of the surface free energy of bacterial cell surfaces and its relevance for adhesion.
Applied and Environmental Microbiology, 48, pp 980-983.

Busscher H.J., Weerkamp A.H. 1987. Specific and non-specific interactions in bacterial adhesion to
solid substrata. FEMS Microbiology Reviews, 46, pp 165-173.

Busscher H.J., Bos R. and van der Mei H.C. 1995. Initial microbial adhesion is a determinant for the
strength of biofilm adhesion. FEMS Microbioly Letters, 46, pp 229-234.

Campanac C., Pineau L., Payard A., Baziard-Mouysset G. and Roques C. 2002. Interactions between
Biocide Cationic Agents and Bacterial Biofilms. Antimicrobial Agents Chemotherapy, 46, 1469-1474.

Caro A., Got P., Lesne J., Binard S. and Baleux B. 1999. Viability and Virulance of Experimentally
Stressed Nonculturable Salmonella typhimurium. Applied and Environmental Microbiology, 65, pp
3229-3232.

Carter D.C. and Ho J.X. 1994. Structure of serum albumin. Adv. Prot. Chem., 45, pp 153-205.

149
Caruso G., Mancuso M. and Crisafi E. 2003. Combined fluorescent antibody assay and viability
staining for the assessment of the physiological states of E. coli in seawaters. Journal of Applied
Microbiology, 95, pp 225-233.

Carvalho A.S., Silva J., Ho P., Teixeira P., Malcata F.X. and Gibbs P.. 2003. Effect of various growth
media upon survival during storage of freeze-dried Enterococcus faecalis and Enterococcus durans.
Journal of Applied Microbiology, 94, pp 947-952.

Chavant P., Martinie B., Meylheuc T., Bellon-Fontaine M.-N. and Hbraud M. 2002. Listeria
monocytogenes LO28 : Surface Physicochemicl properties and Ability To Form Biofilms at Different
Temperatures and Growth Phases. Applied and Environmental Microbiology, 68, pp 728-737.

Chevallier I. 2002. Influence des interactions acido-basiques sur lencrassement et la biocontamination

de supports mtalliques oxyds. Thse de Doctorat Universit Paris XI Orsay, 155p.

Choo-Smith L.-P., Maquelin K., van Vreeswijk T., Bruining H.A., Puppels G.J., ngo Thi N.A.,
Kirschner C., Naumann D., Ami D., Villa A.M., Orsini F., Doglia S.M., Lamfarraj H., Sockalingum
G.D., Manfait M., Allouch P. and Endtz H.P. 2001. Investigating Microbial (Micro)colony
Heterogeneity by Vibrational Spectroscopy. Applied and Environmental Microbiology, 67, pp 1461-
1469.

Chumkhunthod P., Schraft H. and Griffiths M.W. 1998. rapid Monitoring Method to Assess Efficacity
of Sanitizers against Pseudomonas putida Biofilms. Journal of Food Protection, 61, pp 1043-1046.

Crmieux A. et Freney J. 1995. Bases fondamentales de laction antimicrobienne des antiseptiques et

des dsinfectants : les mcanismes daction antimicrobienne. Dans : Antisepsie et dsinfection,
Fleurette J., Freney J. et Reverdy M.E., eds., Editions Eska, pp 23-37.

Darbord J.-C. 1998. Evolution de la normalisation: antiseptiques et disinfectants. Annales

pharmaceutiques franaises, 56, pp 45-46.

Darouiche R.O. 2001. Device-associated infections: a macroproblem that starts with microadherence,
Clinical Infection Disease, 33, pp 1567-1572.

Davies D.G., Chakrabarty A.M. and Geesey G.G. 1993. Exopolysaccharide Production in Biofilms:
Substratum Activation of Alginate Gene Expression by Pseudomonas aeruginosa. Applied and
Environmental Microbiology, 59, pp 1181-1186.

De Beers D., Srinivasan R. And Stewart P.S. 1994. Direct Measurement of Chlorine Penetration into
Biofilms during Disinfection. Applied and Environmental Microbiology, 60, pp 4339-4344.

Donlan R.M. and Costerton J.W. 2002. Biofilms: Survival Mechanisms of Clinically Relevant
Microorganisms. Clinical Microbiology Reviews, 15, pp 167-193.

Drenkard E. 2003. Antimicrobial resistance of Pseudomonas aeruginosa Biofilms. Microbes and

Infection, 5, pp 1213-1219.

Dupr A. 1869. Thorie mcanique de la chaleur, Gauthier-Villars, Paris, pp 367-370.

Duval J. 1989. Classification et mcanisme d'action des agents antibactriens. Bactriologie mdicale,
pp 273-296

Fiedler F. 1988. Biochemistry of the Cell Surface of Listeria Strains : A Locating General View.
Infection, 16, pp S92-S97.

150
Fiksdal L. and Tryland I. 1999. Effect of u.v. light irradiation, starvation and heat on Escherichia coli
-D-galactosidase activity and other potential viability parameters. Journal of Applied Microbiology,
87, pp 62-71.

Fletcher M. 1976. The Effects of Proteins on Bacterial Attachment to Polystyrene. Journal Genetic
Microbiology, 94, pp 400-404.

Fletcher M. and Loeb G.I. 1979. Influence of Substratum Characteristics on the Attachment of a
Marine Pseudomonad to Solid Surfaces. Applied and Environmental Microbiology, 37, pp 67-72.

Fletcher M. 1988. Attachment of Pseudomonas fluorescens to glass and influence of electrolytes on

bacterium substratum separation distance. Journal of Bacteriology, 170, pp 2027-2030.

Freney J. 1995. Composs phnoliques. Dans : Antisepsie et dsinfection, Fleurette J., Freney J. et
Reverdy M.E., eds., Editions Eska, pp 90-134.

Frank J. and Koffi R. 1990. Surface-adherent Growth of Listeria monocytogenes is Associated with
Increased Resistance to Surfactant Sanitizers and Heat. Journal of Food Protection, 53, pp 550-554

Fukuzaki S., Urano H. and Nagata K. 1996. Adsorption of Bovine Serum Albumin onto Metal Oxide
Surfaces. Journal of fermentation and Bioengineering, 81, 163-167.

Garry P. 1997. Proprits physico-chimiques de surface en polyurethane et consquences sur

lencrassement et ladhsion de Bacillus subtilis et Bacillus cereus. Thse de Doctorat, Universit
Claude Bernard, Lyon. 124p.

Glinas P. and Goulet J. 1983. Efficacit de huit dsinfectants sur trois types de surfaces contamines
par Pseudomonas aeruginosa. Canadian Journal of Microbiology, 29, pp 1715-1729.

Giovannaci I., Ermel G., Salavt G., Vendeuvre J.L. and Bellon-Fontaine M.-N. 2000. Physicochemical
surface properties of five Listeria monocytogenes strains from a pork-processing environment in
relation to serotypes, genotypes and growth temperature. Journal of Applied Microbiology, 88, pp
992-1000.

Gomez-Suarez C., Busscher H.J. and van der Mei H. 2001. Analysis of Bacterial Detachment from
Substratum Surfaces by the Passage of Air-Liquid interfaces. Applied and Environmental
Microbiology, 67, pp 2531-2537.

Good R.J. 1960. Theory for estimation of surface interfacial energies. III. Estimation of surface energy
of solids from contact angle data. Journal of Physical Chemistry, 64, 561.

Gugi B, Orange N, Hellio F, Burini JF, Guillou C, Leriche F and Guespin-Michel JF. 1991. Effect of
growth temperature on several exported enzyme activities in the psychrotrophic bacterium
Pseudomonas fluorescens. Journal of Bacteriology, 173, pp 3814-3820.

Guilbert P., Pemberton D. and Wilkinson D.E. 1990. Barrier properties of the Gram-negative cell
envelope towards high molecular weight polyhexamethylene biguanides. Journal of Applied
Bacteriology, 69, pp 585-592.

Guiot E., Georges P., Brun A., Fontaine-Aupart M. P., Bellon-Fontaine M. N. and Briandet R. 2002.
Heterogeneity of Diffusion Inside Microbial Biofilms Determined by Fluorescence Correlation
Spectroscopy Under Two-photon Excitation. Photochemistry and Photobiology, 75, pp570-578.

Hamilton W.A. 1971. Membrane Active Antibacterial Compounds. In : Inhibition and Destruction of
the Microbial Cell. Hugo W.B. ed Academic press, London, pp 77-93.

151
Hancock I.C. 1991. Microbial Cell Surface Architecture. In Microbial Cell Surface Analysis :
Structural and Physicochemical Methods, eds., pp 21-59.

Hancock R.E.W. 1998. Resistance Mechanisms in Pseudomonas aeruginosa and Other

Nonfermentative Gram-Negative Bacteria. Clinical Infection Disease, 27 (Suppl 1), pp S93-S99.

Herry J.-M, Bellon-Fontaine M.-N. et Kondjoyan A. 2003. Analyse de la remise en suspension par une
bulle d'air de particules solides adhrant sur une surface plane. Colloque Prosetia Rennes.

Heidelberg J.F., Shahamat M., Levin M., Rahman I., Stelma G., Grim C. and Colwell R.R. 1997.
Effect of Aerosolization on Culturability and Viability of Gram-Negative Bacteria. Applied and
Environmental Microbiology, 63, pp 3585-3588.

Hiemenz P.C., Rajagopalan R. 1997. Principles of Colloid and Surfaces Chemistry. Marcel Dekker
Inc., New York.

Hill A.W. and James A.M. 1972. Effect of growth temperature on surface properties of cells of
Staphylococcus aureus with particular reference to methicillin-resistance. Microbios, 6, pp 169-178.

Hoffman R.K., 1971. Toxic Gases. Dans : Inhibition and Destruction of the Microbial Cell. Hugo
W.B. (ed.) Academic press, London, pp 226-285.

Hood S.K. and Zottola E.A. 1995. Adherence to stainless steel by foodborne microorganisms during
growth in model food systems. International Journal of Food Microbiology, 37, pp 145-53.

Horsk E., Pokorn J., Labajov M. 1993. Changes of surface charge and hydrophobicity of the outer
bacterial membrane depending on the cultivation medium. Biolgia (Bratislava), 48, pp 343-347.

Huang C. T., Xu K., McFeters G. A. and Stewart P. S. 1998. Spatial Patterns of Alkaline Phosphatase
Expression within Bacterial Colonies and Biofilms in Response to Phosphate Starvation. Applied and
Environmental Microbiology, 64, pp 1526-1531.

Hugo W.B. 1992. Mode of action of non-antibiotic antibacterial agents. In : Pharmaceutical

Microbiology. W.B. Hugo et A.D. Russell, eds., Blackwell Scientific Publications, Oxford, pp 288-
294.

Hugo W.B. and Russell A.D. 1992. Types of antimicrobial agents. In : Principles and Practice of
Disinfection, Preservation and Sterilisation. A.D. Russell, W.B. Hugo et G.A. Ayliffe, Eds Blackwell
Scientific Publications, 7-88.

James A.M. 1991. Charge properties of microbial cell surfaces. In: Microbial cell surface analysis.
Mozes N., Handley P.S., Busscher H.J. and Rouxhet P.G. (Eds), VCH Publishers, New York, pp 221-
262.

John S.F., Derrick M.R., Jacob A.E. and Handley P.S. 1996. The combined effects of plasma and
hydrogel coating on adhesion of Staphylococcus epidermidis and Staphylococcus aureus to
polyurethane catheters. FEMS Microbiology Letters, 144, pp 241-247.

Joly B. 1995. La rsistance microbienne laction des antiseptiques et disinfectants. Dans : :

Antisepsie et dsinfection, Fleurette J., Freney J. et Reverdy M.E. (Eds), Editions Eska, pp 52-65.

Jones C.E., Shama G., Jones D. , Roberts I.S. and Andrew P.W. 1997. Physiological and biochemical
studies on psychrotolerance in Listeria monocytogenes. Journal of Applied Microbiology, 83, pp 31-
35.

152
Jones M.V., Herd T.M. and Christie H.J. 1989. Resistance of Pseudomonas aeruginosa to amphoteric
and quaternary ammonium biocides. Microbios, 58, pp 49-61.

Joseph B., Otta SK., Karunasagar I. And Karunasagar I. 2001. Biofilm formation by salmonella spp.
on food contact surfaces and their sensitivity to sanitizers. International Journal of Food
Microbiology, 64, pp 367-72.

Jucker B.A., Harms H. and Zehnder A.J.B. 1996. Adhesion of the Positively Charged Bacterium
Stenotrophomonas(xanthomonas) maltophilia 70401 to Glass and Teflon. Journal of Bacteriology,
178, pp 5472-5479.

Kiers P.J.M., Bos R., van der Mei H.C. and Busscher H.J. 2001. The electrophoretic softness of the
surface of Staphylococcus epidermidis cells grown in a liquid medium and on a solid agar.
Microbiology, 147, pp 757-762.

King M.A. 2000. Detection of dead cells and measurement of cell killing by flow cytometry. Journal
of Immunological Methods, 243, pp 155-166.

Korber D.R., Lawrence J.R., Lappin-Scott H..M., Costerton J.W., 1995. Growth of Microorganisms on
Surfaces. In Lappin-Scott H.M., Costerton J.W. (Eds), Microbial Biofilms, pp 15-45, University Press,
Cambridge.

Krajewski A., Piancastelli A. and Malavolti R. 1998. Albumin adhesion on ceramics and correlation
with their Z-potential. Biomaterials, 19, 637-641.

Lai H.-C., Lai M.-J., Lin-Chao S., Lu K.-T. and Ho S.-W. 1997. Population Cell Differentiation of
Serratia marcescens on Agar Surface and in Broth Culture. Journal of Microbiology and Immunology,
30, pp 242-254.

Langsrud S. and Sundheim G. 1996. Flow cytometry for rapid assessment of viability after exposure to
a quaternary ammonium compound. Journal of Applied Bacteriology, 81, pp 411-418.

Langsrund S., Sundheim G. and Borgmann-Strahsen R. 2003. Intrinsec and acquired resistance to
quaternary ammonium compounds in food-related Pseudomonas spp. Journal of Applied
Microbiology, 95, pp 874-882.

Laurent P., Buchon L., Guespin-Michel J.F. and Orange N. 2000. Production of Pectate Lyases and
Cellulases by Chryseomonas luteola Strain MFCL0 Depends on the Growth Temperature and the
Nature of the Culture Medium: Evidence for Two Critical Temperatures. Applied and Environmental
Microbiology, 66, pp 1538-1543.

Lebaron P., Catala P. and Parthuisot N. 1998. Effectiveness of SYTOX Green Stain for Bacterial
Viability Assessment. Applied and Environmental Microbiology, 64, pp 2697-2700.

Lee J.C., Takeda S., Livolsi P.J. and Paoletti L.C. 1993. Effects of in vitro and in vivo growth
conditions on expression of type 8 capsular polysaccharide by Staphylococcus aureus. Infection and
Immunity, 61, pp 1853-1858.

Lifshitz E.M. 1955. Teoria molekouliarnir cil pritiagenia megdou tverlimi telami. Zurnal
Eksperimental noj I Teoric Eskoz Fizili,29, 94.

Lisle J.T., Pyle B.H. and McFeters G.A. 1999. The use of multiple indices of physiological activity to
access viability in chlorine disinfected Escherichia coli O157:H7. Letters in Applied Microbiology, 29,
pp 42-47.

153
Ljungh A., Hjerten S. and Wadstrom T. 1985. High Surface Hydrophobicity of Autoaggregating
Staphylococcus aureus Strains Isolated from Human Infections Studied with the Salt Aggregation
Test. Infection and Immunity, 47, pp 522-526.

Loughlin M.F., Jones M.V and Lambert P.A. 2002. Pseudomonas aeruginosa cells adapted to
benzalkonium show resistance to other membrane-active agents but not to clinically relevant
antibiotics. Journal of Antimicrobial Chemotherapy, 49, pp 631-639.

Lundn J., Autio T., Markkula A., Hellstrm S and Korkeala H. 2003. Adaptative and cross-adaptative
response of persistent and non-persistent Listeria monocytogenes strains to disinfectants. International
Journal of Food Microbiology, 82, pp 265-272.

Luppens S.B.I., Reij M.W., van der Heijden R.W.L., Rombouts F.M. and Abee T. 2002. Development
of a standard Test To Assess the Resistance of Staphylococcus aureus Biofilm Cells to Disinfectants.
Applied and Environmental Microbiology, 68, pp 4194-4200.

Mafu A.A., Roy D., Goulet J. and Magny P. 1990. Attachment of Listeria monocytogenes to stainless
steel, glass, polypropylene and rubber surfaces after short contact times. Journal of Food Protection,
53, pp 742-746.

Mah T.-F. C. and OToole G.A. 2001. Mechanisms of biofilm resistance to antimicrobial agents.
TRENDS in Microbiology, 9, pp 34-39.

Man N.-K., Degremont A., Darbord J.-C. Collet M. and Vaillant P. 1998. Evidence of Bacterial
Biofilm in Tubing from Hydraulitic Pathway of Hemodialysis System. Artificial Organs, 22, pp 596-
600.

Maris P. 1995. Modes of action of disinfectants. In : Disinfectants : actions and applications,

McDaniel H.A., ed., Revue Scientifique et Technique de lOffice International dEpizootics, 14, pp
47-55.

McCarter L., Hilmen M. and Silverman . 1988. Cell, 54, pp345.

McDonnell G. and Russell A.D. 1999. Antiseptics and Disinfectants: Activity, Action and Resistance.
Clinical Microbiology Reviews, 12, pp 147-179.

McEldowney S. and Fletcher M., 1986. Effect of Growth Conditions and Surface Characteristics of
Aquatic Bacteria on Their Attachment to Solid Surfaces. Journal of General Microbiology, 132, pp
513-523.

McFeters G.A., Yu F.P., Pyle B.H. and Stewart P.S. 1995. Physiological assessment of bacteria using
fluorochromes. Journal of Microbiological Methods, 21, pp 1-13.

McGuire J. and Krisdhasima V. 1991. Surface Chemical Influences on Protein Adsorption Kinetics.
Food Technology, Dec., pp 92-96.

Mchin L., Dubois-Brissonent F., Heyd B. and Leveau J.Y. 1999. Adaptation of Pseudomonas
aeruginosa ATCC 15442 to didecyldimethylammonium bromide induces changes in membrane fatty
acid composition and in resistance of cells. Journal of Applied Microbiology, 86, pp 859-866.

Merianos J. 1991. Quaternary Ammonium Antimicrobial Compounds. In : Disinfection, Sterilization

and Preservation. Block S.S., ed., Lea and Febiger, 225-255.

Meylheuc T. 2000. Influence de biosurfactants sur ladhsion de Listeria monocytogenes des

surfaces inertes Consquences sur la dsinfection. Thse de doctorat, Universit Paris XI, 191p.

154
Mihoub F. 2003. Influence de la conservation au froid des chantillons alimentaires sur la viabilit des
micro-organismes prsents. Essais de cryoprotection : Approches microbiologique et protomique.
Thse de doctorat Ecole Nationale Suprieure des Industries Agricoles et Alimentaires. Massy.

Mortimer F.C., Mason D.J. and Gant V.A. 2000. Flow Cytometric Monitoring of Antibiotic-Induced
Injury in Escherichia coli Using Cell-Impermeant Fluorescent Probes. Antimicrobial Agents an
Chemotherapy, 44, pp 676-681.

Mougin K and Haidara H. 2002. Complex Pattern Formation in Drying Dispersions. Langmuir, 18, pp
9566-9569.

Mougin K, Haidara H. and Castelain G. 2001. Controlling the two-dimensional adhesion and
organization of colloidal gold nanoparticles. Colloids and Surfaces A: Physicochemical and
Engineering Aspects, 193, pp 231-237.

Nagai K., Murata T., Ohta S., Zenda H., Ohnishi M. and Hayashi T. 2003. Two Different Mechanisms
Are Invoved in the Extremely High-Level Benzalkonium Chloride Resistance of a Pseudomonas
fluorescens Strain. Microbiology and Immunology., 47, pp 709-715.

Naumova I.B., Shashkov A.S. 1997. Anionic Polymers in Cell Walls of Gram-Positive Bacteria.
Biochemistry, 62, pp 947-982.

Navarre W.W., Schneewind O. 1999. Surface Proteins of Gram-positive Bacteria and Mechanisms of
Their Targeting to the Cell Wall Envelope. Microb. Mol. Biol. Rev. 63, pp 174-229.

Neidhardt F.C., Ingraham J.L. et Schaechter M. 1994. Physiologie de la cellule bactrienne : une
approche molculaire. Ed., Masson, 487p.

Ntsama-Essomba C. 1996. Mcanismes de rsistance aux dsinfectants de Escherichia coli et de

Pseudomonas aeruginosa obtenus en biofilms. Thse, Universit Paris-Sud, 209p.

Oie S., Huang Y., Kamiya A., Konishi H. and Nakazawa T. 1996. Efficacy of disinfectants against
biofilm cells of methicillin-resistant Staphylococcus aureus. Microbios, 85, pp 223-230.

OToole G., Kaplan H.B. and Kolter R. 2000. Biofilm Formation as Microbial Development. Annual
Review of Microbiology, 54, pp 49-79.

Papageorgiou D. K. and Marth E.H. 1989. Behavior of Listeria monocytogenes at 4 and 22C in Whey
and Skim Milk Containing 6 or 12% Sodium Chloride. Journal of Food Protection, 52, pp 625-630.

Pelletier C., Bouley C., Cayuela C., Bouttier S., Bourlioux P. and Bellon-Fontaine M.-N. 1997. Cell
Surface Characteristics of Lactobacillus caseisubsp. Casei, Lactobacillus paracasei subsp. Paracasei,
and Lactobacillus rhamnosus Strains. Applied and Environmental Microbiology, 63, pp 1725-1731.

Peng J.S., Tsai W.C and Chou C.C. 2001. Surface characteristics of Bacillus cereus and its adhesion to
stainless steel. International Journal of Food Microbiology,65, pp105-111.

Perrot F., Hbraud M., Charlionet R., Junter G-A. and Jouenne T. 2000. Protein patterns of gel-
entrapped Escherichia coli cells differ from those of free-floating organisms. Electrophoresis, 21, pp
645-653.

Pieto V. et Bardoneschi G. 1988. Llimination des micro-organismes: Dsinfection. Dans :

Microbiologie Alimentaire : Aspect microbiologique de la scurit et de la qualit alimentaire. Eds.
Bourgeois C.M., Mescle J.F. et Zucca F. Ed Tec & Doc Lavoisier, pp 291-307.

155
Piette J.-P. G. and Idziak E.S. 1992. A Model Study of Factors Involved in Adhesion of Pseudomonas
fluorescens to Meat. Applied and Environmental Microbiology, 58, pp 2783-2791.

Pitt W.G., McBride M.O., Lunceford J.K., Roper R.J. and Sagers R. 1994. Ultrasonic Enhancement of
Antibiotic Action on Gram-Negative Bacteria. Antimicrobial Agents and Chemotherapy,38, pp 2577-
2582.

Prigent-Combaret C., Vidal O., Dorel C. and Lejeune P. 1999. Abiotic Surface Sensing and Biofilm-
Dependent Regulation of Gene Expression in Escherichia col. Journal of Bacteriology, 181, pp 5993-
6002.

Reid G., Bialkowska-Hobrzanska H., van der Mei H.C. and Busscher H.J. 1999. Correlation between
genetic, physico-chemical surface characteristics and adhesion of four strains of Lactobacillus.
Journal of Collloids and Surfaces: B, 13, pp 75-81.

Reverdy M.E. 1995a. Les Ammonium Quaternaires. Dans : Antisepsie et dsinfection, Fleurette J.,
Freney J. et Reverdy M.E., eds., Editions Eska, 174-198.

Reverdy M.E. 1995b. La Chlorhexidine. Dans : Antisepsie et dsinfection, Fleurette J., Freney J. et
Reverdy M.E., eds., Editions Eska, pp 135-168.

Rijnaarts H.H.M, Norde W., Lyklema J. and Zehnder A. 1995. The isoelectric point of bacteria as an
indicator for the presence of cell surface polymers that inhibit adhesion. Colloids and Surfaces B:
Biointerfaces, 4, pp 191-197.

Roth B.L., Poot M., Yue S.T. and Millard P.J. 1997. Bacterial Viability and Antibiotic Susceptibility
Testing with SYTOX Green Nucleic Acid Stain. Applied and Environmental Microbiology, 63, pp
2421-2431.

Roy B., Ackermann H.-W., Pandian S., Picard S. and Goulet J. 1993. Biological Inactivation of
Adhering Listeria monocytogens by Listeriaphages and a Quaternay Ammonium Compound. Applied
and Environmental Microbiology, 59, pp 2914-2917.

Rubio C. 2002. Comprhension des mcanismes dadhsion des biofilms en milieu marin en vue de la
conception de nouveaux moyens de prvenion. Thse de Doctorat de lUniversit Paris VI. 213p.

Russell A.D. 1991. Principles of Antimicrobial Activity. In : Disinfection, Sterilization and

Preservation. Block S.S., ed., Lea and Febiger, pp 29-58.

Russell A.D. 1997. Plasmids and bacterial resistance to biocides. Journal of Applied Microbiology, 82,
155-165.

Rutter P.R. and Vincent B. 1980. Adhesion of microorganisms to surfaces: physico-chemical aspects.
In: Microbial Adhesion to surfaces. Ellis Horwood publishers, London.

Sakagami Y., Yokoyama H., nishimura H., Ose Y. and Tashima T. 1989. Mechanism of Resistance to
Benzalkonium Chloride by Pseudomonas aeruginosa. Applied and Environmental Microbiology, 55,
pp 2036-2040.

Samuelsson M.-O. and Kirchman D.L. 1990. Degradation of Adsorbed Protein by Attached Bacteria
in Relationship to Surface Hydrophobicity. Applied and Environmental Microbiology, 56, pp 3643-
3648.

Samranki M.M., Roques C. and Michel G. 1997. Influence of trophic conditions on exopolysaccharide
production: bacterial biofilm susceptibility to chlorine and monochloramine. Canadian Journal of
Microbiology, 43, pp 751-758.

156
Santiago N.I, Zipf A. et Bhunia A. 1999. Influence of Temperature and Growth Phase on Expression
of a 104-Kilodalton Listeria Adhesion Protein in Listeria monocytogenes. Applied and Environmental
Microbiology, 65, pp 2765-2769.

Sasahara K.C. and Zottola E.A. 1993. Biofilm Formation by Listeria monocytogenes Utilizes a
Primary Colonizing Microorganism in Flowing Systems. Journal of Food Protection, 56, pp 1022-
1028.

Sauer K. and Camper A.K. 2001. Characterisation of Phenotypic Changes in Pseudomonas putida in
Response to Surface-Associated Growth. Journal of Bacteriology, 183, pp 6579-6589.

Sauer K., Camper A.K., Ehrlich G.D., Costerton J.W. and Davies D.G. 2002. Pseudomonas
aeruginosa Displays Multiple Phenotypes during development as a Biofilm. Journal of Bacteriology
184, pp 1140-1154.

Seeliger H.P.R. et Jones D. 1986. Genus Listeria Pirie 1940, 383AL. In Bergeys manual of systematic
bacteriology, vol 2. Sneath P.H.A., Mair N.S., Sharpe M.E., Holt J.G (Eds.). The Williams & Wilkins,
Baltimore, Md, pp 1235-1245.

Shapiro H.M. 2000. Microbial analysis at the single-cell level: tasks and techniques. Journal of
Microbiological Methods, 42, pp 3-16.

Sinde E. and Carballo J. 2000. Attachment of Salmonella spp. And Listeria monocytogenes to stainless
steel, rubber and polytetrafluoroethylene: the influence of free enegy and the effect of commercial
sanitizers. Food Microbiology, 17, pp 439-447.

Socit Franaise dhygine hospitalire. 2003. Liste Positive Dsinfectants. Hygines, XI, pp 204-
221.

Stanley N.R., Britton R.A., Grossman A.D. and Lazazzera B.A. 2003. dentification of Catabolite
Repression as a Physiological Regulator of Biofilm Formation by Bacillus subtilis by Use of DNA
Microarrays. Journal of Bacteriology, 185, pp 1951-1957.

Steiner P., Sauer U. 2001. Proteins Induced during Adaptation of Acetobacter aceti to High Acetate
Concentrations. Applied and Environmental Microbiology, 67, pp 5474-5481.

Suller M.T.E. and Lloyd D. 1999. Fluorescence Monitoring of Antibiotic-Induced Bacterial Damage
Using Flow Cytometry. Cytometry, 35, pp 235-241.

Tabata A., Nagamune H., Maeda T., Murakami K., Miyake Y. and Kourai H. 2003. Correlation
between Resistance of Pseudomonas aeruginosa to Quaternary Ammonium Compounds and
Expression of Outer Membran Protein OprR. Antimicrobial Agents and Chemotherapy, 47, pp 2093-
2099.

Takeo Y., Oie S, Kamiya A., Konishi H. and Nakazawa T. 1994. Efficacy of disinfectants against
biofilm cells of Pseudomonas aeruginosa. Microbios, 79, pp 19-26.

Thomas L., Maillard J.-Y., Lambert R.J.W. and Russell A.D. 2000. Development of resistance to
chlorhexidine diacetate in Pseudomonas aeruginosa and the effect of a residual concentration.
Journal of Hospital Infection, 46, pp 297-303.

Tie Y., Calonder C. and van Tassel P.R. 2003. Protein adsorption: kinetics and history dependence.
Journal of Colloid Interface Science, 268, pp 1-11.

157
To M.S., Favrin S., Romanova N. and Griffiths M. 2002. Postadaptational Resistance to
Benzalkonium Chloride and Subsequent Physicochemical Modification of Listeria monocytogenes.
Applied and Environmental Microbiology, 68, pp 5258-5264.

Trueman J.R. 1971. The Halogens. In : Inhibition and Destruction of the Microbial Cell. Hugo W.B.
ed Academic press, London, pp 137-183.

Vacheethasanee K., Temenoff J.S., Higashi J.M., Gary A., Anderson J.M., Bayston R. and Marchant
R.E. 1998. Bacterial surface properties of clinically isolated Staphylococcus epidermidis strains
determine adhesion on polyethylene. In: WILEY J. et SONS (Eds).

van der Mei H.C., Brokke P., Dankert J., Feijen J., Rouxhet P.G. and Busscher H.J. 1989.
Physicochemical Surface Properties of Nonencapsulated and Encapsulated Coagulase-Negative
Staphylococci. Applied and Environmental Microbiology, 55, pp 2806-2814.

van der Mei H.C., Leonard A.J., Weerkamp A.H., Rouxhet P.G. and Busscher H.J. 1988. Surface
properties of Streptococcus salivarius HB and nonfibrillar mutants: measurement of zeta potential and
elemental composition with X-ray photoelectron spectroscopy. Journal of Bacteriology, 70, pp 2462-
6.

van Klingeren B., Koller W., Bloomfield S.F., Bhm R., Cremieux A. and Holah J. 1998. Assessment
of the efficacy of disinfectants on surfaces. International Biodeterioration and Biodegradation, 41, pp
289-296.

van Oss C.J. 1996. Forces interfaciales en milieux aqueux. 402 p. Masson.

van Oss C.J., Chaudhury M.K., Good R.J. 1988. Interfacial Lifshitz van der Waals and Polar
Interactions in Macroscopic Systems. Chem. Rev. 88, pp 927-941.

Vanhaecke E., Remon J.-P., Moors M., Raes F., de Rudder D. et van Peteghem A. 1990. Kinetics of
Pseudomonas aeruginosa adhesion to 304 and 316-L Stainless Steel: Role of Cell Surface
Hydrophobicity. Applied and Environmental Microbiology, 56, pp 788-795.

Vatanyoopaisarn S., Nazli A., Dodd C.E.R., Rees C.E.D. and Waites W.M. 2000. Effect of Flagella on
Initial Attachment of Listeria monocytogenes to Stainless Steel. Applied and Environmental
Microbiology, 66, pp 860-863.

Vidal O., Longin R., Prigent-Combaret C. and Lejeune P. 1998. Isolation of an Escherichia coli K-12
Mutant Strain Able To Form Biofilms on Inert Surfaces: Involvement of a New ompR Allele That
Increase Curli Expression. Journal of Bacteriology, 180, pp 2442-2449.

Visser J. 1976. Adhesion of colloidal particles. Journal of Colloid Interface Science,3, p 714.

von Loosdrecht M.C., Lyklema J., Norde W., Schraa G. and Zehnder A.J. 1987. Electrophoretic
mobility and hydrophobicity as a measure to predict the initial Steps of bacterial adhesion. Applied
and Environmental Microbiology, 53, pp 1898-1901.

von Loosdrecht M.C.M., Lyklema J., Norde W. and Zehnder A.J.B. 1990. Influence of Interfaces on
Microbial Activity. Microbioogical Review, 54, pp 75-87.

Wahlgren M., Arnebrant T., 1991. Protein adsorption to solid surfaces. Trends in Biotechnology, 9,
201-208.

Walter III M.C., Roe F., Bugnicourt A., Franklin M.J. and Stewart P.S. 2003. Contributions of
Antibiotic Penetration, Oxygen Limitation, and Low Metabolic Activity to Tolerance of Pseudomonas

158
aeruginosa Biofilms to Ciprofloxacin and Tobramycin. Antimicrobial Agents and Chemotherapy, 47,
pp 317-323.

Williams I., Paul F., Lloyd D., Jepras R. and Venables W.A. 1999. Flow cytometry and others
techniques show that Staphylococcus aureus undergoes significant physiological changes in the early
stages of surface-attached culture. Microbiology, 145, pp 1325-1333.

Xu K.D., Stewart P.S., Xia F., Huang C.-T. and McFeters G.A. 1998. Spatial Physiological
Heterogeneity in Pseudomonas aeruginosa Biofilms Is Determined by Oxygen Availability. Applied
and Environmental Microbiology, 64, pp 4035-4039.

159
ANNEXES

160
 Annexe I : La duret de l'eau

La duret de l'eau est dfinie par le titre hydrotimtrique, qui correspond la prsence de sels de
calcium et de magnsium. Plus une eau est riche en calcium et en magnsium, plus elle est dite
dure . Inversement, une eau pauvre en calcaire est dite douce . Ainsi, l'importance du calcium
(calcaire) dans l'eau est le principal critre dterminant sa duret. La duret associe lacidit de
l'eau dfinissent son agressivit : une eau douce associe un pH acide donne une eau agressive.
La duret de l'eau s'exprime par un indice, ou titre hydrotimtrique, TH, exprim en degrs, chaque degr
rsultant du calcul suivant : 1 degr (F) = 4 mg/l de calcium ou 2,43 mg/l de magnsium ou 10 mg de
calcaire.
Les eaux sont classes en fonction de leur TH : 0 6 degrs = eau trs douce
6 15 degrs = eau douce
15 30 degrs = eau moyennement dure
30 degrs = eau dure.

Prparation de leau dure

Solution A
MgCl2 - 6H2O 19,84g
CaCl2 - H2O 46,24g
Eau distille qsp 1000 mL

Solution B
NaHCO3 35,02g
Eau distille qsp 1000 mL

Solution A 6 mL
Solution B 8 mL
Eau distille qsp 1000 mL

pH 7 0,2, strilise par filtration ( : 0,22m ; Stritop, Millipore, France)

161
 Annexe II : Milieux de Croissance

Tryptone Soja Agar : TSA (Biomrieux)

Tryptone digestion pancratique de casine 15g

Peptone de soja, digestion papaque de farine de soja 5g

NaCl 5g

Glose 15g

Eau distille 1000 mL

Tryptone Soja Bouillon : TSB (Biomrieux)

Tryptone digestion pancratique de casine 15g

Peptone de soja, digestion papaque de farine de soja 5g

di-Potassium hydrognophosphate 2,5g

Glucose 2,5g

NaCl 5g

Eau distille 1000 mL

162
 Annexe III : Composition chimique de lacier inoxydable AISI 316

Fe Cr Ni Mn Si Mo Cu Ti C S N
67,61% 17,04% 11,13% 1,25% 0,38% 2,13% 0,39% <0,001 254ppm 25ppm 346ppm

163
 STORAGE AND GROWTH CONDITIONS OF BACTERIAL STRAINS: WHAT IMPACT ON

THEIR PHYSICOCHEMICAL SURFACE PROPERTIES?

A. ALLION1,2, F. DURAND2, J. CRIQUELION2, G. RAUWEL2, M.-N. BELLON-FONTAINE1*.

1
Institut National de la Recherche Agronomique, Unit de Recherche en Bioadhsion et Hygine
des Matriaux, Massy, France.
2
Laboratoires ANIOS, Lille-Hellemmes, France.

Storage-growth impact on cell surface

Corresponding author. Mailing address: INRA-UBHM, 25 Avenue de la Rpublique, 91300 Massy,

France.
Phone: 33 1 69 53 64 00.
Fax: 33 1 60 13 36 01.
E-mail: bellon@massy.inra.fr.

164
1 SUMMARY

2 INTRODUCTION

3 MATERIALS AND METHODS

3.1 Bacterial strains and storage conditions.

3.2 Growth conditions and preparation of bacterial suspensions.

3.3 Physicochemical characterisation of the bacterial cell surface

3.4 Statistical analysis.

4 RESULTS

5 DISCUSSION

6 ACKNOWLEDGEMENTS

7 REFERENCES

165
1. SUMMARY

AIMS: TO STUDY THE EFFECTS OF STORAGE AND GROWTH CONDITIONS ON THE

PHYSICOCHEMICAL SURFACE PROPERTIES (HYDROPHOBICITY OR HYDROPHILICITY, LEWIS ACID-

BASE AND ELECTROPHORETIC MOBILITY PROPERTIES) OF BACTERIAL STRAINS.

Methods and Results: These characteristics were determined for Staphylococcus aureus

CIP53154, Listeria monocytogenes CIP103575, Listeria monocytogenes 129P and Pseudomonas

aeruginosa CIPA22 under a variety of storage conditions (-80C and 4C for 0, 1 or 2 months) and

growth conditions (solid and liquid media).

Whatever the storage and growth protocols, the physicochemical surface properties of Ps. aeruginosa

A22 were very similar. In contrast, Gram positive strains were more sensitive to these factors. Cells

cultivated on solid media (TSA) were more hydrophobic than cells grown in liquid (TSB), and duration of

storage affected the microbial surface charge, especially in the case of L. monocytogenes stored at 4C.

Conclusions: Storage and growth conditions probably have a marked influence on the

physicochemical surface properties of Gram-positive strains. Storage at -80C should be preferred

to +4C, particularly for psychrophilic bacteria.

Significance and Impact of the Study: Changes to cellular physicochemical surface

characteristics, and their probable adaptive response to the environment, probably modify both

bacterial adhesion and resistance to biocides.

Keywords : physicochemical surface properties, storage conditions, growth conditions,

hydrophobicity

166
2 INTRODUCTION

The cellular envelope of micro-organisms is a key element in their metabolic activity and their

interactions with the environment. In particular, it is involved in the adsorption of molecules from

the surroundings (nutrients, antimicrobial agents, etc.), as well as in the initiation of bioadhesive

phenomena such as microbial adhesion, cell aggregation and the formation of biofilms. For

bacterial physiologists, the composition of this envelope remains one of the tools of value for

identification and classification, notably in enabling a distinction between Gram-positive and Gram-

negative organisms. Indeed, although the cell wall of Gram positive bacteria is mainly composed of

peptidoglycan (30 to 50% of the dry weight of the cell wall), polysaccharides (teichoic, teichuronic

and lipoteichoic acids) and surface proteins (Hancock, 1991), that of Gram-negative bacteria is

made up of peptidoglycan covered by an external membrane in which proteins, lipoproteins and

lipopolysaccharides can insert themselves (Hancock, 1991; Neidhardt et al., 1994). This

composition, like the conformation of cell wall constituents, may nevertheless vary between genera

and microbial species, as well as a function of environmental parameters (Fiedler, 1988; Neidhardt

et al., 1994; Naumova and Shashkov, 1997; Navarre and Schneewind, 1999). Bonet et al. (1993)

have observed that the synthesis of exopolysaccharides and capsule formation in Aeromonas

salmonicida A450 required the presence of glucose in the culture medium. In addition , Steiner and

Sauer (2001) have showed that changes to medium acidity could modulate the expression of certain

proteins in Acetobacter aceti. Physical state (solid or liquid) may also influence microbial

physiology, as shown by Ljungh et al. (1985), Lee et al. (1993) and, more recently, Bakholdina et

al. (2001) and Kiers et al. (2001).

Temperature is another key factor in bacterial metabolism (Neidhardt et al., 1994). In

particular, it may influence the production of certain surface proteins (Santiago et al., 1999),

extracellular appendages (Vatanyoopaisarn et al., 2000), and cell morphology modification

(Briandet, 1999). When temperatures are close to or lower than 0C (case of storage temperatures),

167
they not only cause a deceleration in metabolic activity (the basis for storage protocols) but may

also induce the expression of specific Cold Acclimatisation Proteins (Caps) (Bayles et al., 1996)

and/or modify the fatty acid composition of the cytoplasmic membrane (Annous et al., 1997 ; Jones

et al., 1997). With the knowledge that a strong link exists between surface physicochemical

properties and the composition of the microbial envelope (van der Mei et al, 1989; Bonet et al.,

1993; Briandet et al., 1999a; Boonaert and Rouxhet, 2000), it is then reasonable to ask whether

storage and culture conditions might not affect hydrophobic/hydrophilic characteristics, Lewis acid-

base properties and the electrical charge of microbial cells, all of which are involved in numerous

interfacial phenomena, including those referred to above.

In this context, we sought to assess the effect of standard storage conditions (4C or -80C

over a period of 2 months) and growth conditions (in broth or on agar) on the surface

physicochemical characteristics of widely used strains, particularly those employed during

procedures to validate the bactericidal activity of disinfectants, i.e. Pseudomonas aeruginosa CIP

A22 (Gram-negative bacillus), Staphylococcus aureus CIP 53 154 (Gram-positive capsule forming

coccus) and Listeria monocytogenes CIP 103 575 (Gram-positive bacillus). A further strain of

Listeria monocytogenes (wild-type strain) was also included in this study: L. monocytogenes 129P.

Hydrophobicity/hydrophilicity and the Lewis acid-base characteristics of the strains were assessed

using the MATS (microbial adhesion to solvent) method, while the global surface charge was

determined from measurements of electrophoretic mobility, using microelectrophoresis.

3 MATERIALS AND METHODS

3.1 Bacterial strains and storage conditions.

Staph. aureus strain CIP53154, Ps. aeruginosa CIPA22 and L. monocytogenes CIP103575 were

provided by Institut Pasteur (France), while L. monocytogenes 129P was isolated from an industrial

168
plant surface. For each of these strains, and in accordance with the NF EN 12353 standard (Anon.,

2000b), two storage conditions were applied, one at -80C and the other at +4C.

Stock at -80C was performed by suspending the micro-organisms in Tryptone Soy Broth

(BioMrieux, France) before application to Tryptone Soy Agar (BioMrieux, France). After 24

hours of incubation at 37C, the bacterial mat was collected by scraping into 10 ml of a

cryoprotectant solution (beef extract: 3 g l-1 ; tryptone, pancreatic digestion: 5 g l-1, glycerol 150 g l-
1
). The bacterial suspension thus obtained was diluted to 1:10 in the same cryoprotectant solution,

incubated for 30 minutes at 20C, and then distributed into cryotubes in 200 l aliquots prior to

storage at -80C.

Stock at 4C was carried out on bacterial cultures stored at -80C and then isolated on TSA prior to

incubation for 24 hours at 37C. The agars were then stored for a maximum of 2 months at 4C.

3.2 Growth conditions and preparation of bacterial suspensions.

All experiments were performed on three separate cultures using micro-organisms stored for 0, 1

and 2 months at 4C and -80C and then cultured on TSA or in TSB.

Bacterial growth. Bacterial cultures on solid agar were obtained after three successive inoculations

for 24 hours at 37C on agar in a sloping position (TSA).

Cells stored at 4C and 80C were sub-cultured twice in TSB at 37C before the working

culture. For the working culture, 1 ml of the second sub-culture was inoculated into 100 ml of a

fresh medium and incubated at 37C until the stationary stage was reached . Growth curves were

recorded to determine the beginning of the stationary stage (data not shown).

Bacterial suspensions. Cells were harvested by centrifugation for 10 min at 7000 g at +4C, and

then washed twice with and re-suspended in the relevant sterile suspending liquid (NaCl 1.5 10-1

or 1.5 10-3mol l-1).

3.3 Physicochemical characterisation of the bacterial cell surface

169
Electrophoretic Mobility. In order to measure electrophoretic mobility (EM), bacteria were

suspended in NaCl 1.5 10-3 mol l-1. The pH of the suspension was adjusted in the range of to pH 2

to 9 by adding nitric acid (HNO3) or potassium hydroxide (KOH). Electrophoretic mobility was

measured using a 50-V electric field and a Laser Zetameter (CAD Instrumentation, France). The

results were based on an automated video analysis of approximately 200 particles for each

measurement. In order to inhibit the motility of Ps. aeruginosa cells because of flagella activity,

formaldehyde (0.7% v/v) was added to the culture prior to centrifugation (Bouttier et al., 1997).

Microbial adhesion to solvents. The partitioning method previously described by Bellon-Fontaine

et al. (1996) is based on a comparison between microbial cell affinity with a monopolar or apolar

solvent. The monopolar solvent may be an electron-acceptor or electron-donor solvent, but both

solvents must exhibit similar van der Waals surface tension components.

On this basis, we selected the following pairs of solvents : (i) chloroform (Sigma), an

electron-acceptor solvent, with hexadecane (Sigma), an apolar n-alkane and (ii) ethyl acetate

(Sigma), a strong electron-donor solvent, with decane (Sigma), an apolar n-alkane.

Experimentally, 2.4 ml of a suspension containing approximately 108 cells in NaCl 1.5 10-
1
mol l-1 was vortex-mixed for 60 s with 0.4 ml of the solvent under investigation. The mixture was

allowed to stand for 15 min to ensure complete separation of the two phases before a sample (1 ml)

was carefully collected from the aqueous phase and the optical density measured at 400 nm. The

percentage of cells binding to each solvent was subsequently calculated using the equation: %

affinity = 100 x [1- (A1/A0)], where A0 is the optical density of the bacterial suspension measured at

400 nm before mixing, and A1 is the absorbance after mixing.

3.4 Statistical analysis.

ANOVA variance analysis and principal-component analysis (PCA) were performed using

Statgraphics (Manugistic, Rockville, Md).

4 RESULTS

170
The results of electrophoretic mobility measurements obtained under the different conditions for

storage and growth tested, are shown in Figures 1 to 4 for Ps. aeruginosa A22, Staph. aureus

53154, L. monocytogenes 103575 and L. monocytogenes 129P, respectively. Whatever the

microbial species considered and the experimental conditions prevailing (storage and growth), the

strains appeared to be electronegative within the studied range of pH values. However, this

electronegativity was less marked with Staph. aureus 53154 than with the two strains of L.

monocytogenes or Ps. aeruginosa. Although this property remained stable for Gram-negative

bacteria, it nevertheless evolved for the three Gram-positive organisms. Thus we observed a

significant increase in the global surface charge of strains, depending on the duration of storage, at a

temperature of 4C. This effect was particularly marked in the two L. monocytogenes strains

(P<0.05). At -80C, no significant effect of storage duration could be demonstrated on these

electrical characteristics of bacteria (P>0.05).

In contrast, a considerable impact of the physical state of the culture medium could be noted

on the electrical properties of the three Gram-positive bacteria: culture on TSA (when compared to

growth in TSB) generated an increase in surface electronegativity for Staph. aureus 53154 and a

reduction in this property for the two L. monocytogenes strains.

The results of MATS tests are grouped in Tables 1 to 4 for Ps. aeruginosa A22, Staph. aureus

53154, L. monocytogenes 103575 and L. monocytogenes 129P, respectively. Although Ps.

aeruginosa A22 appeared to be strongly hydrophilic (weak affinity with hexadecane and decane),

whatever the method and period of storage or the type of culture medium employed, the three

Gram-positive bacteria exhibited intermediate values for surface hydrophilicity (approximately 50%

affinity with apolar solvents). In the case of L. monocytogenes and Ps. aeruginosa, this

hydrophilicity was associated with more or less marked Lewis acid-base characteristics (high

affinity with chloroform and ethyl acetate when compared with apolar solvents), while for Staph.

aureus, it was linked to a principally Lewis base property. In line with data on electrophoretic

171
mobility, and although no significant variations in these properties could be demonstrated as a

function of storage and growth conditions regarding the three collection strains (P>0.05), a change

was observed in the wild-type strain. Thus, after two months of storage at 4C, Listeria

monocytogenes 129P appeared to be more hydrophilic, particularly after growth in TSB. Finally, we

noted that growth in broth significantly increased (P<0.05) the hydrophilic nature of Gram-positive

micro-organisms (when compared with the data obtained after culture on agar).

If all the data obtained were grouped in a single, principal component analysis, (Figure 5), it

appeared clear that each bacterial species exhibited physicochemical surface properties which

differed from the other two species (one group of data per bacterial species). Furthermore, and

under the experimental conditions tested, we noted that only the Gram-positive strains analysed

exhibited surface characteristics which were capable of changing as a function of storage conditions

(duration and protocol) and, above all, of the culture method employed.

5 DISCUSSION

The storage and culture of micro-organisms remain key stages in most microbiological procedures,

regardless of the phenomenon under study. However, although they are essential, it remains true

that these fundamental protocols are usually left to the discretion of those conducting the

experiments. Thus some laboratories store their strains at 4C and others at -20C or -80C, for

periods which may vary from a few weeks to several months. As for the culture conditions, and

notably the physical state of the nutrient medium employed, the same degree of variability may be

encountered. To resolve this problem of diversity, and therefore facilitate the comparison of test

results between laboratories, standardisation organisations have recommended standardised

protocols in their norms. These protocols are usually based on producing a frozen "primary" stock

and a working stock which can be stored at 4C for several weeks (Anon., 2000a; Anon., 2000b).

Although the impact of these experimental differences on bacterial physiology has been the subject

of numerous studies, little work has been done on their physicochemical surface properties. Because

172
these properties depend on the composition of the bacterial envelope, which in turn is closely

involved in interfacial phenomena (microbial adhesion, biofilms, disinfection etc.), legitimate

questions (as mentioned above) are raised as to the impact of storage and growth conditions on the

hydrophilicity, Lewis acid-base characteristics and electrophoretic mobility of strains belonging to

different bacterial species. Based on a review of the literature, we chose to test two of the most

widely employed conditions for storage (in a cryoprotectant solution at -80C and on agar at +4C)

using the same culture medium but presented in two different physical states, i.e. solid (agar) and

liquid (broth). As shown above, the tests were performed on three micro-organisms which are

frequently recommended in disinfection standards, and a wild-type strain isolated from an industrial

site.

As a general rule, and in line with recent studies (Briandet, 1999, Meylheuc, 2000), we not

only observed differences in the physicochemical surface characteristics of the three bacterial

species tested, but also between the two strains of L. monocytogenes. As suggested by Hancock

(1991) and Neidhardt et al. (1994), it is the architecture and nature of the chemical groups present

on the surface of bacterial cells which determine the physicochemical surface characteristics of

micro-organisms. Thus, the negligible affinity with apolar solvents exhibited by Ps. aeruginosa

A22 may be due to the hydrophilic portion of the lipopolysaccharides present on the surface of

Gram-negative bacteria, while the weak hydrophilicity of Gram-positive bacteria may be linked to

the presence of lipoteichoic acids and hydrophobic macromolecules anchored in their cell wall. As

for the negative surface charge of bacteria, this may be directly linked to the presence of ionised

groups (phosphate, carboxylic, sulphate, amine) of macromolecules making up the cell wall of

Gram-positive bacteria and the outer membrane of Gram-negative bacteria (Rijnaarts et al., 1995).

Cellular architecture and the composition of bacterial capsule constituents therefore present inter

and intra-species variations which lead to different physicochemical surface properties (van der Mei

et al., 1989; Pelletier et al., 1997; Giovannacci et al., 2000). However, and as we have

173
demonstrated, these properties are not "set in stone" and may evolve, depending on the physical and

chemical environment of micro-organisms, and more particularly the conditions prevailing during

their storage and growth.

The storage of micro-organisms must first of all ensure their survival over a given period of

time (Carvalho et al., 2003, Mihoub, 2003). Several storage techniques have been proposed, based

on reducing the metabolic activity of micro-organisms. They may be freeze-dried, frozen (to -20C,

-80C or -196C), or inoculated on agar and then stored at +4C. Having selected freezing at -80C

and refrigeration at +4C, we were able to note a marked evolution in the physicochemical surface

properties of some bacteria during their storage at +4C, notably for psychrophilic strains such as L.

monocytogenes, these findings being in agreement with those obtained by Briandet et al. (1999a).

At this temperature, these bacteria are indeed capable of growing (Papageorgiou and Marth, 1989)

and adapting their physiology by synthesising, for example, specific proteins (Caps, or Cold

acclimatisation proteins) (Bayles et al., 1996), or by modifying the fatty acid composition of their

membranes (Annous et al., 1997; Jones et al., 1997). The different adaptations of L. monocytogenes

to temperatures close to zero may therefore have considerable effects upon their physicochemical

surface properties (Briandet et al., 1999b) and also on their pathogenic potential, as shown by

Buncic and Avery in 1996. In contrast, storage at -80C in a cryoprotectant solution seems (at least

for a period of two months) to sufficiently reduce bacterial metabolism to restrict phenotypic

evolutions and conserve the physicochemical surface properties of micro-organisms (Briandet et al.

1999b). Based on the data obtained, storage at +4C on nutrient agar should therefore only be used

for very short periods of storage (less than one month), in contrast with storage at -80C, and

particularly for psychrophilic bacteria.

As for the conditions for growth, it is clearly established today that the composition of a

medium (Bonet et al. 1993; Horsk et al. 1993), the pH (Briandet et al. 1999a) and the incubation

temperature (Hill and James, 1972; Briandet et al., 1999b, Santiago et al., 1999) can affect the

174
physicochemical surface properties of micro-organisms. In contrast, few studies have concerned the

impact of the physical state of the culture medium (i.e. solid or liquid) on these properties (Ljungh

et al., 1985; Kiers et al., 2001). Under the experimental conditions tested, only Gram-positive

strains demonstrated significant variations in terms of their hydrophilicity and surface

electronegativity, as a function of the culture method employed (i.e. on agar or in broth). These

results agree with those found by Ljungh et al. (1985), who demonstrated the more marked surface

hydrophobicity of Staph. aureus strains cultured on solid agar than in nutrient broth. The chemical

compositions of the culture media were similar, so that differences in physicochemical surface

properties could therefore be attributed to the culture method employed alone (agar or nutrient

broth). In a broth, micro-organisms are "free" (planktonic cells), while on agar they can be

assimilated with "fixed" cells. Like the development of cells in biofilms, bacterial colonies

developing on agar do not benefit from a nutrient and oxygen input which is homogenous from all

sides. This mode of development may therefore lead to spatiotemporal heterogeneity in the

metabolic activity of micro-organisms (Lai et al. 1997; Huang et al. 1998; Choo-Smith et al. 2001;

Sauer et al. 2002), and consequently changes to the elemental composition of their cell wall (Perrot

et al., 2000). The physical state of the culture (solid or liquid) therefore influences the near

environment of micro-organisms and hence their physicochemical surface properties, as we have

demonstrated.

To summarise, the work carried out in the context of this study allowed us to demonstrate

changes in the physicochemical surface characteristics of Staph. aureus 53154, L. monocytogenes

103575 and L. monocytogenes 129P as a function of the storage protocol, duration of storage and

physical state of the culture medium employed. However, no general rule could be established, i.e.

an increase or reduction in the hydrophilicity and/or electronegativity of the surface of strains,

under the conditions applied. On the other hand, these changes, which probably constituted an

175
adaptive response to the chemical and physical environment, may in particular modify their

bioadhesive behaviour and their response to the action of antimicrobial agents.

6 ACKNOWLEDGEMENTS

The authors would like to thank R. Briandet, T. Meylheuc, J. Rault et M. Renault for their help and

their valuable comments on this work and V. Hawken for English translation of the manuscript.

7 REFERENCES
Anon. (2000a). AOAC. Official Method 991.48. Testing Disinfectants against Staphylococcus aureus.

Anon. (2000b). Norme AFNOR NF EN 12353. Antiseptiques et dsinfectants chimiques -

Conservation des souches microbiennes utilises pour la dtermination de lactivit bactricide et

fongicide.

Annous B.A., Becker L.A., Bayles D.O., Labeda D.P. and Wilkinson B.J. (1997) Critical role of anteiso-

C15 :0 fatty acid in the growth of Listeria monocytogenes at low temperatures. Applied Environmental

Microbiology, 63, 3887-3894.

Bakholdina S.I., Krasikova I.N., Buzoleva L.S., Shubin F.N. and Soloveva T.F. (2001) Effects of culture

method and growth phase on free lipid composition of Yersinia pseudotuberculosis. Biochemistry (Moscow),

66, 415-421.

Bayles D.O., Annous B.A. and Wilkinson B.J. (1996) Cold stress Proteins Induced in Listeria

monocytogenes in Response to Temperature Downshock and Growth at Low Temperatures. Applied

Environmental Microbiology, 62, 1116-1119.

Bellon-Fontaine M.-N., Rault J. and Van Oss C.J. (1996) Microbial adhesion to solvents: a novel method to

determine the electron-donor/electron-acceptor or Lewis acid-base properties of microbial cells. Colloids and

Surfaces. B : Biointerfaces, 7, 47-53.

176
Bonet R., Simon-Pujol M.D. and Congregado F. (1993) Effects of Nutrients on Exopolysaccharide

Production and Surface properties of Aeromonas salmonicida. Applied Environmental Microbiology, 59,

2437-2441.

Boonaert C.J.P. and Rouxhet P.G. (2000) Surface of Lactic Acid Bacteria : Relationships between

Chemical Composition and Physicochemical Properties. Applied Environmental Microbiology, 66,

2548-2554.

Bouttier S., Linxe C., Ntsama C., Bellon-Fontaine M.-N. and Fourniat J. (1997) Attachment of Salmonella

choleraesuis choleraesuis to Beef Muscle and Adipose Tissues. Journal of Food Protection, 60, 16-22.

Briandet R. (1999) Matrise de lhygine des surfaces par la cration de biofilms Aspects physico-

chimiques. Thse de doctorat, Ecole Nationale Suprieure Agronomique de Rennes, Rennes.

Briandet R., Leriche V., Carpentier B. and Bellon-Fontaine M.-N. (1999a) Effects of the Growth Procedure

on the Surface Hydrophobicity of Listeria monocytogenes cells and their Adhesion to Stainless Steel.

Journal of Food Protection, 62, 994-998.

Briandet R, Meylheuc T., Maher C. and Bellon-Fontaine M.-B. (1999b) Listeria monocytogenes Scott A:

Cell Surface Charge, Hydrophobicity and Electron Donor and Acceptor Characteristics under Different

Environmental Growth Conditions. Applied Environmental Microbiology, 65, 5328-5333.

Buncic S. and Avery S.M. (1996) Relationship between variations in pathogenicity and lag phase at 37C of

Listeria monocytogenes previously stored at 4C. Letters in Applied Microbiology, 23, 18-22.

Carvalho A.S., Silva J., Ho P., Teixeira P., Malcata F.X. and Gibbs P. (2003) Effect of various growth media

upon survival during storage of freeze-dried Enterococcus faecalis and Enterococcus durans. Journal of

Applied Microbiology, 94, 947-952.

Choo-Smith L.-P., Maquelin K., van Vreeswijk T. et al. (2001) Investigating Microbial (Micro)colony

Heterogeneity by Vibrational Spectroscopy. Applied Environmental Microbiology 67, 1461-1469.

Fiedler F. (1988) Biochemistry of the Cell Surface of Listeria Strains : A Locating General View. Infection,

16, S92-S97.

177
Giovannaci I., Ermel G., Salavt G., Vendeuvre J.L. and Bellon-Fontaine M.-N. (2000) Physicochemical

surface properties of five Listeria monocytogenes strains from a pork-processing environment in relation to

serotypes, genotypes and growth temperature. Journal of Applied Microbiology, 88, 992-1000.

Hancock I.C. (1991) Microbial Cell Surface Architecture. In Microbial Cell Surface Analysis : Structural

and Physicochemical Methods ed. Mozes N., Handley P.S., Busscher H.J. and Rouxhet P.G. pp. 21-59. VCH

publishers.

Hill A.W. and James A.M. (1972). Effect of growth temperature on surface properties of cells of

Staphylococcus aureus with particular reference to methicillin-resistance. Microbios, 6, 169-178.

Huang C. T., Xu K., McFeters G.A. and Stewart P. S. (1998) Spatial Patterns of Alkaline Phosphatase

Expression within Bacterial Colonies and Biofilms in Response to Phosphate Starvation. Applied

Environmental Microbiology, 64, 1526-1531.

Horsk E., Pokorn J. and Labajov M. (1993) Changes of surface charge and hydrophobicity of

the outer bacterial membrane depending on the cultivation medium. Biolgia (Bratislava), 48, 343-

347.

Jones C.E., Shama G., Jones D., Roberts I.S and Andrew P.W. (1997) Physiological and biochemical studies

on psychrotolerance in Listeria monocytogenes. Journal of Applied Microbiology 83, 31-35.

Kiers P.J.M., Bos R., van der Mei H.C. and Busscher H.J. (2001) The electrophoretic softness of the surface

of Staphylococcus epidermidis cells grown in a liquid medium and on a solid agar. Microbiology, 147, 757-

762.

Lai H.-C., Lai M.-J., Lin-Chao S., Lu K.-T. and Ho S.-W. (1997) Population Cell Differentiation of Serratia

marcescens on Agar Surface and in Broth Culture. Journal of Microbiology and Immunology, 30 : 242-254.

Lee J.C., Takeda S., Livolsi P.J. and Paoletti L.C. (1993) Effects of in vitro and in vivo growth conditions on

expression of type 8 capsular polysaccharide by Staphylococcus aureus. Infection and Immunity, 61, 1853-

1858.

178
Ljungh A., Hjerten S. and Wadstrom T. (1985) High Surface Hydrophobicity of Autoaggregating

Staphylococcus aureus Strains Isolated from Human Infections Studied with the Salt Aggregation Test.

Infection and Immunity, 47, 522-526.

Meylheuc T. (2000) Influence de biosurfactants sur ladhsion de Listeria monocytogenes des surfaces

inertes Consquences sur la dsinfection. Thse de doctorat, Universit Paris XI.

Mihoub F. (2003) Influence de la conservation au froid des chantillons alimentaires sur la viabilit des

micro-organismes prsents. Essais de cryoprotection : Approches microbiologique et protomique. Thse de

doctorat Ecole Nationale Suprieure des Industries Agricoles et Alimentaires. Massy.

Naumova I.B. and Shashkov A.S. (1997) Anionic Polymers in Cell Walls of Gram-Positive Bacteria.

Biochemistry (Moscow), 62, 947-982.

Navarre W.W. and Schneewind O. (1999) Surface Proteins of Gram-positive Bacteria and Mechanisms of

Their Targeting to the Cell Wall Envelope. Microbiology and Molecular Biology Reviews, 63, 174-229.

Neidhardt F.C., Ingraham J.L. and Schaechter M. (1994) Structure et fonction des parties de la cellule

bactrienne. In Physiologie de la cellule bactrienne : une approche molculaire. ed Neidhardt F.C.,

Ingraham J.L. and Schaechter M. pp.28-56 Paris: Masson.

Papageorgiou D.K. and Marth E.H. (1989) Behavior of Listeria monocytogenes at 4 and 22C in Whey and

Skim Milk Containing 6 or 12% Sodium Chloride. Journal of Food Protection, 52, 625-630.

Pelletier C., Bouley C., Cayuela C., Bouttier S., Bourlioux P. and Bellon-Fontaine M.-N. (1997) Cell Surface

Characteristics of Lactobacillus casei subsp. casei, Lactobacillus paracasei subsp. paracasei, and

Lactobacillus rhamnosus Strains. Applied Environmental Microbiology, 63, 1725-1731.

Perrot F., Hbraud M., Charlionet R., Junter G-A. and Jouenne T. (2000) Protein patterns of gel-entrapped

Escherichia coli cells differ from those of free-floating organisms. Electrophoresis, 21, 645-653.

Rijnaarts H.H.M, Norde W., Lyklema J. and Zehnder A.J.B. (1995) The isoelectric point of bacteria as an

indicator for the presence of cell surface polymers that inhibit adhesion. Colloids and Surfaces B:

Biointerfaces, 4, 191-197.

179
Santiago N.I, Zipf A. and Bhunia A.K. (1999) Influence of Temperature and Growth Phase on Expression of

a 104-Kilodalton Listeria Adhesion Protein in Listeria monocytogenes. Applied Environmental

Microbiology, 65, 2765-2769.

Sauer K., Camper A.K., Ehrlich G.D., Costerton J.W. and Davies D.G. (2002) Pseudomonas aeruginosa

Displays Multiple Phenotypes during development as a Biofilm. Jounal of Bacteriology, 184, 1140-1154.

Steiner P. and Sauer U. (2001) Proteins Induced during Adaptation of Acetobacter aceti to High Acetate

Concentrations. Applied Environmental Microbiology, 67, 5474-5481.

van der Mei H.C., Brokke P., Dankert J., Feijen J., Rouxhet P.G. and Busscher H.J. (1989) Physicochemical

Surface Properties of Nonencapsulated and Encapsulated Coagulase-Negative Staphylococci. Applied

Environmental Microbiology, 55, 2806-2814.

Vatanyoopaisarn S., Nazli A., Dodd C.E.R., Rees C.E.D. and Waites W.M. (2000) Effect of Flagella on

Initial Attachment of Listeria monocytogenes to Stainless Steel. Applied Environmental Microbiology, 66,

860-863.

180
Table 1 Percentage affinity to solvents (Chl: Chloroform, Hx: Hexadecane, Dc: Decane and EA:

Ethyl Acetate) of Ps. aeruginosa A22 as a function of storage and growth conditions.

Period
Medium Stock Chl Hx Dc EA
(months)

0 74 2 2 1 00 27 6

+4C 1 70 5 1 2 00 26 1

2 66 9 54 23 24 5
TSA
0 74 4 2,6 3 22 26 8

-80C 1 71 12 33 22 25 6

2 68 3 77 65 25 4

0 84 5 01 00 29 12

+4C 1 79 3 22 01 33 1

2 84 4 62 21 25 1
TSB
0 83 3 00 00 31 10

-80C 1 81 4 11 00 28 7

2 74 5 42 12 26 3

181
Table 2 Percentage affinity to solvents (Chl: Chloroform, Hx: Hexadecane, Dc: Decane and EA:

Ethyl Acetate) of Staph. aureus 53154 as a function of storage and growth conditions.

Period
Medium Stock Chl Hx Dc EA
(months)

0 98 1 64 7 61 7 13 10

+4C 1 98 2 77 10 79 8 40 28

2 97 2 74 11 74 11 56 30
TSA
0 96 3 59 7 67 12 8 7

-80C 1 97 2 69 15 77 9 35 31

2 98 1 76 4 74 5 51 22

0 94 4 47 8 60 9 2 2

+4C 1 98 2 66 8 75 5 4 4

2 96 4 61 14 62 15 10 11
TSB
0 97 4 45 6 69 9 1 1

-80C 1 98 3 68 9 72 10 12 10

2 96 3 58 15 69 18 8 8

182
Table 3 Percentage affinity to solvents (Chl: Chloroform, Hx: Hexadecane, Dc: Decane and EA:

Ethyl Acetate) of L. monocytogenes 103 575 as a function of storage and growth conditions.

Period
Medium Stock Chl Hx Dc AE
(months)

0 80 5 50 7 53 7 36 2

+4C 1 90 1 56 1 55 2 33 1

2 89 4 54 3 59 8 28 2
TSA
0 76 5 53 7 58 6 36 1

-80C 1 85 1 54 4 57 1 34 1

2 88 3 59 6 59 10 28 3

0 78 5 43 2 43 5 21 4

+4C 1 79 4 49 6 48 4 23 3

2 82 3 44 5 45 4 20 3
TSB
0 73 6 40 2 43 3 19 3

-80C 1 82 4 45 7 49 3 17 2

2 93 1 63 7 62 11 20 5

183
Table 4 Percentage affinity to solvents (Chl: Chloroform, Hx: Hexadecane, Dc: Decane and EA:

Ethyl Acetate) of L. monocytogenes 129P as a function of storage and growth conditions.

Period
Medium Stock Chl Hx Dc EA
(months)

0 92 2 61 4 58 3 55 2

+4C 1 89 3 60 4 53 5 46 11

2 79 7 59 7 55 7 52 4
TSA
0 89 7 67 8 66 10 36 3

-80C 1 94 3 75 4 72 7 30 5

2 84 3 64 9 54 10 42 12

0 81 7 51 4 47 3 60 4

+4C 1 73 5 40 6 34 5 38 4

2 63 6 26 8 23 6 35 4
TSB
0 82 3 54 5 49 4 49 11

-80C 1 76 3 47 2 40 3 32 1

2 78 4 46 5 42 4 35 4

184
Figure 1: Electrophoretic mobility (E.M.) of Ps. aeruginosa A22 at pH 2 to 9 depending on storage

and growth conditions (A: 4C-TSA; B: 4C-TSB; C: -80C-TSA; D: -80C-TSB).

Figure 2: Electrophoretic mobility (E.M.) of Staph. aureus 53 154 at pH 2 to 9 depending on

storage and growth conditions (A: 4C-TSA; B: 4C-TSB; C: -80C-TSA; D: -80C-TSB).

Figure 3: Electrophoretic mobility (E.M.) of L. monocytogenes 103 575 at pH 2 to 9 depending on

storage and growth conditions (A: 4C-TSA; B: 4C-TSB; C: -80C-TSA; D: -80C-TSB).

Figure 4: Electrophoretic mobility (E.M.) of L. monocytogenes 129P at pH 2 to 9 depending on

storage and growth conditions (A: 4C-TSA; B: 4C-TSB; C: -80C-TSA; D: -80C-TSB).

Figure 5: Principal-component analysis of combined physicochemical properties (affinity for the

solvents used with MATS method and electrophoretic mobilities of bacteria) of each strains grown

on TSA (black symbols) or in TSB (clear symbols) for 0 (T0), 1 (T1) and 2 (T2) months of storage

at 4C (circle) and at -80C (square).

185
 pH pH
A 1 B 1
0,5 0,5
0 0
-0,5 2 3 4 5 6 7 8 9 -0,5 2 3 4 5 6 7 8 9

E .M . (1 0 -8 m .V-1 .s-1 )
E.M . (1 0 -8 m .V-1 .s-1 )
-1 -1
-1,5 -1,5
-2 -2
-2,5 -2,5
-3 -3
-3,5 -3,5
-4 -4
-4,5 -4,5
-5 -5

pH pH
C 1 D 1
0,5 0,5
0 0
-0,5 2 3 4 5 6 7 8 9 -0,5 2 3 4 5 6 7 8 9
E .M . (1 0 -8 m .V-1 .s-1 )

E .M . (1 0 -8 m .V-1 .s-1 )
-1 -1
-1,5 -1,5
-2 -2
-2,5 -2,5
-3 -3
-3,5 -3,5
-4 -4
-4,5 -4,5
-5 -5

Figure 1

pH pH
A 1 B 1
0,5 0,5
0 0
-0,5 2 3 4 5 6 7 8 9 -0,5 2 3 4 5 6 7 8 9
E.M . (1 0 -8 m .V-1 .s-1 )
E.M . (1 0 -8 m .V-1 .s-1 )

-1 -1
-1,5 -1,5
-2 -2
-2,5 -2,5
-3 -3
-3,5 -3,5
-4 -4
-4,5 -4,5
-5 -5

pH pH
C 1 D 1
0,5 0,5
0 0
-0,5 2 3 4 5 6 7 8 9 -0,5 2 3 4 5 6 7 8 9
E.M . (10 -8 m .V-1 .s-1 )

E.M . (10 -8 m .V-1 .s-1 )

-1 -1
-1,5 -1,5
-2 -2
-2,5 -2,5
-3 -3
-3,5 -3,5
-4 -4
-4,5 -4,5
-5 -5

Figure 2

186
 pH pH
A 1 B 1
0,5 0,5
0 0
-0,5 2 3 4 5 6 7 8 9 -0,5 2 3 4 5 6 7 8 9

E .M . (1 0 -8 m .V-1 .s-1 )
E.M . (1 0 -8 m .V-1 .s-1 )
-1 -1
-1,5 -1,5
-2 -2
-2,5 -2,5
-3 -3
-3,5 -3,5
-4 -4
-4,5 -4,5
-5 -5

pH pH
C 1 D 1
0,5 0,5
0 0
-0,5 2 3 4 5 6 7 8 9 -0,5 2 3 4 5 6 7 8 9
E .M . (1 0 -8 m .V-1 .s-1 )

E .M . (1 0 -8 m .V-1 .s-1 )
-1 -1
-1,5 -1,5
-2 -2
-2,5 -2,5
-3 -3
-3,5 -3,5
-4 -4
-4,5 -4,5
-5 -5

Figure 3

pH pH
A 1 B 1
0,5 0,5
0 0
-0,5 2 3 4 5 6 7 8 9 -0,5 2 3 4 5 6 7 8 9
E .M . (1 0 -8 m .V-1 .s-1 )
E.M . (1 0 -8 m .V-1 .s-1 )

-1 -1
-1,5 -1,5
-2 -2
-2,5 -2,5
-3 -3
-3,5 -3,5
-4 -4
-4,5 -4,5
-5 -5

pH pH
C 1 D 1
0,5 0,5
0 0
-0,5 2 3 4 5 6 7 8 9 -0,5 2 3 4 5 6 7 8 9
E .M . (1 0 -8 m .V-1 .s-1 )

E .M . (1 0 -8 m .V-1 .s-1 )

-1 -1
-1,5 -1,5
-2 -2
-2,5 -2,5
-3 -3
-3,5 -3,5
-4 -4
-4,5 -4,5
-5 -5

Figure 4

187
 Electrophoretic Mobility

Principal C om ponent 1 (62,8% of the total variation in the data set)

T1b
Staph. aureus 53154
2 T0b T2a
T0b T2a
Principal Com ponent 2 (24,5% of the total variation in the data set)

T2 T2 T2b
T1 T1a T1b T2b
T1a T2a

Hydrophilicity
T1 T0b
T0a T0b
1 T0a L.monocytogenes 103575 (a)
T1 T0 L.monocytogenes 129P (b)
T1 T0 T1a T1b
T2 T2 T1a T0a T2b
0
-6
T0 -5 -4 -3 -2 -1 0 1 2 3 4 5
T0a
T0 T2a
T1b

-1

T2b

-2
T2 T0
T1 T0
T1 T2
T0 T2
-3 T1 T2

T1
Ps.aeruginosa A22

-4

Figure 5

188
 INFLUENCE OF STORAGE (DURATION & PROTOCOL) AND GROWTH CONDITIONS ON PHYSICO-
CHEMICAL SURFACE PROPERTIES OF WILD TYPE AND BACTERIA FROM COLLECTION
A. ALLION1,2, F. DURAND2, J. CRIQUELION2, G. RAUWEL2, M.-N. BELLON-FONTAINE1
INRA, Unit de recherche en bioadhsion et hygine des matriaux, Massy, France1 - Laboratoires ANIOS, Lille-Hellemmes2, France.

AIM OF THE STUDY: The objective of this study was to determine the influence of storage and growth conditions on hydrophobicity, Lewis acid-base properties
and electrophoretic mobility of wild type and bacteria from collection.

MATERIALS AND METHODS:

Bacterial strains, storage and growth conditions : M.A.T.S. (Microbial Adhesion To Solvents) : This method is based on comparing mi-
St. aureus 53154 (Sa 53154), Ps. aeruginosa A22 (Pa A22) and L. monocytogenes crobial cell affinity to a polar solvent and microbial cell affinity to a nonpolar solvent. The
103575 (Lm 103575) were provided from Institut Pasteur Collection (France); whereas L. polar solvent can be electron acceptor or electron donor, but both solvents must have
monocytogenes 129P (Lm 129P) was isolated from food industry. Each strain was stored similar van der Waals surface tension components. The following pairs of solvents were
at -80C in cryoprotectrive solution and at +4C on TSA (Biomrieux, France), during 2 used : chloroform, electron acceptor solvent, and hexadecane ; and ethyl acetate, elec-
months maximum. All experiments were realised at 0, 1 and 2 months of storage. For all tron donor solvent and decane.
experiments, cells were subcultured twice on the same medium as the final culture. Bacte- 2,4 ml of microbial suspension (A0 0,8 at
E m u l s
s o l v
ria grown on Tryptone Soy Agar (TSA) or on Tryptone Soy Broth (TSB) at 37C. 400nm) and 0,4 ml of solvent were strongly b a c t e r i

shaken during 60 s of manner to form an s u s p e n

Physicochemical characterisation of bacterial cells : emulsion. After 15 min. of settling, optical A A

Cells were cleaned by three successive centrifugations (7000 g, 10 minutes, 4C) and re- density of the aqueous phase was meas- 0 1

suspensions in the relevant liquid (NaCl 1,5.10-3 mol.l-1 for electrophoretic mobility and ured (A1). The percentage of bound cells was determined by the following relationship : %
NaCl 0,15 mol.l-1 for MATS method). Affinity = 100 x [1- (A1/A0)].
Microelectrophoresis : Microbial cells electrophoretic mobility was measured as a func-
tion of pH in the range 2-9 by addition of KOH or HNO3. Measurements were realised un- Statistical analysis. A principal component analysis was performed by using Stat-
der an electrical field of 50 Volts using a laser zetameter (SEPHY, France). graphics Plus for Windows (Manugistic, Rockville, Md).

RESULTS:
Pa A22 Sa 53 154 Lm 103 575 Lm 129P pH2 pH4 pH6 pH8 A
Lm 103575 Lm 129P Sa 53154 Pa A22
Growth Conditions Stock Time Chl Hx Dc AE Chl Hx Dc AE Chl Hx Dc AE Chl Hx Dc AE 0,5

0,0
0 74 1,6 0,2 26,9 98 63,7 60,7 12,8 80 49,8 52,5 36,4 91,9 61,3 58,2 54,7
-0,5
4C 1 70,4 0,8 0,1 26,2 97,8 76,9 78,6 39,7 90,2 55,8 55,3 33,5 88,7 60,2 53,1 46,2
E.M. (10 m.V .s )

-1,0
-1 -1

-1,5
2 66,4 4,9 2,6 24,2 97,2 74,5 74,4 56,1 89,7 54,4 59,2 27,9 79,4 59,4 54,8 51,7
-8

TSA -2,0
0 73,7 2,6 1,9 26,6 96,4 59,6 67,3 8,4 76,5 53,4 58,2 36,3 89,5 67 66,3 36,6 -2,5

-80C 1 70,7 2,9 1,5 25 97,6 69,1 76,7 35,1 85 54,1 56,9 34,2 94 75,1 72,3 30,3 -3,0

-3,5
2 68,4 7,3 6,2 25,4 98 75,9 73,8 51,4 87,9 58,7 59,4 28,4 84,1 64 54,2 42,4
-4,0

0 83,7 0,3 0 28,9 93,8 47,6 60 2,1 78,5 43 42,9 20,6 81,5 50,8 47,1 60
pH2 pH4 pH6 pH8 B
4C 1 79,4 2 0,4 32,8 98 66,2 75,5 4,4 78,9 49 48,1 23,4 73,1 40,5 34,5 38,6
Lm 103575 Lm 129P Sa 53154 Pa A22
0,5
2 83,8 5,8 2,6 25,6 96,1 61,3 62,4 9,8 82,5 43,8 44,7 20,2 62,9 26 22,9 34,9
TSB 0,0
0 83 0 0 30,6 96,6 44,9 68,8 0,6 73,3 40,1 42,8 19,2 82 53,7 48,8 49,2 -0,5

-80C 1 80,7 1,1 0,1 28,5 98,2 67,9 72,1 12 81,7 45,6 49 16,8 76,4 46,6 39,8 32,5
E.M. (10 m.V .s )

-1,0
-1 -1

-1,5
2 74,4 3,7 1,3 26 96,2 58,2 69,6 7,7 93,3 62,7 62,5 20 77,8 46,4 42,5 35
-8

-2,0

Table 1 : Affinity of each bacterial strain to the solvents (MATS test) as a function of conservation and growth conditions -2,5

(Chl: Chloroform; Hx : Hexadecane; Dc: Decane and AE : Ethyl Acetate) -3,0

-3,5
3 L . m o n o c y to g e n e s 1 2 9 P
TSA L . m o n o c y to g e n e s 1 0 3 5 7 5 -4,0

-8 0 A 1
TSA
S t. a u r e u s 5 3 1 5 4 pH2 pH4 pH6 pH8
C
2 -8 0 A 0 4 A 2
Lm 103575 Lm 129P Sa 53154 Pa A22
4 A 0 -8 0 A 2 0,5
- 8 0- 8 A0 2 B 2 4 A 1
-8 0 A 2
4 A 1 4 A 1 4 A 2
-8 0 A 1 0,0
-8 0 B 2
-8 0 A 1 -0,5
4 B 0
4 A 0 -8 0 B 0
1
-1,0
E.M. (10 m.V .s )
-1 -1

-8 0 A 0
4 A 0
-8 0 B 1 -8 0 A 1 -1,5
4 B 1
4 B 1 -8 0 B 1
-8

-2,0
-8 0 B 2 4 B 2 4 B 0
-8 0 B 0
-2,5
0 -8 0 B 1
-8 0 B 0
HYDROPHOBICITY

-7 -6 -45 B 0 -4 -3 -2 -1 0 1 2 4 3B 2 4 5 -3,0
-8 0 B 0 4 B 1
-3,5
TSB
-4,0
Axe 2 (24,5% of the variation)

-1
pH2 pH4 pH6 pH8
4 B 2 D
Lm 103575 Lm 129P Sa 53154 Pa A22
TSB
TSB 0,5

-2 0,0
4 B 2 -8 0 B 0
4 B 1 -0,5
4 B 0
-8 0 B 1
E.M. (10 m.V .s )

-1,0
-1

-8 0 A 1 -8 0 A 2
-1

-8 0 B 2
4 A 2 -1,5
4 A 0 -8 0 A 1
-3
-8

4 A 1 -2,0

TSA P s .a e r u g in o s a A 2 2 -2,5

-3,0

-3,5
-4
A x e 1 ( 6 2 , 8 % o f t h e v a r ia t io n o f t h e d a t a ) -4,0

ELECTRONEGATIVITY Fig. 1 : Electrophoretic mobility of cells gown on TSA at T0 of conser-

Fig. 2: Principal Component Analysis. The first axis was closely related with microbial cell affinity to chloroform and vation at 4C (A) and 80C (B) and grown in TSB at T0 of conserva-
with electronegativity of bacteria; and inversely connected with microbial cell affinity for ethyl acetate. The second tion at 4C (C) and 80C (D) .
axis is related with hydrophobicity of cell surface.

CONCLUSION: Figure 2 : Electrophoretic mobility of cells gown in TSB at T0 of conservation at 4C (A) and
In our experimental conditions, each bacterial specie has physico-chemical surface properties
80C (B). different from the others. Storage conditions seem to have little influence on
these surface properties of Ps. aeruginosa A22; on the other hand, growth conditions had an impact on cell hydrophobicity.
Dispersion of the results obtained for the Gram positive strains indicates that the factors studied seem to have an important influence on physico-chemical surface prop-
erties of these strains. Grown on TSA, bacterial cells appear more hydrophobic than in TSB. Moreover, those surface characteristics evolve with the storage conditions.
The results of this study have shown that bacterial storage at 4C shouldnt have to be used for long time conservation, unlike storage at 80C. Moreover, the different
physico-chemical surface properties of the strains, as a function of growth conditions, could indicate various adhesion behaviour on surfaces.
IUMS Congress The World of Microbes (27th July to 1st August 2002 - Palais des Congrs, Paris)
 PLANKTONIC / SESSILE BACTERIA: IMPACT OF STORAGE AND GROWTH
PROTOCOLS ON CELL SENSITIVITY TO DISINFECTANTS.
A. ALLION1,2, F. DURAND2, J. CRIQUELION2, G. RAUWEL2, M.-N. BELLON-FONTAINE1
(1)
INRA - Unit de recherche en Bioadhsion et Hygine des Matriaux, 25, avenue de la Rpublique F-91744 Massy Cedex, France
(2)
Laboratoires ANIOS, Lille-Hellemmes2, France

AIM OF THE STUDY

To compare the efficiency of disinfectants on planktonic or sessile pathogenic bacteria grown under different experimental conditions.

MATERIALS AND METHODS

Bacterial strains Adhesion test Test on planktonic cells
S. aureus CIP 53154 (S1) and Ps. aeruginosa CIP - Solid surface preparation The assays for determination of the activities of
A22 (P1) were provided by Institut Pasteur the compounds were performed according to the
(France), while S. aureus 221 (S2) and Ps. aerugi- Samples of stainless steel AISI 316 (Goodfellow, UK)
NF-EN 1040 procedure.
nosa 222 (P2) were clinical isolates. were soaked for 15 minutes in a 2% (v/v) of a commer-
1 mL
cial RBS 35 detergent (Socit des Traitements Chimi-
Storage and growth conditions
t t
5 1 mL 10

ques de Surface, France), rinsed five times for 5 min- t

0
2 x 1 mL

For each of these strains, and in accordance with utes in tap water and then rinsed five times for 5 min-
the NF EN 12353 standard, two storage conditions utes in demineralized water. Bacterial

Bioc ide : 9 ml
suspension

Ne utralize r: 9 ml
1 to 3x108

were applied, one at -80C in cryoprotective solu- - Microbial adhesion experiments

cfu/ml

tion and the other at 4C on TSA (Biomrieux, Solid surfaces were immersed in 25 ml of bacterial
France). suspension and adhesion assays were performed by
Bacterial cultures on solid agar were obtained af- sedimentation for 3 hours at 20C. To remove non- Test on sessile cells
ter three successive inoculations for 24 hours at adherent bacteria, the surface were rinsed five time in
37C on agar in a sloping position (TSA) of the The assays for determination of the activities of
NaCl 1.5 10-1 mol.l-1 . the compounds were performed according to a
stock at 4C. For cultures in a liquid medium
(TSB) (Biomrieux, France), two pre-cultures of 24 protocol adapted from the NF-EN 1040 proce-
hours and 8 hours of the cells stored at -80C dure.
were done before a final inoculation at a rate of
N t 10
1% (v/v) at a temperature of 37C. All experiments t 0 t 5

M
t

-1
0 '

were performed on cells in the stationary phase of

5 mL de NaCl 1,5 .10

t 3 h
B a c t e r i a l

growth.
- Bacterial suspensions
Disinfection test
Cells were harvested by centrifugation for 10 min
at 7000g at 4C, and then washed twice with and
- Bactericidal compounds Ultrasounds (3 min.)
1ml 1ml

re-suspended in NaCl 1.5 10-1 mol.l-1 . Microbial Biocides chosen were peracetic acid (PAA), didecyldi- Ultra-sounds Bath

suspensions were diluted to obtain a cell concen- methylammonium chloride (DDAC) and polyhexamethyl-

Dilution -2
Dilution -1
Dilution 0
tration of approximately 1.5 to 3 108 CFU/ml. ene biguanide (PHMB). They were obtained from Labo-
Bacterial ratoires ANIOS (France).

RESULTS

A B C
8 8 8
Biocides
Strains Media 7 7 7

PAA DDAC PHMB 6 6 6

Log(ufc/cm)

Log(ufc/cm)

Log(ufc/cm)

5 5 5
TSA 8 20 80 4 4 4
S. aureus 53154 3 3 3
TSB 8 20 ND 2 2 2
1 1 1
TSA 10 10 80 0 0 0
S. aureus 221
0 1000 2000 3000 4000 5000 0 1000 2000 3000 4000 5000 0 1000 2000 3000 4000 5000
TSB 16 20 20 [C] ppm [C] ppm [C] ppm

Table I :CMB (ppm) of disinfectants on suspensions of S. aureus Fig 1: Survival of adherent S. aureus strains after disinfection of stainless steel samples with PAA (A), DDAC (B) and PHMB (C). S1-TSA S1-TSB S2-TSA S2-TSB
strains

A B C
8 8 8
Biocides
Strains Media 7 7 7

PAA DDAC PHMB 6 6 6

Log(ufc/cm)

Log(ufc/cm)

Log(ufc/cm)

5 5 5
TSA 4 20 20 4 4 4
Ps. aeruginosa A22 3 3 3
TSB 4 10 10 2 2 2
1 1 1
TSA 4 5 400
0 0 0
Ps. aeruginosa 222
0 1000 2000 3000 4000 5000 0 1000 2000 3000 4000 5000 0 1000 2000 3000 4000 5000
TSB 8 10 40 [C] ppm [C] ppm [C] ppm

Table II :CMB (ppm) of disinfectants on suspensions of Ps. Fig 2: Survival of adherent Ps. aeruginosa strains after disinfection of stainless steel samples with PAA (A), DDAC (B) and PHMB (C). P1-TSA P1-TSB P2-TSA P2-TSB
aeruginosa strains

CONCLUSION
In this study, we showed that storage and growth conditions may have an impact on bacterial susceptibilty to biocide, especially for non-oxydative disinfectants. So, growth
conditions, modifying the cell wall components, can influence the number of the targets of the antimicrobial agents and so its activity on planktonic cells.
According to previous studies, sessile state of micro-organisms have a strong impact on bactericidal activity of the disinfectants. Even though, the PAA seems to be the
more effective on adherent Pseudomonas strains, whatever the strain and the storage and growth conditions, we observed an increase of the resistance (100 to 1,000 fold)
of the adherent bacteria to the three biocides. Moreover, as planktonic cells, growth conditions can lead variations of the susceptibility of the micro-oranisms tested to bio-
cides.

Biofilms in Medicine - 17 - 19 October, 2003, LO-Skolen, Elsinore, DENMARK.

 PLANKTONIC / SESSILE BACTERIA: IMPACT OF STORAGE AND GROWTH
PROTOCOLS ON CELL SENSITIVITY TO DISINFECTANTS.
A. ALLION1,2, F. DURAND2, J. CRIQUELION2, G. RAUWEL2, M.-N. BELLON-FONTAINE1
(1)
INRA - Unit de recherche en Bioadhsion et Hygine des Matriaux, 25, avenue de la Rpublique F-91744 Massy Cedex, France (2) Laboratoires ANIOS, Lille-Hellemmes2, France

THE AIM OF THE STUDY was to compare the efficiency of disinfectants on planktonic or sessile pathogenic bacteria grown
under different storage and growth conditions.

MATERIALS AND METHODS

Bacterial strains Adhesion test Test on planktonic cells
S. aureus CIP 53154 (S1), L. monocytogenes - Solid surface preparation The assays for determination of the activities of
103575 (L1) and Ps. aeruginosa CIP A22 (P1) were Samples of stainless steel AISI 316 (Goodfellow, UK) the compounds were performed according to the
provided by Institut Pasteur (France), while S. aureus were soaked for 15 minutes in a 2% (v/v) of a commer- NF-EN 1040 procedure.
221 (S2) and Ps. aeruginosa 222 (P2) were clinical cial RBS 35 detergent (Socit des Traitements Chimi-
isolates and L. monocytogenes 177 (L2) was food ques de Surface, France), rinsed five times for 5 min-
plant isolate. utes in tap water and then rinsed five times for 5 min-
Storage and growth conditions utes in demineralized water.
For each of these strains, and in accordance with the - Microbial adhesion experiments
NF EN 12353 standard, two storage conditions were Solid surfaces were immersed in 25 ml of bacterial
applied, one at -80C in cryoprotective solution and suspension and adhesion assays were performed by
the other at 4C on TSA (Biomrieux, France). sedimentation for 3 hours at 20C. To remove non- Test on sessile cells
Bacterial cultures on solid agar were obtained after adherent bacteria, the surface were rinsed five time in The assays for determination of the activities of
three successive inoculations for 24 hours at 37C on NaCl 1.5 10-1 mol.l-1 . the compounds were performed according to a
agar in a sloping position (TSA) of the stock at 4C. protocol adapted from the NF-EN 1040 proce-
For cultures in a liquid medium (TSB) (Biomrieux, dure.
France), two pre-cultures of 24 hours and 8 hours of
the cells stored at -80C were done before a final in-
oculation at a rate of 1% (v/v) at a temperature of 37 t 0 '

C. All experiments were performed on cells in the sta- B a c t e r i a l

t
3 h

tionary phase of growth.

- Bacterial suspensions Disinfection test
Cells were harvested by centrifugation for 10 min at - Bactericidal compounds
7000g at 4C, and then washed twice with and re-
Biocides chosen were peracetic acid (PAA), didecyldi-
suspended in NaCl 1.5 10-1 mol.l-1 . Microbial sus-
methylammonium chloride (DDAC) and polyhexamethyl-
pensions were diluted to obtain a cell concentration
ene biguanide (PHMB). They were obtained from Labo-
of approximately 1.5 to 3 108 CFU/ml.
ratoires ANIOS (France).

RESULTS
A 1000 A 8 8 C 8
B
7 7 7
6 6 6
Log(ufc/cm)

Log(ufc/cm)

Log(ufc/cm)
Log10([CMB] ppm)

100 5 5 5
4 4 4
3 3 3
10 ND
2 2 2
1 1 1
0 0 0
1 0 1000 2000 3000 4000 5000 0 1000 2000 3000 4000 5000 0 1000 2000 3000 4000 5000
S1 - TSA S1 - TSB S2 - TSA S2 - TSB
[C] ppm [C] ppm [C] ppm
Fig 1: :Log10(MBC) of each disinfectant (symboles) for S. Fig 4: Survival of adherent S. aureus strains after disinfection of stainless steel samples with PAA (A), DDAC (B) and PHMB (C). S1-TSA S1-TSB S2-TSA S2-TSB
aureus suspensions

B 1000 A 8 B 8 C 8
7 7 7
6 6 6
Log(ufc/cm)

Log(ufc/cm)

Log(ufc/cm)
Log10([CMB] ppm)

100 5 5 5
4 4 4
3 3 3
10 2 2 2
1 1 1
0 0 0
1 0 1000 2000 3000 4000 5000 0 1000 2000 3000 4000 5000 0 1000 2000 3000 4000 5000
P1 - TSA P1 - TSB P2 - TSA P2 - TSB
[C] ppm [C] ppm [C] ppm
Fig 2: :Log10(MBC) of each disinfectant (symboles) for Ps. Fig 5: Survival of adherent Ps. aeruginosa strains after disinfection of stainless steel samples with PAA (A), DDAC (B) and PHMB (C). P1-TSA P1-TSB P2-TSA P2-TSB
aeruginosa suspensions

C A 8 8 C 8
1000 B
7 7 7
6 6 6
Log(ufc/cm)

Log(ufc/cm)
Log(ufc/cm)
Log10([CMB] ppm)

100 5 5 5
4 4 4
3 3 3
10 ND ND 2 2
2
1 1 1
0 0 0
1 0 1000 2000 3000 4000 5000 0 1000 2000 3000 4000 5000 0 1000 2000 3000 4000 5000
L1 - TSA L1 - TSB L2 - TSA L2 - TSB
[C] ppm [C] ppm [C] ppm
Fig 3: Log10(MBC) of each disinfectant (symboles) for L. Fig 6: Survival of adherent L. monocytogenes strains after disinfection of stainless steel samples with PAA (A), DDAC (B) and PHMB (C).
L 1 T S A L 1 T S B
monocytogenes suspensions

CONCLUSION
In this study, we showed that storage and growth conditions may have an impact on bacterial susceptibilty to biocide, especially for non-oxydative disinfectants. So, growth
conditions, modifying the cell wall components, can influence the number of the targets of the antimicrobial agents and so its activity on planktonic cells.
According to previous studies, sessile state of micro-organisms have a strong impact on bactericidal activity of the disinfectants. Even though, the PAA seems to be the
more effective on adherent Pseudomonas strains, whatever the strain and the storage and growth conditions, we observed an increase of the resistance (100 to 1,000 fold)
of the adherent bacteria to the three biocides. Moreover, as planktonic cells, growth conditions can lead variations of the susceptibility of the micro-oranisms tested to bio-
cides.
Biofilms 2003 - 01 - 06 November, 2003, Victoria, BC, Canada.
Environnement des bactries et sensibilit aux biocides - Mise au point dune technique
rapide pour dterminer in situ lefficacit bactricide dagents antimicrobiens -

Rsum : La matrise de lhygine des surfaces demeure une proccupation constante dans de
nombreux secteurs dactivit. En effet, la contamination microbiologique des surfaces peut
tre lorigine de problmes de sant publique plus ou moins svres dans les industries agro-
alimentaires (toxi-infections alimentaires) ou le milieu mdical (infections nosocomiales).
Lefficacit des agents dsinfectants restant variable dune application lautre (notamment
sur des micro-organismes adhrant), il savre ncessaire damliorer les formulations
dsinfectantes et/ou les procdures de dsinfection qui y sont associes. Cette amlioration
passe par la mise en place de mthodes tests permettant dvaluer rapidement lactivit
antimicrobienne de produits commercialiss ou non, dans des conditions proches de la ralit.
Ainsi, au cours de ce travail, nous avons dfini un protocole pour dterminer lactivit ltale
des produits dsinfectants sur cellules adhrentes, protocole compos de quatre tapes
principales : i) choix des micro-organismes et standardisation de leurs conditions de
conservation et de croissance, ii) mise en place dun protocole dadhsion reproductible sur
supports conditionns ou non, iii) test de dsinfection sur cellules adhrentes et iv)
optimisation de ce protocole dans le caractre in situ et le dlai dobtention des rsultats par
lutilisation de marqueurs fluorescents, indicateurs de la viabilit cellulaire.

Mots-cl : Conditions de conservation et de croissance, bioadhsion, dsinfection, viabilit

cellulaire, pifluorescence

Bacterial environment and susceptibility to the disinfectants setting a rapid technic to

determine, in situ, the lethal efficiency of antimicrobial agents -

Summary : Controlling the hygiene status of surfaces remains a constant concern in different
areas. Indeed, the biofouling of surfaces can be a source of dramatic public health problems in
food industries (food toxi-infections) or in hospitals (nosocomial infections).
The efficiency of biocides remains variable from one application to the others, (especially on
adherent micro-organisms), it is necessary to improve the disinfectant formula and/or the
associated procedures of disinfection. This improvement involves new test methods that allow
rapid assessment of the antibacterial activity of marketed or not products, in conditions closed
to the reality. So, through this work, we defined a protocol to determine lethal activity of
biocides on sessile bacteria, protocol made up of four principal steps: i) selection of micro-
organisms and standardisation of their storage and growth conditions, ii) setting a
reproducible adhesion protocol of bacteria on soiled or not surfaces, iii) disinfection test on
sessile micro-organisms and iv) optimisation of this protocol for in situ observations and
reducing the time needed to obtain results by employing fluorescent markers which give
indications on cellular viability.

Key-words : Storage and growth conditions, bioadhesion, disinfection, cellular viability,

epifluorescence