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ELETROFORESE

A eletroforese uma tcnica de separao de partculas de acordo com sua


carga eltrica e peso molecular. Permite a separao de fraes de molculas
orgnicas como RNA, DNA, protenas e enzimas, pela migrao destas em um
gel durante a aplicao de um potencial eltrico.
eletroforese muito eficiente como mtodo analtico, por possibilitar a
visualizao das macromolculas separadas, alm de permitir que seja
estimada o nmero de protenas diferentes em uma mistura ou o grau de
pureza de uma preparao proteica especfica. A eletroforese permite tambm
que o ponto isoeltrico de uma protena seja determinado, que a sua massa
molecular seja estimada, e permite a identificao de protenas desconhecidas
por comparao com a massa de protenas conhecidas. Entretanto, a utilizao
com frequncia de mtodos eletroforticos afetam adversamente a estrutura e
funo das protenas.

A eletroforese foi realizada pela primeira vez em 1937 pelo qumico Arne
Tiselius para o estudo de protenas em soro, pelo mtodo denominado soluo
livre, um tipo de eletroforese em que as substncias a serem separadas esto
em soluo ou suspenso, e que no emprega suporte. Era um mtodo muito
limitado devido a instabilidades do aparelho, pelos efeitos de difuso e por
provocar, por exemplo, o aquecimento devido ao campo eltrico,
comprometendo a separao dos compostos. Este mtodo foi melhorado com
a introduo do suporte, diminuindo o efeito da difuso.

A eletroforese utilizada em inmeros processos, entre eles:

Cincia forense para comparar o DNA encontrado no local do crime


com o de possveis suspeitos.

Gentica teste de paternidade, diferenciao de espcies ou linhagens


e engenharia gentica.

Microbiologia deteco de diferentes patgenos como vrus, bactrias


e fungos.
Bioqumica deteco da expresso de protenas.

Para se realizar a eletroforese so necessrios tais materiais:

Agarose ou poliacrilamida

A agarose um polissacardeo composto por agar e pectina, utilizado


para separao de cidos nucleicos. Para preparar este gel,
simplesmente faz-se a mistura entre o p de agarose e soluo tampo.
Aps fundir, coloca-se brometo de etidium, que tem ampla afinidade pelo
DNA, e revela sobre presena de UV(ultra violeta) os cidos nuclicos.
Quando a mistura esfriar o gel estar duro. Esse endurecimento feito
em um local apropriado, o mesmo local onde ser feita a corrida da
amostra. Um detalhe importante a colocao do pente no gel durante o
endurecimento. O pente cria poos que sero utilizados para a
colocao das amostras. O gel de agarose e usado pois tem uma maior
extenso de separao para fragmentos longos de DNA( identifica os
cidos nuclicos presente neste). O tamanho e a conformao da
molcula de DNA, a concentrao do gel de agarose , a corrente eltrica
aplicada e tipo de tampo usado influenciam a velocidade da partcula
no gel.

A poliacrilamida uma mistura de dois polmeros, acrilamida e


bisacrilamida. Para preparar este gel, basta adicionar os dois polmeros
nas concentraes desejadas em um suporte de vidro e na presena de
um catalisador. Esta tcnica utilizada, pois o gel poliacrilamida tem a
capacidade de separar fragmentos muito pequenos e que apresentam
uma mnima diferena de massa, alm disso o gel pode recuperar e
purificar determinada amostra.

Apesar das vantagens, o gel de agarose mais utilizado pois a


poliacrilamida muito txica e difcil de ser preparada. Neste tipo de gel
a corrida feita em cubas verticais, e o carante utilizado o mesmo da
eletroforese em gel de agarose.

Cuba e fonte de eletroforese

Soluo-tampo

Em razo das protenas serem substncias anfteras, ou seja, capazes


de adquirirem carga positiva ou negativa em funo do pH,
indispensvel manter constante o pH do meio durante a eletroforese,
pelo uso de solues-tampo.
Marcador de peso molecular

Corante fluorescente corante safer ou brometo de etdio

Transiluminador UV ou LED